Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

DNA-RNA בשילוב פלורסנט Published: June 14, 2014 doi: 10.3791/51628
Automatic Translation
1, 1
1Department of Reproduction and Development, Erasmus MC - University Medical Center

Summary

ניאון הכלאה באתרו (FISH) מאפשר זיהוי של חומצות גרעין בסביבה הטבעית שלהם בתוך תאים. אנחנו כאן מתארים פרוטוקול לזיהוי המשולב, בו זמני של RNA ו-DNA בדרך של דגים, אשר יכול לשמש כדי לחקור איון כרומוזום X בתאי גזע עובריים בעכבר.

Abstract

ניאון הכלאה באתרו (FISH) הוא טכניקה מולקולרית המאפשרת זיהוי של חומצות גרעין בתאים. FISH-DNA משמש לעתים קרובות בציטוגנטיקה ואבחון הסרטן, ויכול לזהות סטיות של הגנום, שלעתים קרובות יש השלכות קליניות חשובות. RNA FISH ניתן להשתמש בם כדי לזהות מולקולות RNA בתאים וספק תובנות חשובות בויסות של ביטוי גנים. שילוב של ה-DNA ודגי RNA בתוך אותו התא הוא מאתגר מבחינה טכנית, כמו תנאים מתאימים לDNA FISH עלולים להיות קשים מדי עבור מולקולות שבירות, חד גדילי רנ"א. אנחנו כאן להציג את הפרוטוקול ישים בקלות המאפשר זיהוי המשולב, בו זמני של Xist RNA ו-DNA מקודד על ידי כרומוזומי ה-X. פרוטוקול FISH זה בשילוב ה-DNA-RNA סביר יכול להיות מיושם על מערכות אחרות שבו שניהם RNA ו-DNA צריכים להיות מזוהים.

Introduction

לומדים תאים ורקמות באמצעות ניאון הכלאה באתרו (FISH) יש, מאז השקתו בסוף 1970s 1, אפשר לחוקרים ללמוד הגנים, ארגון הכרומטין וביטוי גנים ברמת subcellular. FISH-DNA משמש לעתים קרובות בציטוגנטיקה, karyotyping 2, אבחון הסרטן 3 וסינון גנטי טרום השרשה 4, ויש לו תפקיד חשוב במחקר מולקולרי 5-6 שכן היא מאפשרת זיהוי של חומצות גרעין בסביבה המקומית שלהם. ניתוח ביטוי תא בודד על ידי RNA FISH יכול לזהות תעתיקים עיקריים יליד וRNAs noncoding להיות עיבד מכרומוזומים, ומציע יתרונות לטכניקות אחרות שלהעריך ביטוי גנים ברמת אוכלוסייה, כולל למשל כמותית RT-PCR, ניתוח הגנום רחב ביטוי או סופג צפון . על ידי הדמיה תעתיקי רנ"א שמקורם ישירות מהאתרים שלהם ממוצא, זה למשל היהשם לב שביטוי גנים הוא סטוכסטיים 7, ולפעמים יכול להיות אלל מסוים 8. שיפורים בטכניקה שאפילו הרשו לאיתור וכימות של מולקולות ה-mRNA יחיד בתוך התאים 9-11.

העיקרון הבסיסי של דגים מורכב מהכלאה של חומצות גרעין בתוך התא לבדיקת חומצות גרעין באמצעות בסיס זיווג ווטסון וקריק מאוד ספציפי. הבדיקה יכולה להיות במישרין או בעקיפין מזוהה, וכתוצאה מכך אות שניתן דמיינו מיקרוסקופי. ניסיונות ראשוניים היו מורכבים מבדיקות שכותרתו רדיואקטיבית, שחסרונות המבוססים על נושאי בטיחות, ברזולוציה מרחבית מוגבלת והיכולת לזהות רק אחד יעד בכל פעם 12-14. הפיתוח הבא של תוויות nonradioactive, כוללים fluorochromes, haptens, ואנזימים, אפשר שימוש התפשטות הרחב של דגים כטכניקת ביולוגיה מולקולרית שבשגרה. הבדיקה FISH גם יכולה להיות מתויגת באופן ישיר עם fluorochשל רומא על ידי קישור כימי של מולקולות ניאון לחומצות גרעין רצפי 15 ואינטגרציה של נוקלאוטידים שכותרתו fluorescently 16-19, או הבדיקה ניתן דמיינו בעקיפין לאחר אינטגרציה של haptens (כולל ביוטין וdigoxigenin) וזיהוי חיסוני של haptens ידי נוגדנים ספציפיים hapten מצומדת ל כתב ניאון מולקולות 20-21. הגישה השנייה מאפשרת הגברה אות על ידי שימוש במספר שכבות של נוגדנים שכותרתו fluorescently אשר נמצא בשימוש כדי לשפר את האות המקורי, ומאפשרת זיהוי של מיני RNA אשר באים לידי ביטוי ברמות נמוכות. על ידי שילוב של טכניקות תיוג ישירות ועקיפות וhaptens השונים, כמה מטרות יכולות להיות דמיינו בו זמנית באותו התא.

אחד הצעדים החשובים ביותר בפרוטוקולי דגים הוא ההכלאה של החללית ליעד שלו. למרות שבתאוריה, בדיקה תהיה ספציפית להיקשר רק ליעד שלה, הלכה למעשה, הייחוד הזהלא תמיד מושגת, כמו בדיקות עלולות להיקשר לאזורים הומולוגיים, ותנאי הכלאה לא תמיד יהיו אידיאליים למיני אזור DNA או RNA מסוימים. שוטף פוסט הכלאה לכן הם בעלי חשיבות מיוחדת, שכן הם יכולים להגדיל את ההחמרה של הליך הדגים, ויכולים למנוע ספציפי מחייב של בדיקות FISH, אשר יביאו ברמה גבוהה של רעשי רקע. כמולקולות RNA הן חד גדילים הם יכולים בקלות להיות הכלאה לבדיקת FISH. לעומת זאת, מולקולת DNA גדילים הכפולה צריכה ראשונה צעד denaturation, לאחר שבדיקה יכולה להכליא. זו מושגת בדרך כלל על ידי חימום של הדגימה, שתוצאתה denaturation של ה-DNA. עם זאת, בתנאים קשים אלה, מולקולות שבירות, חד גדילי רנ"א עלולות ללכת לאיבוד. לפיכך, ה-DNA-RNA בשילוב הדגים דורש אופטימיזציה משמעותית של התנאים, ויותר מאתגר מבחינה טכנית בהשוואה לזיהוי הנפרד של RNA בלבד או ה-DNA.

כאן אנו presenפרוטוקול מפורט של ת"א בשילוב דגי DNA-RNA, בו זמנית אשר אפשרו לנו ללמוד איון כרומוזום X (xci) בתאי גזע עוברי בעכבר נקבת 22-24. Xci הוא מנגנון חיוני להתפתחות עוברית אפיגנטיים נשית 25, ותוצאות בheterochromatinization ומכאן השתקה של אחד משני כרומוזומי X ביחידים נקבת 26-27. חיוני לתהליך זה הוא RNA Xist noncoding 28-30, אשר מוסדר על ידי RNF12 22-23 וREX1 24 החלבונים. ביטוי Xist הופך שהוגברו על כרומוזום העתיד לא פעיל X (Xi) במהלך התפתחות עוברית או על התמיינות תאי גזע עובריים במבחנה , ויכול להתפשט לאורך כרומוזום X ובכך למשוך אנזימי הכרומטין שיפוץ אשר תוצאת כיבוי תעתיק של כרומוזום X ביום 31. זו הפצת Xist RNA ניתן דמיינו ידי RNA FISH כמו ציפוי של כרומו Xמסוים, המכונה גם ענן Xist. מאחר ותאי גזע עובריים נקבה יכולים לאבד את אחד מכרומוזומי X שלהם בשל חוסר יציבות גנומית, אנו ואחרים מועסקים בשילוב ה-DNA-RNA FISH ללמוד xci, כדי לוודא שתאים רק יציבים karyotypically מוערכים בניתוח של תהליך חשוב זה 22,32 -34. כמו עם כל טכניקה מולקולרית ביולוגיה, כמה פרוטוקולים מעולים שונים כבר פורסמו 35-38. כאן אנו מציגים השיטה שלנו, החל מהגיוס של התמיינות בתאי עכבר גזע עובריים, קיבעון של תאים, תיוג של בדיקות FISH על ידי ניק-תרגום, שלפני טיפול בתאים קבועים כדי לאפשר permeabilization וספיגת בדיקה שלאחר מכן, הכלאה של החללית כדי יעד, ולבסוף זיהוי של הבדיקה על ידי נוגדנים שכותרתו fluorescently. הפרוטוקול במסמך שהוצג מאפשר גילוי נאמן של Xist RNA וכרומוזום X בתוך תקופה של יומיים, ואת היסודות של טכניקה זו יכול ככל הנראה להיות מותאם לotמערכותיה ותחומי המחקר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. אינדוקציה של התמיינות בתאי גזע עוברי נקבה כדי לגרום איון כרומוזום X

הערה: תאי גזע עובריים בעכבר נקבה (על פי בקשה) גדלים בתנאים בתאי גזע עובריים רגילים על תרבות מנות gelatinized המצופה fibroblasts העכבר העוברי (MEFs). אנחנו כאן להניח שהקורא מכיר את טכניקות תרבית תאים סטנדרטיות 39-41. כדי לגרום להתמיינות, תאי גזע עובריים גדלו במנות T25 יופרדו מMEFs, ויהיו מצופים במדיום בידול.

  1. הסר בינוני ES מתרבית תאי הגזע העובריים, ולשטוף פעמיים עם תרבית תאי PBS.
  2. הוסף 1.5 מיליליטר טריפסין-EDTA (לפני לחמם 37 מעלות צלזיוס), ותאי דגירה ב37 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות. לאחר 3.5 דקות, לנער את הצלחת בעדינות כדי לשבור את המושבות.
  3. להשבית טריפסין-EDTA על ידי הוספת 3.5 מיליליטר של מדיום התמיינות לתאים. תאי פיפטה מעלה ומטה כדי להשיג פתרון תא בודד, ולאסוףבצינור 15 מיליליטר. ספין 5 דקות ב200 XG, ולאסוף תאים ב10 מיליליטר של מדיום בידול.
  4. הוסף השעיה תא למנת תרבות שאינה gelatinized, ודגירה עבור שעה 1 בחממה תרבות תא. הערה: MEFs יוכל לדבוק בצלחת התרבות שאינה gelatinized, ואילו תאי גזע עובריים יישארו בהשעיה.
  5. בינתיים, להוסיף coverslips מעוקר זכוכית (24 x 24 מ"מ) ל6 צלחות היטב, להוסיף ג'לטין 0.2%, ו דגירה במשך 5 דקות מינימליות בטמפרטורת חדר.
  6. לאחר 1 שעות, לאסוף את supernatant של תרבית תאי ES מצופה מראש, אשר כוללת בעיקר תאי גזע עובריים שאינו דבקים. פלייט תאי גזע עובריים ל6 גם צלחות המכילות coverslips. הערה: השתמש ב⅙ ה של צלחת T25 מחוברות ל6 בארות של צלחת 6 באר. זה יאפשר בידול מחוברות גם לאחר 3 ימים של בידול. שנה בינונית על בסיס יומי. לקורסים ארוכים יותר זמן התמיינות, תאי גזע עובריים מראש מצופים צלחת במדיום התמיינות בחיידקי מנות, וincubאכלתי על שייקר סלולרי משולב בחממת תרבות תא. זה יאפשר לתאים ליצירת גופי embryoid, אשר יכול להיות מצופה לcoverslips 1-2 ימים לפני הקיבעון.

2. קיבוע של התאים מובחנים ES לניתוח FISH DNA-RNA לאחר

  1. הסר בינוני בידול מתרבויות בידול, ולשטוף פעמיים עם תרבית תאי PBS. הערה: הוסף PBS בזהירות כדי למנוע את התאים שנשטפו.
  2. הסר תרבית תאי PBS ולתקן את התאים על ידי הוספת paraformaldehyde 4% (PFA) / PBS, ודגירה של 10 דקות בטמפרטורת חדר. זהירות: PFA הוא רעיל ויכול לגרום לסיכון בריאותי משמעותי כאשר להיות בשאיפה או בעת מגע על עור או בעיניים. יתר על כן, PFA הוא מסרטנת.
  3. הסר PFA 4% / PBS, ולשטוף coverslips 3x עם 70% אתנול. הערה: השטיפה נכונה היא חשובה, כמו כל זכר של PFA יפריע לצעדי דגים שלאחר מכן. ניתן לאחסן coverslips ב70% אתנול ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים לפני Fניתוח ISH.

3. תיוג של בדיקות DNA לניסויים בדגים

הערה: קבל קטע DNA של הגן של עניין (אורך מינימאלי> 2 KB לRNA FISH, או> 20 kb לדגי DNA), או BAC מכסה את הגן של עניין. לגילוי RNA, חללית קטנה יותר יכולה להיות מספיק בהשוואה לגילוי ה-DNA, שכן סביר להניח שעתוק יגרום תמלילים מרובים, אשר ניתן לאתרם בו זמנית. לאיתות חזקה על גדיל עותק דנ"א היחיד, נדרשת בדיקה ארוכה יותר, כדי להיות מסוגל לזהות מספר מספיק של haptens המשולב. רצוי, אזור גנומי שאינו עיבד נבחר לעיצוב הבדיקה ה-DNA. בנוסף, בעת שימוש בחללית קטנה יותר כדי לזהות RNA, זה יהיה למנוע שהלוקוסים הגנומי שממנו RNA הוא עיבד הוא שיראו בגישת FISH DNA-RNA בשילוב, אם כי לא ניתן לשלול את זה באופן מלא. כדי לזהות עכבר Xist, שימשה בדיקה cDNA 5.5 kb. לDetection של כרומוזום X, ניתן להשתמש במספר בדיקות BAC. תוצאות טובות הושגו בתערובת של BAC RP23-100E1 וBAC CT7-474E4, אשר ממוקמים בסמיכות למוקד Xist. בהתאם לגן או כרומוזום של עניין, כמה בדיקות שונות ייתכן שתידרשנה כדי להשיג תוצאות אופטימליות. בכל פעם שעובד עם חומרים אשר ישמש לRNA-FISH, השתמשו טיפים סטריליים מסנן, H RNase ללא 2 O, ולעבוד בסביבה נקייה.

  1. קח 1 מיקרוגרם של ה-DNA ולדלל בH 2 O בנפח כולל של 16 μl. הוסף 4 μl של digoxigenin או פתרון תיוג ביוטין (ראה חומרים כימיים), מערבב על ידי vortexing ולדגור על 16 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. הערה: ביוטין או נוקלאוטידים שכותרת digoxigenin עכשיו יהיה משולב על ידי nick-תרגום.
  2. בינתיים, להכין את עמודות G50 להסיר נוקלאוטידים שאינם משולבים. קח מזרק 2 מיליליטר, להסיר את סטמפר, ולהוסיף כותנה מעוקרת לתוך המזרק. להוסיף כדורי G50 בt הפתרוןo למלא את המזרק, במקום מזרק בצינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 642 דקות 1. הערה: בסביבות 80% מהמזרק צריכים עכשיו להיות מלאים עם G50. חזור כאשר פחות G50 הוא הווה.
  3. לאחר 90 דקות, להוסיף 40 μl של H 2 O לתערובת תגובת nick-התרגום, ולהוסיף התגובה לטור G50. הוספת צינור ריק תחת העמודה, ו צנטריפוגות ב XG 642 למשך 2 דקות. לאסוף את הזרימה דרך בצינור תגובה.
  4. מדוד את עוצמת הקול של הזרימה דרך עם טפטפת, ולהוסיף H 2 O להגיע להיקף כולל של 200 μl. לזרז את הזרימה דרך ה-DNA על ידי הוספת 13.3 μl זרע סלמון (10 מ"ג / מיליליטר), 13.3 tRNA שמרי μl (10 מ"ג / מיליליטר), ה-DNA 26.7 עכבר μl Cot-1 (1 מ"ג / מיליליטר) ו28 μl 2 M NaAc, pH 5.6. מערבבים על ידי vortexing, ולהוסיף 533 קרח μl אתנול 100% קרים. לנער את הצינור, ו צנטריפוגות ב XG 16,200 למשך 30 דקות ב 4 ° C.
  5. הסר את supernatant ולשטוף גלולה פעמיים עם 70% אתנול. צנטריפוגה ב XG 16,200 במשך 5 דקות ב4 ° C, ואוויר יבש גלולה. הוסף 50 μl של פתרון +50 הכלאה, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי להקל על ההמסה. הערה: בדיקה תווית יכולה להיות מאוחסנת במשך מספר שנים ב -20 ° C. זהירות: 50 + פתרון הכלאה מכיל פוראמיד, שהוא רעיל, עלול לגרום לגירוי במערכת הנשימה עור, עיניים ו, ​​והוא גם teratogen.

4. Permeabilization, טרום טיפול וכלאה של תאים קבועים לCombined DNA-RNA FISH

  1. רעננות תאים קבועים על coverslips, על ידי הסרת 70% אתנול והתוספת של תרבית תאי PBS ל6 גם הצלחות. דגירה במשך 5 דקות. חזור על פעולה שלוש פעמים בסך הכל.
  2. הסר תרבית תאי PBS, ולהוסיף פפסין 0.2% עד 6 הצלחות היטב, לpermeabilize התאים. דגירה 6 צלחות היטב באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות. הסר פפסין, ולהשבית עם H RNase ללא 2 O.
  3. תאים שלאחר תיקון על ידי דוגרים עם PFA 4% / PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. לאחר fixatiב, לשטוף פעמיים עם תרבית תאי PBS במשך 5 דקות.
  4. מייבש את התאים על ידי דוגרים עם אתנול 70% במשך 3 דקות, אתנול 90% במשך 3 דקות ו100% אתנול במשך 3 דקות. העברת coverslips מתוך 6 צלחות היטב, וcoverslips האוויר יבש במשך כמה דקות.
  5. תאי גיל על ידי דוגרים coverslips על 65 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 על צלחת חום.
  6. טרום להכליא בדיקה FISH עם DNA Cot-1 עכבר על ידי הוספה יחד במשך כל coverslip להיות מנותחים, 25 μl של פתרון +50 הכלאה, DNA Cot-1 0.5 עכבר μl, μl 1 של הבדיקה Xist כותרת ביוטין וμl 1 של digoxigenin הבדיקה BAC שכותרתו גילוי כרומוזום X. מערבבים על ידי vortexing, ולפגל על ​​C ° 99 למשך 5 דקות. דגירה באופן מיידי ב-C ° 37 45 דקות, כדי לאפשר DNA Cot-1 כדי להכליא לחזור על רצפים הנמצאים בבדיקות.
  7. לאחר ההזדקנות, במקום 50 μl של חיץ denaturation (בהיקף של 70% formamide/2x חיץ פוספט SSC/10 מ"מ) בשקופית זכוכית, ולשים את coverslips על גבי עם תאים מול towards חיץ denaturation. לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
  8. הוספת coverslips חזרה ל6 צלחות היטב, ותאים שלאחר תיקון, על ידי דוגרים באתנול 70% קרח קר למשך 5 דקות.
  9. מייבש את התאים על ידי דגירה לאחר מכן ב70% אתנול במשך 3 דקות, אתנול 90% במשך 3 דקות ו100% אתנול במשך 3 דקות. הסר את coverslips מ6 צלחות היטב, ולתת אוויר יבש במשך כמה דקות.
  10. ספוט חללית הכלאה מראש בשקופית זכוכית, ודגירת coverslip על גבי. מגלשות מקום בתא humidified מלא 50 מיליליטר 50% formamide/2x SSC, ודגירת הלילה בשעה 37 ° C.

5. רוחצת פוסט כלאה ונוגדן מתווך איתור של בדיקה

  1. מלא 6 צלחות היטב עם 2x SSC, וטרום חם עד 42 ° C. הוספת coverslips לאחר דגירה הלילה, ודגירה על C ° 42 למשך 5 דקות.
  2. הסר SSC 2x, ודגירת coverslips עם SSC formamide/2x 50% עבור 10 דקות ב42 ° C. חזור על פעולה 3 פעמים בסך הכל (30 דקות של כביסה בסך הכל). הסר 50% formamide/2x SSC, ולשטוף שקופיות עם טריס-מלוחים Tween (TST) עבור 2 x 5 דקות בטמפרטורת חדר.
  3. ספוט 50 μl טריס-מלוח-BSA (TSBSA) לכל coverslip על שקופיות זכוכית חדשות, ודגירת coverslips במהופך לחסימה ב30 דקות בטמפרטורת חדר בחדר חשוך TST-humidified.
  4. העברת coverslips חזרה ל6 צלחות היטב, ולשטוף 2 x 5 דקות עם TST.
  5. ספוט 50 μl של נוגדן כבשים נגד חפירות (1:500 בTSBSA) לכל coverslip על שקופיות זכוכית חדשות, ודגירת coverslips הפוכה לשלב הדגירה הראשון ב30 דקות בטמפרטורת חדר בחדר חשוך TST-humidified.
  6. העברת coverslips חזרה ל6 צלחות היטב, ולשטוף 2 x 5 דקות עם TST.
  7. ספוט 50 μl של נוגדן ארנב נגד כבשים מצומד עם FITC (1:250 בTSBSA) לכל coverslip על שקופיות זכוכית חדשות, ודגירת coverslips במהופך לשלב הדגירה השנייה במהלך 30 דקות בטמפרטורת חדר בחדר חשוך TST-humidified .
  8. טרנסfer coverslips חזרה ל6 צלחות היטב, ולשטוף 2 x 5 דקות עם TST.
  9. ספוט 50 μl של נוגדן העז נגד ארנב מצומד עם FITC (1:250 בTSBSA) לכל coverslip על שקופיות זכוכית חדשות, ודגירת coverslips במהופך לשלב הדגירה השלישית במהלך 30 דקות בטמפרטורת חדר בחדר חשוך TST-humidified .
  10. העברת coverslips חזרה ל6 צלחות היטב, ולשטוף 2 x 5 דקות עם TST.
  11. ספוט 50 μl של עכבר אנטי ביוטין נוגדנים (1:200 בTSBSA) לכל coverslip על שקופיות זכוכית חדשות, ודגירת coverslips במהופך לשלב הדגירה הרביעית ב30 דקות בטמפרטורת חדר בחדר חשוך TST-humidified.
  12. העברת coverslips חזרה ל6 צלחות היטב, ולשטוף 2 x 5 דקות עם TST.
  13. ספוט 50 μl של נוגדן חמור אנטי עכבר מצומד עם Rhodamine (1:250 בTSBSA) לכל coverslip על שקופיות זכוכית חדשות, ודגירת coverslips במהופך לשלב הדגירה החמישית ב30 דקות בטמפרטורת החדר בchamb כהה humidified-TSTאה.
  14. העברת coverslips חזרה ל6 צלחות היטב, ולשטוף 2 x 5 דקות עם TST.
  15. ספוט 50 μl של נוגדן העז נגד סוס מצומד עם Rhodamine (1:250 בTSBSA) לכל coverslip על שקופיות זכוכית חדשות, ודגירת coverslips במהופך לשלב הדגירה השישי ב30 דקות בטמפרטורת חדר בחדר חשוך TST-humidified . הערה: הנוגדן העז נגד הסוס יזהה את הנוגדנים החמורים אנטי עכבר; כאשר עומדים לרשות החוקרת, נוגדן עז נגד חמור יעבוד גם כן.
  16. העברת coverslips חזרה ל6 צלחות היטב, ולשטוף 2 x 5 דקות עם TST. שטוף 5 דקות נוספות עם טריס-מלוח (TS).
  17. מייבש את התאים על ידי דגירה לאחר מכן ב70% אתנול במשך 3 דקות, אתנול 90% במשך 3 דקות ו100% אתנול במשך 3 דקות. הסר את coverslips מ6 צלחות היטב, ולתת אוויר יבש במשך כמה דקות.
  18. לזהות ירידה של הרכבה בינונית עם DAPI (ראה חומרים כימיים) בשקופית זכוכית, ולהוסיף coverslip במהופך על גבי. לאטום שקופיות עם מסמר לכה ולהעריך את תוצאות דגים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות הפרוטוקול הנ"ל לשילוב דגי DNA-RNA, היינו מסוגל לדמיין איון כרומוזום X בתאי גזע עובריים ממין נקבה. איור 1 מציג דוגמא מייצגת של ניסוי FISH DNA-RNA, שבו זיהינו את שני Xist (שהוא גלוי כXist RNA ענן שנקרא על כרומוזום X פעיל ולהצביע שעתוק בסיסי על כרומוזום X הפעיל), ואזור של כרומוזום X, המופיע כאות ממוקדת. שים לב שאחד מהאותות להצביע ממוקם בתוך ענן Xist, ובכך מראה כי ענן Xist אכן לוקליזציה לאורך, וציפוי כרומוזום X. בלמעלה מ 99% מתאים, אנו מזהים באמצעות הפרוטוקול שלנו אות נכונה DNA (מידע לא מוצג). בהשוואה ל-RNA-FISH, ענני Xist דמיינו באמצעות הליך FISH DNA-RNA בשילוב נראה לפעמים גדול יותר, כפי שנראה את ה-DNA מפוגל לכבוש שטח גדול יותר. יש לנו OBמזרקת תוצאות דומות באמצעות תאים אנושיים גזע עובריים, לימפוציטים אנושיים ושורות תאי פיברובלסטים שונות של מינים שונים, ואותו הפרוטוקול יושם ללמוד ביטוי גנים של לוקוסי X-linked שונים, לרבות Rnf12. בנוסף, כאשר פרוטוקול זה היה מוחל על תאי גזע עובריים נקבה שלא עברו התמיינות, ביטוי Xist הבזליים משני כרומוזומי X ניתן היה לזהות, מה שמראה שגנים באמצעות פרוטוקול זה גם באו לידי ביטוי ברמות נמוכות יכולים להיות דמיינו (מידע לא מוצג).

איור 1
איור 1. המשולב DNA-RNA FISH בתאי גזע עובריים נקבה מובחנות. נציג תוצאות המתקבלות לאחר הפרוטוקול המתואר במסמך זה לשילוב דגי DNA-RNA. כרומוזום X (X Chr.) הוא זוהה באמצעות בדיקה שכותרתו digoxigenin BAC, אשר דמיינו באמצעות נוגדנים מצומדות כדי FITC (סימן ירוקאל). כמעט בכל תא, שני כרומוזומי X מזוהים. Xist RNA הוא זוהה באמצעות בדיקה ביוטין שכותרתו cDNA, שהיא דמיינו באמצעות נוגדנים מצומדות כדי rhodamine (אות אדומה). שתי הצטברויות Xist הגדולות על כרומוזום X פעיל (ענני Xist) וביטוי Xist הבזליים מכרומוזום X הפעיל (סיכת Xist) מזוהות (הערה: על התמיינות ביטוי Xist בסיס זה פסק על כרומוזום X הפעיל בעתיד, ולכן לא זוהה בכל גרעין). גרעיני counterstained עם DAPI (כחול). בר סולם מייצג 10 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שילוב ה-DNA-RNA FISH יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית, כמו תנאים מתאימים לדנ"א דגים יכולים להיות קשים מדי עבור מולקולות RNA פחות יציבה. כמה גישות יושמו ללמוד שני DNA ו-RNA באותו התא, לעקוף את הצורך בדגירה בו זמנית עם בדיקות לזיהוי שני DNA ו-RNA. לדוגמא, בגישת חפיפה, דגי RNA הראשונים מתבצע, ותאים הם צילמו, וקואורדינטות נלקחות. בהמשך לכך, אותו השקופיות המשמשות לדגי ה-DNA, שבמהלכו האות של RNA FISH הולכת לאיבוד. לאחר FISH-DNA, התאים הם צילמו שוב, והתמונות שהתקבלו משני RNA ודגי DNA הן על גבי. למרות שגישה זו תעבוד כמעט בכל המקרים, כמו ה-DNA של תאים קבועים היא יציבה, ואינו מושפעת מהטיפול הדרוש לדגי רנ"א ראשוניים, זו גישה מאוד מייגע שתעלה לפחות ארבעה ימים. בגישה אחרת, ראשון FISH RNA מתבצע, אות FISH RNA היא קבועה על ידי תוספת ofixatives f, לאחר שדגי DNA מוחל. למרות שגם גישה זו יכולה לעבוד, חלק מאות הניאון נגזרת מדגי RNA יכול ללכת לאיבוד על קיבעון. זה עלול במיוחד להקשות על זיהוי של תמלילים שבאים לידי ביטוי רק ברמה נמוכה. הגישה המוצגת כאן היא מותאמת לזיהוי בו זמני של שני יעד RNA אחד ויעד DNA אחד בניסוי דגים יחיד, ויש לו היתרון שניתן להשיג גם תוצאות בניסוי אחד בתוך יומיים, עם תוצאות אמינות.

כמה צעדים בפרוטוקול FISH הם קריטיים כדי להשיג תוצאות אופטימליות. ראשית, בכל פעם שעוסק במולקולות RNA, אחד צריך להיות זהיר שלא להכניס RNAse בכל חיץ או פתרון בשימוש. לפיכך, סביבת עבודה נקייה צריכה להיות מבוססת, ויש להשתמש במסנן טיפים כאשר ריאגנטים pipetting בשימוש עבור דגים. יש להקפיד להשתמש בתרכובות חופשיות RNAse (לדוגמא מים חופשיים RNAse, הכיתה תרבית תאי PBS, מוחלטותוכו 'אתנול ly טהור). כאשר הכללים פשוטים האלה הם אחריו, זה בדרך כלל אין צורך להשתמש במעכבי RNAse נוספים בתוספת לחומרים הכימיים המשמשים. שנית, הליך permeabilization באמצעות פפסין הוא שיווי משקל עדין בין מעט מדי, או יותר מדי permeabilization. בהתאם לסוג תא המסוים בשימוש, ייתכן שיידרש כדי לייעל את הזמן מוותר עבור permeabilization, או ריכוזי פפסין. האחרון תלוי גם בתצוו הספציפי שלך של פפסין, כפעילות עשויה להשתנות. כחלופה, permeabilization באמצעות Triton-X100/PBS 0.1% במשך 5 דקות תוצאות בתוצאות טובות בתנאים מסוימים, ויש לו היתרון כי דגים בשיטה זו של permeabilization יכולים להיות משולבים עם immunostaining לזהות חלבונים גרעיניים או cytoplasmic. כהיבט חשוב שלישי של דגים, צריכים להיות כל הזמן בטמפרטורות הזדקנות, denaturation, ההכלאה ושטיפה מתמדת. אפילו סטיות קטנות מטמפרטורת היעד יכולות לגרום פחות EFFdenaturation icient, הכלאה, או שוטף מחמיר פחות, שיגרום ליותר מכתים רקע. כחלופה לצעד הזדקנות השעה 1 ב65 ° C ואחריו denaturation על 65 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, גם denaturation ראשוני על 80 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ללא הזדקנות, יכול לתת תוצאות טובות. אנו מעדיפים את הליך ההזדקנות, כמו באופן כללי הליך זה נותן אותות FISH DNA אמינים יותר. לבסוף, בדיקות דנ"א מסוימות תהיה כל כך ספציפיות, שהם לא דורשים שלוש שכבות של נוגדנים לזיהוי מספק. זה צריך להיבדק באופן אמפירי לכל בדיקה חדשה שנוצרה.

אף על פי הפרוטוקול הנוכחי עובד וחסונה במחקר של איון כרומוזום X וזיהוי של Xist, זיהוי משולב של RNA ו-DNA יכול להיות מסובכים יותר בהגדרות אחרות. זה עלול במיוחד להיות המקרה כאשר מיני RNA שנועד כדי להתגלות באו לידי ביטוי רק ברמות נמוכות מאוד, מלא ברצפים חוזרים או הוא קצר יחסיתתמליל. במצבים אלה, זה יכול להיות די קשה לעצב בדיקה אופטימלית, שתאפשר להכלאה היעילה לכמות מוגבלת, לא אופטימלית זמינה של היעד. במצבים כאלה, זה יכול להיות שווה אופטימיזציה של התנאים הראשונים לRNA FISH. כמה בדיקות חלופיות יכולה להיות ניסו, ואת משך הזמן של תיוג בדיקה על ידי ניק-תרגום יכול להיות טיטרציה, כדי לייעל את כמות haptens המשולב. חשוב לציין, שזה צריך להיות מאומת שRNA המטרה מתבטא בתאים להיחקר, על ידי למשל אימות ביטוי על ידי RT-PCR. גם בעת ניתוח סוג של תאים שונים, זה חיוני כדי לכלול תאים בהם ביטוי כבר בעבר זוהו כפקדים חיוביים, כפי שזה יאפשר את ההבחנה בין בעיה טכנית, דגים קשורים, או ההעדר הפשוט של ביטוי בסוג החדש של תאים נותח. כאשר, למרות ביטוי לאמת, השימוש בבדיקות ואופטימיזציה של תנאי תיוג שונים, RNA FISH עושה nתוצאת ot באיתות ברורה, זה יכול להיות שווה לשנות את תנאי ההכלאה, על ידי שינוי כמות פוראמיד בשימוש, או את משך הזמן והטמפרטורה של הכלאת בדיקה. לחלופין, עשויות לשמש בדיקות oligonucleotide שכותרתו ישירות 9-10. לאחר מכן ניתן ליישם את אותם צעדי אופטימיזציה כדי לשפר את דגי ה-DNA, וזיהוי בו זמני של DNA ו-RNA.

באמצעות פרוטוקול FISH DNA-RNA בשילוב, היינו מסוגל ללמוד איון כרומוזום X בהבחנת תאי גזע עובריים ממין נקבה. תוצאות דומות התקבלו במחקרים שלנו באמצעות תאים מסוגים שונים ועוברים, ואנחנו כרגע אופטימיזציה תנאים להחלת FISH DNA-RNA בשילוב בסעיפי רקמות נוספים. כתפקיד החשוב של RNAs ללא קידוד בתהליכים ביולוגיים רבים הופך להיות יותר ומוערך יותר, אנו צופים כי באותו הפרוטוקול יכול ככל הנראה לשמש כדי לחקור RNAs ללא קידוד אחר בהקשר של הכרומטין הספציפי שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
female mouse embryonic stem cells will be made available upon request
mouse embryonic fibroblasts can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g. Millipore
ES cell culture medium DMEM, 15% fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM γ-mercaptoethanol, and 1,000 U/ml LIF. Filter sterilize and store at 4 °C for maximum of 2 weeks.
LIF Chemicon ESG1107
DMEM Invitrogen 11960085
Fetal Calf Serum Invitrogen 10099141
Penicillin–streptomycin (100x) Invitrogen 15140-122
Non-essential aminoacids Invitrogen 11140-050
γ-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M7522
ES cell differentiation medium IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 μl/L monothioglycerol and 50 μg/ml ascorbic acid
IMDM-Glutamax Invitrogen 31980-030
Ascorbic acid (50 mg/ml) Sigma-Aldrich A4403
monothioglycerol Sigma-Aldrich M6145
T25 cell culture dishes Greiner Bio-one 690160
6-well cell culture dishes Greiner Bio-one 662160
cell culture grade PBS Sigma-Aldrich D8537
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS Gibco 25200-056
Falcon tubes Falcon 352196
24 x 24 mm coverslips Menzle 780882
gelatin Sigma-Aldrich G1890-100G prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave
Pepsin Sigma-Aldrich P7000 Dilute to 0.2% in 0.01 M HCl (pH 2.0)
absolute 100% ethanol Sigma-Aldrich 32221-2.5L use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions
RNAse free water Baxter TKF7114
sterile filter tips Rainin Bio Clean GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation) Roche 11745816910
biotin-labeling kit (Biotin Nick translation) Roche 11745824910
Sephadex G50 Sigma-Aldrich G5080
2 ml syringe BD Plastipak 300013
sterilized cotton
Eppendorf tubes Eppendorf 30120086
yeast tRNA 10 mg/ml Invitrogen 15401-029
Salmon Sperm DNA 10 mg/ml Invitrogen 15632-011
mouse cot-1 DNA 1 mg/ml Invitrogen 18440-016
Eppendorf bench top microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Eppendorf refrigerated centrifuge Eppendorf Model 5810R
2 M NaAc, pH 5.6 Sigma-Aldrich S7670
50+ hybridization solution 50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7
formamide Acros organics 3272350000
dextran sulfate Fluka 31403
10 mM phosphate buffer, pH 7 add 57.7 ml of 1 M Na2HPO4 and 42.3 ml 1 M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave
denaturation buffer 70% formamide/2x SSC/10 mM phosphate buffer pH 7
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287
2 M Tris pH 7.5 solution
Tris-saline-Tween washing solution (TST) 100 ml 10x saline, 50 ml 2M Tris, 500 μl Tween-20, add RNAse free water till 1 L
10x saline solution dissolve 85 g NaCl in 1 L RNAse free H2O, and autoclave
Tris-saline-BSA (TSBSA) 500 μl 10x saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3.25 ml RNAse free H2O
BSA, purified, 100x New England Biolabs B9001S
sheep-anti-dig antibody Roche diagnostics use 1:500 diluted in TSBSA
rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
mouse-anti-biotin antibody Roche diagnostics use 1:200 diluted in TSBSA
donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
Tris-saline washing solution (TS) 10 ml 10x saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O
Vectashield mounting medium with DAPI Vectorlabs H-1200
nail varnish
fluorescent miscroscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rudkin, G. T., Stollar, B. D. High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence. Nature. 265, 472-473 (1977).
  2. Imataka, G., Arisaka, O. Chromosome analysis using spectral karyotyping (SKY). Cell Biochem Biophys. 62, 13-17 (2012).
  3. Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
  4. Mastenbroek, S., et al. Preimplantation genetic screening: a systematic review and meta-analysis of RCTs. Hum Reprod Update. 17, 454-466 (2011).
  5. Martins-Taylor, K., Xu, R. H. Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 22-27 (2012).
  6. Rens, W., et al. Resolution and evolution of the duck-billed platypus karyotype with an X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5 male sex chromosome constitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16257-16261 (2004).
  7. Munsky, B., et al. Using gene expression noise to understand gene regulation. Science. 336, 183-187 (2012).
  8. Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
  9. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Rep. 46, 65-72 (2013).
  10. Ji, N., van Oudenaarden, A. Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos. WormBook. , 1-16 (2012).
  11. Femino, A. M., et al. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  12. Buongiorno-Nardelli, M., Amaldi, F. Autoradiographic detection of molecular hybrids between RNA and DNA in tissue sections. Nature. 225, 946-948 (1970).
  13. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).
  14. John, H. A., et al. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature. 223, 582-587 (1969).
  15. Bauman, J. G., et al. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
  16. Wiegant, J., et al. In situ hybridization with fluoresceinated DNA. Nucleic Acids Res. 19, 3237-3241 (1991).
  17. Langer, P. R., et al. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 6633-6637 (1981).
  18. Manuelidis, L., et al. High-resolution mapping of satellite DNA using biotin-labeled DNA probes. J Cell Biol. 95, 619-625 (1982).
  19. Kislauskis, E. H., et al. Isoform-specific 3'-untranslated sequences sort alpha-cardiac and beta-cytoplasmic actin messenger RNAs to different cytoplasmic compartments. J Cell Biol. 123, 165-172 (1993).
  20. Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 79, 7331-7335 (1982).
  21. Corput, M. P., et al. Fluorescence in situ hybridization using horseradish peroxidase-labeled oligodeoxynucleotides and tyramide signal amplification for sensitive DNA and mRNA detection. Histochem Cell Biol. 110, 431-437 (1998).
  22. Jonkers, I., et al. RNF12 is an X-Encoded dose-dependent activator of X chromosome inactivation. Cell. 139, 999-101 (2009).
  23. Barakat, T. S., et al. RNF12 activates Xist and is essential for X chromosome inactivation. PLoS Genet. 7, (2011).
  24. Gontan, C., et al. RNF12 initiates X-chromosome inactivation by targeting REX1 for degradation. Nature. 485, 386-390 (2012).
  25. Lyon, M. F. Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L). Nature. 190, 372-373 (1961).
  26. Barakat, T. S., Gribnau, J. X. chromosome inactivation in the cycle of life. Development. 139, 2085-2089 (2012).
  27. Augui, S., et al. Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre. Nat Rev Genet. 12, 429-442 (2011).
  28. Brown, C. J., et al. A gene from the region of the human X inactivation centre is expressed exclusively from the inactive X chromosome. Nature. 349, 38-44 (1991).
  29. Brockdorff, N., et al. Conservation of position and exclusive expression of mouse Xist from the inactive X chromosome. Nature. 351, 329-331 (1991).
  30. Borsani, G., et al. Characterization of a murine gene expressed from the inactive X chromosome. Nature. 351, 325-329 (1991).
  31. Barakat, T. S., Gribnau, J. X chromosome inactivation and embryonic stem cells. Adv Exp Med Biol. 695, 132-154 (2010).
  32. Chaumeil, J., et al. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
  33. Okamoto, I., et al. Eutherian mammals use diverse strategies to initiate X-chromosome inactivation during development. Nature. 472, 370-374 (2011).
  34. Gribnau, J., et al. X chromosome choice occurs independently of asynchronous replication timing. J Cell Biol. 168, 365-373 (2005).
  35. Namekawa, S. H., Lee, J. T. Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos. Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).
  36. Van Tine, B. A., et al. Simultaneous in situ detection of RNA, DNA, and protein using tyramide-coupled immunofluorescence. Methods Mol Biol. 292, 215-230 (2005).
  37. Pollex, T., et al. Live-Cell Imaging Combined with Immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to Study the Nuclear Dynamics and Expression of the X-Inactivation Center. Methods Mol Biol. 1042, 13-31 (2013).
  38. Chaumeil, J., et al. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
  39. Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 690, 31-56 (2011).
  40. Meissner, A., et al. Derivation and manipulation of murine embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 482, 3-19 (2009).
  41. Nichols, J., Ying, Q. L. Derivation and propagation of embryonic stem cells in serum- and feeder-free culture. Methods Mol Biol. 329, 91-98 (2006).

Tags

ביוכימיה גיליון 88 פלורסנט ה-DNA-RNA בשילוב דגים בתאי גזע עובריים ציטוגנטיקה ניתוח תא בודד איון כרומוזום X (xci), כרומוזום בקטריאלי מלאכותי (BAC) ה-DNA בדיקה,
DNA-RNA בשילוב פלורסנט<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים) לחקר איון כרומוזום X בתאי גזע הבדיל נקבה עכבר עוברי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined … More

Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (88), e51628, doi:10.3791/51628 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter