Summary
Ekstracellulære vesikler spiller viktige roller i fysiologiske og patologiske prosesser, herunder koagulasjon, immunreaksjoner, og kreft eller som potensielle terapeutiske midler i levering av legemidler eller regenerativ medisin. Denne protokollen presenterer metoder for kvantifisering og størrelse karakterisering av isolerte og ikke-isolerte ekstracellulære vesikler i forskjellige væsker ved hjelp av avstembar resistive pulsføle.
Abstract
Ekstracellulære vesikler (EVS), herunder 'mikrovesikler' og 'exosomes', er svært rik på kroppsvæsker. De siste årene har sett en enorm økning i interessen for elbiler. EV har blitt vist å spille en viktig rolle i en rekke fysiologiske og patologiske prosesser, inkludert koagulering, immunresponser og kreft. I tillegg, EV har potensiale som terapeutiske midler, for eksempel som medikamentleveringskjøretøy eller som regenerativ medisin. På grunn av sin lille størrelse (50 til 1000 nm) nøyaktig kvantifisering og størrelse profilering av elbiler er teknisk utfordrende.
Denne protokollen beskriver hvordan avstembar resistive pulsføle (trps)-teknologi, ved bruk av qNano systemet, kan brukes til å bestemme konsentrasjonen og størrelsen av el-biler. Fremgangsmåten, som er avhengig av deteksjon av el-biler ved deres overføring gjennom en nano store porer, er forholdsvis rask, er tilstrekkelig for bruk av små prøvevolumer, og krever ikke purreduser fuktighet og konsentrasjonen av elbiler. Ved siden av ordinær drift protokollen en alternativ tilnærming beskrives ved hjelp prøvene tilsatt isopor perler av kjent størrelse og konsentrasjon. Denne sanntids-kalibreringsteknikken kan brukes til å overvinne tekniske hindringer oppstått ved måling elbil direkte i biologiske fluider.
Introduction
Blemmer fra mobilnettet opprinnelse er svært rik på kroppsvæsker en. Disse såkalte ekstracellulære vesikler (EVS) (50 - 1000 nm i størrelse) er dannet enten ved sammensmelting av flere vesikulær organer med cellemembranen eller ved direkte ytre spirende av cellemembranen. I de senere årene har vitenskapelig interesse i elbiler øker kraftig, noe som resulterer i en mengde EV-fokusert publikasjoner, der nye funksjoner og egenskaper av elbiler er beskrevet en. Elbiler er nå antatt å være involvert i et bredt spekter av fysiologiske og patologiske prosesser som signaltransduksjon, immunregulering, og blod koagulasjon 1-4. I kreft, elbiler synes å spille en rolle i dannelsen av premetastatic nisjer 5,6, overføring av pro-kreft innhold 7,8 og stimulering av angiogenese åtte. Utenom dette, er elbiler utforsket som leveringsmidler av terapeutiske midler ni.
Til tross for disse deviklingen, pålitelig kvantifisering av elbiler fortsatt utfordrende. Tradisjonelt er indirekte kvantifisering metoder som brukes, noe som er avhengig av kvantifisering av totalt proteininnhold, eller spesifikke proteiner. Selv om mye brukt, disse teknikkene ikke står for protein-per-EV forskjeller, og ikke diskriminerer mellom forurensende protein aggregater og proteiner i elbiler. Videre har disse teknikkene krever isolering av elektriske biler, som i mange tilfeller gjør sammenligning av EV-konsentrasjoner i biologiske prøver umulig.
Derfor er arbeidet gjennomført for å utvikle nye metoder som gir mulighet for mer presis og direkte EV måling 10. Denne rapporten beskriver bruken av tunbare resistive puls sensing (trps) for pålitelig kvantifisering og størrelse profilering av elbiler.
For tiden er qNano instrumentet (figur 1a) er den eneste kommersielt tilgjengelige plattform for trps. I trps, et ikke-ledende elastisk membran krydres with en nanostørrelse pore er å skille to væske celler. En av de væske cellene er fylt med prøven av interesse, mens den andre cellen er fylt med partikkel-frie elektrolytt. Ved å påtrykke en spenning, er en ionisk strømnings / elektrisk strøm opprettes, som endres ved overføring av partikler gjennom poren (Figur 1b). Størrelsen av denne strøm blokade ('resistive puls') er proporsjonal med volumet av partikkelen 11 (figur 1c). Blokade varighet kan brukes til å vurdere det zeta-potensialet for partiklene, som er avhengig av partikkelegenskaper som charge eller form 12. Størrelses profilering av ukjente partikler kan utføres ved å sammenlikne de resistive pulser forårsaket av de ukjente partikler med de resistive pulser forårsaket av partikler kalibrerings med en kjent diameter. I tillegg til størrelsen av en blokade hendelse, er hastigheten som disse oppstår måles. Dette tellerate Relies på partikkelkonsentrasjonen. Siden konsentrasjonen og frekvensen av blokkader er lineært proporsjonal 13, ved hjelp av en enkelt kalibreringsprøve med partikler av kjent konsentrasjon og partikkelstørrelse gjør det mulig for måling av konsentrasjonen og størrelsesfordeling 14 11 av en ukjent prøve.
Bevegelsen av partikler gjennom nanopore bestemmes av elektro kinetic- (elektroforetiske og elektro-osmotisk) og fluidic krefter 15. Ved hjelp av de variable trykkmodulen (VPM) en trykkforskjell mellom fluid celler kan induseres som en ekstra kraft. Påføring overtrykk øker strømningshastigheten av partiklene, som kan være til nytte når partikkelkonsentrasjonen er lav. Dessuten kan trykk påføres for å redusere effekten av elektrokinetiske krefter. Dette er spesielt viktig når du bruker nanopores med en relativ liten pore diameter (NP100, NP150 og muligens NP200) som ofte brukes for påvisning av elbiler.For disse nanopores, selv ved anvendelse av vesentlig trykk, de elektro-kinetiske krefter kan, avhengig av partikkel-overflateladning, forblir nonnegligible 16. Ved måling av partikkelhastighet i flere trykk, en elektrokinetisk korrigert, og således mer nøyaktig, kan EV konsentrasjonen beregnes.
Her blir detaljerte protokoller gitt for å bestemme størrelsesfordelingen og konsentrasjonen av el-biler. Ved siden av ordinær drift protokollen, er en alternativ tilnærming beskrevet hvor prøvene er tilsatt isopor perler av kjent størrelse og konsentrasjon 17. Denne sanntids-kalibreringsteknikken kan brukes til å overvinne noen av de tekniske utfordringene som oppstår ved måling av EV direkte i biologiske væsker, slik som urin, plasma og cellekultur supernatant, eller når stabiliteten av nanopore over en lang periode av måletiden ikke kan bli sikres.
Protocol
1. Standard Operating Protocol
1.1 Instrumentoppsett og Prøvepreparering
- Koble apparatet til en datamaskin med Izon Control Suite-programvaren installert.
- Velg nanopore størrelse å bruke: for størrelse og konsentrasjonsmåling av elbiler en NP150 (target størrelsesområdet 85-300 nm) eller NP200 (target størrelsesområdet 100 - 400 nm) er mest brukt. Når man arbeider med el-biler som er blitt isolert ved hjelp av en protokoll som involverer fjerning av større el-biler, for eksempel ved å føre prøven gjennom et 220 nm filter, en pore NP100 (target størrelsesområdet 70-200 nm) kan brukes. Når du arbeider med elbiler i en biologisk prøve eller elbiler isolert ved hjelp av en annen protokoll, kan NP200 brukes, da det vil komme tett sjeldnere. Andre nanopores som NP300 (target størrelsesområdet 150-600 nm) eller NP400 (target størrelsesområdet 200-800 nm), eller til og med større nanopores, kan brukes for større typer av el-biler.
- Velg polystyren calibrasjon partikler som utfyller nanopore valgt i trinn 1.1.2. For en NP100, NP150 og NP200 nanopore bruke CPC100, CP100 og CPC200 partikler, henholdsvis. For nøyaktig størrelse estimering, sikre at partiklene kalibrerings har en lignende størrelse som de ukjente partikler.
- For å sikre homogeniteten av partiklene kalibrerings, vortex-kort (30 sek). Eventuelt søke lydbehandling å fjerne aggregater.
- Fortynn partiklene kalibrerings i PBS til den bestemte konsentrasjonen i et volum på minst 40 mikroliter. Merk: Målet konsentrasjonen varierer basert på nanopore valgt i trinn 1.1.2. Målkonsentrasjoner leveres med nanopores.
- Bruk og direkte fjerne 78 mL PBS på nedre væske celle; denne fukting av den nedre fluidcelle reduserer risikoen for luftbobledannelse under nanopore ved anvendelse av en elektrolytt til den nedre fluidcellen når nanopore er i stilling.
- Plasser nanopore på de fire armer av instrumentet. Brukde digitale calipers å måle avstanden mellom to motsatte armer og angir avstanden i mm inn i "Stretch" tekstfeltet og klikk "kalibrere strekk" for å kalibrere nanopore strekningen.
- Strekk nanopore til 47 mm, ved å dreie sidehjulet og derved å øke avstanden mellom de motstående armer av instrumentet før reapplying 78 mL PBS til den nedre fluidcellen.
Merk: Elektrisk interferens kan vesentlig påvirke kvaliteten av målingene. Når du bruker en laptop til å kjøre Izon Control Suite-programvare, må den bærbare datamaskinen er koblet til strømnettet ved hjelp av en jordet stikkontakt og plugg. Mobiltelefoner holdt nær instrumentet kan også være en kilde for elektriske forstyrrelser. Elektrisk interferens er observert som stadig gjentatte topper i referansestrøm, ofte med root mean square (RMS) støy> 10 Pa.
Merk: Nesten alle buffer kan brukes til å fortynne partikler kalibrerings og elbiler for trps karakteristiske gjestgzation. Nærværet av salter er en forutsetning for etablering av en elektrisk strøm. For EV målinger bruke PBS som en buffer. Kalibrerings partikler skal fortynnes i samme buffer som elbiler for å sikre nøyaktige målinger.
1.2. Bestem de optimale innstillingene for måling
Merk: Før opptak, er det viktig å etablere optimale måleinnstillinger. Blokade magnitude forårsakes av en partikkel som passerer gjennom nanopore er avhengig av det anvendte strekke og den spenning som påtrykkes. For pålitelige målinger RMS støy bør være <10 pA og modus blokaden omfanget bør være> 0,1 nA.
- Plasser den øvre fluidcelle og skjerming buret på nanopore og innføre 40 pl av fortynnede partikler kalibrerings i den øvre fluidcellen. Bruk VPM å søke ≥0.8 kPa overtrykk.
- Reduser det påførte strekk sakte mot 44 mm mens analysere blokade hendelser forårsaket av kalibreringspartikler. Merk: Når reduksjons diameter pore bevegelse av partiklene gjennom nanopore vil være mindre sannsynlig og dermed partikkelhastighet vil avta. Imidlertid, på grunn av økt relativ blokade av pore et større blokade arrangement vil oppstå som resulterer i forbedret signal-til-støy-forhold. Økning av spenningen kan ytterligere øke blokade størrelsesorden, men kan også øke RMS-støy.
- Reduser strekningen inntil egnede blokade hendelser (Figur 1c) er observert i "Signal Trace" panel. (Mode> 0,1 NA) og tilsvarende partikkelfrekvensen er> 100 / min. Merk: Det partikkelhastighet er en mindre streng kuttes, men som målinger av minst 500 partikler er ideell, vil partikkelhastigheter på <100 / min forårsake opptak lengder på minst 5 min. Partikkel priser høyere enn 2000 / min kan resultere i mindre nøyaktige målinger (hvis de finnes, bør prøve fortynning utføres).
1.3 Måling av kalibreringPartikler, Vasking av Uper Fluid Cell og Sample Måling
- I denne delen elbiler fra cellekultur supernatanten av glioblastoma multicellelinje U87-MG / EGFRvIII er preget. Isoleringen og fremstilling av disse EV har tidligere blitt beskrevet og visualisert 18.
- Plasser partiklene kalibrerings i den øvre fluidcellen. Bruk kraft (for eksempel 0,8 kPa) med VPM og rekord> 500 partikler.
- Ved å utføre en flertrykkmåling, øke påført trykk (for eksempel 1,0 kPa) og registrere en andre kalibrerings fil. Merk: Et minimum på 0,2 kPa forskjell er nødvendig.
- Fjern kalibreringsprøve fra den øvre fluidcellen. Vask den øvre fluidcellen 3 ganger med 100 ul PBS for å fjerne gjenværende partikler. Før innføringen av prøven inn i den øvre fluidcelle, å bruke lofri vev for å fjerne eventuelle gjenværende PBS fra den øvre fluidcellen.
- Innføre prøven til den øvre fluidcellen. Kontroller at referansestrømmen er innenfor 3% av grunnlinjestrøm observert ved måling av partiklene kalibrerings. Hvis ikke innen 3%, anvende strategien beskrevet nedenfor for å stabilisere utgangsstrøm. Påfør den eksakte press som brukes til partiklene kalibrering og spille inn eksempelfilene.
Merk: Partikkel sats tomten skal vise konstant partikkeldeteksjon (figur 2a). I tilfelle av plutselig avbrytelse av partikkelregistrering, et plutselig fall i utgangsstrøm, eller en plutselig økning i RMS-støy, kan pore bli tilstoppet; dermed stanse innspillingen. For å gjenopprette grunnlinjen, trykk eller vri skjerming cap, bruke stempelet, eller helt fjerne nanopore og vaske den med avionisert vann og sett den på instrumentet.
Merk: Alternativt øke nanopore strekningen til 47 mm i kombinasjon med maksimal press fra VPM for ca 5 min.
1.4 Data Analysis
- Klikk på "; Analysere data "for å gå inn i analyse-delen av programvaren. Behandle kalibrering og eksempelfiler ved å høyreklikke på "Ubehandlet Files" og velge "Process Files".
- Klikk i boksen ved siden av prøven i "kalibrert" kolonnen til par eksempelfilene til opptakene kalibrerings. Velg tilsvarende prøve og kalibrerings filer, og klikk "OK". Merk: når du bruker multi-press kalibrering alternativet velg "Multi-press kalibrering" fanen til venstre for å koble flere prøver til flere filer kalibrerings.
- Når hell kombinert, vil Izon Control Suite-programvaren vise ulike sample egenskaper som en størrelse-distribusjon (Figur 2b), baseline varighet, full bredde halv maksimum (FWHM) og en konsentrasjon analyse. Alternativt: For hver prøve, individuelle datapunkter kan eksporteres som en kommaseparert fil.
2. Enlternative Protocol - Spike Prøver med Kalibrerings Perler
Merk: Generelt kan det standard prosedyre brukes ved arbeid med isolerte elbiler. Når du arbeider med ikke-isolerte elbiler i biologiske prøver, eller isolerte EV forberedelser forurenset med store protein aggregater, opererer instrumentet kan være utfordrende. Utfordringene består hovedsakelig av en høy grad av nanopore blokkering (plutselig fall i utgangsstrøm), manglende evne til å gjenopprette utgangsstrømmene innenfor 3% av kalibreringsmåling eller signifikante forskjeller i partikkelhastigheter mellom identiske prøver (figur 3a). For prøver som viser disse vanskelighetene en alternativ protokoll for å kvantifisere elbiler ble utviklet 17. Denne metode er avhengig av innføring av større polystyren kalibrerings perler inn i prøven av interesse (figur 3b). En detaljert prosedyre for denne alternative protokoll er diskutert nedenfor.
2.1. SampleForberedelse
Merk: Ved tilberedning av prøvene ved å bruke den alternative fremgangsmåte, er det ønskelig å etablere en EV-til-perle-forhold på omkring 1. Dessuten er det nødvendig å inkludere en "kalibrerings vulsten bare 'prøven, for å tillate nøyaktig" gating "av perler og kalibrering for å bestemme antallet bakgrunns partikler (for eksempel protein-aggregater) til stede i bufferen.
- Sentrifuger 100 pl cellekultur supernatant til 7 min ved 300 xg
- Tilsett 20 pl av supernatanten til 20 mL PBS og 10 pl 75 ganger fortynnet 335 nm polystyrenkuler (stock 7e10 / ml).
2.2. Eksempel Måling
- Bruke strategien som er beskrevet i kapittel 1.2 for å bestemme optimale instrumentinnstillinger.
- Mål 'kalibrering perle bare "prøve først. Påse at bakgrunnen påvisning av små ikke-kulepartikler er så lav som mulig (<10% av kulene).
- Måle hver enkelt SAmple gang før innspillingen replikerer for å fordele svingninger i nanopore forhold likt over de ulike prøvene. Mål minst 3 replikater av hver prøve.
- Du måle 'kalibrering perle bare "prøve etter endt innspilling av alle prøvene.
2.3. Data Analysis
Merk: Når du bruker alternativ protokollen, gjør eksklusiv bruk av Izon Control Suite-programvaren nok ikke for konsentrasjon beregning. Ytterligere regnearkprogrammer er nødvendig. Tabell 1 viser et eksempel på beregning av konsentrasjonen av prøvene som er avbildet i figur 3.
- Åpne 'kalibrering perle bare "prøve og en eller flere eksempelfiler.
- Bestem hvilke blokade event størrelse (i NA) kan brukes som en cut-off for skillet mellom elbiler og isopor perler. Bestemme blokaden verdi (nA) som tilsvarer den venstre foten av polystyrenkuler populasjonen (
- Hente verdiene av det totale partikkeltelling for hver prøve ved å klikke på "Particle Analyse Summary"-kategorien av prøven.
- Filtrere datasettene ved hjelp av cut-off nivå bestemt i trinn 2.3.2. ved å velge "Datafiltrering" pop-up. Kun visning partikler mindre enn cut-off.
- Hente verdiene av EV-telling for hver prøve fra "Particle Analyse Summary".
- Trekk fra mengden av el-biler fra de totale partikler for å bestemme mengden av perler kalibrerings.
- Bestem EV-til-perle prosent ved å dividere EV telling etter kalibrering perle teller.
- Bestem den gjennomsnittlige bakgrunnsforholdet ved å ta gjennomsnittet av forholdstall er fastsatt for hvert &# 8220; perle bare "kalibrering prøven. Trekk fra denne verdien fra hver enkelt prøve.
- Multipliser justerte EV-til-perle forholdet av konsentrasjonen av perler kalibrering for å bestemme konsentrasjonen av el-biler for hver prøve.
- Multipliser konsentrasjonen funnet i trinn 2.3.9 ved EV fortynningsfaktoren innført ved tilsetning av perler kalibrerings til EV prøven. Merk: I eksemplet prøveoppsett, er den totale fortynning av prøven i PBS og perler kalibrerings 2,5 ganger og dermed konsentrasjonen funnet i trinn 2.3.9 skal multipliseres med 2,5 for å bestemme den rå EV prøvekonsentrasjon.
- Beregn statistikk som gjennomsnitt, standardavvik og standard feil av gjennomsnittet for hver gruppe av replikater.
Merk: I noen tilfeller overlapper mellom elbiler og piggete isopor perler er observert. Hvis korreksjon for undervurdering av EV konsentrasjon er nødvendig, bør prøvene uten piggete isopor perler også måles. Bruk samme kuttav som bestemt i trinn 2.3.2 for å bestemme en "kule-til-EV"-forhold, for å beregne forholdet av el-biler som faller innenfor rekkevidden av de piggete polystyrenkuler. Denne perle-til-EV forholdet bør legges til EV-til-perle ratio bestemt i trinn 2.3.8.
2.4. Valgfritt: EV Størrelse distribusjon med den alternative metoden.
- Åpne en sample opptak to ganger i Control Suite Software.
- Sett filteralternativene i en av prøvene for å vise bare partikler større enn cut-off bestemt ovenfor. Dette vil vise bare partiklene kalibrerings.
- Sett den filtrerte prøven til "kalibrering fil" og gå inn i modus størrelsen på perler kalibrerings.
- Par eksempelfilen og "kalibreringsfilen" opprettet i trinn 2.4.3 som beskrevet i 1.4.2. Eksempelfilen vil nå vise en størrelsesfordeling av både elbiler og perler kalibrering basert på piggete kalibrerings perler.
Merk: Standard operaTing protokollen vil oftest være nok for bestemmelse av størrelse-distribusjoner av elbiler. Noen ganger er imidlertid nøyaktige bufferkomponenter er kjent (for eksempel i plasma eller urin) som gjør det umulig å fremstille en prøve av perler kalibrerings i den samme buffer som den EV av interesse. En EV prøven tilsatt partikler kalibrerings kan brukes til EV størrelse-estimering i disse spesifikke betingelser.
Representative Results
For å bruke trps instrument, har en ikke-ledende nanopore å bli plassert på de fire armer av maskinen (figur 1a) og en spenning (figur 1b) har til å bli anvendt. Når en elektrisk utgangsstrøm er etablert, vil resistive pulser forårsaket av partikler som passerer gjennom pore bli detektert som illustrert i figur 1c.
EV ble renset fra cellekultur supernatant av glioblastoma cellelinje U87-MG / EGFRvIII ved ultrasentrifugering. En stabil partikkelhastighets Tomten er observert ved måling de isolerte elbiler (figur 2a) på en NP100 nanopore. Denne stabile partikkelhastighet-tomten er nødvendig for en pålitelig EV konsentrasjonsmåling. Etter sammenkobling EV-sample opptak til et opptak av 115 nm polystyren kalibrerings perler, en størrelsesfordeling (Figur 2b) og konsentrasjon estimat på EV-prøven kan fås (data ikke vist).
(Figrue 3a). Dette resulterer i unøyaktige EV konsentrasjons estimater. Ved å tilsette prøven med polystyrenkuler med kjent konsentrasjon og størrelse, kan en EV-til-perle-forhold bestemmes. Figur 3b illustrerer de resultatene som ble oppnådd etter spiking cellekultur supernatant med polystyrenkuler av 335 nm i størrelse. To klare populasjoner er observert. Partiklene som induserer en blokade av mindre enn 0.46 na, er målbevisste elbiler, de større partiklene er bestemt polystyren perler. Forholdet av el-biler til polystyren-perler blir brukt til å regne ut konsentrasjonen av rå EV (tabell 1). Figur 3c illustrerer størrelsen estimering av de to populasjoner basert på de piggete polystyrenkuler. Den nanopore oppsett brukt remedført at påvisning av elbiler> 140 nm i størrelse. Dette kan senkes ved å redusere nanopore åpningen, men dette vil også føre til mer tilstopping hendelser.
Figur 1: qNano instrument og virkemåte. (A) Fotografi av instrumentet. En nanopore er anbragt på instrumentet, separering av en nedre fluidcellen fra en øvre fluidcellen. Væsken cellene er beskyttet mot miljø elektrisk interferens ved skjerming cap. (B) Illustrasjon skisserte tunbare resistive puls sensing (trps). En ikke-ledende elastisk nanopore er separering av to væske celler. Ved å påtrykke en spenning av en elektrisk strøm er etablert gjennom pore punktert i nanopore. Som ekstracellulære vesikler bevege seg gjennom nanopore, er den ioniske strømmen endres og detekteres som en resistiv puls. I trps åpningsstørrelse på nanopore kan være innstilt (reduseres eller økes) ved å strekke nanopore ved å øke avstanden mellom de motstående armer av instrumentet, eller redusere denne avstand. (C) illustrerende eksempel på resistive pulser. Størrelsen på en enkelt resistive puls er proporsjonal til volumet av partikkel:. Større pulser indikerer større partikler Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Partikkel telle-plot og størrelse-distribusjon hentet fra måle isolerte elbiler fra U87-MG / EGFRvIII cellekultur supernatanten (A) Partikkel telle-plot som indikerer samlet konstant partikkeldeteksjon.. Kort reduksjon av spele deteksjon ble observert mellom 80 og 100 sekunder av opptaket. Etter pause opptaket og trykke på skjerming cap, partikkelhastighet stabilisert seg etter opptaket ble gjenopptatt. (B) Størrelsesfordelingen av isolerte elbiler er plottet etter kalibrering ukjent prøve (elbiler) til 115 nm polystyren kalibrerings perler. (5 nm bin størrelse). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: trps kvantifisering av el-biler i cellekultur supernatant ved å bruke den alternative protokoll. (A) Typiske partikkel-rate tomter innhentet ved måling av elbiler direkte i en biologisk væske. Pore clogging forårsaker korte avbrudd og svingninger i frekvensen av partikkeldeteksjon. Hvertplott representerer en gjengivelse måling av den samme prøven (B). Tre replikere størrelse-fordeling grafer som oppnås etter spiking cellekultur supernatant med 335 nm polystyren kalibrerings perler. Alle partikler som induserer en resistiv puls på mindre enn 0,46 nA er valgt som EV. (C) De piggete polystyrenkuler kan brukes for å oppnå en størrelsesfordeling av prøven. (5 nm bin størrelse). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Måling | Kalibrering bare # 1 | Kalibrering bare # 2 | Supernatant # 1 | Supernatant # 2 | Supernatant # 3 |
| Gjennomsnittlig Strøm (NA) | 117 | 120 | <td> 116118 | 120 | |
| Partikkelhastighet | 172 | 194 | 250 | 246 | 196 |
| cutoff brukes (NA) | 0.46 | 0.46 | 0.46 | 0.46 | 0.46 |
| Totalt antall partikler | 303 | 317 | 489 | 488 | 454 |
| Ekstracellulære vesikler | 3 | 1 | 213 | 215 | 213 |
| Spiked kalibrerings perler | 300 | 316 | 276 | 273 | 241 |
| EVS / perler kalibrerings | 0,01 | 0.003 | 0.772 | 0.788 | 0.884 |
| Sample - bakgrunn | 0.765 | 0,781 | 0.877 | ||
| Extracelullar vesikler (10 7) / Ml | 7.14 | 7.29 | 8.18 | ||
| Eksempel 2.5x utvannet | |||||
| Raw konsentrasjons elbiler (10 7) / ml | 17.85 | 18.22 | 20.46 |
Tabell 1:. Eksempel beregning av EV konsentrasjon ved hjelp av alternative protokollen en cut-off verdien er fast bestemt på å skille elbiler fra perler kalibrerings. Deretter kan det totale antall elbiler og perler hentes. For hver måling av EV-til-perle-forhold er beregnet. Mengden av bakgrunns partikler i elektrolytt (for eksempel protein-aggregater) beregnes ved å ta gjennomsnittet av EV-til-perle-forhold for de enkelte målinger av den "perler kalibrerings bare 'prøven. For hver prøve bakgrunnsforholdet subtraheres fra den oppnådde forholdet. Dette adjusted-forhold er multiplisert med konsentrasjonen av perlene kalibrerings i prøven (i dette eksempel: 9.33e7 / ml). For å bestemme konsentrasjonen av rå el-biler, er den oppnådde konsentrasjon multiplisert med den totale EV fortynningsfaktoren (i dette eksempel: 2,5).
Discussion
Protokollen beskrevet i dette manuskriptet tilbod metoder for kvantifisering og størrelse karakterisering av elbiler bruker trps. De store fordeler ved den trps plattformen er den lille prøvestørrelse, relativ kort varighet for måling og fravær av ønskede prøve manipulasjon.
Forutsetning for nøyaktig trps måling er å holde forholdene identiske mellom kalibrering og prøvemålinger. Dette omfatter bruk av identiske buffere, så vel som identiske instrumentinnstillinger, slik som nanopore størrelse, spenning og påført trykk. Den opprinnelige VPM mangler en mekanisme for nøyaktig innstilling av det påførte trykk, og dermed forårsaker mindre forskjeller i anvendt trykk mellom prøvene. Dessuten kan fordampningen av priming fluid i VPM indusere små trykkforskjeller ved måling ved ulike tidspunkt og VPM bør derfor ofte være re-primet. Disse begrensninger har potensielt blitt løst ved innføringen av VPM2, somhar en klikk-basert skalering og er lufttrykket basert.
Den alternative protokoll beskrevet i dette manuskriptet er spesielt egnet for måling av el-biler i ikke rensede biologiske prøver 17. Vi tror at bufferkomponenter, for eksempel sukker, lipider, proteiner og andre større rusk, kan i noen tilfeller påvirke måleforholdene for mye for protokollen til å være aktuelt. Tilsetning av perler kalibrerings til prøven i stedet for å sammenlikne to separate målinger introduserer 'sanntid kalibrering'. Denne metoden er spesielt egnet ved sammenligning av prøvene (for eksempel blodplasma fra forskjellige donorer) som har forskjellige og / eller ukjente fluidic bakgrunnsinnholdet. Selv om det er forskjeller mellom elbiler og polystyren partikler (for eksempel partikkeltetthet og overflate kostnad), teoretiske modeller samt eksperimentelle data understbrukbarheten av isopor perler for kvantifisering og størrelse profilering av elbiler,under forutsetning at betydelig trykk påføres 15,19. For å minimere påvirkning av elektrokine styrker, er bruken av relativt større NP150 / NP200 nanopore og betydelig overtrykk anbefales.
Elbiler og perler kalibrerings er preget av størrelse. Følgelig, har til å bli åpnet ved å påføre strekk, til en diameter der påvisning av både elektriske biler og de større partikler kalibrerings er observert nanopore. Etter åpning av pore vil redusere følsomheten overfor mindre partikler, Evs bare er større enn en viss størrelse blir registrert (ofte EV> 120 nm ved bruk av en 335 nm kalibrerings bead). Minstedeteksjonsgrensen for elbiler kan bli redusert til ca 90 nm, ved hjelp av 203 nm kalibrerings perler på en NP150 nanopore. Imidlertid kan dette oppsettet være unviable når større elbiler indusere hyppig tilstopping av nanopore. Tilstedeværelsen av disse sperrer elbiler kan tvinge utnyttelse av et oppsett der en befolkning på elbiler, for lite til å reaCH deteksjonsgrensen, vil ikke bli oppdaget.
Vanskeligheten med å operere systemet øker når man prøver å måle partikler mindre enn 100 nm i størrelse. I slike tilfeller kan deteksjon kan forbedres ved å øke saltkonsentrasjonen i elektrolytten. En økt ion konsentrasjonen vil indusere relativt økte blokade størrelser for små partikler (større signal-til-støy-forhold). Levedyktighet av denne teknikken for målinger av elbiler må valideres skjønt, som økte saltkonsentrasjoner kan påvirke volumet av elbiler.
Som konklusjon kan det trps plattformen skal brukes for direkte kvantifisering og størrelse karakterisering av el-biler. Siden ingen isolering eller EV manipulering (antistoff-bindende eller fluorescerende merking) er nødvendig, er plattformen egnet for direkte kvantifisering EV i biologiske fluider. Et alternativ protokollen er gitt som kan være gunstig for prøver der bufferkomponenter indusere betydelig pore clogging hendelser, noe som gjør pålitelig utnyttelse av standardprotokollen unviable.
Disclosures
Utviklingen av den skisserte protokollen og skrivingen av dette manuskriptet har blitt støttet, delvis av den nederlandske Brain Foundation, Schumacher Kramer Foundation, og Bohnenn fondet. Produksjon av denne video-artikkelen ble delvis sponsorted av Izon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| qNano instrument | Izon Science Ltd. | N/A | |
| Variable pressure module | Izon Science Ltd. | N/A | |
| Nanopore | Izon Science Ltd. | NP100, NP200 | Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes. |
| Calibration Particles | Izon Science Ltd. | CPC100, CPC200, CPC400 | Calibration particles are available in different sizes. |
| Sonication bath | Multiple available | Basic sonication bath is sufficient | |
| (Mini) vortexer | Multiple available | ||
| Lift-free tissues | Multiple available | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Multiple available | ||
| Windows based computer | |||
| Izon Control Suite 2.2 | Izon Science Ltd. | N/A | |
| Spreadsheet Software | Multiple available | N/A |
References
- Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature reviews. Drug discovery. 12, 347-357 (2013).
- Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis. Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 11, 24-35 (2013).
- Lee, T. H., et al. Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer--the emerging science of cellular 'debris'. Seminars in immunopathology. 33, 455-467 (2011).
- Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. 9, 871-881 (2008).
- Bobrie, A., et al. Rab27a supports exosome-dependent and -independent mechanisms that modify the tumor microenvironment and can promote tumor progression. Cancer research. 72, 4920-4930 (2012).
- Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nature medicine. 18, 883-891 (2012).
- Al-Nedawi, K., et al. Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFRvIII by microvesicles derived from tumour cells. Nature cell biology. 10, 619-624 (2008).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature cell biology. 10, 1470-1476 (2008).
- Dommelen, S. M., et al. Microvesicles and exosomes: opportunities for cell-derived membrane vesicles in drug delivery. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 161, 635-644 (2012).
- Pol, E., Coumans, F., Varga, Z., Krumrey, M., Nieuwland, R. Innovation in detection of microparticles and exosomes. Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 11, 36-45 (2013).
- Vogel, R., et al. Quantitative sizing of nano/microparticles with a tunable elastomeric pore sensor. Analytical chemistry. 83, 3499-3506 (2011).
- Kozak, D., et al. Simultaneous size and zeta-potential measurements of individual nanoparticles in dispersion using size-tunable pore sensors. ACS. 6, 6990-6997 (2012).
- Willmott, G. R., et al. Use of tunable nanopore blockade rates to investigate colloidal dispersions. Journal of physics. Condensed matter : an Institute of Physics journal. 22, 454116-4510 (2010).
- Roberts, G. S., et al. Tunable pores for measuring concentrations of synthetic and biological nanoparticle dispersions. Biosensor. 31, 17-25 (2012).
- Vogel, R., Anderson, W., Eldridge, J., Glossop, B., Willmott, G. A variable pressure method for characterizing nanoparticle surface charge using pore sensors. Analytical chemistry. 84, 3125-3131 (2012).
- Kozak, D., Anderson, W., Trau, M. Tuning Particle Velocity and Measurement Sensitivity by Changing Pore Sensor Dimensions. Chemistry Letters. 41, 1134-1136 (2012).
- Vrij, J., et al. Quantification of nanosized extracellular membrane vesicles with scanning ion occlusion sensing. Nanomedicine. 8, 1443-1458 (2013).
- Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. (3037), (2012).
- Yang, L., Broom, M. F., Tucker, I. G. Characterization of a nanoparticulate drug delivery system using scanning ion occlusion sensing. Pharmaceutical research. 29, 2578-2586 (2012).
