Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kombineret DNA-RNA Fluorescent Published: June 14, 2014 doi: 10.3791/51628
Automatic Translation
1, 1
1Department of Reproduction and Development, Erasmus MC - University Medical Center

Summary

Fluorescerende in situ-hybridisering (FISH) muliggør påvisning af nukleinsyrer i deres native miljø i cellerne. Vi her beskrive en protokol for den kombinerede, samtidig påvisning af RNA og DNA ved hjælp af fisk, som kan bruges til at studere X-kromosom inaktivering i muse embryonale stamceller.

Abstract

Fluorescerende in situ-hybridisering (FISH) er en molekylær teknik, som muliggør påvisning af nukleinsyrer i celler. DNA FISH anvendes ofte i cytogenetik og kræftdiagnostik og kan påvise aberrationer af genomet, som ofte har vigtige kliniske konsekvenser. RNA FISH kan anvendes til påvisning af RNA-molekyler i celler og har givet vigtig indsigt i reguleringen af ​​genekspression. Ved at kombinere DNA og RNA fisk inden for den samme celle er teknisk udfordrende, da betingelser egnet til DNA FISH kan være for barsk for skrøbelige, enkeltstrengede RNA-molekyler. Vi her præsentere en let anvendelig protokol, som gør det muligt for kombineret, samtidig påvisning af Xist RNA og DNA kodet med X-kromosomer. Denne kombinerede DNA-RNA-FISH protokol kan sandsynligvis anvendes i andre systemer, hvor både RNA og DNA, der skal detekteres.

Introduction

Studere celler og væv ved hjælp af fluorescerende in situ hybridisering (FISH) har, siden den blev indført i slutningen af 1970'erne 1, tillod forskerne at studere gener, kromatin organisation og genekspression på subcelleniveauet. DNA FISH anvendes ofte i cytogenetik, karyotyping 2, kræftdiagnostik 3 og præ-implantation genetisk screening 4, og har en vigtig rolle i molekylær forskning 5-6, da det giver mulighed for påvisning af nukleinsyrer i deres eget miljø. Single analyse celleekspression af RNA FISH kan opdage indfødte primære udskrifter og noncoding RNA bliver transskriberet fra kromosomer, og giver fordele til andre teknikker, som vurderer genekspression på populationen, herunder for eksempel kvantitativ RT-PCR, genom bred udtryk analyse eller Northern blotting . Ved at visualisere RNA afskrifter oprindelse direkte fra deres websteder oprindelseslande, har det for eksempel væretbemærket, at genekspression er stokastisk 7 og kan undertiden være allelspecifik 8. Forbedringer i teknik har endda tilladt detektion og kvantificering af enkelt mRNA molekyler i cellerne 9-11.

Det grundlæggende princip i FISH består af hybridisering af nukleinsyrer i cellen til en nukleinsyre-probe ved hjælp af meget specifik Watson og Crick baseparring. Proben kan enten være direkte eller indirekte registreret, hvilket resulterer i et signal, som kan visualiseres mikroskopisk. Indledende forsøg bestod af radioaktivt mærkede prober, som havde ulemper baseret på sikkerhedsspørgsmål, begrænset rumlig opløsning og evnen til at opdage kun ét mål ad gangen 12-14. Den senere udvikling af ikke-radioaktive mærker, herunder fluorokromer, haptener og enzymer, har gjort udbredt brug af fisk som en rutinemæssig molekylærbiologisk teknik. FISH-proben kan enten være direkte mærket med fluorochRomes ved kemisk kobling af fluorescerende molekyler nukleinsyresekvenser 15 og integration af fluorescensmærkede nukleotider 16-19 eller proben indirekte kan visualiseres efter integration af haptener (herunder biotin og digoxigenin) samt immunologisk påvisning af haptener af hapten-specifikke antistoffer konjugeret til fluorescerende reportermolekyler 20-21. Sidstnævnte fremgangsmåde giver signalforstærkning ved hjælp af flere lag af fluorescens-mærkede antistoffer, som anvendes til at forbedre det oprindelige signal, og muliggør detektering af RNA-arter, der er udtrykt ved lave niveauer. Ved at kombinere direkte og indirekte teknikker mærkningskrav og forskellige haptener, kan flere mål samtidigt visualiseres i samme celle.

Et af de vigtigste skridt i fisk protokoller er hybridisering af proben til sit mål. Selv om der i teorien vil en sonde specifikt binder kun til sit mål i praksis denne specificiteter ikke altid opnås, som prober kan binde til homologe regioner og hybridiseringsbetingelser vil ikke altid være ideel for en bestemt DNA-region eller RNA-arter. Post-hybridisering vasker er derfor af særlig betydning, da de kan øge stringensen i FISH proceduren, og kan forhindre uspecifik binding af fisk sonder, hvilket ville resultere i et højt niveau af baggrundsstøj. Da RNA molekyler enkelt er strandet de let kan hybridiseret til en FISH sonde. I modsætning hertil dobbeltstrenget DNA-molekyle skal først et denatureringstrin, hvorefter en probe kan hybridisere. Dette opnås sædvanligvis ved opvarmning af prøven, hvilket resulterer i denaturering af DNA'et. Men under disse hårde betingelser, skrøbelige, enkeltstrengede RNA-molekyler kan gå tabt. Derfor kombineret DNA-RNA FISH kræver betydelige optimering af betingelserne, og er mere teknisk udfordrende i forhold til den separate påvisning af kun RNA eller DNA.

Her præsentation vita detaljeret protokol af kombineret, samtidig DNA-RNA fisk, som har givet os mulighed for at studere X-kromosom inaktivering (XCI) differentiere hunmus embryonale stamceller 22-24. XCI er en afgørende epigenetisk mekanisme for kvindelige fosterudvikling 25 og resulterer i heterochromatinization og dermed undertrykkelse af en af de to X-kromosomer i kvindelige individer 26-27. Afgørende for denne proces er noncoding RNA Xist 28-30, som er reguleret af RNF12 22-23 og REX1 24 proteiner. Xist udtryk bliver opreguleret den fremtidige inaktive X-kromosom (Xi) under fosterudviklingen eller på ES-celle differentiering in vitro og kan spredes langs X-kromosom og dermed tiltrække chromatin remodeling enzymer, der resulterer i den transkriptionelle lukning af X-kromosomet 31. Denne spredning af Xist RNA kan visualiseres ved RNA FISH som et overtræk af X chromonogle, som også betegnes som en Xist sky. Da kvindelige ES-celler kan miste en af deres X-kromosomer på grund genomisk instabilitet, har vi og andre ansat kombinerede DNA-RNA FISH at studere XCI, for at sikre, at kun karyotypiske stabile celler vurderes i analysen af denne vigtige proces 22,32 -34. Som med enhver molekylærbiologisk teknik, har flere forskellige gode protokoller blevet offentliggjort 35-38. Her præsenterer vi vores metode, startende fra induktion af differentiering i muse ES-celler, fiksering af celler, mærkning af fisk sonder af Nick-oversættelse, forbehandling af faste celler til at tillade permeabilisering og efterfølgende sonde optagelse, hybridisering af sonden til mål, og endelig påvisning af proben ved fluorescensmærkede antistoffer. Den her præsenterede protokol tillader den trofaste detektion af Xist RNA og X-kromosom inden for en frist på to dage, og det grundlæggende i denne teknik kan sandsynligvis tilpasses til othendes systemer og forskningsområder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Induktion af differentiering i Female embryonale stamceller til Fremkald X kromosominaktivering

BEMÆRK: hunmus embryonale stamceller (kan rekvireres) dyrkes under standard ES celle betingelser på gelatiniserede kultur retter belagt med muse embryonale fibroblaster (MEF). Vi her antager, at læseren er bekendt med standard celledyrkningsteknikker 39-41. For at inducere differentiering, vil ES-celler dyrket i T25 retter adskilles fra MEF'er og vil blive udpladet i differentiering medium.

  1. Fjern ES medium fra ES cellekultur og vaskes to gange med cellekultur PBS.
  2. Tilføj 1,5 ml trypsin-EDTA (forvarmet til 37 ° C), og der inkuberes cellerne ved 37 ° C i 7 min. Efter 3,5 minutter, ryste skålen forsigtigt for at bryde op kolonierne.
  3. Inaktivere trypsin-EDTA ved tilsætning af 3,5 ml af differentiering medium til cellerne. Pipette cellerne op og ned for at opnå en enkelt celle opløsning og indsamlei et 15 ml rør. Spin 5 min ved 200 x g, og indsamle cellerne i 10 ml af differentiering medium.
  4. Tilføj cellesuspension til en ikke-gelatineret dyrkningsskål og inkuberes i 1 time i en cellekultur inkubator. BEMÆRK: MEF'er vil være i stand til at overholde den ikke-gelatinized kultur fad, hvorimod ES-celler vil forblive i suspension.
  5. I mellemtiden tilsættes steriliserede dækglas (24 x 24 mm) til 6-brøndsplader, tilsættes 0,2% gelatine, og der inkuberes i minimal 5 minutter ved stuetemperatur.
  6. Efter 1 time, indsamle supernatanten fra præ-belagte ES-celle kultur, som hovedsageligt vil bestå af ikke-vedhængende ES-celler. Plate ES-celler til 6-brønds plader indeholdende dækglas. BEMÆRK: Brug ⅙ th af en sammenflydende T25 fad i 6 brønde af en 6-brønds plade. Dette vil give et sammenflydende differentiering godt efter 3 dage af differentiering. Skift medium på en daglig basis. For længere differentiering tidsforløb, varmeplader pre-belagte ES-celler i differentiering medium i bakterielle retter og incubspiste på en celle shaker integreret i cellekultur inkubator. Dette vil tillade at cellerne danner embryoid organer, der kan udplades til dækglas 1-2 dage før fiksering.

2.. Fiksering af differentierede ES-celler til efterfølgende DNA-RNA FISH Analyse

  1. Fjern differentiering medium fra differentiering kulturer, og vaskes to gange med cellekultur PBS. BEMÆRK: Læg PBS forsigtigt for at forhindre cellerne at blive skyllet væk.
  2. Fjern cellekultur PBS og løse celler ved tilsætning af 4% paraformaldehyd (PFA) / PBS og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur. ADVARSEL: PFA er giftigt og kan forårsage betydelig sundhedsrisiko, når de indåndes eller ved kontakt til huden eller i øjnene. Desuden PFA er kræftfremkaldende.
  3. Fjern 4% PFA / PBS og vaskes dækglassene 3x med 70% ethanol. BEMÆRK: Korrekt vask er vigtig, da ethvert spor af PFA vil forstyrre senere FISH trin. Dækglas kan opbevares i 70% ethanol ved -20 ° C i flere måneder før FISH analyse.

3.. Mærkning af DNA-prober til FISH Eksperimenter

BEMÆRK: opnåelse af et DNA-fragment af genet af interesse (minimal længde> 2 kb til RNA FISH eller> 20 kb til DNA FISH) eller en BAC omfatter genet af interesse. For RNA-detektion, kan en mindre probe være tilstrækkelig i forhold til DNA-detektion, da mest sandsynligt transkription vil resultere i flere transkripter, der samtidig kan påvises. For et stærkt signal på enkelt eksemplar DNA-streng, er en længere sonde nødvendigt at være i stand til at opdage et tilstrækkeligt antal indarbejdet haptener. Fortrinsvis er en ikke-transskriberet genomisk område er valgt til at designe DNA-probe. Desuden, når der anvendes en mindre probe til påvisning af RNA, vil det blive forhindret, at den genomiske loci, hvorfra RNA transkriberes der registreres i den kombinerede DNA-RNA-FISH tilgang, selv om dette ikke helt kan udelukkes. Til påvisning muse Xist blev en 5,5 kb cDNA-probe anvendes. For itfdeling af X-kromosomet kan flere BAC prober anvendes. Gode ​​resultater er blevet opnået med en blanding af BAC RP23-100E1 og BAC CT7-474E4, som er placeret i umiddelbar nærhed af Xist locus. Afhængigt af genet eller kromosom af interesse, kan flere forskellige prober være forpligtet til at opnå optimale resultater. Når du arbejder med materialer, der vil blive anvendt til RNA-FISH bruge sterile filter tips, RNAse gratis H 2 O og arbejde i et rent miljø.

  1. Tag 1 ug DNA og fortynd i H 2 O i et samlet volumen på 16 ul. Tilsæt 4 pi digoxigenin eller biotinmærkning opløsning (se reagenser), vortexes og inkuberes ved 16 ° C i 90 min. BEMÆRK: biotin eller digoxigenin-mærkede nukleotider vil nu blive indarbejdet ved nick-translation.
  2. I mellemtiden forbereder G50 søjler for at fjerne ikke-integrerede nukleotider. Tag en 2 ml sprøjte, fjern stamper og tilføje steriliseret bomuld i sprøjten. Tilføj G50 bolde i opløsning to fylde sprøjten, anbringes sprøjten i et 15 ml rør og centrifugeres ved 642 xg i 1 min. BEMÆRK: Omkring 80% af sprøjten skal nu fyldes med G50. Gentag når mindre G50 er til stede.
  3. Efter 90 minutter tilsættes 40 ul H2O til nick-translation reaktionsblandingen, og tilføj reaktionen på G50 kolonne. Tilføj et tomt rør under kolonnen, og der centrifugeres ved 642 xg i 2 min. Saml gennemstrømningen i et reaktionsrør.
  4. Mål mængden af gennemstrømningen med en pipette, og tilsæt H2O til at nå et samlet volumen på 200 ul. Præcipitere gennemstrømningen ved tilsætning af 13,3 pi laksesperma-DNA (10 mg / ml), 13.3 pi gær-tRNA (10 mg / ml), 26,7 pi muse Cot-1 DNA (1 mg / ml) og 28 pi 2 M NaAc, pH 5.6. Vortexes og tilføje 533 pi iskold 100% ethanol. Ryst rør og centrifugeres ved 16.200 xg i 30 minutter ved 4 ° C.
  5. Fjern supernatanten og vask pellet to gange med 70% ethanol. Centrifuger ved 16.200 xg i 5 minutter ved4 ° C, og lufttørre pellet. Der tilsættes 50 ul af 50 + hybridiseringsopløsning, og inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter for at lette opløsning. BEMÆRK: mærket probe kan opbevares i flere år ved -20 ° C. ADVARSEL: 50 + hybridisering opløsning indeholder formamid, som er giftigt, kan irritere huden, øjnene og luftvejene, og er også en teratogen.

4.. Permeabilisering, forbehandling og hybridisering af faste celler til Combined DNA-RNA FISH

  1. Rehydrér fikserede celler på dækglas ved at fjerne 70% ethanol og tilsætning af cellekultur PBS til 6-brønds plader. Inkuber i 5 min. Gentag i alt tre gange.
  2. Fjern cellekultur PBS, og der tilsættes 0,2% pepsin i 6-brønds plader for at permeabilisere cellerne. Inkuber plader med 6 brønde i et vandbad ved 37 ° C i 4 min. Fjern pepsin, og inaktivere med RNAse gratis H 2 O.
  3. Post-fix-celler ved inkubering med 4% PFA / PBS i 5 minutter ved stuetemperatur. Efter fixatiden vaskes to gange med cellekultur PBS i 5 min.
  4. Dehydrere celler ved inkubering med 70% ethanol i 3 minutter, 90% ethanol i 3 minutter og 100% ethanol i 3 min. Overførsel dækglas af 6-brønds plader, og lufttørre dækglas i flere minutter.
  5. Alder celler ved inkubering dækglas ved 65 ° C i 1 time på en varmeplade.
  6. Pre-hybridisere FISH probe med muse Cot-1-DNA ved at addere for hvert dækglas, der skal analyseres, 25 pi 50 + hybridiseringsopløsning, 0,5 pi muse Cot-1-DNA, 1 pi af biotin-mærket Xist sonden og 1 pi digoxigenin mærket BAC probe detektere X-kromosom. Vortexes og denaturere ved 99 ° C i 5 min. Inkuberes straks ved 37 ° C i 45 minutter for at tillade Cot-1-DNA til at hybridisere til gentage sekvenser til stede i sonderne.
  7. Efter ældning, spot 50 ul denatureringsbuffer (bestående af 70% formamid/2X SSC/10 mM fosfatbuffer) på en glasplade, og lægge dækglas på toppen med celler vender towards denaturering buffer. Inkuber ved 65 ° C i 2 minutter.
  8. Læg dækglas tilbage til plader med 6 brønde, og post-fix-celler ved inkubering i iskold 70% ethanol i 5 minutter.
  9. Dehydrere cellerne ved efterfølgende inkubering i 70% ethanol i 3 minutter, 90% ethanol i 3 minutter og 100% ethanol i 3 min. Fjern dækglas fra 6-brønds plader, og lad lufttørre i flere minutter.
  10. Spot præhybridiseret sonde på et objektglas, og der inkuberes dækglas på toppen. Anbring objektglassene i et fugtigt kammer fyldt med 50 ml 50% formamid/2X SSC og inkuberes natten over ved 37 ° C.

5. Post-hybridisering vasker og antistof-medieret Påvisning af Probe

  1. Fyld 6-brønds plader med 2 x SSC, og præ-varm indtil 42 ° C. Tilføj dækglas efter inkubation natten over, og der inkuberes ved 42 ° C i 5 min.
  2. Fjern 2x SSC, og inkuberes dækglas med 50% formamid/2X SSC i 10 minutter ved 42 ° C. Gentag i alt 3 gange (30 min vask helt). Fjern 50% formamid/2X SSC og vask objektglassene med Tris-saltvand-Tween (TST) i 2 x 5 minutter ved stuetemperatur.
  3. Spot 50 gl Tris-saltvand-BSA (TSBSA) pr dækglas på nye objektglas og inkuberes dækglas på hovedet for blokering i løbet af 30 minutter ved stuetemperatur i en TST-fugtigt mørk kammer.
  4. Overførsel dækglas tilbage til 6-brønds plader og vask 2 x 5 min med TST.
  5. Spot 50 ul fåre-anti-grave antistof (1:500 i TSBSA) pr dækglas på nye objektglas og inkuberes dækglas på hovedet for første inkubation skridt i løbet af 30 minutter ved stuetemperatur i en TST-fugtigt mørk kammer.
  6. Overførsel dækglas tilbage til 6-brønds plader og vask 2 x 5 min med TST.
  7. Spot 50 ul kanin-anti-får antistof konjugeret med FITC (1:250 i TSBSA) pr dækglas på nye objektglas og inkuberes dækglas på hovedet for andet inkubationstrinnet i 30 minutter ved stuetemperatur i en TST-befugtet mørk kammer .
  8. Transfer dækglas tilbage til 6-brønds plader og vaske 2 x 5 min med TST.
  9. Spot 50 ul gede-anti-kanin-antistof konjugeret med FITC (1:250 i TSBSA) pr dækglas på nye objektglas og inkuberes dækglas hovedet for tredje inkubationstrin i 30 minutter ved stuetemperatur i en TST-befugtet mørkekammeret .
  10. Overførsel dækglas tilbage til 6-brønds plader og vask 2 x 5 min med TST.
  11. Spot 50 ul muse-anti-biotin antistof (1:200 i TSBSA) pr dækglas om nye objektglas og inkuberes dækglas på hovedet for fjerde inkubationstrinnet i 30 minutter ved stuetemperatur i en TST-fugtigt mørk kammer.
  12. Overførsel dækglas tilbage til 6-brønds plader og vask 2 x 5 min med TST.
  13. Spot 50 ul æsel-anti-mus antistof konjugeret med Rhodamin (1:250 i TSBSA) pr dækglas på nye objektglas og inkuberes dækglas på hovedet for femte inkubationstrinnet i 30 minutter ved stuetemperatur i en TST-befugtes mørk Chambis.
  14. Overførsel dækglas tilbage til 6-brønds plader og vask 2 x 5 min med TST.
  15. Spot 50 ul gede-anti-hest antistof konjugeret med Rhodamin (1:250 i TSBSA) pr dækglas på nye objektglas og inkuberes dækglas på hovedet for sjette inkubationstrinnet i 30 minutter ved stuetemperatur i en TST-befugtet mørk kammer . NB: gede-anti-hest-antistof genkender æsel-anti-muse-antistof; når til rådighed for forskeren vil en ged-anti-æsel antistof arbejde så godt.
  16. Overførsel dækglas tilbage til 6-brønds plader og vask 2 x 5 min med TST. Vask yderligere 5 min med Tris-saltvand (TS).
  17. Dehydrere cellerne ved efterfølgende inkubering i 70% ethanol i 3 minutter, 90% ethanol i 3 minutter og 100% ethanol i 3 min. Fjern dækglas fra 6-brønds plader, og lad lufttørre i flere minutter.
  18. Spot en dråbe montering medium med DAPI (se reagenser) på en glasplade, og tilføje dækglas hovedet på toppen. Seal dias med neglelak ogvurdere FISH resultater ved fluorescerende mikroskopi (figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af ovennævnte protokol til kombineret DNA-RNA FISH, har vi været i stand til at visualisere X-kromosom inaktivering differentiere kvindelige embryonale stamceller. Figur 1 viser et repræsentativt eksempel på en DNA-RNA FISH eksperiment, hvor vi konstateret både Xist (som er synlig som en såkaldt Xist RNA sky på det inaktive X-kromosom og en basal transkription lokalisere det aktive X-kromosom), og en region af X-kromosomet, som er synlig som en knivskarp signal. Bemærk, at en af de lokalisere signaler er beliggende i Xist skyen, hvilket viser, at den Xist sky rent faktisk lokalisere sammen og overtrække X-kromosom. I mere end 99% af cellerne, opdage vi at bruge vores protokol et korrekt DNA-signal (data ikke vist). I forhold til RNA-FISH Xist skyer visualiseret ved hjælp af den kombinerede DNA-RNA FISH procedure ser undertiden større, da denatureret DNA synes at besætte et større område. Vi har obopretholdes lignende resultater ved anvendelse af humane ES-celler, humane lymfocytter og forskellige fibroblastcellelinier af forskellige arter, og den samme protokol er blevet anvendt til at undersøge genekspression af forskellige X-koblede loci, herunder Rnf12. Hertil kommer, når denne protokol er blevet anvendt til udifferentieret kvindelige ES-celler, basal Xist udtryk fra begge X-kromosomer kunne påvises, hvilket viser, at ved hjælp af denne protokol også gener udtrykt ved lave niveauer kan visualiseres (data ikke vist).

Figur 1
Figur 1.. Kombineret DNA-RNA FISH i differentierede kvindelige ES-celler. Repræsentative resultater opnået efter de heri beskrevne protokol for kombinerede DNA-RNA FISH. X-kromosom (X chr.) Detekteres under anvendelse af et digoxigenin-mærket BAC-probe, som er visualiseret under anvendelse af antistoffer konjugeret til FITC (grønt skiltal.) I næsten alle celler, der påvises to X-kromosomer. Xist RNA detekteres under anvendelse af et biotin-mærket cDNA-probe, som er visualiseret under anvendelse af antistoffer konjugeret til rhodamin (rødt signal). Både store Xist ophobninger på det inaktive X-kromosom (Xist skyer) og basal Xist udtryk fra den aktive X-kromosom (Xist pinpoints) detekteres (bemærk: ved differentiering denne basale Xist udtryk ophørt om fremtiden aktive X-kromosom, og derfor ikke opdaget i hver kerne). Kerner modfarvet med DAPI (blå). Målestokken repræsenterer 10 um. Klik her for at se større billede.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kombineret DNA-RNA FISH kan være teknisk udfordrende, da betingelser egnet til DNA FISH kan være for barsk for mindre stabile RNA-molekyler. Adskillige fremgangsmåder er blevet anvendt til at undersøge både DNA og RNA i den samme celle, omgår behovet for samtidig inkubation med prober påvisning både DNA og RNA. For eksempel i en overlejring fremgangsmåde er første RNA-FISH udført, og cellerne afbildes, og koordinaterne er taget. Efterfølgende samme objektglas anvendt til DNA-FISH, hvor signalet i RNA FISH er tabt. Efter DNA-FISH cellerne igen afbildes, og billederne opnået fra både RNA og DNA FISH overlejres. Selv om denne tilgang vil fungere i næsten alle tilfælde, som DNA af faste celler er stabil, og er ikke påvirket af den nødvendige behandling til indledende RNA FISH, dette er en meget besværlig fremgangsmåde, som vil koste mindst fire dage. I en anden fremgangsmåde, først RNA FISH udføres, RNA FISH signal fast ved tilsætning of fiksativer, hvorefter DNA fisk er anvendt. Selv om også denne fremgangsmåde kan fungere, kan en del af det fluorescerende signal afledt RNA FISH tabt efter fiksering. Dette kan især hindrer påvisning af transkripter, der kun er udtrykt på et lavt niveau. Den her præsenterede fremgangsmåde er optimeret til samtidig påvisning af både et RNA-mål og et DNA-mål i en enkelt FISH eksperiment, og har den fordel, at der kan opnås både resulterer i et enkelt eksperiment inden for to dage, med pålidelige resultater.

Flere trin i FISH-protokollen er afgørende for at opnå optimale resultater. Først, når der beskæftiger sig med RNA molekyler, bør man være forsigtig med ikke at indføre RNAse i enhver buffer eller opløsning, der anvendes. Derfor bør der etableres et rent arbejdsmiljø, og filter tips bør anvendes, når pipettering reagenser bruges til fisk. Der bør udvises omhu for at anvende RNAse frie forbindelser (for eksempel RNAse frit vand, cellekultur klasse PBS absoluttely ren ethanol osv.). Når disse enkle regler følges, er det generelt ikke nødvendigt at bruge ekstra RNAse inhibitorer suppleret til de anvendte reagenser. Sekund, permeabilisering med anvendelse af pepsin er en blid balance mellem for lidt eller for meget permeabilisering. Afhængigt af den konkrete anvendte celletype, kan det være nødvendigt at optimere fristen for permeabilization, eller pepsin koncentrationer. Sidstnævnte afhænger også af din bestemt parti af pepsin, som den aktivitet, kan variere. Som et alternativ, permeabilisering anvendelse af 0,1% Triton-X100/PBS i 5 min resulterer i gode resultater under visse betingelser, og har den fordel, at fisk ved hjælp af denne metode til permeabilisering kan kombineres med immunfarvning for at opdage nukleare eller cytoplasmatiske proteiner. Som et tredje vigtigt aspekt af FISH bør aldring, denaturering, hybridisering og vask temperaturerne holdes konstant. Selv små afvigelser fra den ønskede temperatur kan resultere i mindre efficient denaturering, hybridisering eller mindre strenge vasker, hvilket vil resultere i mere baggrundsfarvning. Som et alternativ til 1 hr modningstrin ved 65 ° C efterfulgt af denaturering ved 65 ° C i 2 minutter, også en indledende denaturering ved 80 ° C i 5 minutter uden aldring, kan give gode resultater. Vi foretrækker den aldrende procedure, som i almindelighed denne procedure giver mere pålidelige DNA FISH signaler. Endelig vil nogle af DNA-prober være så specifikke, at de ikke vil kræve tre lag af antistoffer til tilstrækkelig detektion. Dette bør empirisk testet for hver nyligt genererede probe.

Selv om den nuværende protokol fungerer solidt i studiet af X-kromosom inaktivering og detektion af Xist, kombineret påvisning af RNA og DNA kan være mere kompliceret i andre indstillinger. Dette kan især være tilfældet, når RNA-arter, som har til formål at blive opdaget kun udtrykkes ved meget lave niveauer, er fuld af gentagne sekvenser eller er en forholdsvis kortudskrift. I disse situationer kan det være temmelig svært at designe en optimal sonde, som vil give en effektiv hybridisering til en begrænset, ikke er optimalt tilgængelig mængde af målet. I sådanne situationer kan det være værd at optimere første betingelser for RNA FISH. Flere alternative sonder kunne blive retsforfulgt, og varigheden af ​​sonden mærkning af Nick-translation kan titreres for at optimere mængden af ​​inkorporeret haptener. Vigtigere er det, skal det kontrolleres, at den sigter RNA udtrykkes i cellerne, der skal undersøges, ved for eksempel at kontrollere udtryk ved RT-PCR. Også når man analyserer en anden type af celler, er det nødvendigt, at celler, hvori ekspression tidligere er blevet detekteret som positiv kontrol, da dette kunne gøre det muligt at skelne mellem en teknisk FISH relateret problem, eller blot fravær af ekspression i den nye type celler analyseret. Når trods kontrollerede ekspression anvendelsen af ​​forskellige prober og optimering af mærkningsbetingelser, RNA FISH gør not resultat i et klart signal, kan det være værd at ændre hybridiseringsbetingelser, ved at variere mængden af ​​formamid anvendes, eller varigheden og temperaturen af ​​probehybridisering. Alternativt kan direkte mærkede oligonukleotidprober anvendes 9-10. De samme optimering trin kan anvendes efterfølgende til at forbedre DNA-FISH, og den samtidige påvisning af DNA og RNA.

Brug af den kombinerede DNA-RNA FISH-protokol, har vi været i stand til at studere X-kromosom inaktivering differentierende kvindelige ES-celler. Lignende resultater er opnået i vores studier ved hjælp af forskellige celletyper og embryoner, og vi er i øjeblikket yderligere optimering vilkår for at anvende kombineret DNA-RNA FISH på vævssnit. Da den vigtige rolle, ikke-kodende RNA i mange biologiske processer bliver mere og mere værdsat, vi forudser, at den samme protokol sandsynligvis kan bruges til at studere andre ikke-kodende RNA i forbindelse med deres specifikke kromatin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
female mouse embryonic stem cells will be made available upon request
mouse embryonic fibroblasts can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g. Millipore
ES cell culture medium DMEM, 15% fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM γ-mercaptoethanol, and 1,000 U/ml LIF. Filter sterilize and store at 4 °C for maximum of 2 weeks.
LIF Chemicon ESG1107
DMEM Invitrogen 11960085
Fetal Calf Serum Invitrogen 10099141
Penicillin–streptomycin (100x) Invitrogen 15140-122
Non-essential aminoacids Invitrogen 11140-050
γ-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M7522
ES cell differentiation medium IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 μl/L monothioglycerol and 50 μg/ml ascorbic acid
IMDM-Glutamax Invitrogen 31980-030
Ascorbic acid (50 mg/ml) Sigma-Aldrich A4403
monothioglycerol Sigma-Aldrich M6145
T25 cell culture dishes Greiner Bio-one 690160
6-well cell culture dishes Greiner Bio-one 662160
cell culture grade PBS Sigma-Aldrich D8537
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS Gibco 25200-056
Falcon tubes Falcon 352196
24 x 24 mm coverslips Menzle 780882
gelatin Sigma-Aldrich G1890-100G prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave
Pepsin Sigma-Aldrich P7000 Dilute to 0.2% in 0.01 M HCl (pH 2.0)
absolute 100% ethanol Sigma-Aldrich 32221-2.5L use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions
RNAse free water Baxter TKF7114
sterile filter tips Rainin Bio Clean GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation) Roche 11745816910
biotin-labeling kit (Biotin Nick translation) Roche 11745824910
Sephadex G50 Sigma-Aldrich G5080
2 ml syringe BD Plastipak 300013
sterilized cotton
Eppendorf tubes Eppendorf 30120086
yeast tRNA 10 mg/ml Invitrogen 15401-029
Salmon Sperm DNA 10 mg/ml Invitrogen 15632-011
mouse cot-1 DNA 1 mg/ml Invitrogen 18440-016
Eppendorf bench top microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Eppendorf refrigerated centrifuge Eppendorf Model 5810R
2 M NaAc, pH 5.6 Sigma-Aldrich S7670
50+ hybridization solution 50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7
formamide Acros organics 3272350000
dextran sulfate Fluka 31403
10 mM phosphate buffer, pH 7 add 57.7 ml of 1 M Na2HPO4 and 42.3 ml 1 M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave
denaturation buffer 70% formamide/2x SSC/10 mM phosphate buffer pH 7
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287
2 M Tris pH 7.5 solution
Tris-saline-Tween washing solution (TST) 100 ml 10x saline, 50 ml 2M Tris, 500 μl Tween-20, add RNAse free water till 1 L
10x saline solution dissolve 85 g NaCl in 1 L RNAse free H2O, and autoclave
Tris-saline-BSA (TSBSA) 500 μl 10x saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3.25 ml RNAse free H2O
BSA, purified, 100x New England Biolabs B9001S
sheep-anti-dig antibody Roche diagnostics use 1:500 diluted in TSBSA
rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
mouse-anti-biotin antibody Roche diagnostics use 1:200 diluted in TSBSA
donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
Tris-saline washing solution (TS) 10 ml 10x saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O
Vectashield mounting medium with DAPI Vectorlabs H-1200
nail varnish
fluorescent miscroscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rudkin, G. T., Stollar, B. D. High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence. Nature. 265, 472-473 (1977).
  2. Imataka, G., Arisaka, O. Chromosome analysis using spectral karyotyping (SKY). Cell Biochem Biophys. 62, 13-17 (2012).
  3. Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
  4. Mastenbroek, S., et al. Preimplantation genetic screening: a systematic review and meta-analysis of RCTs. Hum Reprod Update. 17, 454-466 (2011).
  5. Martins-Taylor, K., Xu, R. H. Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 22-27 (2012).
  6. Rens, W., et al. Resolution and evolution of the duck-billed platypus karyotype with an X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5 male sex chromosome constitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16257-16261 (2004).
  7. Munsky, B., et al. Using gene expression noise to understand gene regulation. Science. 336, 183-187 (2012).
  8. Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
  9. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Rep. 46, 65-72 (2013).
  10. Ji, N., van Oudenaarden, A. Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos. WormBook. , 1-16 (2012).
  11. Femino, A. M., et al. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  12. Buongiorno-Nardelli, M., Amaldi, F. Autoradiographic detection of molecular hybrids between RNA and DNA in tissue sections. Nature. 225, 946-948 (1970).
  13. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).
  14. John, H. A., et al. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature. 223, 582-587 (1969).
  15. Bauman, J. G., et al. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
  16. Wiegant, J., et al. In situ hybridization with fluoresceinated DNA. Nucleic Acids Res. 19, 3237-3241 (1991).
  17. Langer, P. R., et al. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 6633-6637 (1981).
  18. Manuelidis, L., et al. High-resolution mapping of satellite DNA using biotin-labeled DNA probes. J Cell Biol. 95, 619-625 (1982).
  19. Kislauskis, E. H., et al. Isoform-specific 3'-untranslated sequences sort alpha-cardiac and beta-cytoplasmic actin messenger RNAs to different cytoplasmic compartments. J Cell Biol. 123, 165-172 (1993).
  20. Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 79, 7331-7335 (1982).
  21. Corput, M. P., et al. Fluorescence in situ hybridization using horseradish peroxidase-labeled oligodeoxynucleotides and tyramide signal amplification for sensitive DNA and mRNA detection. Histochem Cell Biol. 110, 431-437 (1998).
  22. Jonkers, I., et al. RNF12 is an X-Encoded dose-dependent activator of X chromosome inactivation. Cell. 139, 999-101 (2009).
  23. Barakat, T. S., et al. RNF12 activates Xist and is essential for X chromosome inactivation. PLoS Genet. 7, (2011).
  24. Gontan, C., et al. RNF12 initiates X-chromosome inactivation by targeting REX1 for degradation. Nature. 485, 386-390 (2012).
  25. Lyon, M. F. Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L). Nature. 190, 372-373 (1961).
  26. Barakat, T. S., Gribnau, J. X. chromosome inactivation in the cycle of life. Development. 139, 2085-2089 (2012).
  27. Augui, S., et al. Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre. Nat Rev Genet. 12, 429-442 (2011).
  28. Brown, C. J., et al. A gene from the region of the human X inactivation centre is expressed exclusively from the inactive X chromosome. Nature. 349, 38-44 (1991).
  29. Brockdorff, N., et al. Conservation of position and exclusive expression of mouse Xist from the inactive X chromosome. Nature. 351, 329-331 (1991).
  30. Borsani, G., et al. Characterization of a murine gene expressed from the inactive X chromosome. Nature. 351, 325-329 (1991).
  31. Barakat, T. S., Gribnau, J. X chromosome inactivation and embryonic stem cells. Adv Exp Med Biol. 695, 132-154 (2010).
  32. Chaumeil, J., et al. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
  33. Okamoto, I., et al. Eutherian mammals use diverse strategies to initiate X-chromosome inactivation during development. Nature. 472, 370-374 (2011).
  34. Gribnau, J., et al. X chromosome choice occurs independently of asynchronous replication timing. J Cell Biol. 168, 365-373 (2005).
  35. Namekawa, S. H., Lee, J. T. Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos. Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).
  36. Van Tine, B. A., et al. Simultaneous in situ detection of RNA, DNA, and protein using tyramide-coupled immunofluorescence. Methods Mol Biol. 292, 215-230 (2005).
  37. Pollex, T., et al. Live-Cell Imaging Combined with Immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to Study the Nuclear Dynamics and Expression of the X-Inactivation Center. Methods Mol Biol. 1042, 13-31 (2013).
  38. Chaumeil, J., et al. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
  39. Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 690, 31-56 (2011).
  40. Meissner, A., et al. Derivation and manipulation of murine embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 482, 3-19 (2009).
  41. Nichols, J., Ying, Q. L. Derivation and propagation of embryonic stem cells in serum- and feeder-free culture. Methods Mol Biol. 329, 91-98 (2006).

Tags

Biokemi Fluorescent kombineret DNA-RNA FISH ES celle cytogenetik enkelt celle analyse X-kromosom inaktivering (XCI) DNA-probe,
Kombineret DNA-RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH) til at studere X-kromosom inaktivering differentieret hunmus embryonale stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined … More

Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (88), e51628, doi:10.3791/51628 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter