Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

В сочетании ДНК-РНК Люминесцентная Published: June 14, 2014 doi: 10.3791/51628
Automatic Translation
1, 1
1Department of Reproduction and Development, Erasmus MC - University Medical Center

Summary

Люминесцентная в гибридизация (FISH) позволяет обнаружить нуклеиновых кислот в их родной среде внутри клетки. Мы здесь опишем протокол для комбинированной, одновременного обнаружения РНК и ДНК с помощью FISH, который может быть использован для изучения инактивации Х-хромосомы в мышиных эмбриональных стволовых клеток.

Abstract

Флуоресцентный в гибридизация (FISH) представляет собой молекулярный метод, который позволяет обнаруживать нуклеиновых кислот в клетки. РЫБЫ ДНК часто используется в цитогенетики и диагностики рака, и может обнаружить аберрации генома, которые нередко имеют важное клиническое значение. РНК FISH может быть использован для обнаружения молекулы РНК в клетках и предоставил важную информацию в регуляции экспрессии генов. Сочетание ДНК и РНК FISH в одной камере технически сложным, так как условия, пригодные для ДНК FISH может быть слишком суровыми для хрупких, одноцепочечными молекул РНК. Мы здесь представляем легко применимый протокола, который позволит комбинированный, одновременное обнаружение Xist РНК и ДНК, кодируемый Х-хромосомы. Это в сочетании протокол FISH ДНК-РНК может, вероятно, быть применены к другим системам, в которых необходимо как РНК и ДНК, которые будут обнаружены.

Introduction

Изучение клеток и тканей с помощью флуоресцентной в гибридизация (FISH) с момента своего появления в конце 1970-х 1, позволило исследователям изучить гены, организации хроматина и экспрессии генов на субклеточном уровне. РЫБЫ ДНК часто используется в цитогенетики, кариотипирование 2, диагностики рака 3 и предимплантационной генетического скрининга 4, и имеет важную роль в молекулярных исследований 5-6, так как это позволяет обнаружить нуклеиновых кислот в их родной среде. Одноместный анализ экспрессии клеток РНК FISH может обнаружить родные первичных транскриптов и некодирующие РНК транскрибируется от хромосом, и дает преимущества с другими методами, которые оценивают экспрессию генов на уровне населения, в том числе, например, количественной ОТ-ПЦР, геном широкий анализ экспрессии или Северная блоттинга . Визуализируя РНК-транскриптов, происходящих непосредственно со своих сайтов происхождения, он, например, былзаметил, что экспрессия гена является стохастической 7, а иногда может быть аллельспецифический 8. Улучшения в технике даже позволяли обнаружение и количественное определение отдельных молекул мРНК в клетках 9-11.

Основной принцип состоит из FISH-гибридизации нуклеиновых кислот в клетке с зондом нуклеиновой кислоты с помощью высоко специфического Уотсон и Крик спаривания оснований. Зонд может быть прямо или косвенно обнаружено, что приводит к сигналу, который может быть визуализированы под микроскопом. Первоначальные попытки состоял из радиоактивно меченых зондов, которые имели недостатки основе по вопросам безопасности, ограниченного пространственного разрешения и способности обнаружить только один цель одновременно 12-14. Последующее развитие нерадиоактивных меток, включая флуорохромами, гаптенами и ферментов, позволило широкое распространение использование рыбы, как рутинной техники молекулярной биологии. РЫБЫ зонд либо могут быть непосредственно помечены fluorochROMES по химическому связыванию флуоресцентных молекул нуклеиновой кислоты в последовательности 15 и интеграции флуоресцентно меченых нуклеотидов 16-19, или зонд может быть косвенно визуализированных после интеграции гаптенов (в том числе биотин и дигоксигенин) и иммунологической детекции гаптенов на гаптен специфических антител, конъюгированных с люминесцентные репортер молекул 20-21. Последний подход позволяет усиление сигнала с помощью нескольких слоев флуоресцентно меченых антител, которые используются для повышения исходный сигнал, и позволяет обнаруживать РНК видов, которые экспрессируются на низких уровнях. Комбинируя прямые и косвенные методы маркировки и различные гаптенов, несколько целей могут быть одновременно визуализировать в пределах одной ячейки.

Одним из наиболее важных шагов в протоколах рыба гибридизация зонда к своей цели. Хотя теоретически, зонд специфически связываются только с его мишенью, на практике это специфичностьне всегда достигается, в качестве зондов могут связываться с гомологичными участками, и условия гибридизации не всегда будет идеальным для конкретного региона ДНК или РНК видов. После гибридизации моет, следовательно, особенно важное значение, поскольку они могут увеличивать строгость процедуры рыба, и может предотвратить неспецифическое связывание рыбы зондов, что приведет к высокому уровню фонового шума. Как Молекулы РНК одноцепочечную они могут быть легко гибридизуют с зондом FISH. В противоположность этому, двухцепочечной молекулы ДНК сначала должен стадии денатурации, после чего зонд может гибридизоваться. Это обычно достигается путем нагревания образца, что приводит к денатурации ДНК. Тем не менее, в этих тяжелых условиях, хрупкие, одноцепочечные молекулы РНК могут быть потеряны. Таким образом, в сочетании ДНК-РНК FISH требует значительного оптимизацию условий, и более технически сложным по сравнению с отдельной обнаружения только РНК или ДНК.

Здесь мы изложета Подробный протокол комбинированного, одновременного ДНК-РНК FISH, который позволил нам изучить Х-хромосома инактивации (XCI) в дифференциации женский мышиных эмбриональных стволовых клеток 22-24. XCI является одним из важнейших эпигенетические механизм женского эмбрионального развития 25, и приводит к хроматина и, следовательно, заставить замолчать одного из двух Х-хромосом в женских особей 26-27. Существенное значение для этого процесса является некодирующих РНК Xist 28-30, который регулируется RNF12 22-23 и Rex1 24 белков. Xist экспрессия становится активируется на будущей неактивной Х-хромосоме (Xi) во время эмбрионального развития или по дифференциации клеток ES в пробирке , и может распространяться по Х-хромосоме и тем самым привлечь хроматина ферменты, которые приводят к транскрипции закрытия Х-хромосоме 31. Это распространение Xist РНК могут быть визуализированы РНК FISH в виде покрытия на хромосоме Xнекоторых, который также упоминается как Xist облака. Поскольку женские стволовые клетки могут потерять один из своих Х-хромосом из-за нестабильности генома, мы и другие использовали комбинированную ДНК-РНК FISH учиться XCI, чтобы убедиться, что только кариотипически стабильные клетки оцениваются в анализе этого важного процесса 22,32 -34. Как и в любом молекулярной техники биологии, несколько различных отличные протоколы были опубликованы 35-38. Здесь мы представляем наш метод, начиная с индукции дифференцировки в ЭС клеток мыши, для фиксации клеток, маркировки рыбы зонды ник-трансляции, предварительной обработки основных клеток, чтобы позволить пермеабилизации и последующее поглощение зонд, гибридизация зонда мишенью, и, наконец, обнаружение зонда по флуоресцентно меченых антител. Протокол здесь представлены позволяет верный обнаружение Xist РНК и Х-хромосомы в течение двух дней, и основы этого метода, вероятно, могут быть адаптированы к аее системы и направления исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Индукции дифференцировки в женском эмбриональных стволовых клеток для стимуляции Х-хромосома инактивации

ПРИМЕЧАНИЕ: Женский мышиных эмбриональных стволовых клеток (по запросу) выращивают в стандартных условиях клеточных ES на желатинизированные чашек для культивирования, покрытых мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs). Мы здесь предполагаем, что читатель знаком с помощью стандартных методов культивирования клеток 39-41. Чтобы индуцировать дифференцировку ЭС клетки, выращенные в Т25 блюд будут отделены от MEFs, и будет помещали в дифференциации среды.

  1. Удалить среда для ЭС клеток из культуры клеток ES, и дважды промывали PBS для культивирования клеток.
  2. Добавить 1,5 мл трипсин-ЭДТА (предварительно нагревали до 37 ° С), и инкубируют клетки при 37 ° С в течение 7 мин. Через 3,5 мин, встряхните блюдо аккуратно разбить колонии.
  3. Инактивации трипсина-ЭДТК добавлением 3,5 мл среды дифференциации в клетки. Внесите клетки вверх и вниз, чтобы получить единое решение клеток, и собратьв 15 мл пробирку. Вращение в течение 5 мин при 200 х г, и собрать клетки в 10 мл дифференцировки среды.
  4. Добавить клеточной суспензии на не желатинированный культуральной чашке, и инкубируют в течение 1 ч в инкубаторе для клеточных культур. ПРИМЕЧАНИЕ: MEFs сможете присоединиться к не-желированного блюдо культуры, в то время как ЭС клетки останутся во взвешенном состоянии.
  5. В то же время, добавляют стерилизованные покровные стекла (24 х 24 мм) в 6-луночных планшетах, добавьте 0,2% желатина, и инкубируют в течение минимального 5 мин при комнатной температуре.
  6. Через 1 ч, собирают супернатант предварительно покрытием ES клеточной культуры, которая в основном состоит из не-прилипших ЭС клеток. Пластинчатые ЭС клетки в 6-луночных планшетах, содержащих покровные. ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ⅙ й из сливной T25 блюдо на 6 скважинах 6-луночный планшет. Это позволит сливающийся дифференциацию хорошо после 3 дней дифференциации. Изменение среды на ежедневной основе. Для более длинных курсов времени дифференциация, плиты предварительно металлизированных ЭС клеток в дифференциации среды в бактериальных блюд, и incubели по мобильному шейкере, интегрированного в инкубаторе для клеточных культур. Это позволит сформировать клетки эмбриональных телец, которые могут быть покрыты в покровных 1-2 дней до фиксации.

