Summary
세포 외 소포는 응고, 면역 반응, 암 또는 약물 전달이나 재생 의학의 잠재적 치료제를 포함하여 생리 학적 및 병리학 적 과정에 중요한 역할을한다. 이 프로토콜은 조정 가능한 저항 펄스 감지 기능을 사용하여 다양한 유체 절연 및 비 절연 외 소포의 정량화 및 크기 특성화하기위한 방법을 제시한다.
Abstract
'마이크로 소포'와 '엑소 좀'를 포함한 세포 외 소포 (전기 자동차)는, 체액 매우 풍부하다. 최근 몇 년 동안 전기 자동차에 대한 관심의 엄청난 증가를 목격했다. 전기차는 응고, 면역 반응, 및 암을 포함하는 다양한 생리 학적 및 병리학 적 과정에서 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 또한, 전기차가 약물 전달 등의 차량, 예를 들어 또는 재생 의학으로서, 치료제로서 가능성이있다. 때문에 작은 크기 (50 ~ 1,000 nm의)의 정확한 정량 및 전기 자동차의 크기 프로파일 링은 기술적으로 도전이다.
이 프로토콜은 qNano 시스템을 사용하여, 어떻게 가변 저항 펄스 감지 (TRPS) 기술을 설명 전기차의 농도와 크기를 결정하는데 사용될 수있다. 나노 크기의 기공을 통해 자신의 전송시 전기차의 검출에 의존하는 방법은 상대적으로 빠르다 작은 샘플 볼륨의 사용을 충분하고부터 끝까지 필요없는동북 아시아의 평화와 번영 및 전기 자동차의 농도. 다른 방법이 사용하여 설명 일반 동작 프로토콜에 대한 다음 샘플은 알려진 크기와 농도의 폴리스티렌 비즈를 타서. 생물학적 유체에서 직접 전기차를 측정 할 때 교정 기법 기술적 장애물을 극복하기 위해 이용 될 수있는이 실시간이 발생.
Introduction
휴대 원점에서 소포는 체액 한 매우 풍부하다. 이 소위 세포 외 소포 (전기 자동차) (50 - 크기가 1,000 nm의)는 세포막 다중 기공을 갖는 기관 중 하나 융합하거나 세포막의 직접 바깥쪽으로 신진에 의해 형성된다. 최근, 전기 자동차에 대한 관심이 크게 과학적 새로운 기능 및 전기차의 특성을 설명 하나되는 EV 중심 출판물 과다, 결과적으로 증가하고있다. 전기차는 이제 이러한 신호 전달, 면역 조절 및 혈액 응고 1-4과 병리 생리 학적 과정의 광범위한 어레이에 관여하는 것으로 생각된다. 암에서 전기 자동차는 premetastatic 틈새 5,6, 혈관 신생 팔의 프로 암 콘텐츠 7,8의 전송 및 자극의 형성에 중요한 역할을 할 것으로 보인다. 이 외에도 전기 자동차는 치료제 9의 배달 요원으로 탐구한다.
이러한 데에도 불구하고velopments는 전기 자동차의 신뢰성 정량화 도전 남아있다. 전통적으로, 간접 정량 방법은 총 단백질 함량 또는 특정 단백질의 정량화에 의존하는 데 사용됩니다. 광범위하게 사용되지만, 이러한 기술은 단백질 당 EV의 차이를 고려하지 않고, 전기 자동차에 단백질 응집체 및 단백질 오염을 구별하지 않습니다. 더욱이, 이들 기술은 많은 경우에 생물학적 시료에서 EV 농도의 비교가 불가능하게 전기차의 절연을 필요로한다.
따라서 노력은 더 정밀하고 직접적인 EV 측정 열 수 있도록 신규 한 방법을 개발하기 위해 수행된다. 이 보고서는 신뢰할 수있는 정량 및 전기 자동차의 크기 프로파일에 대한 조정 저항 펄스 감지 (TRPS)를 사용하는 방법을 설명한다.
현재 qNano 악기 (도 1a) TRPS 유일한 시판 플랫폼이다. TRPS에서, 비도 전성 탄성 멤브레인은 위스콘신 구두점나노 크기의 세공이 유체 번째 셀을 분리한다. 다른 셀이없는 입자 전해질로 채워진 반면 유체 셀 중 하나는 관심있는 시료로 채워진다. 전압을인가함으로써, 이온 유동 / 전류가 기공을 통해 입자의 전사시에 변경되는, (도 1B)으로 설정된다. 이 전류 차단 ( '펄스 저항')의 크기는 입자 (11) (도 1C)의 체적에 비례한다. 봉쇄 기간은 충전 또는 12 모양 같은 입자 특성에 의존하는 입자의 제타 전위를 평가하기 위해 사용될 수있다. 미지의 입자 크기 프로파일은 공지 직경 보정 입자에 의한 저항 펄스와 미지의 입자에 의한 저항 펄스를 비교함으로써 수행 될 수있다. 봉쇄 이벤트의 크기 외에,이 발생하는 속도가 측정된다. 이 계수 속도 RELI입자 농도에 에스. 농도 및 봉쇄 율 알려진 농도와 입도의 입자가 단일 캘리브레이션 샘플을 사용하여, 직선 (13)의 농도에 비례하기 때문에 (14)와 미지 시료의 입도 분포 (11)의 측정을 허용한다.
나노 기공을 통해 입자의 움직임은 전기 kinetic- (전기 및 전기 삼투) 및 유체의 힘 (15)에 의해 결정된다. 변압 모듈 (VPM) 유체 셀 사이의 압력 차를 이용하여 부가적인 힘으로서 발생 될 수있다. 양압을 적용하면, 입자의 농도가 낮은 경우에 도움이 될 수있다 입자의 유량을 증가시킨다. 또한, 압력은 전기 역학적 힘의 영향을 줄이기 위해 적용될 수있다. 상대적으로 작은 기공 직경을 갖는 나노 기공을 사용하는 경우에 특히 중요하다 (NP100, NP150 가능성 및 NP200)는 자주 전기차의 검출을 위해 사용.이러한 나노 기공 들어, 상당한 압력을 가하는 경우에도, 전기 역학적 힘은, 입자 표면 전하에 따라, 16 무시할 남아있을 수있다. 다양한 압력에서의 입자 속도를 측정함으로써, 전기 - 역학적 보정, 따라서 더 정확하고, EV 농도를 산출 할 수있다.
여기서, 상세한 프로토콜은 전기차의 크기 분포 및 농도를 결정하기 위해 제공된다. 샘플은 공지 된 크기 및 농도 17의 폴리스티렌 비드 아군 곳 정상운 프로토콜은 다음에, 다른 방법에 대하여 설명한다. 이것은 실시간 교정 기술은 소변, 혈장 및 세포 배양 상등액, 또는 생물학적 유체에서 직접 전기차를 측정 할 때 기술적 과제 일부 발생 극복하는데 사용될 수 측정 장시간 나노 기공의 안정성을 할 수없는 경우 보장.
Protocol
1 표준 작동 프로토콜
1.1 장비 설정 및 샘플 준비
- 설치 Izon 컨트롤 스위트 소프트웨어 악기를 컴퓨터에 연결합니다.
- - 또는 NP200 (대상 크기 범위 100-400 nm의) 가장 자주 사용되는 NP150 (300 nm의 대상 크기 범위 85)는 전기 자동차의 크기와 농도 측정 : 사용하는 나노 기공의 크기를 선택합니다. 220 nm의 필터를 통해 샘플을 전달하여 예를 들어 큰 전기차의 제거를 포함하는 프로토콜을 이용하여 분리 한 전기차로 작업 할 때, NP100 기공 (목표 크기 범위 70-200 나노 미터)가 사용될 수있다. 생체 시료에서 전기차 또는 다른 프로토콜을 사용하여 절연 전기차 작업하는 경우가 종종 덜 막히게되므로, NP200을 사용할 수있다. 또는 NP400 (목표 크기 범위 200-800 나노 미터) - 등 NP300G의 (600 nm의 목표 크기 범위 (150))와 같은 다른 나노 기공, 또는 더 큰 나노 기공이 큰 전기차의 종류에 사용될 수있다.
- 폴리스티렌 캘리 브레이션을 선택1.1.2 단계에서 선택한 나노 기공을 보완 ation 입자. NP100를 들어, NP150와 NP200의 나노 기공은 각각 CPC100, CP100 및 CPC200 입자를 사용합니다. 정확한 크기의 추정을 위해, 캘리브레이션 입자 알려지지 입자와 유사한 크기를 갖도록.
- 교정 입자의 균일 성, 소용돌이 짧게 (30 초)을 확인하십시오. 선택적으로, 집계를 제거하기 위해 초음파를 적용합니다.
- 적어도 40 μL의 부피 목표 농도로 PBS에 교정 입자를 희석. 참고 : 목표 농도는 단계 1.1.2에서 선택한 나노 기공에 따라 달라집니다. 목표 농도는 나노 기공 함께 제공됩니다.
- 적용하고 직접 낮은 유체 셀 PBS의 78 μl를 제거; 나노 기공이 위치에있을 때, 상기 하부 유체 셀에 전해질을 도포 할 때 하부 유체 셀이 습윤은 나노 기공 하에서 기포 형성의 위험을 감소시킨다.
- 악기의 네 팔에 나노 기공을 놓습니다. 사용디지털 캘리퍼스이 반대 팔 사이의 거리를 측정하고 "스트레치"입력 필드에 mm의 거리를 입력하고 나노 기공 스트레칭 교정하는 "스트레치를 교정"을 클릭합니다.
- 하부 액체 셀에 78 μl의 PBS를 다시 적용하기 전에, 기기의 대향 아암들 사이의 거리가 증가하므로 사이드 휠을 켜서, 47mm로 나노 기공을 스트레칭.
주 : 전기 간섭이 실질적으로 측정의 품질에 영향을 미칠 수있다. Izon 제어 Suite 소프트웨어를 실행하는 노트북을 사용하는 경우, 노트북이 접지 된 소켓과 플러그를 사용 전력망에 연결되어 있는지 확인합니다. 휴대 전화는 전기 간섭의 원인이 될 수있는 근접 악기로 유지했다. 전기 간섭은 종종 루트로 광장 (RMS) 노이즈> 10 pA의 의미, 기준 전류가 지속적으로 반복 피크로 관찰된다.
참고 : 거의 모든 버퍼의 TRPS characteri 대한 교정 입자 및 전기차를 희석하는데 사용될 수있다아네트. 염의 존재는 전류의 확립을위한 필수 조건이다. EV 측정을위한 버퍼로 PBS를 사용합니다. 전기차가 정확한 측정을 보장하기 위해 교정 입자는 항상 동일한 완충액으로 희석한다.
1.2. 측정을위한 최적의 설정을 결정
주 : 촬영 전에, 최적의 측정 설정을 설정하는 것이 중요하다. 나노 기공을 통과하는 입자에 의한 봉쇄의 크기는 적용 스트레칭 및인가 전압에 의존한다. 신뢰할 수있는 측정을 위해 RMS 잡음이 있어야합니다 0.1 nA의 <10 PA 및 모드 봉쇄 크기는되어야한다>.
- 나노 기공에 상부 유체 세포와 차폐 케이지를 놓고 상부 유체 셀에 희석 교정 입자의 40 μl를 소개합니다. ≥0.8 kPa의 긍정적 인 압력을 적용 할 VPM을 사용합니다.
- 교정에 의한 봉쇄 이벤트를 분석하는 동안 44mm쪽으로 천천히 적용 스트레칭 감소입자. 나노 기공을 통해 공경보기 입자의 이동을 감소시키는 경우가 거의 없을 것이며, 따라서, 입자 속도는 감소한다 참고. 그러나, 공극이 증가 상대적인 봉쇄 큰 봉쇄 이벤트 향상된 신호대 잡음비로 인한 발생한다. 전압을 증가 시키면 더 봉쇄의 크기를 증가시킬 수 있습니다뿐만 아니라 RMS 노이즈를 증가시킬 수있다.
- 적절한 봉쇄 이벤트 (그림 1C)는 "신호 추적"패널에서 관찰 될 때까지 스트레칭을 줄일 수 있습니다. (모드> 0.1 nA의)와 해당 입자의 속도는> 100 / 분이다. 주 : 입자 속도는 적어도 500의 입자 측정이 이상적으로하지만, 덜 엄격한 컷오프이며, <100 / 분의 입자의 비율은 적어도 5 분의 지속 시간을 기록하게됩니다. (샘플 희석 수행해야있는 경우) 2000 / 분보다 더 높은 입자 속도는 덜 정확한 측정 될 수 있습니다.
교정의 1.3 측정입자, Uper 유체 셀 및 샘플 측정의 세척
- 다형성 아교 모세포종 세포주 U87-MG / EGFRvIII의 세포 배양 상층 액에서이 섹션의 전기 자동차에서 특징입니다. 이러한 전기 자동차의 분리 및 준비는 이전에 기술과 18을 가시화하고있다.
- 상부 유체 셀의 교정 입자를 놓습니다. (예 : 0.8 kPa의에 대한) 압력 VPM 기록> (500) 입자를 사용하여 적용합니다.
- 다중 압력 측정을 수행하는 경우, (1.0 kPa의 행 예)인가 압력을 증가시키고 제 캘리브레이션 파일을 기록한다. 참고 : 0.2 kPa의 차이의 최소 필요합니다.
- 상부 유체 셀로부터 교정 샘플을 제거합니다. 잔류 입자를 제거하기 위해 상부 유체 세포 100 ㎕의 PBS로 3 회 세척 할 것. 상부 유체 셀에 시료를 도입하기 전에 상부 유체 셀로부터 잔여 PBS를 제거하려면 보풀이없는 조직을 사용합니다.
- 상부 유체 셀에 샘플을 소개. 기준 전류가 교정 입자를 측정 할 때 관찰 된 기준 전류의 3 % 이내인지 확인. 3 % 이내하지 않으면, 기준 전류를 안정화 후술 전략을 적용한다. 교정 입자에 적용되는 정확한 압력을 적용하고 샘플 파일을 기록합니다.
참고 : 입자의 속도 그래프는 일정한 입자 검출 (그림 2a)를 표시해야합니다. 입자 검출, 기준 전류의 급격한 저하, 또는 RMS 잡음 급증 갑자기 중단 된 경우에는, 기공이 막히게 될 수있다; 이에 따라, 촬영을 일시 정지. 베이스 라인, 탭을 복원하거나 차폐 캡을 비틀, 플런저를 적용하거나 완전히 나노 기공을 제거하고 탈 이온수로 씻어 그리고 장비를 교체하기 위해.
참고 : 다른 방법으로, 약 5 분 동안 VPM에서 최대 압력과 함께 47mm에 나노 기공 스트레칭을 증가시킨다.
1.4 데이터 분석
- 클릭 ", 소프트웨어의 분석 부분을 입력 데이터 "탭을 분석합니다. "처리되지 않은 파일"을 선택 "프로세스 파일"을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 교정 및 예제 파일을 처리합니다.
- 교정 기록에 부부에 "보정"열에서 샘플 옆에있는 샘플 파일을 체크 박스를 클릭합니다. 해당 샘플 및 교정 파일을 선택하고 '확인'을 클릭합니다. 참고 : 다중 압력 보정 옵션은 여러 교정 파일에 몇 여러 샘플 왼쪽에있는 "멀티 압력 보정"탭을 선택 사용하는 경우.
- 일단 성공적으로 결합 Izon 제어 Suite 소프트웨어는 크기 분포 등 다양한 시료의 특징에게 (그림 2B)를 표시합니다, 기준 기간, 전체 폭의 절반 최대 (FWHM) 및 농도 분석. 선택적 : 쉼표로 구분 된 파일로 각 샘플의 경우, 각각의 데이터 포인트는 내보낼 수 있습니다.
2lternative 프로토콜 - 교정 비즈 샘플을 못을 박는
주 : 절연 전기차로 작업 할 때 일반적으로, 표준 운영 절차가 사용될 수있다. 생물학적 샘플, 또는 대형 단백질 집합체로 오염 된 절연 EV 준비 비 절연 전기 자동차, 작업 할 때 장비를 운영하는 것은 문제가 될 수 있습니다. 이 문제는 주로 나노 기공 차단 (기준 전류의 급격한 하락), 교정 측정하거나 동일한 샘플 (그림 3a) 사이의 입자 속도에서 큰 차이의 3 % 내에서 기준 전류를 복구 할 수없는 높은 비율로 구성되어 있습니다. 전기 자동차를 정량화하기 위해 이러한 어려움에게 다른 프로토콜을 표시하는 샘플은 17를 개발 하였다. 이 방법론은이자 (그림 3b)의 샘플에 큰 폴리스티렌 교정 구슬의 도입에 의존한다. 이 대안 프로토콜에 대한 자세한 절차는 아래에 설명되어 있습니다.
2.1. 샘플준비
주 : 대안적인 방법을 사용하여 시료를 제조 할 때, 주위도 1의 EV-대 - 비드 비율을 설정하는 것이 바람직하다, 그것의 정확한 '게이팅'있도록 샘플 '만 교정 비드'를 포함하는 것이 필수적이다 교정 구슬 및 버퍼에 존재 (예를 들어 단백질 응집체의 경우) 배경 입자의 수를 결정한다.
- 300 XG에 7 분 동안 세포 배양 상층 액의 원심 분리기 100 μL
- PBS의 20 μl의 75 배의 10 μL에 상층 액의 20 μl를 추가는 335 nm의 폴리스티렌 비즈 (주식 7e10 / ㎖)로 희석.
2.2. 샘플 측정
- 최적의 장비 설정을 결정하기 위해 1.2 절에서 설명하는 전략을 사용합니다.
- 샘플 첫번째 '만 교정 구슬'을 측정한다. 작은 비 - 비드 입자의 배경에 검출 가능한 낮은 지 확인 (<비드 10 %).
- 각 개별 사를 측정mple 한번 기록 동등하게 다른 시료 위에 나노 기공 조건에서의 변동을 분산하기 위해 복제 전에. 각 샘플의 적어도 3 회 반복 측정한다.
- 모든 샘플의 기록을 마친 후 '교정 비드만을'샘플을 재 측정.
2.3. 데이터 분석
주의 : 다른 프로토콜을 사용하는 경우, 제어 Izon 스위트 소프트웨어가 전용 농도 계산을 위해 충분하지 않는다. 추가 스프레드 시트 소프트웨어가 필요하다. 표 1은도 3에 도시 된 샘플의 농도를 계산하는 예를 나타낸다.
- '교정 구슬만을'샘플 및 하나 이상의 샘플 파일을 엽니 다.
- 전기 자동차 및 폴리스티렌 구슬 사이의 구별에 대한 컷 - 오프로 사용할 수 (NA)에있는 봉쇄 이벤트의 크기를 결정합니다. 폴리스티렌 비즈 인구의 좌측베이스에 대응 봉쇄 값 수 (NA) (결정
- 샘플의 "입자 분석 요약"탭을 클릭하여 각 샘플에 대한 총 입자 수의 값을 검색합니다.
- 단계 2.3.2에서 결정된 컷오프 레벨을 이용하여 상기 데이터 세트를 필터링. "데이터 필터링"팝업을 선택하여. 디스플레이는 단지 컷오프보다 작은 입자.
- "입자 분석 요약"에서 각 샘플에 대한 EV 수의 값을 검색합니다.
- 교정 비드의 양을 결정하기 위해 전체 입자에서 전기차의 양을 뺀다.
- 교정 구슬 수에 의해 EV 수를 나눈 EV - 투 - 비드 비율을 결정합니다.
- 및 각각에 대해 결정된 비율을 평균화함으로써 평균 백그라운드 비율을 결정# 8220; 만 "교정 샘플을 구슬. 각각의 샘플에서이 값을 뺍니다.
- 각 샘플에 대한 전기차의 농도를 결정하기 위해 교정 구슬의 농도에 의해 조절 된 EV-대 - 비드 비율을 곱한다.
- EV 샘플로 보정 구슬의 첨가에 의해 도입 EV 희석 인자에 의해 단계 2.3.9에서 발견 된 농도를 곱한다. 참고 예 시료 설정에서 PBS 및 교정 구슬 시료의 전체의 2.5 배 희석하고, 따라서 단계 2.3.9에서 발견 농도 것의 EV 샘플 농도를 결정하기 위해 2.5 곱해야하다.
- 예컨대 평균, 표준 편차 및 복제물의 각 그룹에 대한 평균의 표준 오차로서 통계를 계산한다.
주 : 어떤 경우에 관찰되는 전기 자동차 및 아군 폴리스티렌 구슬 사이에 겹칩니다. EV 농도의 과소 평가에 대한 보정이 필요한 경우, 아군 폴리스티렌 비드가없는 샘플은 또한 측정되어야한다. 같은 컷 -을 사용하여"비드 투 EV"비율을 결정하는 단계에서 결정된 바와 같이 2.3.2 떨어져 아군 폴리스티렌 비드의 범위 내에 전기차의 비율을 산출한다. 이 비드 대 비율은 EV 단계 2.3.8에서 결정된 EV-대 - 비드 비율로 첨가한다.
2.4. 옵션 : 다른 방법을 사용하여 EV 크기 분포.
- 컨트롤 스위트 소프트웨어에 두 번 샘플 녹음을 엽니 다.
- 상기 결정된 컷오프보다 더 큰 경우에만 표시 입자 샘플 중 하나의 필터 옵션을 설정한다. 이 교정 입자 만 표시됩니다.
- "교정 파일"에 대한 필터링 된 샘플을 설정하고 교정 구슬의 모드 크기를 입력합니다.
- 커플 샘플 파일 및 1.4.2에 설명 된대로 단계 2.4.3에서 만든 "교정 파일". 샘플 파일은 이제 아군 교정 구슬에 기초 전기차 및 교정 비드 모두의 크기 분포를 표시한다.
참고 : 표준 오페라팅 프로토콜은 대부분 전기 자동차의 크기 분포 측정에 충분합니다. 그러나 때때로, 버퍼 정확한 성분은 불가능 관심 전기차와 같은 버퍼에 교정 비드 시료를 제조 할 수있는 (혈장 또는 뇨에서 예) 알려져 있지 않다. 교정 입자 타서 EV 시료 이들 특정 조건 EV 크기 추정을 위해 사용될 수있다.
Representative Results
TRPS 기기를 사용하기 위해, 비도 전성 나노 기공은 머신 (도 1A)의 암 (4) 상에 배치되어야하며 전압 (도 1B)을 적용 할 수있다. 전기 기준 전류가 설정되면도 1c에 도시 된 바와 같이, 공극을 통과 입자에 의한 저항 펄스가 검출된다.
전기차은 초 원심 분리에 의해 교 아세포종 세포주 U87-MG / EGFRvIII의 세포 배양 상청액으로부터 정제 하였다. NP100의 나노 기공에 고립 된 전기 자동차 (그림 2a)를 측정 할 때 안정적인 입자 속도 플롯이 관찰된다. 이 안정된 입자 속도 플롯은 신뢰할 수있는 EV 농도 측정이 필요합니다. 115 nm의 폴리스티렌 보정 구슬, 입도 분포 (도 2b) 및 EV-샘플의 농도 추정의 기록에 EV-샘플 기록 페어링 후 (데이터는 도시하지 않음)를 얻을 수있다.
(Figrue의 3A)의 중단 및 / 또는 변동을 초래한다. 이 부정확 EV 농도 추정 결과. 공지 된 농도와 크기의 폴리스티렌 비드와 샘플 급상승하여, EV-대 - 비드 비율이 결정될 수있다.도 3b는 크기가 335 나노 미터의 폴리스티렌 비드와 세포 배양 상등액을 급상승 한 후 얻어진 결과를 도시한다. 두 명확 인구 관찰된다. 미만 0.46 NA가 봉쇄를 유도 입자는 큰 입자는 폴리스티렌 비드를 결정, 결정된 전기차이다. 폴리스티렌 비드에 전기차의 비율은 전기차 (표 1)의 원료 농도를 계산하는데 사용된다. 3C는 아군 폴리스티렌 비드에 기초하여 두 개의 집단의 크기 추정을 도시도. 나노 기공 설치 사용 재크기 전기차> 140 nm 인 검출 sulted. 이것은 나노 기공 개구를 감소시킴으로써 저하 될 수 있으나이 또한 더 클 로깅 이벤트가 발생할 것이다.
그림 1 : qNano 기기의 동작 모드와. 악기의 (A)의 사진. 나노 기공은 상부 유체 세포에서 낮은 유체 세포를 분리, 악기에 위치한다. 유체 셀은 차폐 캡에 의한 환경 전기적 간섭으로부터 보호된다. (B) 그림 조정 저항 펄스 감지 (TRPS)를 개설. 비도 전성 탄성 나노 기공은 두 유체 세포를 분리한다. 전압을인가하여 전류가 나노 기공에 천공 구멍을 통해 확립된다. 세포 외 소포가 나노 기공을 통해 이동하면 이온 흐름을 변경하고 저항 펄스로 검출. TRPS에서 나노 기공의 개구부의 크기가 장비의 대향 아암들 사이의 거리를 증가 또는이 거리를 감소시켜 나노 기공을 연신 (감소 또는 증가) 튜닝 될 수있다. (C) 저항 펄스의 예시. 단일 저항 펄스의 크기는 입자의 부피에 비례한다 :. 큰 펄스가 큰 입자를 나타내는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 입자 카운트 음모와 U87-MG / EGFRvIII 세포 배양 상층 액에서 격리 된 전기 자동차를 측정에서 얻은 크기 분포 전체 일정 입자 검출을 나타내는 (A) 입자 카운트 줄거리.. partic의 간단한 감소르 검출은 기록의 80 ~ 100 초 사이에서 관찰되었다. 차폐 캡 기록을 일시 태핑 후, 입자 속도는 그 후에 기록이 재개 된 안정화. (B) 절연 전기차의 입도 분포는 115 nm의 폴리스티렌 보정 비드 미지 시료 (전기 자동차)를 조정 한 후의 플롯. (5 nm의 빈 크기). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 : 다른 프로토콜을 사용하는 세포 배양 상청액에서 전기차의 TRPS 정량. 생물학적 유체에서 직접 전기차를 측정 할 때 얻어지는 (A)의 전형적인 입자 속도의 플롯. 모공 막힘 입자 검출 속도에 대한 간단한 중단되거나 변동이 발생합니다. 각플롯은 동일한 샘플의 복제에 측정을 나타낸다. 335 nm의 폴리스티렌 보정 비드 세포 배양 상등액을 급상승 후에 얻어진 (B) 세 복제 크기 분포 그래프. 이하 NA가 0.46 저항성 펄스를 유도하는 모든 입자를 전기차로 선택된다. (C) 아군 폴리스티렌 비드 샘플의 크기 분포를 얻기 위해 사용될 수있다. (5 nm의 빈 크기). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 측정 | 교정 만 # 1 | 교정 만 # 2 | 뜨는 # 1 | 뜨는 # 2 | 뜨는 # 3 |
| 평균 전류 (NA) | 117 | 120 | <TD> (116)118 | 120 | |
| 입자의 속도 | 172 | 194 | 250 | 246 | 196 |
| 사용 차단 (NA) | 0.46 | 0.46 | 0.46 | 0.46 | 0.46 |
| 총 입자 | 303 | 317 | 489 | 488 | 454 |
| 세포 외 소포 | 3 | 1 | 213 | 215 | 213 |
| 가시 교정 구슬 | 300 | 316 | 276 | 273 | 241 |
| 전기 자동차 / 교정 구슬 | 0.01 | 0.003 | 0.772 | 0.788 | 0.884 |
| 샘플 - 배경 | 0.765 | 0.781 | 0.877 | ||
| Extracelullar 소포 (10 7) / ㎖ | 7.14 | 7.29 | 8.18 | ||
| 샘플 2.5 배 희석 | |||||
| 원시 농도 전기 자동차 (10 7) / ㎖ | 17.85 | 18.22 | 20.46 |
표 1. 대체 프로토콜을 이용하여 EV 농도의 계산 예 컷오프 값은 캘리브레이션 비드에서 전기차를 구별 판정된다. 이어서, 전기차 비드의 총 수를 검색 할 수있다. 각 측정의 EV 투 비드 비율이 계산된다. (실시 예 단백질 골재) 전해질 배경 입자의 양은 '교정 비드 만'샘플의 개별 측정 EV-대 - 비드 비율을 평균화함으로써 계산된다. 각 샘플에 대한 배경 비가 얻어지는 비로부터 감산된다. 이 adjusteD 비율 (: 9.33e7 / ㎖이 예에서) 샘플에서 보정 구슬의 농도에 의해 곱해진다. 전기차의 원료 농도를 측정하기 위해, 얻어진 농도 (2.5이 예에서) 다운로드 전기차 희석 인자에 의해 곱해진다.
Discussion
정량 TRPS를 사용하여 전기 자동차의 크기 특성이 원고 제공 방법에 설명 된 프로토콜을 지원합니다. TRPS 플랫폼의 주요 장점은 작은 샘플 크기, 상대적 짧은 측정 기간 및 요구되는 시료의 조작 부재이다.
정확한 TRPS 측정을위한 전제 조건은 교정 및 샘플 측정과 동일한 조건을 유지하는 것입니다. 이것은 동일한 버퍼의 사용뿐만 아니라 나노 기공 크기,인가 전압 및 압력과 같은 동일한 장비 설정을 포함한다. 일본어 VPM시켜 시료 사이에인가 된 압력의 작은 차이를 일으키는인가 압력의 정확한 설정을위한 메커니즘이 부족하다. 상이한 시점에서 측정하는 경우도, 프라이밍 VPM에서 유체를 증발 부 압력 차이를 유도 할 수 있으며, 따라서 종종 VPM 다시 프라이밍되어야한다. 이러한 제한은 잠재적으로 VPM2의 도입에 의해 해결되고있는클릭 기 스케일링을 가지며 공기압 기초한다.
이 논문에 설명 된 대체 프로토콜은 비 정제 된 생물학적 시료 17에서 전기차의 측정에 특히 적합하다. 우리는 당, 지질, 단백질 및 몇몇 경우에, 더 큰 수의 다른 파편 등 완충 성분, 적용하는 표준 프로토콜에 대한 너무 많은 측정 조건에 영향을 미칠 것으로 믿는다. 샘플이 아닌 별도의 측정 값을 비교하는 캘리브레이션 구슬 첨가 '실시간 교정'을 소개한다. 상이한 및 / 또는 알 유체 배경 콘텐츠가 샘플 (예를 들면 다른 기증자의 혈장)를 비교할 때이 방법은 특히 적절하다. 전기차가 차이 및 폴리스티렌 입자 (예를 들면 입자 밀도와 표면 전하), 이론적 모델뿐만 아니라 실험 데이터간에 존재하지만 정량화 및 전기차의 크기 프로파일 폴리스티렌 비드의 유용성을 강조,사전에서 그 의미 압력은 15,19 적용됩니다. 동 전기의 힘의 영향을 최소화하기 위해 상대적으로 더 큰 NP150 / NP200의 나노 기공과 유의 한 양의 압력의 사용은 권장합니다.
전기차 및 교정 구슬의 크기에 의해 구별된다. 결과적으로, 나노 기공이 큰 전기차과 교정 모두 입자의 검출이 관찰 직경에 신축성을 적용하여 열 수있다. 공극의 개구부가 작은 입자쪽으로 감도를 감소하기 때문에, 단지 기록 된 특정 크기 (종종 전기차> 120 내지 335 nm의 보정 비드를 사용하여)보다 큰 EVS. 전기차의 최소 검출 한계는 NP150의 나노 기공에 203 nm의 보정 비드를 사용하여, 약 90 나노 미터로 감소 될 수있다. 큰 전기 자동차가 나노 기공을 자주 막힘을 유도 할 때,이 설정은 생존이 불가능 할 수 있습니다. 이러한 방해 전기 자동차의 존재는 설정의 사용을 강제 할 수 있습니다 어디 정말이에요 너무 작은 전기 자동차의 인구,검출 임계 값을 채널, 감지되지 않습니다.
크기가 100 나노 미터보다 작은 입자를 측정하도록 시도 할 때 어려움이 증가 시스템을 운영한다. 이러한 경우에, 검출은 전해질 염 농도를 증가시킴으로써 개선 될 수있다. 증가 된 이온 농도가 상대적으로 작은 입자에 대한 증가 된 봉쇄 크기 (큰 신호 대 잡음비)을 유도 할 것이다. 전기차의 측정을위한 이러한 기술의 가능성이 증가 염 농도는 전기차의 체적에 영향을 미칠 수 있으므로, 비록 검증되어야한다.
결론적 TRPS 플랫폼은 직접 정량화 및 전기차의 크기 특성화에 사용될 수있다. 더 격리 또는 EV 조작 (항체 결합 또는 형광 라벨)이 필요하지 않기 때문에,이 플랫폼은 생물학적 유체에 직접 EV 정량에 적합합니다. 대안적인 프로토콜은 완충 성분 상당한 세공 cloggin 유도 여기서 샘플 유리할 수있다 제공된다살수 표준 프로토콜의 안정적인 활용을 g 이벤트.
Disclosures
설명 프로토콜이 원고를 작성하는 개발은 재정적으로 네덜란드 뇌 재단, 슈마허 크레이머 재단 및 Bohnenn 기금에 의해 부분적으로 지원하고있다. 이 비디오 문서의 생산은 부분적으로 Izon에 의해 sponsorted했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| qNano instrument | Izon Science Ltd. | N/A | |
| Variable pressure module | Izon Science Ltd. | N/A | |
| Nanopore | Izon Science Ltd. | NP100, NP200 | Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes. |
| Calibration Particles | Izon Science Ltd. | CPC100, CPC200, CPC400 | Calibration particles are available in different sizes. |
| Sonication bath | Multiple available | Basic sonication bath is sufficient | |
| (Mini) vortexer | Multiple available | ||
| Lift-free tissues | Multiple available | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Multiple available | ||
| Windows based computer | |||
| Izon Control Suite 2.2 | Izon Science Ltd. | N/A | |
| Spreadsheet Software | Multiple available | N/A |
References
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