Summary
Vescicole extracellulari svolgono un ruolo importante nei processi fisiologici e patologici, tra cui la coagulazione, le risposte immunitarie, e il cancro o come potenziali agenti terapeutici nella consegna di droga o medicina rigenerativa. Questo protocollo presenta metodi per la quantificazione e la dimensione caratterizzazione di isolati e non isolati vescicole extracellulari in diversi fluidi con settaggio di rilevamento di impulsi resistivo.
Abstract
Vescicole extracellulari (SVE), tra cui 'microvescicole' e 'exosomes', sono molto abbondanti nei fluidi corporei. Negli ultimi anni si è assistito ad un enorme aumento di interesse per i veicoli elettrici. Veicoli elettrici hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante in vari processi fisiologici e patologici, tra cui la coagulazione, le risposte immunitarie, e il cancro. Inoltre, i veicoli elettrici hanno un potenziale come agenti terapeutici, ad esempio come veicoli di consegna della droga o come la medicina rigenerativa. A causa delle loro piccole dimensioni (da 50 a 1000 nm) quantificazione accurata e dimensioni profilatura dei veicoli elettrici è tecnicamente impegnativo.
Questo protocollo descrive come sintonizzabile tecnologia di rilevamento di impulsi resistivo (TRP), utilizzando il sistema qNano, può essere utilizzato per determinare la concentrazione e le dimensioni dei veicoli elettrici. Il metodo, che si basa sulla rilevazione dei veicoli elettrici su loro trasferimento attraverso un poro di dimensioni nano, è relativamente veloce, è sufficiente l'uso di piccoli volumi di campione e non richiede la purificazione e la concentrazione di veicoli elettrici. Accanto al protocollo regolare funzionamento di un approccio alternativo è descritta utilizzando campioni diluiti con perle di polistirene di dimensioni note e concentrazione. Questo tempo reale tecnica di calibrazione può essere utilizzato per superare ostacoli tecnici rilevato quando si misura EVs direttamente nei fluidi biologici.
Introduction
Le vescicole di origine cellulare sono molto abbondanti nei fluidi corporei 1. Queste cosiddette vescicole extracellulari (SVE) (50 - 1.000 nm dimensioni) sono formate da una fusione di corpi multi vescicolari con la membrana cellulare o per gemmazione diretta verso l'esterno della membrana cellulare. Negli ultimi anni, l'interesse scientifico nei veicoli elettrici è notevolmente aumentato, con conseguente in una pletora di pubblicazioni EV-focalizzato, in cui nuove funzioni e le caratteristiche dei veicoli elettrici sono descritte 1. EVs sono ora crede di essere coinvolti in una vasta gamma di processi fisiologici e patologici, quali la trasduzione del segnale, regolazione immunitaria, e la coagulazione del sangue 1-4. Nel cancro, veicoli elettrici sembrano giocare un ruolo nella formazione di nicchie premetastatic 5,6, il trasferimento di contenuti pro-cancerose 7,8 e la stimolazione dell'angiogenesi 8. Oltre a questo, i veicoli elettrici sono esplorate come agenti di consegna di agenti terapeutici 9.
Nonostante questi desvi-, quantificazione affidabile di veicoli elettrici rimane impegnativo. Tradizionalmente, vengono utilizzati metodi di quantificazione indiretti, che si basano sulla quantificazione del contenuto proteico totale o proteine specifiche. Anche se usato in generale, queste tecniche non tengono conto delle differenze di proteine-per-EV, e non discriminano tra contaminare aggregati proteici e proteine in veicoli elettrici. Inoltre, queste tecniche richiedono isolamento di PA, che in molti casi rende confronto delle concentrazioni EV in campioni biologici impossibile.
Pertanto, gli sforzi sono intraprese per sviluppare nuovi metodi che permettono di misurazione più preciso e diretto EV 10. Questo rapporto descrive l'uso di rilevamento dell'impulso resistivo regolabile (TRP) per la quantificazione affidabile e dimensioni profilatura dei veicoli elettrici.
Attualmente, il qNano strumento (Figura 1a) è l'unica piattaforma disponibile in commercio per TrPs. In TrPs, una membrana elastica non conduttiva punteggiato with un poro di dimensioni nanometriche è che separa due cellule del liquido. Una delle cellule del liquido è riempito con il campione di interesse, mentre l'altra cella è riempita con elettrolita libero-particella. Applicando una tensione, si stabilisce un flusso / corrente elettrica ionica, che viene modificato in caso di trasferimento delle particelle attraverso il poro (Figura 1b). L'entità di questo blocco corrente ('impulso resistivo') è proporzionale al volume della particella 11 (figura 1c). La durata del blocco può essere utilizzato per valutare la zeta-potenziale di particelle, che si basa sulle caratteristiche delle particelle come la carica o la forma 12. Dimensioni profilatura di particelle sconosciute può essere eseguita confrontando gli impulsi resistivi causate dalle particelle sconosciute con gli impulsi resistivi causati da particelle di calibrazione con diametro noto. Oltre alla grandezza di un evento di blocco, il tasso di cui questi si verificano viene misurato. Questo tasso di conteggio relies sulla concentrazione di particelle. Poiché la concentrazione ed il tasso di blocchi sono linearmente proporzionale 13, utilizzando un unico campione di calibrazione con particelle di concentrazione nota e granulometria consente la misurazione della concentrazione di 14 e 11 distribuzione dimensionale di un campione sconosciuto.
Il movimento delle particelle attraverso il nanoporo è determinata da forze elettro kinetic- (elettroforesi e elettro-osmotica) e fluidici 15. Utilizzando il modulo di pressione variabile (VPM) una differenza di pressione tra le cellule del liquido può essere indotta da una forza aggiuntiva. L'applicazione di una pressione positiva aumenta il flusso di particelle, che possono essere di beneficio quando la concentrazione di particelle è bassa. Inoltre, la pressione può essere applicata per ridurre l'effetto delle forze elettro-cinetico. Ciò è particolarmente importante quando si utilizza nanopori con piccolo diametro dei pori relativa (NP100, NP150 e NP200 possibilmente) come spesso utilizzato per la rilevazione dei veicoli elettrici.Per questi nanopori, anche quando applicando una pressione significativa, le forze elettro-cinetica possono, a seconda della carica superficiale delle particelle, rimangono non trascurabile 16. Misurando la velocità delle particelle a molteplici pressioni, un elettro cineticamente corretto, e quindi più accurata, concentrazione EV può essere calcolato.
Qui, sono previsti protocolli dettagliati per determinare la distribuzione dimensionale e la concentrazione di veicoli elettrici. Accanto al protocollo di regolare funzionamento, un approccio alternativo è descritto in cui i campioni vengono diluiti con perle di polistirene di dimensioni note e concentrazione 17. Questa tecnica di calibrazione in tempo reale può essere utilizzata per superare alcune delle difficoltà tecniche incontrate quando si misura EVs direttamente nei fluidi biologici, quali urina, plasma e coltura cellulare surnatante, o quando la stabilità del nanoporo per un lungo periodo di tempo di misura non può essere assicurata.
Protocol
1. standard protocollo operativo
1.1 Impostazione dello strumento e la preparazione dei campioni
- Collegare lo strumento a un computer con il software Izon Control Suite installata.
- Scegliere la dimensione nanoporo da utilizzare: per le dimensioni e la concentrazione di misurazione EV un NP150 (target gamma di dimensioni 85-300 nm) o NP200 (target gamma di dimensioni 100-400 nm) sono più spesso utilizzati. Quando si lavora con EVs che sono stati isolati utilizzando un protocollo che comporta la rimozione dei veicoli elettrici più grandi, ad esempio facendo passare il campione attraverso un filtro a 220 nm, un poro NP100 (target gamma di dimensioni 70-200 nm) può essere utilizzato. Quando si lavora con veicoli elettrici in un campione biologico o veicoli elettrici isolati utilizzando un protocollo diverso, l'NP200 può essere utilizzato, in quanto sarà intasarsi meno spesso. Altri nanopori come l'NP300 (target range dimensioni 150-600 nm) o il NP400 (gamma di dimensioni di destinazione 200-800 nm), o nanopori ancora più grandi, possono essere utilizzati per grandi tipologie di veicoli elettrici.
- Scegliere il Taratura polistiroloparticelle zione che completano il nanoporo selezionata al punto 1.1.2. Per un NP100, NP150 e NP200 nanopore utilizzano il CPC100, particelle CP100 e CPC200 rispettivamente. Per la stima formato esatto, in modo che le particelle di calibrazione hanno una dimensione simile a quella delle particelle sconosciute.
- Per garantire l'omogeneità delle particelle di taratura, vortice brevemente (30 sec). Facoltativamente, si applicano sonicazione per rimuovere aggregati.
- Diluire le particelle di calibrazione in PBS alla concentrazione di destinazione in un volume di almeno 40 ml. Nota: La concentrazione target varia in base al nanoporo selezionato al punto 1.1.2. Le concentrazioni target sono forniti con i nanopori.
- Applicare e rimuovere direttamente 78 ml di PBS sulla cella fluido inferiore; questo bagnatura del fluido cella inferiore riduce il rischio di formazione di bolle d'aria sotto il nanoporo quando si applica un elettrolita alla cella fluido inferiore quando nanoporo è in posizione.
- Posizionare il nanoporo sui 4 bracci dello strumento. Usale pinze digitali per misurare la distanza tra due bracci opposti e inserire la distanza in mm nel campo di immissione "Stretch" e fare clic su "calibrare stretch" per calibrare il tratto nanoporo.
- Stretch nanoporo a 47 mm, ruotando la ruota lato e quindi aumentando la distanza tra i bracci opposti dello strumento, prima di riapplicare 78 microlitri di PBS alla cella fluido inferiore.
Nota: Le interferenze elettriche possono influenzare notevolmente la qualità delle misure. Quando si utilizza un computer portatile per eseguire il software Izon Control Suite, assicurarsi che il computer sia collegato alla rete elettrica con una presa di messa a terra e spina. I telefoni cellulari tenuti vicino allo strumento può anche essere una fonte di interferenze elettriche. Le interferenze elettriche è osservato come i picchi costantemente utilizzate nel corso di base, spesso con quadratico medio (RMS) del rumore> 10 pA.
Nota: Quasi ogni buffer può essere utilizzato per diluire le particelle di calibrazione e veicoli elettrici per TrPs caratterizzazionezione. La presenza di sali è un prerequisito per la creazione di una corrente elettrica. Per le misurazioni EV utilizzare PBS come buffer. Particelle di taratura devono essere sempre diluiti nello stesso tampone come i veicoli elettrici per garantire misure accurate.
1.2. Determinare le impostazioni ottimali per la misurazione
Nota: Prima della registrazione, è importante per stabilire le impostazioni di misura ottimali. L'entità blocco causato da una particella che passa attraverso il nanoporo dipende dal tratto applicata e la tensione applicata. Per misurazioni affidabili il rumore RMS dovrebbe essere <10 pA e la modalità di blocco grandezza deve essere> 0,1 nA.
- Posizionare la cella di liquido superiore e schermatura gabbia sul nanoporo e introdurre 40 ml di particelle di taratura diluiti nella cella liquido superiore. Utilizzare la VPM per applicare ≥0.8 kPa pressione positiva.
- Ridurre il tratto applicato lentamente verso 44 millimetri, mentre analizzando gli eventi del blocco causati dalla calibrazioneparticelle. Nota: Quando si riduce il diametro dei pori il movimento delle particelle attraverso il nanoporo sarà meno probabile e quindi il tasso di particelle diminuisce. Tuttavia, a causa della maggiore blocco relativo del poro si verifica un evento di blocco più grande con conseguente miglioramento del rapporto segnale-rumore. Aumentando la tensione può aumentare ulteriormente la grandezza blocco ma può anche aumentare il rumore RMS.
- Ridurre il tratto fino a quando gli eventi del blocco appropriate (Figura 1c) si osservano nel pannello "Signal Trace". (Mode> 0,1 nA) e il tasso di particella corrispondente è> 100 / min. Nota: Il tasso di particelle è una meno rigorosa cut-off, tuttavia, come misura di almeno 500 particelle sono ideali, i tassi di particelle di <100 / min causeranno la registrazione durata di almeno 5 minuti. Tassi di particelle superiori a 2.000 / min possono comportare misure meno accurate (se presente, diluizione del campione deve essere eseguita).
1.3 Misura di TaraturaParticelle, lavaggio della Cellula Fluid Uper e misurazione del campione
- In questa sezione EVs dal supernatante di coltura cellulare di glioblastoma multiforme linea cellulare U87-MG / EGFRvIII sono caratterizzati. L'isolamento e la preparazione di questi veicoli elettrici è stato precedentemente descritto e visualizzato 18.
- Posizionare le particelle di calibrazione nella cella liquido superiore. Applicare una pressione (per esempio 0,8 kPa) con il VPM e registrare> 500 particelle.
- Se si esegue una misurazione multi-pressione, aumentare la pressione applicata (per esempio a 1,0 kPa) e registrare un secondo file di calibrazione. Nota: Un minimo di 0,2 kPa differenza è richiesto.
- Rimuovere il campione di calibrazione dalla cella liquido superiore. Lavare la cella fluido superiore 3 volte con 100 microlitri di PBS per rimuovere le particelle residue. Prima dell'introduzione del campione nella cella di fluido superiore, utilizzare il tessuto privo di lanugine per rimuovere eventuali residui di PBS dalla cella liquido superiore.
- Introdurre il campione alla cella del fluido superiore. Assicurarsi che la corrente di base è entro il 3% della corrente di base osservata quando si misurano le particelle di calibrazione. Se non nel raggio di 3%, applicare la strategia descritta di seguito per stabilizzare la corrente di base. Applicare le pressioni esatte applicati alle particelle di taratura e registrare i file di esempio.
Nota: il tasso trama particella dovrebbe visualizzare rivelazione di particelle costante (Figura 2a). In caso di improvvisa interruzione di rivelazione di particelle, un improvviso calo della corrente di base, o un improvviso aumento del rumore RMS, il poro potrebbe essere intasato; quindi, mettere in pausa la registrazione. Al fine di ripristinare la linea di base, toccare o torcere il cappuccio schermatura, applicare lo stantuffo, o rimuovere completamente il nanoporo e lavarlo con acqua deionizzata e sostituirlo sullo strumento.
Nota: In alternativa, aumentare il tratto nanoporo a 47 mm in combinazione con la pressione massima del VPM per circa 5 min.
Analisi dei dati 1.4
- Clicca sul "; Analizza scheda Dati "per entrare nella sezione di analisi del software. Elaborare la taratura e file di esempio cliccando col tasto destro del "Lordo Files" e selezionando "Process Files".
- Fare clic sulla casella di controllo accanto al campione nella colonna "calibrata" per accoppiare i file di esempio per le registrazioni di calibrazione. Selezionare file di esempio e di taratura corrispondenti e fare clic su "OK". Nota: quando si utilizza l'opzione di calibrazione multi-pressione selezionare la scheda "Calibrazione multi-pressione" a sinistra per paio di campioni multipli per più file di calibrazione.
- Una volta accoppiato con successo, il software Izon Control Suite mostrerà diverse caratteristiche del campione, come una dimensione di distribuzione (Figura 2b), la durata di base, larghezza metà del massimo (FWHM) e una analisi di concentrazione. Facoltativamente: Per ogni campione, i singoli punti dati possono essere esportati come una virgola di file separati.
2.lternative Protocollo - Spiking Campioni con Perline di calibrazione
Nota: In generale, la procedura operativa standard può essere utilizzata quando si lavora con veicoli elettrici isolati. Quando si lavora con i veicoli elettrici non isolati in campioni biologici, o preparati isolati di EV contaminati con grandi aggregati proteici, operativo lo strumento può essere impegnativo. Queste sfide sono costituite principalmente da un elevato tasso di nanoporo blocco (improvviso calo della corrente di base), incapacità di recuperare le correnti di base entro il 3% della misura di calibrazione o differenze significative nei tassi di particelle tra campioni identici (Figura 3a). Per i campioni che mostrano queste difficoltà un protocollo alternativo per quantificare i veicoli elettrici è stato sviluppato 17. Questa metodologia si basa sull'introduzione di grandi perle di polistirene taratura nel campione di interesse (Figura 3b). Una procedura dettagliata per questo protocollo alternativo è discusso di seguito.
2.1. CampionePreparazione
Nota: Nella preparazione dei campioni utilizzando il metodo alternativo, si desidera stabilire un rapporto EV-a-tallone di circa 1 Inoltre, è essenziale includere un 'cordone calibrazione solo' di esempio, per consentire accurata 'gating' del perline di calibrazione e per determinare il numero di particelle di fondo (per esempio aggregati proteici) presenti nel buffer.
- Centrifuga 100 ml di surnatante di coltura cellulare per 7 minuti a 300 xg
- Aggiungere 20 ml di surnatante a 20 ml di PBS e 10 ml di 75 volte diluito 335 nm perle di polistirene (magazzino 7e10 / ml).
2.2. Misurazione del campione
- Utilizzare la strategia descritta nella sezione 1.2 per determinare le impostazioni ottimali dello strumento.
- Misurare il 'tallone di calibrazione solo' campione in primo luogo. Assicurarsi che il rilevamento sfondo di piccole particelle non tallone è il più basso possibile (<10% delle perline).
- Misurare ogni individuo sample volta prima registrazione replica per distribuire fluttuazione condizioni nanopori equamente tra i diversi campioni. Misurare almeno 3 repliche di ogni campione.
- Misurare ancora il 'tallone di calibrazione solo' campione dopo aver terminato la registrazione di tutti i campioni.
2.3. Analisi dei dati
Nota: Quando si utilizza il protocollo alternativo, uso esclusivo del software Izon Control Suite non è sufficiente per il calcolo della concentrazione. È richiesto software aggiuntivo foglio. Tabella 1 indica un esempio di calcolo concentrazione dei campioni rappresentati nella figura 3.
- Aprire il 'tallone di calibrazione solo' campione e uno o più file di esempio.
- Determinare quale blocco evento dimensione (in nA) può essere usato come un cut-off per la distinzione tra i veicoli elettrici e le perle di polistirene. Determinazione del valore di blocco (nA) corrispondente alla base sinistra della popolazione perle di polistirene (
- Recuperare i valori del numero totale di particelle per ogni campione facendo clic sulla scheda "Analisi Particle Sommario" del campione.
- Filtrare i set di dati utilizzando il livello di cut-off definito al punto 2.3.2. selezionando l'opzione "Filtro di dati" pop-up. Visualizza solo particelle più piccolo del cut-off.
- Recuperare i valori del numero di EV per ogni campione dalla "Analisi Particle Sommario".
- Sottrarre la quantità di veicoli elettrici dalle particelle totali per determinare la quantità di perline di calibrazione.
- Determinare il rapporto EV-a-tallone dividendo conte VE dal conte tallone calibrazione.
- Determinare il rapporto medio di sfondo facendo la media dei coefficienti determinati per ciascun &# 8220; bordare solo "campione di calibrazione. Sottrarre il valore di ogni singolo campione.
- Moltiplicare la ratio aggiustato EV-a-tallone dalla concentrazione di perline di calibrazione per determinare la concentrazione di veicoli elettrici per ogni campione.
- Moltiplicare la concentrazione riscontrata nel passo 2.3.9 per il fattore di diluizione EV introdotto con l'aggiunta di perline di calibrazione al campione EV. Nota: Nella configurazione di esempio esempio, la diluizione totale del campione in PBS e perline di calibrazione è 2,5 volte e quindi la concentrazione trovata nel punto 2.3.9 deve essere moltiplicato per 2,5 per determinare la concentrazione del campione EV crudo.
- Calcola le statistiche, come le medie, deviazione standard ed errore standard della media per ogni gruppo di replicati.
Nota: in alcuni casi sovrapporsi tra i veicoli elettrici e le perle di polistirene a spillo si osserva. Se è necessaria la correzione per la sottostima della concentrazione EV, campioni senza perle di polistirene a spillo dovrebbero essere misurati. Utilizzare lo stesso cutoff come determinato al punto 2.3.2 per determinare un rapporto di "tallone-a-EV", per calcolare il rapporto di veicoli elettrici che rientrano nella gamma delle perle di polistirene a spillo. Questo rapporto tallone a EV deve essere aggiunto al rapporto EV-a-tallone determinata nella fase 2.3.8.
2.4. Optional: EV Size Distribution con il metodo alternativo.
- Aprire una registrazione del campione per due volte nella Suite software di controllo.
- Impostare le opzioni del filtro di uno dei campioni ai soli particelle display più grande rispetto al cut-off sopra determinato. Questo visualizzerà solo le particelle di calibrazione.
- Impostare il campione filtrato a "file di calibrazione" e immettere la dimensione modo di sferette di calibrazione.
- Coppia il file di esempio e il "file di calibrazione" creato nel passaggio 2.4.3 come descritto in 1.4.2. Il file di esempio visualizzerà ora una distribuzione delle dimensioni di entrambi i veicoli elettrici e perline di calibrazione in base sferette di calibrazione a spillo.
Nota: L'opera di serieprotocollo ting sarà molto spesso sufficiente per la determinazione della taglia distribuzioni di veicoli elettrici. Talvolta tuttavia, componenti tampone esatte sono sconosciute (per esempio nel plasma o urina) che rende impossibile preparare un campione di sferette di calibrazione nello stesso tampone come gli EV di interesse. Un campione EV a spillo con particelle di calibrazione può essere utilizzato per EV size-stima in queste specifiche condizioni.
Representative Results
Per utilizzare lo strumento TrPs, un nanoporo non conduttivo deve essere collocato sui 4 bracci della macchina (Figura 1a) e una tensione (Figura 1b) deve essere applicata. Una volta stabilita una corrente elettrica di riferimento, impulsi resistivi causati da particelle che passano attraverso il poro verranno rilevate come illustrato nella Figura 1c.
Veicoli elettrici sono stati purificati da sovranatante di coltura cellulare della linea cellulare di glioblastoma U87-MG / EGFRvIII da ultracentrifugazione. Un tasso stabile particella-plot si osserva quando si misurano i veicoli elettrici isolati (Figura 2a) su un nanoporo NP100. È richiesto Questo stabile di particelle tasso-plot per una misura della concentrazione EV affidabile. Dopo l'accoppiamento la registrazione EV-campione ad una registrazione di 115 nm perline di calibrazione polistirolo, una distribuzione di dimensione (Figura 2b) e la concentrazione stima della EV-campione può essere ottenuto (dati non riportati).
(Figrue 3a). Ciò si traduce in stime di concentrazione EV imprecisi. Con chiodare il campione con perle di polistirene di concentrazione e di dimensioni note, un rapporto EV-a-tallone può essere determinata. Figura 3b illustra i risultati ottenuti dopo i picchi cella cultura surnatante con perle di polistirene di 335 nm di dimensione. Si osservano due popolazioni chiare. Le particelle che inducono un blocco di meno di 0,46 nA sono determinati veicoli elettrici, le particelle più grandi sono determinati perle di polistirene. Il rapporto di veicoli elettrici a perle di polistirene viene utilizzata per calcolare la concentrazione grezza di veicoli elettrici (Tabella 1). Figura 3c illustra la stima delle dimensioni delle due popolazioni in base alle perle di polistirene a spillo. La nuova impostazione nanopore usatoconsultati nella rilevazione dei veicoli elettrici> 140 nm di dimensione. Questo può essere abbassata riducendo l'apertura nanoporo, ma questo comporterà anche gli eventi più intasamento.
Figura 1: Strumento qNano e modalità di funzionamento. (A) dello strumento fotografico. Un nanoporo è posizionato sullo strumento, separando una cella fluido inferiore da una cellula fluido superiore. Le cellule del liquido sono protette da interferenze elettriche dell'ambiente dal tappo schermatura. (B) Illustrazione delinea rilevamento impulsi resistivo regolabile (TRP). Un nanoporo elastico non-conduttivo sta separando due cellule del liquido. Applicando una tensione di una corrente elettrica viene stabilita attraverso il poro forato nel nanoporo. Come vescicole extracellulari muovono attraverso il nanoporo, il flusso ionico viene alterata e rilevato come un impulso resistivo. Nel TrPs la dimensione del nanoporo apertura può essere sintonizzato (ridotta o aumentata) allungando nanoporo aumentando la distanza tra i bracci opposti dello strumento, o ridurre questa distanza. (C) Esempio illustrativo di impulsi resistivi. La grandezza di un singolo impulso resistivo è proporzionale al volume della particella:. Impulsi più grandi indicano le particelle più grandi Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: particelle conta-plot e le dimensioni-distribuzione ottenuta dalla misurazione EV isolati da U87-MG / EGFRvIII colture cellulari surnatante (A) particelle conta-plot che indica il rilevamento complessivo di particelle costante.. Breve riduzione di particrilevazione le è stata osservata tra 80 e 100 secondi di registrazione. Dopo la pausa la registrazione e toccando il tappo di schermatura, la velocità delle particelle è stabilizzata dopo che la registrazione è stata ripresa. (B) La distribuzione delle dimensioni dei veicoli elettrici isolati è tracciata dopo la calibrazione del campione non noto (EV) a 115 nm perline di calibrazione polistirolo. (5 nm formato bin). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: TrPs quantificazione dei veicoli elettrici a celle cultura surnatante utilizzando il protocollo alternativo. (A) tipici appezzamenti di particelle a tasso ottenuti nella misurazione EV direttamente in un fluido biologico. Intasamento dei pori provoca brevi interruzioni e fluttuazioni del tasso di rilevamento delle particelle. Ognitrama rappresenta una misura replica dello stesso campione. grafici (B) Tre replicare size-distribuzione ottenuti dopo i picchi cella cultura surnatante con 335 nm perline di calibrazione polistirolo. Tutte le particelle che inducono un impulso resistivo inferiore a 0,46 nA sono selezionati come i veicoli elettrici. (C) Le perle di polistirene a spillo possono essere utilizzati per ottenere una dimensione-distribuzione del campione. (5 nm formato bin). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Misurazione | Calibrazione solo 1 # | Calibrazione solo 2 # | Surnatante # 1 | Surnatante 2 # | Surnatante # 3 |
| Corrente media (nA) | 117 | 120 | <td> 116118 | 120 | |
| Tasso di particelle | 172 | 194 | 250 | 246 | 196 |
| taglio utilizzata (nA) | 0.46 | 0.46 | 0.46 | 0.46 | 0.46 |
| Particelle totali | 303 | 317 | 489 | 488 | 454 |
| Vescicole extracellulari | 3 | 1 | 213 | 215 | 213 |
| Perline di calibrazione Spiked | 300 | 316 | 276 | 273 | 241 |
| EV / perline di calibrazione | 0.01 | 0.003 | 0,772 | 0,788 | 0,884 |
| Sample - sfondo | 0,765 | 0,781 | 0.877 | ||
| Vescicole Extracelullar (10 7) / Ml | 7.14 | 7.29 | 8.18 | ||
| Campione 2.5x diluito | |||||
| EV concentrazione Raw (10 7) / ml | 17.85 | 18.22 | 20.46 |
Tabella 1:. Esempio di calcolo della concentrazione EV utilizzando il protocollo alternativo Un valore di cut-off è determinato a distinguere i veicoli elettrici da perline di taratura. Successivamente, il numero totale di veicoli elettrici e perline possono essere recuperate. Per ogni misura il rapporto EV-a-tallone viene calcolato. La quantità di particelle di fondo nella elettrolita (per esempio gli aggregati proteici) viene calcolato facendo la media il rapporto EV-a-tallone per le singole misure del 'perle di calibrazione solo' del campione. Per ogni campione il rapporto di sfondo viene sottratto dal rapporto ottenuto. Questa regolabile ad rapporto viene moltiplicato per la concentrazione delle sferette di calibrazione nel campione (in questo esempio: 9.33e7 / ml). Per determinare la concentrazione grezza di veicoli elettrici, la concentrazione ottenuto viene moltiplicato per il fattore di diluizione totale veicoli elettrici (in questo esempio: 2.5).
Discussion
I protocolli descritti in questo manoscritto offrono metodologie per la quantificazione e la dimensione caratterizzazione dei veicoli elettrici che utilizzano TrPs. I principali vantaggi della piattaforma TrPs sono la piccola dimensione del campione, la misurazione di breve durata relativa e l'assenza di manipolazione del campione richiesto.
Prerequisito per la misurazione accurata TrPs è quello di mantenere condizioni identiche tra le misurazioni di calibrazione e il campione. Questo comprende l'utilizzo di buffer identici così come le impostazioni dello strumento identiche, come la dimensione nanoporo, la tensione e la pressione applicata. L'originale VPM manca di un meccanismo per la regolazione precisa della pressione applicata, provocando piccole differenze di pressione applicata tra i campioni. Inoltre, l'evaporazione del liquido adescamento della VPM può indurre lievi differenze di pressione durante la misurazione in diversi momenti e la VPM deve quindi spesso essere re-innescato. Queste limitazioni sono state potenzialmente risolti dalla introduzione del VPM2, cheha una scala basato sui click e si basa pressione dell'aria.
Il protocollo alternativo descritto in questo manoscritto è particolarmente adatto per la misura di EVs in campioni biologici purificati non 17. Noi crediamo che i componenti tampone, come zuccheri, lipidi, proteine e altri detriti più grandi, può in alcuni casi influenzano le condizioni di misura troppo per il protocollo standard applicabile. L'aggiunta di perline di calibrazione per il campione, piuttosto che il confronto di due misure distinte introduce 'di calibrazione in tempo reale'. Questo metodo è particolarmente indicato quando si confrontano i campioni (ad esempio plasma sanguigno di diversi donatori) che hanno diverse e / o sconosciuti contenuti di sfondo fluidici. Sebbene esistano differenze tra i veicoli elettrici e le particelle di polistirene (ad esempio, densità delle particelle e la carica di superficie), modelli teorici e dati sperimentali sottolineare l'usabilità di perle di polistirene per la quantificazione e la dimensione profilatura dei veicoli elettrici,sotto il presupposto che la pressione significativa viene applicata 15,19. Per ridurre al minimo l'influenza di forze elettrocinetiche, si consiglia l'utilizzo del relativamente più grande NP150 / NP200 nanopore e significativa pressione positiva.
EV e perline di calibrazione si distinguono per dimensioni. Di conseguenza, il nanoporo deve essere aperto applicando tratto, ad un diametro dove si osserva individuazione dei veicoli elettrici e le particelle più grandi di calibrazione. Dal momento che l'apertura del poro diminuisce la sensibilità verso particelle più piccole, solo SVE più grandi di una certa dimensione sono registrati (spesso EVs> 120 nm utilizzando un cordone di calibrazione 335 nm). Il limite minimo di rilevazione per i veicoli elettrici può essere ridotto a circa 90 nm, utilizzando 203 nm perline di calibrazione su un nanoporo NP150. Tuttavia, questa configurazione potrebbe essere impraticabile quando i veicoli elettrici più grandi inducono frequente intasamento del nanoporo. La presenza di questi veicoli elettrici che ostacolano può forzare l'utilizzo di una configurazione in cui una popolazione di PA, troppo piccolo per reach la soglia di rilevamento, non verrà rilevata.
La difficoltà di operare del sistema aumenta quando si cerca di misurare le particelle di dimensioni inferiori a 100 nm di dimensione. In tali casi, il rilevamento può essere migliorata aumentando la concentrazione di sale dell'elettrolito. Un aumento della concentrazione di ioni indurrà relativamente aumento delle grandezze del blocco per le piccole particelle (maggiore rapporto segnale-rumore). La vitalità di questa tecnica per le misurazioni di veicoli elettrici deve essere convalidato, però, come l'aumento delle concentrazioni di sale possono influenzare il volume dei veicoli elettrici.
In conclusione, la piattaforma TrPs può essere utilizzata per la quantificazione diretta e dimensioni caratterizzazione dei veicoli elettrici. Dal momento che non è necessario alcun isolamento o manipolazione EV (anticorpo etichettatura vincolante o fluorescente), la piattaforma è adatta per la quantificazione EV diretta nei fluidi biologici. Un protocollo alternativo è previsto che può essere utile per i campioni in cui i componenti tampone inducono significativo di intasamento dei porig eventi, rendendo l'utilizzo affidabile del protocollo standard impraticabile.
Disclosures
Lo sviluppo del protocollo delineato e la stesura di questo manoscritto è stato sostenuto finanziariamente, in parte, dal cervello Fondazione olandese, Schumacher Kramer Foundation, e Bohnenn Fondo. La produzione di questo video-articolo è stato parzialmente sponsorted da Izon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| qNano instrument | Izon Science Ltd. | N/A | |
| Variable pressure module | Izon Science Ltd. | N/A | |
| Nanopore | Izon Science Ltd. | NP100, NP200 | Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes. |
| Calibration Particles | Izon Science Ltd. | CPC100, CPC200, CPC400 | Calibration particles are available in different sizes. |
| Sonication bath | Multiple available | Basic sonication bath is sufficient | |
| (Mini) vortexer | Multiple available | ||
| Lift-free tissues | Multiple available | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Multiple available | ||
| Windows based computer | |||
| Izon Control Suite 2.2 | Izon Science Ltd. | N/A | |
| Spreadsheet Software | Multiple available | N/A |
References
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