2. Фиксация Дифференцированный ES клеток для последующей ДНК-РНК анализа FISH

  1. Удалить дифференциации среды из дифференциации культур, и мыть дважды культуры клеток PBS. ПРИМЕЧАНИЕ: тщательно Добавить PBS, чтобы предотвратить клетки смывается.
  2. Удалить культуры клеток PBS и клетки исправить путем добавления 4% параформальдегида (PFA) / PBS, и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. ВНИМАНИЕ: PFA является токсичным и может вызвать значительный риск для здоровья при вдыхании или при контакте с кожей и глазами. Кроме того, PFA является канцерогенным.
  3. Удалить 4% PFA / PBS, и мыть покровные 3x с 70% этанола. ПРИМЕЧАНИЕ: Правильный стиральная важно, так как никаких следов PFA будет мешать последующих стадиях РЫБЫ. Покровные могут быть сохранены в 70%-ном этаноле при -20 ° С в течение нескольких месяцев до FISH анализ.

3. Маркировка ДНК зондов для рыб экспериментов

ПРИМЕЧАНИЕ: Получить фрагмента ДНК интересующего гена (минимальная длина> 2 кб для РНК FISH, или> 20 кб для рыб ДНК), или BAC охватывающий интересующий ген. Для обнаружения РНК, меньший зонд может быть достаточным по сравнению с выявления ДНК, так как, скорее всего, приведет к транскрипции в различных транскриптов, которые могут быть одновременно обнаружены. Для сильного сигнала на одной нити ДНК-копии, больше зонд требуется, чтобы иметь возможность обнаружить достаточное количество включенных гаптенов. Предпочтительно, нетранскрибируемые геномной область выбрана для проектирования ДНК-зонда. Кроме того, при использовании меньшего зонд для обнаружения РНК, она будет предотвращено, что геномные локусы, из которых РНК транскрибируется в настоящее время обнаружено в сочетании ДНК-РНК FISH подхода, хотя это не может быть полностью исключена. Для обнаружения мыши XIST, был использован 5,5 кб кДНК-зонд. Для опрАЗДЕЛ Х-хромосомы, несколько ВАС зонды могут быть использованы. Хорошие результаты были получены со смесью BAC RP23-100E1 и BAC CT7-474E4, которые расположены в непосредственной близости от очага Xist. В зависимости от гена или хромосомы интереса, несколько различных зондов может потребоваться для получения оптимальных результатов. Всякий раз, когда работы с материалами, которые будут использоваться для РНК-FISH, использовать стерильные наконечники фильтра, РНКазы H 2 O и работу в чистой окружающей среде.

  1. Возьмем 1 мкг ДНК и разбавленной в H 2 O в общем объеме 16 мкл. Добавьте 4 мкл дигоксигенином или биотин маркировки решение (см. реагенты), перемешать встряхиванием и инкубировать при 16 ° С в течение 90 мин. Примечание: биотин или дигоксигенином-меченых нуклеотидов теперь будут включены в ник-трансляции.
  2. В то же время, подготовить столбцы G50 для удаления не интегрированные нуклеотидов. Возьмите 2 мл шприц, снимите штампа, а также добавить стерилизованное хлопок в шприц. Добавить G50 шары в растворе то заполнить шприц, поместите шприц в 15 мл трубки и центрифуге при 642 мкг в течение 1 мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Около 80% шприца теперь должны быть заполнены G50. Повторите, когда менее G50 присутствует.
  3. Через 90 мин, добавить 40 мкл H 2 O в ник-трансляции реакционной смеси и добавить реакцию на колонке G50. Добавить пустую трубу в столбце, и центрифуге при 642 мкг в течение 2 мин. Сбор поток через в реакционной трубке.
  4. Измеряют объем потока через пипеткой, а также добавить H 2 O, чтобы достичь общего объема 200 мкл. Осадок поток через добавлением 13,3 мкл ДНК спермы лосося (10 мг / мл), 13,3 мкл дрожжевой тРНК (10 мг / мл), 26,7 мкл мыши Cot-1 ДНК (1 мг / мл) и 28 мкл 2 М, рН NAAC 5.6. Смешайте встряхиванием, и добавить 533 мкл ледяным 100% этанола. Встряхнуть пробирку и центрифуги в 16 200 мкг в течение 30 мин при 4 ° С.
  5. Удалить супернатант и мыть гранул в два раза с 70% этанола. Центрифуга на 16200 мкг в течение 5 мин при4 ° С, а воздух сухой осадок. Добавить 50 мкл 50 + растворе для гибридизации, и инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин, чтобы облегчить растворение. Примечание: меченым зондом могут быть сохранены в течение нескольких лет при -20 ° С. ВНИМАНИЕ: 50 + решение гибридизации содержит формамид, который является токсичным, может раздражать кожу, глаза и дыхательные пути, а также является тератогенным.

4. Пермеабилизации, Предварительная обработка и Гибридизация фиксированные клетки для комбинированных ДНК-РНК FISH

  1. Увлажняет фиксированных клеток на покровных стеклах, путем удаления 70% этанола и добавление культуры клеток PBS в 6-луночных планшетах с. Инкубировать в течение 5 мин. Повторите в общей сложности три раза.
  2. Удалить культуры клеток PBS, и добавить 0,2% пепсин в 6-луночных планшетах с, чтобы клетки проницаемыми. Инкубировать 6-луночных планшетах в водяной бане при 37 ° С в течение 4 мин. Удалить пепсин, и инактивировать РНКазой свободной H 2 O.
  3. После исправить путем инкубации клеток с 4% PFA / PBS в течение 5 мин при комнатной температуре. После fixatiна, дважды промывали PBS для культивирования клеток в течение 5 мин.
  4. Высушить клеток путем инкубации с 70% этанолом в течение 3 мин, 90% этанола в течение 3 мин и 100% этанола в течение 3 мин. Передача покровные из 6-луночных планшетах, и воздушные сухие покровные в течение нескольких минут.
  5. Возраст клеток путем инкубации покровные при 65 ° С в течение 1 часа на нагревательной пластине.
  6. Предварительно гибридизуются FISH зонд с мыши Cot-1 ДНК путем суммирования для каждого покровного стекла для анализа, 25 мкл 50 + растворе для гибридизации, 0,5 мкл мышиной Cot-1 ДНК, 1 мкл меченных биотином Xist зондом и 1 мкл дигоксигенином помечены BAC зонд обнаружения Х-хромосома. Смешайте на вортексе и денатурация при 99 ° С в течение 5 мин. Инкубировать немедленно при 37 ° С в течение 45 мин, чтобы позволить Cot-1 ДНК для гибридизации с повтора последовательности, присутствующие в зондов.
  7. После старения, место 50 мкл денатурации буфера (состоящие из 70% formamide/2x SSC/10 мМ фосфатного буфера) на предметное стекло, и положить покровные на вершине с клетки сталкиваются Towarспуск буфера денатурации. Инкубируют при 65 ° С в течение 2 мин.
  8. Добавить покровные обратно в 6-луночных планшетах и ​​пост-исправлений клетки путем инкубации в ледяной холод 70% этанола в течение 5 мин.
  9. Высушить клетки путем последующей инкубацией в 70% этаноле в течение 3 мин, 90% этанола в течение 3 мин и 100% этанола в течение 3 мин. Удалить покровные от 6-луночных планшетах, и пусть сухой воздух в течение нескольких минут.
  10. Пятно предварительно гибридизировали зонда на предметное стекло, и инкубировать покровное на вершине. Место слайдов в увлажненной камере, заполненной 50 мл 50% formamide/2x SSC и инкубировать в течение ночи при 37 ° С.

5. После гибридизации Моет и опосредованной антителами Обнаружение Probe

  1. Заполните 6-луночных с 2х SSC, и предварительно прогревается до 42 ° С Добавить покровные после инкубации в течение ночи и инкубировали при 42 ° С в течение 5 мин.
  2. Удалить 2x SSC, и инкубировать покровные с 50% formamide/2x SSC в течение 10 мин при 42 ° С Повторите всего 3 раза (30 мин стирки в целом). Удалить 50% formamide/2x SSC, и мыть слайды с Трис-солевом-Tween (TST) для 2 х 5 мин при комнатной температуре.
  3. Пятно 50 мкл Трис-солевой БСА (TSBSA) за покровного о новых предметных стеклах, и инкубировать покровные с ног на голову для блокирования в течение 30 мин при комнатной температуре в ТСТ-увлажненной темной камере.
  4. Передача покровные обратно в 6-луночные планшеты, и мыть 2 х 5 мин с TST.
  5. Пятно 50 мкл овец-анти-DIG антитела (1:500 в TSBSA) в покровного о новых предметных стеклах, и инкубировать покровные вверх-вниз для первого шага инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре в ТСТ-увлажненной темной камере.
  6. Передача покровные обратно в 6-луночные планшеты, и мыть 2 х 5 мин с TST.
  7. Пятно 50 мкл кролик-анти-овец антитела, конъюгированного с FITC (1:250 в TSBSA) за покровного о новых предметных стеклах, и инкубировать покровные с ног на голову во второй стадии инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре в ТСТ-увлажненной темной камере .
  8. Транспортфер покровные обратно в 6-луночные планшеты, и мыть 2 х 5 мин с TST.
  9. Пятно 50 мкл козьего антителам кролика сопряженной с FITC (1:250 в TSBSA) за покровного о новых предметных стеклах, и инкубировать покровные с ног на голову в третий стадии инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре в ТСТ-увлажненной темной камере .
  10. Передача покровные обратно в 6-луночные планшеты, и мыть 2 х 5 мин с TST.
  11. Пятно 50 мкл мышиной анти-биотин антитела (1:200 в TSBSA) на покровное на новые предметные стекла и инкубировать покровные вверх дном на четвертой стадии инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре в увлажненной TST-темную камеру.
  12. Передача покровные обратно в 6-луночные планшеты, и мыть 2 х 5 мин с TST.
  13. Пятно 50 мкл осла анти-мышиного антитела, конъюгированные с родамина (1:250 в TSBSA) за покровного о новых предметных стеклах, и инкубировать покровные с ног на голову в пятый стадии инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре в ТСТ-увлажненном темной Chambэ.
  14. Передача покровные обратно в 6-луночные планшеты, и мыть 2 х 5 мин с TST.
  15. Пятно 50 мкл козы против лошади антитела сопряжено с родамина (1:250 в TSBSA) за покровного о новых предметных стеклах, и инкубировать покровные с ног на голову в шестой стадии инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре в ТСТ-увлажненной темной камере . ПРИМЕЧАНИЕ: коза-анти-лошадь антитела распознает антитела осла антимышиного; когда станет доступен для исследователя, коза-анти-осел антитело будет работать также.
  16. Передача покровные обратно в 6-луночные планшеты, и мыть 2 х 5 мин с TST. Промыть еще 5 мин с Трис-солевом растворе (TS).
  17. Высушить клетки путем последующей инкубацией в 70% этаноле в течение 3 мин, 90% этанола в течение 3 мин и 100% этанола в течение 3 мин. Удалить покровные от 6-луночных планшетах, и пусть сухой воздух в течение нескольких минут.
  18. Найди каплю монтажа среду с DAPI (см. реагенты) на предметное стекло, и добавить покровное с ног на голову сверху. Печать слайдов с лаком для ногтей иоценки результатов FISH методом флуоресцентной микроскопии (рис. 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Используя упомянутую выше протокол для комбинированной ДНК-РНК FISH, мы были в состоянии представить себе инактивации Х-хромосомы в дифференциации женские эмбриональных стволовых клеток. Рисунок 1 показывает, представитель пример FISH эксперимента ДНК-РНК, где мы обнаруженного как XIST (который является видимым в качестве так называемого Xist РНК облако на неактивной Х-хромосомы и базальной транскрипции Pinpoint на активной Х-хромосомы), а область Х-хромосоме, которая видна как сигнал определить. Следует отметить, что один из точечных сигналов находится в пределах Xist облаке, тем самым показав, что Xist облако действительно локализации вдоль, и покрытие Х-хромосоме. В более чем 99% клеток, мы обнаружить с помощью нашего протокол правильный сигнал ДНК (данные не показаны). По сравнению с РНК-FISH, XIST облака визуализированы с помощью комбинации ДНК-РНК процедура рыбы выглядят иногда и больше, как кажется денатурированной ДНК, чтобы занять большую площадь. Мы наблюtained аналогичные результаты с использованием человеческих ЭС клеток, лимфоцитов человека и различные клеточные линии фибробластов различных видов и тот же протокол был применен для изучения экспрессии генов различных Х-хромосомой локусов, в том числе Rnf12. Кроме того, когда этот протокол был применен к недифференцированной женских ЭС клеток, базально-выражение Xist с обеих Х-хромосомы могут быть обнаружены, что свидетельствует о том, что с помощью этого протокола также гены, выраженные при низких уровнях могут быть визуализированы (данные не показаны).

Рисунок 1
Рисунок 1. Комбинированный ДНК-РНК FISH в дифференцированных женских ЭС клеток. Представитель результаты, полученные после описанных в данном документе протокола для комбинированной ДНК-РНК FISH. Х-хромосома (Х CHR.) Обнаружен с помощью дигоксигенином помечены ВАС зонд, который визуализируется с использованием антител, конъюгированных с FITC (зеленый знакдр.). Почти в каждой клетке, две Х-хромосомы обнаружены. Xist РНК обнаружены с помощью биотин помечены кДНК зонд, который визуализируется с использованием антител, конъюгированных с родамина (красный сигнал). И крупные XIST скопления на неактивный Х-хромосоме (XIST облака) и базальных выражения Xist от активной Х-хромосоме (XIST выявляет) обнаруживаются (примечание: после дифференцировки это базальная выражение Xist прекращается на будущее активной Х-хромосоме, и поэтому не обнаружены в каждом ядре). Ядра контрастно с DAPI (синий). Шкала бар составляет 10 мкм. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В сочетании ДНК-РНК FISH может быть технически сложным, так как условия, пригодные для ДНК FISH может быть слишком жестким для менее стабильных молекул РНК. Некоторые подходы были применены для изучения как ДНК и РНК в одной камере, в обход необходимость одновременной инкубации с зондов обнаружения как ДНК и РНК. Например, в наложении подхода первого РНК FISH выполняется, и клетки отображаемого, и координаты взяты. Впоследствии те же слайды используются для FISH ДНК, в течение которого сигнал РНК FISH теряется. После FISH ДНК, клетки снова в образ, и фотографии, полученные как от РНК и FISH ДНК накладываются. Хотя этот подход будет работать почти во всех случаях, так как ДНК основных клеток является стабильной, и не зависит от лечения, необходимого для начального РНК FISH, это очень трудоемкий подход, который будет стоить не менее четырех дней. В другом подходе сначала выполняется РНК FISH, рыба сигнал РНК фиксируется того ое фиксаторы, после чего РЫБЫ ДНК, применяемые. Хотя этот подход также может работать, некоторые из флуоресцентного сигнала, полученного от РНК FISH могут быть потеряны при фиксации. Это может препятствовать особенно обнаружение транскриптов, которые экспрессируются только на низком уровне. Здесь представлены подход оптимизирован для одновременного обнаружения как одной РНК-мишени и один ДНК-мишени в одном эксперименте FISH, и имеет то преимущество, что оба результата можно получить в одном эксперименте в течение двух дней, с надежными результатами.

Несколько шагов в протоколе FISH имеют решающее значение для получения оптимальных результатов. Во-первых, всякий раз, когда дело с молекулами РНК, следует быть осторожным, чтобы не вводить РНКазы в любом буфера или раствора, используемого. Следовательно, должны быть установлены чистый рабочая среда, а также советы фильтр следует использовать, когда пипетки реагенты используются для FISH. Следует проявлять осторожность в использовании РНКазы соединений (например РНКазы свободной воды, степень культуры клеток PBS, абсолютныелы чистый этанол и т.д.). Когда эти простые правила не соблюдать, то, как правило, нет необходимости использовать дополнительные ингибиторы ДНК-азу, дополненные в используемых реагентов. Во-вторых, процедура пермеабилизации помощью пепсин нежный равновесие между слишком мало, или слишком много пермеабилизации. В зависимости от конкретного типа клеток используется, он может потребоваться, чтобы оптимизировать время, предоставляемое для проницаемости, или концентрации пепсина. Последний также зависит от конкретной партии пепсина, так как активность может меняться. В качестве альтернативного, пермеабилизации использованием 0,1% Triton-X100/PBS течение 5 результатов мин в хорошие результаты при определенных условиях, и имеет то преимущество, что РЫБА помощью этого метода проницаемости может быть в сочетании с использованием иммунной обнаружения ядерных или цитоплазматические белки. В качестве третьего важного аспекта FISH, старение, денатурации, гибридизации и промывки температура должна оставаться постоянной. Даже небольшие отклонения от заданной температуры может привести к менее эфicient денатурации, гибридизации или менее строгие стирает, что приведет к более фоновое окрашивание. В качестве альтернативы в 1 ч стадии старения при 65 ° С с последующим денатурации при 65 ° С в течение 2 мин, также первоначальной денатурации при 80 ° С в течение 5 мин, без старения, может дать хорошие результаты. Мы предпочитаем процедуру старения, как и вообще эта процедура дает более надежные FISH ДНК сигналы. Наконец, определенные ДНК-зонды будут настолько специфичны, что они не будут требовать три слоя антител для обнаружения достаточного. Это должно быть эмпирически проверены на каждом вновь генерируемого датчиком.

Хотя в настоящее время протокол работает надежно в изучении Х-хромосомы инактивации и обнаружения Xist, в сочетании обнаружения РНК и ДНК может быть сложнее в других условиях. Это может быть, в частности, случай, когда вид РНК, которая направлена ​​на обнаружить только выразил на очень низком уровне, полна повторяющихся последовательностей или является относительно короткимстенограмма. В таких ситуациях, это может быть довольно трудно разработать оптимальный зонд, который позволит эффективное гибридизации в ограниченной, не оптимальной доступного количества цели. В таких ситуациях, это могло бы стоить оптимизации первые условия для РНК FISH. Несколько альтернативных зонды могли быть судимы, а продолжительность маркировки зонда Ника-перевод можно титровать, чтобы оптимизировать количество включенных гаптенами. Важно отметить, что она должна проверить, что направлены РНК выражается в клетках быть исследованы, например, путем проверки экспрессии посредством RT-PCR. Кроме того, при анализе другой тип клеток, важно, чтобы включать клетки, в которых выражение ранее обнаруженные в качестве положительного контроля, так как это может позволить различие между технической, рыба, связанных с проблемой, или простое отсутствие экспрессии в новом типе клеток анализировали. Когда, несмотря на проверенной выражения, использование различных зондов и оптимизации условий маркировки, РНК FISH делает пOT результат в четкий сигнал, было бы целесообразно изменение условий гибридизации, путем изменения количества формамида используются или продолжительность и температуру зонда гибридизации. В качестве альтернативы, непосредственно меченые олигонуклеотидные зонды могут быть использованы 9-10. Те же действия оптимизации могут впоследствии применяться для улучшения FISH ДНК, и одновременное обнаружение ДНК и РНК.

Использование в сочетании протокол FISH ДНК-РНК, мы смогли изучить инактивации Х-хромосомы в дифференциации женские ЭС клеток. Аналогичные результаты были получены в наших исследованиях с использованием различных типов клеток и эмбрионов, и мы в настоящее дальнейшей оптимизации условия для применения в сочетании ДНК-РНК FISH на срезах тканей. Как важная роль некодирующих РНК во многих биологических процессах становится все более и более высокую оценку, мы предвидим, что тот же протокол, скорее всего могут быть использованы для изучения других некодирующих РНК в контексте их конкретных хроматина.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
female mouse embryonic stem cells will be made available upon request
mouse embryonic fibroblasts can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g. Millipore
ES cell culture medium DMEM, 15% fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM γ-mercaptoethanol, and 1,000 U/ml LIF. Filter sterilize and store at 4 °C for maximum of 2 weeks.
LIF Chemicon ESG1107
DMEM Invitrogen 11960085
Fetal Calf Serum Invitrogen 10099141
Penicillin–streptomycin (100x) Invitrogen 15140-122
Non-essential aminoacids Invitrogen 11140-050
γ-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M7522
ES cell differentiation medium IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 μl/L monothioglycerol and 50 μg/ml ascorbic acid
IMDM-Glutamax Invitrogen 31980-030
Ascorbic acid (50 mg/ml) Sigma-Aldrich A4403
monothioglycerol Sigma-Aldrich M6145
T25 cell culture dishes Greiner Bio-one 690160
6-well cell culture dishes Greiner Bio-one 662160
cell culture grade PBS Sigma-Aldrich D8537
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS Gibco 25200-056
Falcon tubes Falcon 352196
24 x 24 mm coverslips Menzle 780882
gelatin Sigma-Aldrich G1890-100G prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave
Pepsin Sigma-Aldrich P7000 Dilute to 0.2% in 0.01 M HCl (pH 2.0)
absolute 100% ethanol Sigma-Aldrich 32221-2.5L use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions
RNAse free water Baxter TKF7114
sterile filter tips Rainin Bio Clean GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation) Roche 11745816910
biotin-labeling kit (Biotin Nick translation) Roche 11745824910
Sephadex G50 Sigma-Aldrich G5080
2 ml syringe BD Plastipak 300013
sterilized cotton
Eppendorf tubes Eppendorf 30120086
yeast tRNA 10 mg/ml Invitrogen 15401-029
Salmon Sperm DNA 10 mg/ml Invitrogen 15632-011
mouse cot-1 DNA 1 mg/ml Invitrogen 18440-016
Eppendorf bench top microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Eppendorf refrigerated centrifuge Eppendorf Model 5810R
2 M NaAc, pH 5.6 Sigma-Aldrich S7670
50+ hybridization solution 50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7
formamide Acros organics 3272350000
dextran sulfate Fluka 31403
10 mM phosphate buffer, pH 7 add 57.7 ml of 1 M Na2HPO4 and 42.3 ml 1 M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave
denaturation buffer 70% formamide/2x SSC/10 mM phosphate buffer pH 7
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287
2 M Tris pH 7.5 solution
Tris-saline-Tween washing solution (TST) 100 ml 10x saline, 50 ml 2M Tris, 500 μl Tween-20, add RNAse free water till 1 L
10x saline solution dissolve 85 g NaCl in 1 L RNAse free H2O, and autoclave
Tris-saline-BSA (TSBSA) 500 μl 10x saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3.25 ml RNAse free H2O
BSA, purified, 100x New England Biolabs B9001S
sheep-anti-dig antibody Roche diagnostics use 1:500 diluted in TSBSA
rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
mouse-anti-biotin antibody Roche diagnostics use 1:200 diluted in TSBSA
donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
Tris-saline washing solution (TS) 10 ml 10x saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O
Vectashield mounting medium with DAPI Vectorlabs H-1200
nail varnish
fluorescent miscroscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rudkin, G. T., Stollar, B. D. High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence. Nature. 265, 472-473 (1977).
  2. Imataka, G., Arisaka, O. Chromosome analysis using spectral karyotyping (SKY). Cell Biochem Biophys. 62, 13-17 (2012).
  3. Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
  4. Mastenbroek, S., et al. Preimplantation genetic screening: a systematic review and meta-analysis of RCTs. Hum Reprod Update. 17, 454-466 (2011).
  5. Martins-Taylor, K., Xu, R. H. Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 22-27 (2012).
  6. Rens, W., et al. Resolution and evolution of the duck-billed platypus karyotype with an X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5 male sex chromosome constitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16257-16261 (2004).
  7. Munsky, B., et al. Using gene expression noise to understand gene regulation. Science. 336, 183-187 (2012).
  8. Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
  9. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Rep. 46, 65-72 (2013).
  10. Ji, N., van Oudenaarden, A. Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos. WormBook. , 1-16 (2012).
  11. Femino, A. M., et al. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  12. Buongiorno-Nardelli, M., Amaldi, F. Autoradiographic detection of molecular hybrids between RNA and DNA in tissue sections. Nature. 225, 946-948 (1970).
  13. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).
  14. John, H. A., et al. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature. 223, 582-587 (1969).
  15. Bauman, J. G., et al. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
  16. Wiegant, J., et al. In situ hybridization with fluoresceinated DNA. Nucleic Acids Res. 19, 3237-3241 (1991).
  17. Langer, P. R., et al. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 6633-6637 (1981).
  18. Manuelidis, L., et al. High-resolution mapping of satellite DNA using biotin-labeled DNA probes. J Cell Biol. 95, 619-625 (1982).
  19. Kislauskis, E. H., et al. Isoform-specific 3'-untranslated sequences sort alpha-cardiac and beta-cytoplasmic actin messenger RNAs to different cytoplasmic compartments. J Cell Biol. 123, 165-172 (1993).
  20. Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 79, 7331-7335 (1982).
  21. Corput, M. P., et al. Fluorescence in situ hybridization using horseradish peroxidase-labeled oligodeoxynucleotides and tyramide signal amplification for sensitive DNA and mRNA detection. Histochem Cell Biol. 110, 431-437 (1998).
  22. Jonkers, I., et al. RNF12 is an X-Encoded dose-dependent activator of X chromosome inactivation. Cell. 139, 999-101 (2009).
  23. Barakat, T. S., et al. RNF12 activates Xist and is essential for X chromosome inactivation. PLoS Genet. 7, (2011).
  24. Gontan, C., et al. RNF12 initiates X-chromosome inactivation by targeting REX1 for degradation. Nature. 485, 386-390 (2012).
  25. Lyon, M. F. Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L). Nature. 190, 372-373 (1961).
  26. Barakat, T. S., Gribnau, J. X. chromosome inactivation in the cycle of life. Development. 139, 2085-2089 (2012).
  27. Augui, S., et al. Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre. Nat Rev Genet. 12, 429-442 (2011).
  28. Brown, C. J., et al. A gene from the region of the human X inactivation centre is expressed exclusively from the inactive X chromosome. Nature. 349, 38-44 (1991).
  29. Brockdorff, N., et al. Conservation of position and exclusive expression of mouse Xist from the inactive X chromosome. Nature. 351, 329-331 (1991).
  30. Borsani, G., et al. Characterization of a murine gene expressed from the inactive X chromosome. Nature. 351, 325-329 (1991).
  31. Barakat, T. S., Gribnau, J. X chromosome inactivation and embryonic stem cells. Adv Exp Med Biol. 695, 132-154 (2010).
  32. Chaumeil, J., et al. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
  33. Okamoto, I., et al. Eutherian mammals use diverse strategies to initiate X-chromosome inactivation during development. Nature. 472, 370-374 (2011).
  34. Gribnau, J., et al. X chromosome choice occurs independently of asynchronous replication timing. J Cell Biol. 168, 365-373 (2005).
  35. Namekawa, S. H., Lee, J. T. Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos. Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).
  36. Van Tine, B. A., et al. Simultaneous in situ detection of RNA, DNA, and protein using tyramide-coupled immunofluorescence. Methods Mol Biol. 292, 215-230 (2005).
  37. Pollex, T., et al. Live-Cell Imaging Combined with Immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to Study the Nuclear Dynamics and Expression of the X-Inactivation Center. Methods Mol Biol. 1042, 13-31 (2013).
  38. Chaumeil, J., et al. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
  39. Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 690, 31-56 (2011).
  40. Meissner, A., et al. Derivation and manipulation of murine embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 482, 3-19 (2009).
  41. Nichols, J., Ying, Q. L. Derivation and propagation of embryonic stem cells in serum- and feeder-free culture. Methods Mol Biol. 329, 91-98 (2006).

Tags

Биохимия выпуск 88 флуоресцентная лампа в сочетании ДНК-РНК FISH ES клеток цитогенетика анализ одной клетки Х-хромосома инактивации (XCI), Бактериальный искусственную хромосому (BAC) ДНК-зонд,
В сочетании ДНК-РНК Люминесцентная<em&gt; В месте</em&gt; Гибридизация (FISH) по изучению Х-хромосома инактивации в Дифференцированный Женский эмбриональных стволовых клеток мыши
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined … More

Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (88), e51628, doi:10.3791/51628 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter