Summary
कोशिकी पुटिकाओं जमावट, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, और कैंसर या दवा वितरण या पुनर्योजी दवा के रूप में संभावित चिकित्सीय एजेंट सहित शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. इस प्रोटोकॉल ट्यून करने योग्य प्रतिरोधक पल्स संवेदन का उपयोग कर विभिन्न तरल पदार्थ में अलग और गैर पृथक कोशिकी पुटिका की मात्रा का ठहराव और आकार लक्षण वर्णन के लिए तरीके प्रस्तुत करता है.
Abstract
'Microvesicles' और 'exosomes' सहित कोशिकी पुटिकाओं (ईवीएस), शारीरिक तरल पदार्थ में अत्यधिक प्रचुर मात्रा में हैं. हाल के वर्षों में ईवीएस में ब्याज में भारी वृद्धि देखी गई है. ईवीएस जमावट, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, और कैंसर सहित विभिन्न शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है. इसके अलावा, ईवीएस दवा वितरण वाहनों के रूप में उदाहरण के लिए या पुनर्योजी दवा के रूप में, चिकित्सीय एजेंट के रूप में संभावित है. क्योंकि उनके छोटे आकार (50 करने के लिए 1000 एनएम) की सटीक मात्रा का ठहराव और ईवीएस के आकार की रूपरेखा तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है.
इस प्रोटोकॉल qNano प्रणाली का उपयोग कर, कैसे ट्यून करने योग्य प्रतिरोधक पल्स संवेदन (टीआरपी) तकनीक का वर्णन, ईवीएस की एकाग्रता और आकार निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक नैनो आकार ताकना के माध्यम से अपने स्थानांतरण पर ईवीएस का पता लगाने पर निर्भर करता है, जो विधि,,, अपेक्षाकृत तेज है छोटा सा नमूना संस्करणों का उपयोग suffices और पुर की आवश्यकता नहीं हैification और ईवीएस की एकाग्रता. एक वैकल्पिक दृष्टिकोण का उपयोग वर्णित है नियमित संचालन प्रोटोकॉल को अगले नमूने ज्ञात आकार और एकाग्रता की polystyrene मोती के साथ नुकीला. जैविक तरल पदार्थ में सीधे ईवीएस मापने जब अंशांकन तकनीक तकनीकी बाधाओं को पार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है यह वास्तविक समय का सामना करना पड़ा.
Introduction
सेलुलर मूल से vesicles शारीरिक तरल पदार्थ 1 में अत्यधिक प्रचुर मात्रा में हैं. ये तथाकथित कोशिकी पुटिकाओं (ईवीएस) (50 - आकार में 1000 एनएम) सेलुलर झिल्ली के साथ बहु vesicular निकायों के दोनों संलयन द्वारा या सेलुलर झिल्ली के प्रत्यक्ष जावक नवोदित द्वारा गठित कर रहे हैं. हाल के वर्षों में, ईवीएस में वैज्ञानिक ब्याज काफी नए कार्य और ईवीएस की विशेषताओं 1 वर्णित हैं जिसमें EV केंद्रित प्रकाशनों की अधिकता, जिसके परिणामस्वरूप में वृद्धि हुई है. ईवीएस अब ऐसे संकेत पारगमन, प्रतिरक्षा विनियमन, और रक्त जमावट 1-4 के रूप में शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं की एक व्यापक सरणी में शामिल होना माना जाता है. कैंसर में, ईवीएस premetastatic आलों 5,6, angiogenesis 8 के समर्थक कैंसर सामग्री 7,8 के हस्तांतरण और उत्तेजना के गठन में एक भूमिका निभाने के लिए लग रहे हैं. इस के अलावा, ईवीएस चिकित्सीय एजेंट 9 के वितरण एजेंट के रूप में पता लगाया है.
इन डे के बावजूदvelopments, ईवीएस के विश्वसनीय मात्रा का ठहराव चुनौती बनी हुई है. परंपरागत रूप से, अप्रत्यक्ष मात्रा का ठहराव तरीकों कुल प्रोटीन सामग्री या विशिष्ट प्रोटीन की मात्रा का ठहराव पर भरोसा करते हैं, जो उपयोग किया जाता है. मोटे तौर पर प्रयोग किया जाता है, इन तकनीकों प्रोटीन प्रति ईवी मतभेद के लिए खाते में नहीं है, और ईवीएस में प्रोटीन समुच्चय और प्रोटीन contaminating के बीच भेदभाव नहीं करते. इसके अलावा, इन तकनीकों के कई मामलों में जैविक नमूने में ईवी सांद्रता की तुलना असंभव बना देता है जो ईवीएस के अलगाव की आवश्यकता होती है.
इसलिए, प्रयासों और अधिक सटीक और प्रत्यक्ष ईवी माप 10 के लिए अनुमति देते हैं कि उपन्यास तरीकों को विकसित करने के लिए किए जाते हैं. यह रिपोर्ट विश्वसनीय मात्रा का ठहराव और ईवीएस के आकार की रूपरेखा के लिए ट्यून करने योग्य प्रतिरोधक पल्स संवेदन (टीआरपी) के उपयोग का वर्णन करता है.
वर्तमान में, qNano साधन (चित्रा 1 ए) टीआरपी के लिए केवल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मंच है. टीआरपी में, एक गैर प्रवाहकीय लोचदार झिल्ली वाई punctuatedएक नैनो आकार ताकना वें दो तरल पदार्थ कोशिकाओं को अलग किया जाता है. अन्य सेल कण मुक्त इलेक्ट्रोलाइट से भर जाता है, जबकि तरल पदार्थ कोशिकाओं में से एक, ब्याज का नमूना से भर जाता है. एक वोल्टेज लागू करके, एक आयनिक प्रवाह / विद्युत प्रवाह ताकना के माध्यम से कणों के स्थानांतरण पर बदल जाता है, जो (चित्रा 1 बी) की स्थापना की है. इस वर्तमान नाकाबंदी ('प्रतिरोधक पल्स') का परिमाण कण 11 (चित्रा -1 सी) की मात्रा के लिए आनुपातिक है. नाकाबंदी अवधि में इस तरह के आरोप या 12 आकार के रूप में कण विशेषताओं पर निर्भर करता है जो कणों की जीटा संभावित, का आकलन किया जा सकता है. अज्ञात कणों के आकार की रूपरेखा एक ज्ञात व्यास के साथ अंशांकन कणों की वजह से प्रतिरोधक दालों के साथ अज्ञात कणों की वजह से प्रतिरोधक दालों की तुलना द्वारा किया जा सकता है. एक नाकाबंदी घटना की भयावहता इसके अलावा, इन होती है जो की दर को मापा जाता है. इस गणना दर धर्मकण एकाग्रता पर तों. एकाग्रता और blockades की दर ज्ञात एकाग्रता और कण आकार के कणों के साथ एक एकल अंशांकन नमूना का उपयोग, रैखिक 13 आनुपातिक चूंकि एकाग्रता 14 और एक अज्ञात नमूना के आकार के वितरण 11 की माप के लिए अनुमति देता है.
nanopore के माध्यम से कणों के आंदोलन इलेक्ट्रो kinetic- (electrophoretic और विद्युत आसमाटिक) और fluidic बलों 15 से निर्धारित होता है. चर दबाव मॉड्यूल (VPM) तरल पदार्थ कोशिकाओं के बीच एक अंतर दबाव का उपयोग करके एक अतिरिक्त बल के रूप में प्रेरित किया जा सकता है. सकारात्मक दबाव लागू कण एकाग्रता कम होने पर लाभ हो सकता है जो कणों के प्रवाह की दर बढ़ जाती है. इसके अलावा, दबाव विद्युत गतिज ताकतों के प्रभाव को कम करने के लिए लागू किया जा सकता है. एक रिश्तेदार छोटे ताकना व्यास के साथ nanopores का उपयोग करते समय यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है (NP100, संभवतः NP150 और NP200) के रूप में अक्सर ईवीएस का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया.इन nanopores के लिए, महत्वपूर्ण दबाव लागू करने, तब भी जब विद्युत गतिज बलों, कण सतह आरोप के आधार पर, 16 nonnegligible रह सकते हैं. कई दबाव में कण दर को मापने के द्वारा, एक विद्युत kinetically सही, और इस प्रकार अधिक सटीक, ईवी एकाग्रता की गणना की जा सकती है.
इधर, विस्तृत प्रोटोकॉल ईवीएस के आकार के वितरण और एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए प्रदान की जाती हैं. नमूने ज्ञात आकार और एकाग्रता की 17 polystyrene मोती के साथ नुकीला कर रहे हैं जहां नियमित संचालन प्रोटोकॉल के आगे, एक वैकल्पिक दृष्टिकोण वर्णन किया गया है. यह वास्तविक समय अंशांकन तकनीक ऐसी मूत्र, प्लाज्मा और सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला, या के रूप में जैविक तरल पदार्थ, में सीधे ईवीएस मापने जब तकनीकी चुनौतियों में से कुछ का सामना करना पड़ा पर काबू पाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता माप समय की एक लंबी अवधि में nanopore की स्थिरता नहीं हो सकता जब यह सुनिश्चित किया.
Protocol
1 मानक संचालन प्रोटोकॉल
1.1 साधन सेटअप और नमूना तैयार
- स्थापित Izon नियंत्रण सुइट सॉफ्टवेयर के साथ एक कंप्यूटर के लिए साधन कनेक्ट करें.
- - या NP200 (लक्ष्य आकार सीमा 100 - 400 एनएम) सबसे अधिक बार उपयोग किया जाता है एक NP150 (300 एनएम लक्ष्य आकार रेंज 85) ईवीएस के आकार और एकाग्रता माप के लिए: उपयोग करने के लिए nanopore आकार चुनें. एक 220 एनएम फिल्टर के माध्यम से नमूना गुजर द्वारा उदाहरण के लिए बड़ा ईवीएस को हटाने, शामिल है कि एक प्रोटोकॉल का उपयोग कर अलग कर दिया गया है कि ईवीएस के साथ काम करते हैं, एक NP100 ताकना (लक्ष्य आकार सीमा 70-200 एनएम) का इस्तेमाल किया जा सकता है. एक जैविक नमूने में ईवीएस या एक अलग प्रोटोकॉल का उपयोग कर अलग ईवीएस के साथ काम करना यह कम अक्सर रुकावट पैदा हो जाएगा, जैसा कि NP200, इस्तेमाल किया जा सकता है. या NP400 (लक्ष्य आकार रेंज 200-800 एनएम) - जैसे NP300 (600 एनएम लक्ष्य आकार सीमा 150) के रूप में अन्य nanopores, या भी बड़ा nanopores, ईवीएस का बड़ा प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- Polystyrene calibr चुनेंकदम 1.1.2 में चयनित nanopore पूरक है कि व्यावहारिक कणों. एक NP100 के लिए, NP150 और NP200 nanopore क्रमशः CPC100, CP100 और CPC200 कणों का उपयोग करें. सटीक आकार आकलन के लिए, अंशांकन कणों अज्ञात कणों के रूप में एक समान आकार है कि यह सुनिश्चित करें.
- अंशांकन कणों की एकरूपता, भंवर संक्षिप्त (30 सेकंड) सुनिश्चित करने के लिए. वैकल्पिक रूप से, समुच्चय को दूर करने के sonication के लागू होते हैं.
- कम से कम 40 μl की एक मात्रा में लक्ष्य एकाग्रता पीबीएस में अंशांकन कणों पतला. नोट: लक्ष्य एकाग्रता कदम 1.1.2 में चयनित nanopore के आधार पर भिन्न होता है. लक्ष्य सांद्रता nanopores के साथ आपूर्ति की जाती है.
- लागू करें और सीधे कम तरल पदार्थ सेल पर पीबीएस के 78 μl हटाने; nanopore स्थिति में है जब निचले द्रव सेल के लिए एक इलेक्ट्रोलाइट आवेदन करते समय कम द्रव सेल के इस गीला nanopore के तहत हवा बुलबुला गठन के जोखिम को कम करता है.
- साधन के 4 बाहों पर nanopore रखें. उपयोगडिजिटल नली का व्यास दो विपरीत भुजाओं के बीच की दूरी को मापने और "खिंचाव" इनपुट क्षेत्र में मिमी में दूरी भर nanopore खिंचाव जांच करने के लिए "खिंचाव जांचना" पर क्लिक करें.
- कम द्रव सेल के लिए 78 μl पीबीएस reapplying से पहले, साधन के दूसरे हथियारों के बीच दूरी बढ़ती जा रही है, इस प्रकार पक्ष पहिया बदल रहे हैं और से, 47 मिमी nanopore खींचो.
नोट: बिजली के हस्तक्षेप काफी माप की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं. Izon नियंत्रण सुइट सॉफ्टवेयर को चलाने के लिए एक लैपटॉप का प्रयोग करते समय, लैपटॉप एक उड़ान सॉकेट और प्लग का उपयोग कर बिजली ग्रिड से जुड़ा है सुनिश्चित करें. मोबाइल फोन भी बिजली के हस्तक्षेप का एक स्रोत हो सकता है करीब साधन करने के लिए रखा. बिजली के हस्तक्षेप अक्सर जड़ के साथ वर्ग (आरएमएस) शोर> 10 पीए मतलब, आधारभूत वर्तमान में लगातार दोहराया चोटियों के रूप में मनाया जाता है.
नोट: लगभग किसी भी बफर टीआरपी characteri के लिए अंशांकन कणों और ईवीएस को कमजोर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैzation. लवण की उपस्थिति एक विद्युत प्रवाह की स्थापना के लिए एक शर्त है. ईवी मापन के लिए एक बफर के रूप में पीबीएस का उपयोग करें. ईवीएस सटीक माप सुनिश्चित करने के रूप में अंशांकन कणों हमेशा एक ही बफर में पतला होना चाहिए.
1.2. मापन के लिए इष्टतम सेटिंग्स निर्धारित
नोट: रिकॉर्डिंग से पहले, यह इष्टतम माप सेटिंग्स स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है. nanopore से गुजर एक कण की वजह से नाकाबंदी परिमाण लागू खिंचाव और लागू वोल्टेज पर निर्भर है. विश्वसनीय माप के लिए आरएमएस शोर होना चाहिए 0.1 ना <10 पीए और मोड नाकाबंदी परिमाण होना चाहिए>.
- Nanopore पर ऊपरी द्रव सेल और परिरक्षण पिंजरे प्लेस और ऊपरी द्रव सेल में पतला अंशांकन कणों के 40 μl परिचय. ≥0.8 kPa सकारात्मक दबाव लागू करने के लिए VPM का प्रयोग करें.
- अंशांकन की वजह से नाकाबंदी की घटनाओं का विश्लेषण whilst 44 मिमी की ओर धीरे धीरे लागू खिंचाव में कमीकणों. Nanopore के माध्यम से ताकना व्यास कणों के आंदोलन को कम करते हैं की संभावना कम होगी और इस प्रकार कण दर में कमी होगी: ध्यान दें. हालांकि, की वजह ताकना की वृद्धि की रिश्तेदार नाकाबंदी करने के लिए एक बड़ा नाकाबंदी घटना सुधार संकेत करने वाली शोर अनुपात में जिसके परिणामस्वरूप घटित होगा. वोल्टेज बढ़ आगे नाकाबंदी परिमाण में वृद्धि हो सकती है लेकिन यह भी आरएमएस शोर बढ़ा सकते हैं.
- उचित नाकाबंदी की घटनाओं (चित्रा -1 सी) "सिग्नल ट्रेस" पैनल में मनाया जाता है जब तक खिंचाव कम करें. (मोड> 0.1 एनए) और इसी कण दर> 100 / मिनट है. नोट: कण दर कम से कम 500 कणों की माप आदर्श होते हैं तथापि के रूप में, एक कम सख्त कट ऑफ है, <100 / मिनट के कण दरों में कम से कम 5 मिनट के durations रिकॉर्डिंग कारण होगा. (नमूना कमजोर पड़ने प्रदर्शन किया जाना चाहिए अगर वर्तमान) 2,000 / मिनट से अधिक कण दरें कम सटीक माप में परिणाम कर सकते हैं.
अंशांकन के 1.3 मापनकण, uper द्रव सेल और नमूना मापन की धुलाई
- Glioblastoma मल्टीफार्मी सेल लाइन U87 एमजी / EGFRvIII के सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला से इस खंड ईवीएस में विशेषता है. इन ईवीएस के अलगाव और तैयारी पहले से वर्णित है और 18 से कल्पना की गई है.
- ऊपरी द्रव सेल में अंशांकन कणों रखें. (उदाहरण 0.8 kPa के लिए) दबाव VPM और रिकॉर्ड> 500 कणों का उपयोग कर लागू करें.
- एक बहु दबाव माप प्रदर्शन करते हैं, तो (1.0 kPa के लिए उदाहरण के लिए) लागू दबाव बढ़ाने के लिए और एक दूसरे अंशांकन फ़ाइल रिकॉर्ड है. नोट: 0.2 kPa अंतर का एक न्यूनतम आवश्यकता है.
- ऊपरी द्रव सेल से अंशांकन नमूना निकालें. अवशिष्ट कणों को दूर करने के लिए ऊपरी द्रव सेल 100 μl पीबीएस के साथ 3 बार धोएं. ऊपरी द्रव सेल में नमूना की शुरूआत से पहले, ऊपरी द्रव सेल से किसी भी अवशिष्ट पीबीएस दूर करने के लिए एक प्रकार का वृक्ष मुक्त ऊतक का उपयोग करें.
- ऊपरी द्रव सेल के लिए नमूना परिचय. आधारभूत वर्तमान अंशांकन कणों को मापने जब मनाया आधारभूत वर्तमान में 3% के भीतर है सुनिश्चित करें. नहीं 3% के भीतर हैं, आधारभूत वर्तमान स्थिर करने के लिए नीचे वर्णित रणनीति लागू होते हैं. अंशांकन कणों को लागू के रूप में सटीक दबाव लागू करें और नमूना फाइलें रिकॉर्ड.
नोट: कण दर साजिश निरंतर कण का पता लगाने (चित्रा 2A) प्रदर्शित करना चाहिए. कण का पता लगाने, आधारभूत वर्तमान में अचानक गिरावट, या आरएमएस शोर में अचानक वृद्धि के अचानक रुकावट के मामले में, ताकना भरा जा सकता है; इस प्रकार, रिकॉर्डिंग रोकें. आधारभूत, नल बहाल या परिरक्षण टोपी मोड़, सवार लागू होते हैं, या पूरी तरह से nanopore हटाने और विआयनीकृत पानी से धो लें और साधन पर इसे बदलने के लिए आदेश में.
नोट: वैकल्पिक रूप से, लगभग 5 मिनट के लिए VPM से अधिकतम दबाव के साथ संयोजन में 47 मिमी nanopore खिंचाव वृद्धि हुई है.
1.4 डेटा विश्लेषण
- पर क्लिक करें "; सॉफ्टवेयर का विश्लेषण अनुभाग में प्रवेश करने के लिए डाटा "टैब का विश्लेषण करें. "Unprocessed फ़ाइलें" और चयन "प्रक्रिया फ़ाइलें" सही क्लिक करके अंशांकन और नमूना फ़ाइलों की प्रक्रिया.
- अंशांकन रिकॉर्डिंग करने के लिए कुछ करने के लिए "calibrated" कॉलम में नमूने के अगले नमूना फ़ाइलों चेकबॉक्स क्लिक करें. इसी नमूना और अंशांकन फ़ाइलों का चयन करें और "ठीक" पर क्लिक करें. नोट: बहु दबाव अंशांकन विकल्प कई अंशांकन फाइल करने के लिए जोड़े को कई नमूने के लिए छोड़ दिया पर "मल्टी दबाव अंशांकन" टैब का चयन का उपयोग करते समय.
- एक बार सफलतापूर्वक युग्मित, Izon नियंत्रण सुइट सॉफ्टवेयर इस तरह के एक आकार वितरण के रूप में अलग नमूना विशेषताओं (चित्रा 2B) प्रदर्शित करेगा, आधारभूत अवधियों, पूर्ण चौड़ाई आधा अधिकतम (FWHM) और एक एकाग्रता विश्लेषण. वैकल्पिक: एक अल्पविराम फाइल अलग कर के रूप में प्रत्येक नमूना के लिए, व्यक्तिगत डेटा बिंदुओं का निर्यात किया जा सकता है.
2.एकlternative प्रोटोकॉल - अंशांकन मोतियों के साथ नमूने spiking
नोट: पृथक ईवीएस के साथ काम कर रहा है जब सामान्य में, मानक संचालन प्रक्रिया का इस्तेमाल किया जा सकता है. जैविक नमूने, या बड़े प्रोटीन समुच्चय के साथ दूषित पृथक ईवी तैयारी में गैर पृथक ईवीएस, के साथ काम करना साधन ऑपरेटिंग चुनौतीपूर्ण हो सकता है. इन चुनौतियों मुख्य रूप से nanopore अवरुद्ध (आधारभूत वर्तमान में अचानक गिरावट), अंशांकन माप या समान नमूने (चित्रा 3 ए) के बीच कण दरों में काफी अंतर के 3% के भीतर आधारभूत धाराओं को ठीक करने में असमर्थता की एक उच्च दर से मिलकर बनता है. ईवीएस यों इन कठिनाइयों एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल प्रदर्शित नमूने के लिए 17 विकसित किया गया था. इस पद्धति ब्याज (चित्रा 3 बी) के नमूने में बड़ा polystyrene अंशांकन मोतियों की शुरूआत पर निर्भर करता है. इस विकल्प के प्रोटोकॉल के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया नीचे चर्चा की है.
2.1. उदाहरणार्थतैयारी
नोट: वैकल्पिक पद्धति का उपयोग कर नमूने की तैयारी करते हैं, तो यह आसपास भी 1 के एक EV करने वाली मनका अनुपात की स्थापना के लिए वांछित है, इसके बारे में सटीक 'gating' के लिए अनुमति देने के लिए, नमूना एक 'केवल अंशांकन मनका' शामिल करने के लिए आवश्यक है अंशांकन माला और बफर में मौजूद है (उदाहरण के प्रोटीन समुच्चय के लिए) पृष्ठभूमि कणों की संख्या निर्धारित करने के लिए.
- 300 XG पर 7 मिनट के लिए सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला की अपकेंद्रित्र 100 μl
- पीबीएस के 20 μl और 75 बार के 10 μl के लिए सतह पर तैरनेवाला के 20 μl जोड़ें 335 एनएम polystyrene मोती (शेयर 7e10 / एमएल) पतला.
2.2. उदाहरणार्थ मापन
- इष्टतम साधन सेटिंग्स निर्धारित करने के लिए खंड 1.2 में वर्णित रणनीति का प्रयोग करें.
- नमूना पहले 'केवल अंशांकन मनका' उपाय. छोटे गैर मनका कणों की पृष्ठभूमि का पता लगाने के लिए जितना संभव हो कम है कि यह सुनिश्चित करें (<मोती का 10%).
- प्रत्येक व्यक्ति सा उपायmple एक बार रिकॉर्डिंग समान रूप से विभिन्न नमूने से अधिक nanopore स्थितियों में अस्थिरता वितरित करने के क्रम में replicates से पहले. प्रत्येक नमूने की कम से कम 3 replicates उपाय.
- सभी नमूनों की रिकॉर्डिंग खत्म करने के बाद 'अंशांकन मनका केवल' नमूना Remeasure.
2.3. डेटा विश्लेषण
नोट: वैकल्पिक प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय, Izon नियंत्रण सुइट सॉफ्टवेयर के अनन्य उपयोग एकाग्रता गणना के लिए पर्याप्त नहीं है. अतिरिक्त स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर की आवश्यकता है. तालिका 1 में 3 चित्र में दर्शाया नमूनों की एकाग्रता गणना का एक उदाहरण इंगित करता है.
- 'अंशांकन मनका केवल' नमूना और एक या एक से अधिक नमूना फ़ाइलें खोलें.
- ईवीएस और polystyrene मोतियों के बीच अंतर के लिए एक कट ऑफ के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है (ना में) जो नाकाबंदी घटना आकार का निर्धारण. Polystyrene मोती आबादी के बाईं आधार को इसी नाकाबंदी मूल्य (एनए) (निर्धारण
- नमूने के "कण विश्लेषण सारांश" टैब पर क्लिक करके प्रत्येक नमूने के लिए कुल कण गिनती के मूल्यों को पुनः प्राप्त.
- कदम 2.3.2 में निर्धारित कट ऑफ स्तर का उपयोग कर डेटा सेट फिल्टर. "डेटा छनन" पॉप अप का चयन करके. दिखाना ही कट ऑफ से छोटे कण.
- "कण विश्लेषण सारांश" से प्रत्येक नमूने के लिए EV गणना के मूल्यों को पुनः प्राप्त.
- अंशांकन मोतियों की राशि निर्धारित करने के लिए कुल कणों से ईवीएस की मात्रा घटाना.
- अंशांकन मनका गणना द्वारा EV गिनती विभाजित करके ईवी करने वाली मनका अनुपात निर्धारित करते हैं.
- प्रत्येक और के लिए निर्धारित अनुपात औसत से औसत पृष्ठभूमि अनुपात का निर्धारण# 8220; केवल "अंशांकन नमूना मनका. प्रत्येक व्यक्ति के नमूने से इस मूल्य घटाना.
- प्रत्येक नमूने के लिए ईवीएस की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए अंशांकन मोतियों की एकाग्रता द्वारा समायोजित ईवी करने वाली मनका अनुपात गुणा.
- ईवी नमूना अंशांकन मोतियों के अलावा द्वारा शुरू की ईवी कमजोर पड़ने कारक द्वारा कदम 2.3.9 में पाया एकाग्रता गुणा. नोट: उदाहरण नमूना सेटअप में, पीबीएस और अंशांकन मोती में नमूना की कुल कमजोर पड़ने 2.5 गुना है और इस तरह कदम 2.3.9 में पाया एकाग्रता कच्चे ईवी नमूना एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए 2.5 से गुणा किया जाना चाहिए है.
- इस तरह औसत, मानक विचलन और प्रतिकृति के प्रत्येक समूह के लिए मतलब की मानक त्रुटि के रूप में आंकड़ों की गणना.
नोट: कुछ मामलों में देखा गया है ईवीएस और नुकीला polystyrene मोती के बीच ओवरलैप. ईवी एकाग्रता के मूल्यवान समझना के लिए सुधार की आवश्यकता है, नुकीला polystyrene मोती बिना नमूने भी मापा जाना चाहिए. एक ही कटौती का प्रयोग करेंएक "मनका करने वाली ईवी" अनुपात निर्धारित करने के लिए कदम 2.3.2 में निर्धारित रूप में बंद, नुकीला polystyrene मोती की श्रेणी में आते हैं कि ईवीएस के अनुपात की गणना. इस मनका करने वाली ईवी अनुपात कदम 2.3.8 में निर्धारित ईवी करने वाली मनका अनुपात में जोड़ा जाना चाहिए.
2.4. वैकल्पिक: वैकल्पिक पद्धति का उपयोग EV आकार के वितरण.
- नियंत्रण सुइट सॉफ्टवेयर में दो बार एक नमूना रिकॉर्डिंग खोलें.
- ऊपर निर्धारित कट ऑफ से भी बड़ा ही प्रदर्शन कणों को नमूनों में से एक का फिल्टर विकल्प सेट करें. इस अंशांकन कणों ही प्रदर्शित करेगा.
- "अंशांकन फ़ाइल" के लिए फ़िल्टर नमूना सेट और अंशांकन मोतियों की विधा आकार दर्ज करें.
- युगल नमूना फाइल और 1.4.2 में वर्णित के रूप में कदम 2.4.3 में बनाया "अंशांकन फ़ाइल". नमूना फाइल अब नुकीला अंशांकन मोती पर आधारित ईवीएस और अंशांकन मोती दोनों के आकार के वितरण को प्रदर्शित करेगा.
नोट: मानक ओपेराting प्रोटोकॉल सबसे अक्सर ईवीएस के आकार के वितरण के निर्धारण के लिए पर्याप्त होगा. कभी कभी हालांकि, सटीक बफर घटकों यह असंभव ब्याज की ईवीएस के रूप में ही बफर में अंशांकन मोतियों का एक नमूना तैयार करने के लिए जो बनाता है (प्लाज्मा या मूत्र में उदाहरण के लिए) अज्ञात हैं. अंशांकन कणों के साथ नुकीला एक EV नमूना इन विशेष परिस्थितियों में ईवी आकार के आकलन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Representative Results
टीआरपी साधन का उपयोग करने के लिए, एक गैर प्रवाहकीय nanopore मशीन (चित्रा 1 ए) के 4 हथियारों पर रख दिया गया है और एक वोल्टेज (चित्रा 1 बी) लागू हो गया है. एक बिजली के आधारभूत वर्तमान स्थापित हो जाने के बाद चित्रा 1C में सचित्र के रूप में, ताकना से गुजर कणों की वजह से प्रतिरोधक दालों पता लगाया जाएगा.
ईवीएस ultracentrifugation द्वारा ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइन U87 एमजी / EGFRvIII के सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला से शुद्ध किया गया. एक NP100 nanopore पर पृथक ईवीएस (चित्रा 2A) को मापने जब एक स्थिर कण दर साजिश मनाया जाता है. यह स्थिर कण दर भूखंड एक विश्वसनीय ईवी एकाग्रता माप के लिए आवश्यक है. 115 एनएम polystyrene अंशांकन मोती, एक आकार वितरण (चित्रा 2B) और ईवी नमूना की एकाग्रता अनुमान की रिकॉर्डिंग के लिए EV-नमूना रिकॉर्डिंग बाँधना बाद (नहीं दिखाया डेटा) प्राप्त किया जा सकता है.
(Figrue 3 ए) में रुकावट और / या उतार चढ़ाव में यह परिणाम है. यह गलत ईवी एकाग्रता अनुमानों में यह परिणाम है. ज्ञात एकाग्रता और आकार की polystyrene मोतियों के साथ नमूना spiking करके, एक EV करने वाली मनका अनुपात निर्धारित किया जा सकता है. चित्रा 3b आकार में 335 एनएम polystyrene मोतियों के साथ सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला spiking के बाद प्राप्त परिणाम दिखाता है. दो स्पष्ट आबादी मनाया जाता है. कम तो 0.46 एनए के एक नाकाबंदी उत्प्रेरण कणों बड़े कणों polystyrene मोती निर्धारित कर रहे हैं, निर्धारित ईवीएस हैं. polystyrene मोती को ईवीएस के अनुपात ईवीएस (1 टेबल) के कच्चे एकाग्रता की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. -3 सी नुकीला polystyrene मोती के आधार पर दो आबादी के आकार के आकलन दिखाता चित्रा. nanopore सेटअप फिर से इस्तेमाल कियाआकार में ईवीएस> 140 एनएम का पता लगाने में sulted. इस nanopore खोलने को कम से कम किया जा सकता है, लेकिन यह भी अधिक clogging घटनाओं में परिणाम होगा.
चित्रा 1: qNano साधन और आपरेशन के मोड. साधन (ए) तस्वीर. एक nanopore एक ऊपरी द्रव सेल से एक कम तरल पदार्थ कोशिका को अलग करने, उपकरण पर तैनात है. तरल पदार्थ कोशिकाओं परिरक्षण टोपी से पर्यावरण बिजली के हस्तक्षेप से रक्षा कर रहे हैं. (बी) के चित्रण ट्यून करने योग्य प्रतिरोधक पल्स संवेदन (टीआरपी) की रूपरेखा. एक गैर प्रवाहकीय लोचदार nanopore दो तरल पदार्थ कोशिकाओं को अलग किया जाता है. एक वोल्टेज लागू करके एक विद्युत प्रवाह nanopore में पंचर ताकना के माध्यम से स्थापित किया गया है. बाह्य पुटिकाओं nanopore के माध्यम से कदम के रूप में, आयनिक प्रवाह बदल दिया और एक प्रतिरोधक नाड़ी के रूप में पाया जाता है. टीआरपी में nanopore के उद्घाटन के आकार साधन के दूसरे हथियारों के बीच दूरी बढ़ रही है, या इस दूरी को कम करने से nanopore खींच द्वारा (कम या बढ़ा) देखते जा सकते हैं. (सी) प्रतिरोधक दालों की व्याख्यात्मक उदाहरण. एक भी प्रतिरोधक नाड़ी की भयावहता कण की मात्रा के लिए आनुपातिक है. बड़ा दालों बड़े कणों से संकेत मिलता है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2: कण गिनती साजिश और U87 एमजी / EGFRvIII सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला से पृथक ईवीएस को मापने से प्राप्त आकार वितरण समग्र निरंतर कण का पता लगाने का संकेत (ए) कण गिनती साजिश है.. खास का संक्षिप्त कमीLe रिकॉर्डिंग का पता लगाने के लिए 80 और 100 सेकंड के बीच मनाया गया. परिरक्षण टोपी रिकॉर्डिंग रोक और दोहन के बाद, कण दर जिसके बाद रिकॉर्डिंग फिर से शुरू किया गया था स्थिर हो. (बी) पृथक ईवीएस के आकार के वितरण 115 एनएम polystyrene अंशांकन मोती अज्ञात नमूना (ईवीएस) औजार के बाद साजिश रची है. (5 एनएम बिन आकार). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3: वैकल्पिक प्रोटोकॉल का उपयोग सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला में ईवीएस की टीआरपी मात्रा का ठहराव. एक जैविक तरल पदार्थ में सीधे ईवीएस मापने जब प्राप्त (ए) विशिष्ट कण दर भूखंडों. पोर clogging कण का पता लगाने की दर में संक्षिप्त रुकावट और उतार चढ़ाव का कारण बनता है. प्रत्येकभूखंड एक ही नमूने के एक दोहराने के माप का प्रतिनिधित्व करता है. 335 एनएम polystyrene अंशांकन मोतियों के साथ सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला spiking के बाद प्राप्त (बी) के तीन दोहराने के आकार वितरण रेखांकन. कम से कम 0.46 एनए के एक प्रतिरोधक नाड़ी उत्प्रेरण सभी कणों ईवीएस के रूप में चुने गए हैं. (सी) नुकीला polystyrene मोती नमूना के आकार वितरण प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. (5 एनएम बिन आकार). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
| मापन | अंशांकन केवल # 1 | अंशांकन केवल # 2 | सतह पर तैरनेवाला # 1 | सतह पर तैरनेवाला # 2 | सतह पर तैरनेवाला # 3 |
| औसत वर्तमान (एनए) | 117 | 120 | <टीडी> 116118 | 120 | |
| कण दर | 172 | 194 | 250 | 246 | 196 |
| इस्तेमाल किया कटौती (एनए) | 0.46 | 0.46 | 0.46 | 0.46 | 0.46 |
| कुल कणों | 303 | 317 | 489 | 488 | 454 |
| कोशिकी पुटिकाओं | 3 | 1 | 213 | 215 | 213 |
| नुकीला अंशांकन मोती | 300 | 316 | 276 | 273 | 241 |
| ईवीएस / अंशांकन मोती | 0.01 | 0.003 | 0.772 | 0.788 | 0.884 |
| उदाहरणार्थ - पृष्ठभूमि | 0.765 | 0.781 | 0.877 | ||
| Extracelullar पुटिकाओं (10 7) / मिलीलीटर | 7.14 | 7.29 | 8.18 | ||
| उदाहरणार्थ 2.5x पतला | |||||
| कच्चे एकाग्रता ईवीएस (10) 7 / मिलीलीटर | 17.85 | 18.22 | 20.46 |
तालिका 1:. वैकल्पिक प्रोटोकॉल का उपयोग EV एकाग्रता का उदाहरण गणना एक कट ऑफ मूल्य अंशांकन मोतियों से ईवीएस भेद करने के लिए निर्धारित किया जाता है. इसके बाद, ईवीएस और मोतियों की कुल संख्या लिया जा सकता है. प्रत्येक माप के लिए EV करने वाली मनका अनुपात की गणना है. (उदाहरण प्रोटीन समुच्चय के लिए) इलेक्ट्रोलाइट में पृष्ठभूमि कणों की मात्रा 'अंशांकन मोती केवल' नमूने की व्यक्तिगत मापन के लिए EV करने वाली मनका अनुपात औसत से गणना की है. प्रत्येक नमूना के लिए पृष्ठभूमि अनुपात प्राप्त अनुपात से घटाया जाता है. इस adjusteडी अनुपात (: 9.33e7 / एमएल इस उदाहरण में) नमूने में अंशांकन मोतियों की एकाग्रता से गुणा किया जाता है. ईवीएस कच्चा एकाग्रता का निर्धारण करने, प्राप्त एकाग्रता (2.5 इस उदाहरण में) कुल ईवीएस कमजोर पड़ने कारक से गुणा किया जाता है.
Discussion
मात्रा का ठहराव और टीआरपी का उपयोग ईवीएस के आकार के लक्षण वर्णन के लिए इस पांडुलिपि के प्रस्ताव के तरीके में वर्णित प्रोटोकॉल. टीआरपी मंच का प्रमुख लाभ छोटा सा नमूना आकार, सापेक्ष कम माप अवधि और आवश्यक नमूना हेरफेर के अभाव हैं.
सटीक टीआरपी मापन के लिए शर्त अंशांकन और नमूना माप के बीच समान शर्तों रखने के लिए है. यह समान buffers के उपयोग के साथ ही इस तरह के nanopore आकार, वोल्टेज और लागू दबाव के रूप में समान साधन सेटिंग्स, शामिल हैं. मूल VPM जिससे नमूनों के बीच लागू दबाव में मामूली अंतर के कारण लागू दबाव का सही स्थापित करने के लिए एक तंत्र का अभाव है. अलग समय बिंदुओं पर मापने इसके अलावा, जब VPM में भड़काना तरल पदार्थ का वाष्पीकरण मामूली दबाव मतभेद पैदा कर सकते हैं और VPM इसलिए अक्सर फिर से primed किया जाना चाहिए. इन सीमाओं के संभावित VPM2, के लागू होने से हल किया गया है जोएक क्लिक के आधार पर स्केलिंग है और हवा के दबाव आधारित है.
इस पांडुलिपि में वर्णित वैकल्पिक प्रोटोकॉल गैर शुद्ध जैविक नमूने 17 में ईवीएस की माप के लिए विशेष रूप से अनुकूल है. हम ऐसे शर्करा, लिपिड, प्रोटीन और कुछ मामलों में कर सकते हैं, अन्य बड़े मलबे के रूप में बफर घटकों, लागू होने के लिए मानक प्रोटोकॉल के लिए बहुत ज्यादा माप की स्थिति को प्रभावित करता है. नमूना के बजाय दो अलग माप की तुलना करने के लिए अंशांकन मोतियों के अलावा 'वास्तविक समय अंशांकन' का परिचय. अलग और / या अज्ञात fluidic पृष्ठभूमि सामग्री है कि नमूने (विभिन्न दानदाताओं की जैसे रक्त प्लाज्मा) की तुलना करते समय इस विधि विशेष रूप से उपयुक्त है. मतभेद ईवीएस और polystyrene कणों (जैसे कण घनत्व और सतह प्रभार), सैद्धांतिक मॉडल के रूप में अच्छी तरह से प्रयोगात्मक डेटा के बीच मौजूद हालांकि मात्रा का ठहराव और ईवीएस के आकार की रूपरेखा के लिए polystyrene मोती के प्रयोज्य को रेखांकित,शर्त के तहत कि महत्वपूर्ण दबाव 15,19 लागू किया जाता है. Electrokinetic ताकतों के प्रभाव को कम करने के लिए, अपेक्षाकृत बड़ा NP150 / NP200 nanopore और महत्वपूर्ण सकारात्मक दबाव के उपयोग की सलाह दी है.
ईवीएस और अंशांकन मोती आकार द्वारा प्रतिष्ठित हैं. नतीजतन, nanopore ईवीएस और बड़ा अंशांकन कणों दोनों का पता लगाने में मनाया जाता है, जहां एक व्यास, खिंचाव लगाने से खोला जाना है. ताकना के उद्घाटन के छोटे कणों के प्रति संवेदनशीलता कम हो जाएगा, केवल दर्ज कर रहे हैं एक निश्चित आकार (अक्सर ईवीएस> 120 एनएम एक 335 एनएम अंशांकन मनका का उपयोग करते समय) से बड़ा ईवीएस. ईवीएस के लिए न्यूनतम सीमा का पता लगाने के लिए एक NP150 nanopore पर 203 एनएम अंशांकन मोती का उपयोग, लगभग 90 एनएम तक की कमी की जा सकती है. बड़ा ईवीएस nanopore की लगातार clogging प्रेरित हालांकि, जब इस स्थापना अलाभकारी हो सकता है. इन निरोधक ईवीएस की उपस्थिति एक सेटअप के उपयोग के लिए मजबूर हो सकता है, जहां इसकी वजह के लिए बहुत छोटा ईवीएस की आबादी,पता लगाने सीमा CH, पता नहीं होगा.
आकार में 100 एनएम से छोटे कणों को मापने की कोशिश कर रहा है जब कठिनाई प्रणाली बढ़ जाती है संचालित करने के लिए. ऐसे मामलों में, पता लगाने इलेक्ट्रोलाइट का नमक एकाग्रता में वृद्धि से सुधार किया जा सकता है. एक बढ़ा आयन एकाग्रता छोटे कणों के लिए अपेक्षाकृत वृद्धि की नाकाबंदी परिमाण (बड़ा संकेत करने वाली शोर अनुपात) को उत्पन्न करेगा. ईवीएस की माप के लिए इस तकनीक की व्यवहार्यता वृद्धि हुई नमक सांद्रता ईवीएस की मात्रा को प्रभावित कर सकते हैं, हालांकि मान्य किया गया है.
अंत में, टीआरपी मंच प्रत्यक्ष मात्रा का ठहराव और ईवीएस के आकार के लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कोई अलगाव या EV हेरफेर (एंटीबॉडी या फ्लोरोसेंट लेबलिंग) की आवश्यकता है के बाद से, मंच जैविक तरल पदार्थ में प्रत्यक्ष ईवी मात्रा का ठहराव के लिए उपयुक्त है. एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल बफर घटक महत्वपूर्ण ताकना cloggin प्रेरित जहां नमूने के लिए फायदेमंद हो सकता है कि प्रदान की जाती हैअलाभकारी मानक प्रोटोकॉल के विश्वसनीय उपयोग कर रही जी घटनाओं,.
Disclosures
उल्लिखित प्रोटोकॉल और इस पांडुलिपि के लेखन के विकास के लिए आर्थिक रूप से डच ब्रेन फाउंडेशन, शूमाकर क्रेमर फाउंडेशन, और Bohnenn फंड से, भाग में, समर्थित किया गया है. इस वीडियो लेख के उत्पादन आंशिक रूप से Izon द्वारा sponsorted था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| qNano instrument | Izon Science Ltd. | N/A | |
| Variable pressure module | Izon Science Ltd. | N/A | |
| Nanopore | Izon Science Ltd. | NP100, NP200 | Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes. |
| Calibration Particles | Izon Science Ltd. | CPC100, CPC200, CPC400 | Calibration particles are available in different sizes. |
| Sonication bath | Multiple available | Basic sonication bath is sufficient | |
| (Mini) vortexer | Multiple available | ||
| Lift-free tissues | Multiple available | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Multiple available | ||
| Windows based computer | |||
| Izon Control Suite 2.2 | Izon Science Ltd. | N/A | |
| Spreadsheet Software | Multiple available | N/A |
References
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