Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kombine DNA-RNA Floresan Published: June 14, 2014 doi: 10.3791/51628
Automatic Translation
1, 1
1Department of Reproduction and Development, Erasmus MC - University Medical Center

Summary

In situ hibridizasyon (FISH) floresan hücre içinde kendi doğal ortamında nükleik asitlerin saptanmasını sağlar. Burada fare embriyonik kök hücreleri X kromozomu inaktivasyon incelemek için kullanılabilir FISH vasıtasıyla RNA ve DNA birleşik, eş zamanlı olarak saptanması için bir protokol açıklar.

Abstract

In situ hibridizasyon (FISH) floresan hücrelerdeki nükleik asitlerin saptanmasını sağlayan bir molekül tekniktir. DNA FISH genellikle sitogenetiği ve kanser teşhisinde kullanılan ve çoğu zaman önemli klinik etkileri vardır genomun, sapmaları tespit edebilir. RNA FISH hücrelerde RNA molekülleri tespit etmek için kullanılabilir ve gen ekspresyonunun düzenlenmesinde önemli bilgiler sağlamıştır. DNA FISH için uygun koşullar kırılgan, tek sarmallı RNA molekülleri için çok sert olabilir gibi aynı hücre içinde DNA ve RNA BALIK birleştiren, teknik olarak zordur. Biz burada X kromozomu tarafından kodlanan Xist RNA ve DNA kombine eşzamanlı algılamayı sağlayan kolay uygulanabilir bir protokol mevcut. Bu kombine DNA-RNA FISH protokol muhtemelen RNA ve DNA hem de tespit edilmesi gereken diğer sistemlere de uygulanabilir.

Introduction

In situ hibridizasyon (FISH) floresan vasıtasıyla hücre ve dokuları inceleyerek 1970'lerin 1 yılından bu yana, araştırmacılar subselüler seviyesinde genler, kromatin organizasyonu ve gen ifadesini incelemek için izin vardır. DNA FISH sık sitogenetik, karyotipleme 2, kanser teşhis 3 ve pre-implantasyon genetik tarama 4'te kullanılan ve onların doğal ortamında nükleik asitlerin saptanmasını sağlar çünkü moleküler araştırma 5-6 önemli bir role sahiptir. RNA FISH ile tek hücre ekspresyon analizleri yerli primer transkript algılayabilir ve kodlamayan RNA'lar kromozom transkripsiyonu, ve aralarında örneğin bir nüfus düzeyinde gen ifadesini değerlendirmek diğer tekniklerden avantaj sunuyor kantitatif RT-PCR, genom ekspresyon analizi veya Kuzey lekeleme . Geldikleri sitelerinden doğrudan kaynaklanan RNA transkript görselleştirerek, örneğin olmuşturgen ekspresyon stokastik 7, ve bazen 8 alel spesifik olabilir fark ettim. Tekniğin gelişmeler bile hücreler 9-11 olan bir mRNA moleküllerinin algılama ve ölçümü izin vermektedir.

FISH temel ilkesi, son derece spesifik, Watson ve Crick'in baz eşleştirme aracılığıyla bir nükleik asit sondasına hücre içinde nükleik asitlerin hibridizasyonu oluşur. Sonda, ya doğrudan veya dolaylı olarak tespit edildi, mikroskobik olarak görselleştirilebilen bir sinyal elde olabilir. Başlangıç ​​girişimleri güvenlik sorunları sınırlı uzamsal çözünürlük ve bir süre 12-14 yalnızca bir hedef tespit etme yeteneğine göre sakıncaları vardı radyoaktif olarak etiketlenmiş problar, oluşuyordu. Fluorochromes, haptenlere ve enzimler içeren radyoaktif olmayan etiketler, sonraki gelişme, rutin moleküler biyoloji tekniği olarak FISH yaygın kullanımına izin vermiş. FISH prob ya doğrudan fluoroch ile etiketlenmiş olabilirnükleik asit floresan moleküller ile kimyasal bağlanması romes 15 ve floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin 16-19, ya da dolaylı olarak prob (biyotin ve digoksijenin dahil) haptenlerin entegrasyonu ve konjüge edilmiş hapten özgü antikorlarla haptenlerin immünolojik tespiti sonra görselleştirilebilir entegrasyonu dizilerinin flüoresan raportör moleküllerin 20-21. İkinci yaklaşım orijinal sinyal geliştirmek için kullanılan floresan işaretli antikorlar çeşitli katmanları kullanarak sinyal büyütülmesine olanak tanır, ve düşük seviyelerde ifade edilmiştir RNA türünün saptanmasını sağlar. Doğrudan ve dolaylı etiketleme teknikleri ve çeşitli haptenleri birleştirerek, bazı hedefler aynı anda aynı hücre içinde görselleştirilebilir.

FISH protokolleri en önemli adımlardan biri hedefine probun hibridizasyonu. Teorik olarak, bir prob özel uygulamada, hedefine bağlanan tek olsa da, bu özgünlüğüprobları homolog bölgelere bağlanabilir her zaman olduğu gibi, elde edilememesi ve hibridizasyon koşulları daima belirli bir DNA bölgesi ya da RNA türleri için ideal olmayabilir olacaktır. Bunlar FISH prosedürün sıkılığının artırabilir ve arka plan gürültüsü yüksek düzeyde olmasına neden olur FISH prob, spesifik olmayan bağlanmasını önlemek gibi hibridizasyon sonrası yıkamalar, bu nedenle özel bir önem taşımaktadır. RNA molekülleri tek telli gibi kolayca bir BALIK hibritlenmiştir olabilir. Buna karşılık, iki iplikçikli DNA molekülü, birinci bir sonda melezleşebilir sonra denatürasyon adımı gerekmektedir. Bu genellikle DNA'nın denatürasyonu ile sonuçlanan numunenin ısıtılması ile elde edilir. Ancak bu sert koşullar altında, kırılgan, tek sarmallı RNA molekülleri kaybolmuş olabilir. Bu nedenle, birleşik DNA-RNA FISH koşullarının önemli optimizasyon gerektirir ve sadece RNA veya DNA'nın ayrı bir algılama göre daha teknik açıdan zor.

Burada presenta detaylı bizi dişi fare embriyonik kök hücreleri 22-24 ayırt X kromozomu inaktivasyonu (XCI) okuttu kombine, eşzamanlı DNA-RNA FISH protokolü. XCI önemli bir epigenetik dişi embriyonik gelişme için bir mekanizma 25 ve heterochromatinization ile sonuçlanır ve bu nedenle dişi bireyler 26-27 iki X kromozomu birinin susturma. Bu işlem için gerekli 22-23 RNF12 ve REX1 24 proteinler tarafından düzenlenir kodlayıcı olmayan RNA Xist 28-30 vardır. Xist sentezleme embriyonik gelişimi sırasında ya da in vitro ES hücre farklılaşması üzerine gelecek etkin X kromozom (Xi) üzerinde yukarı regüle olur ve X kromozomu boyunca yayılır ve böylece X kromozomu 31 transkripsiyonel kapanmasına neden kromatin yeniden enzimleri de olabilir. Bu Xist RNA yayılan X kromozomal bir kaplama olarak RNA FISH ile görselleştirilebilirbazıları, aynı zamanda bir bulut Xist olarak ifade edilmektedir. Kadın ES hücreleri genomik istikrarsızlık nedeniyle X kromozomu birini kaybedebilir yana, biz ve diğerleri emin sadece karyotipik istikrarlı hücreleri, bu önemli sürecin 22,32 analizinde değerlendirilir emin olmak için, XCI çalışma kombine DNA-RNA FISH istihdam var -34. Her moleküler biyoloji tekniğinde olduğu gibi, çok sayıda farklı mükemmel protokoller 35-38 yayınlanmıştır. Burada izin vermek için, fare ES hücreleri, hücrelerin tespit Nick-çeviri, sabit hücrelerin ön-muamelesi ile FISH prob etiketleme farklılaşmasının indüksiyonu başlayarak eden yöntem mevcut permeabilizasyon ve daha sonra prob alımı, için sondanın hibridizasyon Hedef ve son olarak floresan etiketli antikorlar ile prob tespiti. Burada sunulan protokol Xist RNA sadık algılama ve iki günlük bir süre içinde X kromozomu sağlar ve bu tekniğin temelleri muhtemel ot adapte edilebilirOnun sistemleri ve araştırma alanları.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Kadın Embriyonik Kök Hücreleri Farklılaşma endüklenmesi X kromozomu inaktivasyonu tetikleyebilecek

NOT: Bayan fare embriyonik kök hücreleri (istek üzerine) fare embriyonik fibroblastlar (MEF'ler) ile kaplanmış Jelatinize kültür yemekleri standart ES hücre koşullarında yetiştirilir. Biz burada okuyucu standart hücre kültürü teknikleri 39-41 aşina olduğunu varsayalım. Farklılaşmasını teşvik etmek için, T25 tabaklarında büyütülmüş ES hücreler MEF'ler ayrılabilir, ve farklılaşma ortam içinde kaplı olacaktır.

  1. ES hücre kültüründen ES orta çıkarın ve hücre kültürü iki kez PBS ile yıkayın.
  2. 1.5 ml tripsin-EDTA (37 ° C'ye önceden ısıtılmış) ekleyin ve 7 dakika boyunca 37 ° C'de hücreler inkübe edilir. 3.5 dakika sonra, koloniler kırmak için hafifçe çanak sallayın.
  3. Hücrelere farklılaştırma ortamının 3.5 ml eklenerek tripsin-EDTA etkisiz hale getirirler. Pipet hücreler yukarı ve aşağı tek hücreli çözüm elde ve toplamakbir 15 ml tüp içinde. 200 x g'de 5 dakika boyunca Spin ve farklılaştırma ortamının 10 ml hücreleri toplamak.
  4. Olmayan bir jelatinleştirilmiş kültür tabağına hücre süspansiyonu ekleyin ve bir hücre kültürü kuluçka makinesi içinde 1 saat boyunca inkübe edilir. NOT: ES hücreleri süspansiyon içinde kalacaktır MEF'ler, non-jelatinleştirilmiş kültür tabağına yapışma mümkün olacaktır.
  5. Bu arada, 6-çukurlu plakalara steril cam lamelleri (24 x 24 mm) ekleyin% 0.2 jelatin ekleyin ve oda sıcaklığında en az 5 dakika boyunca inkübe edin.
  6. 1 saat sonra, esas olarak non-yapışan ES hücre oluşacak, ön kaplama ES hücre kültürü süpernatan toplamak. Lamelleri içeren 6 oyuklu plakalara plaka ES hücreleri. NOT: ⅙ 6 oyuklu plakanın 6 kuyu için bir birleşik T25 çanak th. Bu da farklılaşma 3 gün sonra, bir birleşik farklılaşma sağlayacaktır. Günlük olarak orta değiştirin. Uzun farklılaşma zamanlı dersler, bakteriyel yemekleri farklılaşma ortamda plaka ön kaplama ES hücreleri ve inkubasyon içinHücre kültürü inkübatörü içine entegre edilmiş bir hücre çalkalayıcıda yedi. Bu hücreler, 1-2 gün önce tespit etmek için lamelleri kaplama olabilir embriyoit organları oluşturmak için izin verir.

Daha sonraki DNA-RNA FISH Analizi için Ayrılmış ES Hücre 2. Fixation

  1. Farklılaşma kültürlerden farklılaşma orta çıkarın ve hücre kültürü iki kez PBS ile yıkayın. NOT: hücreler yıkanır önlemek için dikkatli bir şekilde PBS ekleyin.
  2. Hücre kültürü PBS çıkarın ve% 4 paraformaldehit (PFA) / PBS eklenerek hücreleri düzeltmek ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edilir. DİKKAT: PFA toksik ve inhale veya zaman Gözlere veya cilde temas edilirken önemli sağlık riskine neden olabilir. Ayrıca, PFA kanserojen.
  3. % 4 PFA / PBS çıkarın ve% 70 etanol ile lamelleri 3x yıkayın. NOT: PFA herhangi bir iz sonraki BALIK adımlarla engel olacak şekilde Doğru yıkama, önemlidir. Lameller önce F birkaç ay boyunca -20 ° C 'de% 70 etanol içinde saklanabilirISH analizi.

FISH Deneyler için DNA Proses 3. Etiketleme

Not: ilgi konusu genin (minimum uzunluğu> RNA balık ya da> DNA FISH için 20 kb 2 kb) ya da ilgi konusu geni içeren bir BAC bir DNA fragmanını elde edilir. Büyük ihtimalle transkripsiyon eş zamanlı olarak tespit edilebilir çok transkript ile sonuçlanacaktır Başlangıcı RNA saptanması için, daha küçük bir sonda, DNA tespiti ile karşılaştırıldığında yeterli olabilir. Tek bir kopya DNA şeridi üzerinde güçlü bir sinyal için, daha uzun bir sonda dahil haptenlerin yeterli sayıda tespit edebilmek için gereklidir. Tercihen, bir non-transkribe genomik bölge için DNA probunun tasarlanması için seçilir. RNA tespit etmek için daha küçük bir sonda kullanılarak Buna ek olarak, bu tamamen göz ardı edilemez olsa da RNA transkripsiyonu edildiği genomik lokusları, birleşik DNA-RNA FISH yaklaşımla tespit ediliyor önlenecektir. Fare Xist algılamak için, bir 5.5 kb cDNA probu kullanılmıştır. Det içinX kromozomu ection çeşitli BAC problar kullanılabilir. İyi sonuçlar Xist lokusuna yakın bulunan BAC RP23-100E1 ve BAC CT7-474E4, bir karışımı elde edilmiştir. Ilgi konusu gen veya kromozom bağlı olarak, çeşitli problar en iyi sonuçları elde etmek için gerekli olabilir. RNA-FISH için kullanılacak malzemeler ile çalışan temiz bir ortamda steril filtre ipuçları, RNAse serbest H 2 O ve iş kullanımı zaman.

  1. DNA 1 ug alın ve 16 ul bir toplam hacimde, H2O içinde seyreltin. , 4 digoksijenin ul veya biotin etiketleme çözeltisi (reaktif bakınız) ekle vorteks ile karıştırın ve 90 dakika boyunca 16 ° C'de inkübe edin. Not: biotin ya da digoksigenin-etiketli nükleotidler hemen nik-çevirisi ile dahil edilecektir.
  2. Bu arada, sigara entegre nükleotidler kaldırmak için G50 sütunları hazırlamak. , 2 ml şırınga alın stamper kaldırmak ve şırınga içine sterilize pamuk ekleyin. Çözüm t G50 topları Ekleo, 1 dakika boyunca 642 x g, 15 ml bir tüp ve santrifüj içinde şırınga, şırınga doldurun. NOT: şırınga% 80 civarında şimdi G50 ile dolu olmalıdır. Az G50 mevcut olduğunda tekrarlayın.
  3. 90 dakika sonra, çentik-translasyon reaksiyon karışımına, H2O içinde 40 ul ekleyin ve G50 kolonuna reaksiyonu ekleyin. Sütunun altında boş bir tüp ekleyin ve 2 dakika boyunca 642 x g 'de santrifüj. Bir reaksiyon tüpü yoluyla akışını toplamak.
  4. Bir pipet ile üzerinden akışı hacmini ölçün ve 200 ul toplam hacme ulaşmak için, H 2 O ekleyin. 13.3 ul somon sperm DNA'sı (10 mg / ml), 13.3 ul maya tRNA (10 mg / ml), 26.7 ul fare Cot-1 DNA (1 mg / ml) ve 28 ul 2 M NaAc, pH ekleyerek yoluyla akışını Çökelti 5.6. Vorteks ile karıştırın ve 533 ul buz soğukluğunda% 100 etanol ilave edin. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 16,200 xg'de tüp ve santrifüj sallayın
  5. Süpernatant kaldırmak ve% 70 etanol ile iki kez pelet yıkayın. 5 dk boyunca 16,200 x g'de santrifüj4 ° C ve hava pelet kurutun. 50 + melezleştirme çözeltisi 50 ul ve çözülmesini kolaylaştırmak için 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Not: Etiketli prob -20 ° C'de birkaç yıl boyunca depolanabilir DİKKAT: 50 + melezleme çözüm, toksik deri, gözleri ve solunum sistemini tahriş edebilir ve aynı zamanda bir teratojen formamid içerir.

4.. Permeabilization, Kombine DNA-RNA FISH için Sabit Hücreler tedavi öncesi ve Hibritleşme

  1. % 70 etanol ve 6-delikli plakalara hücre kültürü PBS ilave kaldırarak, lamelleri ile sabitleştirilmiş hücreler rehidrate. 5 dakika boyunca inkübe edin. Toplam üç kez tekrarlayın.
  2. Hücre kültürü PBS çıkarın ve hücreleri permeabilize, 6-çukurlu plakalara% 0.2 pepsin ekleyin. 4 dakika boyunca 37 ° C'de bir su banyosu içinde 6 oyuklu inkübe edin. Pepsin kaldırmak ve RNAse serbest H 2 O. ile inaktive
  3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 4 PFA / PBS ile inkübe edilmesi ile post-fix hücreleri. Fixati sonraon, 5 dakika boyunca hücre kültürü iki kez PBS ile yıkayın.
  4. 3 dakika sonra 3 dakika için 3 dakika ve% 100 etanol için% 90 etanol,% 70 etanol ile inkübe hücreleri kurutmak. Gelirleri 6-çukurlu dışarı lamelleri, ve birkaç dakika boyunca hava kuru lamelleri.
  5. Bir ısı plaka üzerinde, 1 saat boyunca 65 ° C'de inkübe edilerek lamelleri Yaş hücreleri.
  6. Analiz edilecek her bir lamel için bir araya eklenerek, fare Cot-1 DNA ile FISH prob önceden hibridize, 50 + hibridizasyon çözeltisi, 0.5 ul fare Cot-1 DNA, biyotin-etiketli prob Xist 1 ul ve digoksijenin 1 ul 25 ul X kromozomu tespit etiketli BAC prob. Vorteks ile karıştırılmakta ve 5 dakika boyunca 99 ° C'de denatüre. Katlanır-1 DNA probları mevcut dizilerini tekrar hibridize izin vermek için, 45 dakika boyunca 37 ° C 'de hemen inkübe edin.
  7. Bekletildikten sonra cam slayt üzerinde (SSC/10 mM fosfat tampon maddesi formamide/2x% 70 arasında oluşan) denatürasyon tampon maddesi 50 ul nokta ve hücreler towar bakacak şekilde üst üste koymak lamelleridenatürasyon tampon ds. 2 dakika boyunca 65 ° C'de inkübe edin.
  8. 5 dakika boyunca buz gibi soğuk% 70 etanol içinde inkübe edilerek geri 6-çukurlu plakalara lamelleri ve post-fix hücreleri ekleyin.
  9. 3 dakika sonra 3 dakika için 3 dakika ve% 100 etanol için% 90 etanol,% 70 etanol içinde daha sonraki kuluçka hücreleri kurutmak. 6-delikli plakadan lamelleri çıkarın ve birkaç dakika kurumasını sağlar.
  10. Bir cam slayt üzerinde ön melezleşmiştir sonda nokta, ve üstüne lamel kuluçkaya yatmaktadır. Yer SSC formamide/2x 50 ml% 50 ile dolu nemli bir oda içinde slaytlar, 37 ° C de bir gece inkübe

5. Olarak hibridizasyon sonrası yıkamaların ve Probe Antikor Aracılı Algılama

  1. 2x SSC ile 6 oyuklu plakalar doldurun ve önceden 42 ° C sıcak kadar Gece boyunca inkübasyondan sonra lamelleri ekleyin ve 5 dakika boyunca 42 ° C'de inkübe edin.
  2. 2x SSC çıkarın ve 42 ° C'de 10 dakika boyunca% 50 formamide/2x SSC ile lamelleri inkübe Toplam 3 kez (tamamen yıkama 30 dakika) tekrarlayın. SSC formamide/2x% 50 kaldırmak ve oda sıcaklığında 2 x 5 dakika boyunca Tris-salin-Tween (TST) ile slaytlar yıkayın.
  3. Nokta 50 ul yeni cam slaytlar üzerinde lamel başına Tris-salin-BSA (TSBSA) ve TST-nemlendirilmiş karanlık bir oda içinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bloke edilmesi için ters lamelleri inkübe edin.
  4. Aktarım arka 6-çukurlu plakalara lamelleri ve TST ile 2 x 5 dakika yıkayın.
  5. Nokta 50 yeni cam slaytlar üzerinde lamel başına koyun-anti-dig antikoru (TSBSA olarak 1:500) ve ul ve TST-nemlendirilmiş karanlık bir oda içinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübasyon birinci adım için lamelleri inkübe ters.
  6. Aktarım arka 6-çukurlu plakalara lamelleri ve TST ile 2 x 5 dakika yıkayın.
  7. Nokta 50 yeni cam slaytlar üzerinde lamel başına FITC (TSBSA olarak 1:250) ile konjüge edilmiş tavşan anti-koyun antikoru ul ve TST-nemlendirilmiş karanlık bir oda içinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ikinci bir inkübasyon aşaması için ters lamelleri inkübe .
  8. Transfer arka 6-çukurlu plakalara lamelleri ve TST ile 2 x 5 dakika yıkayın.
  9. Nokta 50 yeni cam slaytlar üzerinde lamel başına FITC (TSBSA olarak 1:250) ile konjuge edilmiş keçi anti-tavşan antikoru ul ve TST-nemlendirilmiş karanlık bir oda içinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübasyon üçüncü aşama için baş aşağı inkübe lamelleri .
  10. Aktarım arka 6-çukurlu plakalara lamelleri ve TST ile 2 x 5 dakika yıkayın.
  11. Nokta 50 yeni cam slaytlar üzerinde lamel başına fare-anti-biotin antikor ul (TSBSA olarak 1:200) ve TST-nemlendirilmiş karanlık bir oda içinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübasyon dördüncü aşama için ters lamelleri inkübe edin.
  12. Aktarım arka 6-çukurlu plakalara lamelleri ve TST ile 2 x 5 dakika yıkayın.
  13. Nokta 50 yeni cam slaytlar üzerinde lamel başına Rodamin (TSBSA olarak 1:250) ile konjuge edilmiş eşek anti-fare antikorunun ul ve ters bir TST-nemlendirilmiş karanlık odacıklı içerisinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübasyon beşinci aşama için lamelleri inkübeer.
  14. Aktarım arka 6-çukurlu plakalara lamelleri ve TST ile 2 x 5 dakika yıkayın.
  15. Nokta 50 yeni cam slaytlar üzerinde lamel başına Rodamin (TSBSA olarak 1:250) ile konjuge edilmiş keçi anti-at antikor ul ve TST-nemlendirilmiş karanlık bir oda içinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübasyon altıncı aşama için baş aşağı inkübe lamelleri . NOT: keçi anti-at antikor eşek anti-fare antikoru tanıyacaktır; zaman araştırmacı mevcut, bir keçi-anti-eşek antikoru de işe yarayacaktır.
  16. Aktarım arka 6-çukurlu plakalara lamelleri ve TST ile 2 x 5 dakika yıkayın. Tris-salin (TS) ilave 5 dakika yıkanır.
  17. 3 dakika sonra 3 dakika için 3 dakika ve% 100 etanol için% 90 etanol,% 70 etanol içinde daha sonraki kuluçka hücreleri kurutmak. 6-delikli plakadan lamelleri çıkarın ve birkaç dakika kurumasını sağlar.
  18. Bir cam slayt üzerinde DAPI ile montaj orta bir damla (reaktiflerimize bakın) Nokta ve baş aşağı üstüne lamel ekleyin. Tırnak cilası ile slaytlar mühür vefloresan mikroskopisi ile FISH sonuçlarının değerlendirilmesi (Şekil 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kombine DNA-RNA FISH için yukarıda belirtilen protokolü kullanarak, dişi embriyonik kök hücreleri farklılaştırarak X kromozomu inaktivasyonu görselleştirmek mümkün olmuştur. 1. biz Xist (ki her ikisi de tespit edilen DNA-RNA FISH deney, temsili bir örneğini göstermektedir inaktif X kromozomu üzerindeki bir sözde Xist RNA bulut ve aktif X kromozomu üzerinde bir bazal transkripsiyon iğne ucu) ve bir iğne ucu sinyali olarak görülebilir X kromozomu, bir bölge olarak görülebilir. Iğne ucu sinyallerinden biri böylece Xist bulut gerçekten boyunca yerelleştirilmesi ve X kromozomu kaplama olduğunu gösteren, Xist bulut içinde bulunduğunu unutmayın. Hücrelerin% 99'dan fazla, bizim protokol doğru DNA sinyali (veriler gösterilmemiştir) kullanarak algılar. RNA-FISH ile karşılaştırıldığında, Xist bulutlar denatüre DNA büyük bir alanı işgal gibi görünüyor kombine DNA-RNA FISH prosedürü, bazen büyük görünmesini kullanılarak görüntülendi. Biz ob varES hücreleri, insan, insan lenfositleri ve çeşitli türlerin çeşitli fibroblast hücre hatları kullanılarak benzer sonuçlar saklanmaktadır ve aynı protokol Rnf12 dahil olmak üzere çeşitli X-bağlı lokus, gen ekspresyonunu incelemek için uygulanmıştır. Bu protokol, farklılaşmamış dişi ES hücrelerine uygulandığında Buna ek olarak, iki X kromozomu ikinci bazal Xist ekspresyon düşük seviyelerde sentezlendiği, aynı zamanda, bu protokol kullanılarak genler (veriler gösterilmemiştir) görselleştirilebilir olduğunu gösteren, saptanabilir.

Şekil 1
Şekil 1. Farklılaşmış dişi ES hücrelerinde Kombine DNA-RNA FISH. Birleştirilen DNA-RNA FISH için burada tarif edilen protokol sonra elde edilen sonuçlar Örnek. X kromozomu (X CHR). FITC konjüge edilmiş antikorlar kullanılarak görselleştirilir digoksigenin ile işaretlenmiş prob BAC, (yeşil işaret kullanılarak saptanıral). Hemen hemen her hücrede, iki X kromozomu tespit edilir. Xist RNA rodamin (kırmızı sinyali) konjüge edilmiş antikorlar kullanılarak görselleştirilir bir biyotin etiketli cDNA probu kullanılarak tespit edilir. Inaktif X kromozomu (Xist bulutlar) ve aktif X kromozomu (Xist saptar) den bazal Xist ifadesi hem büyük Xist birikimleri tespit edilir (not: farklılaşma üzerine bu bazal Xist ifade gelecekte aktif X kromozomu üzerinde durmuş ve bu nedenle tespit edilmez her çekirdekte). Çekirdekler DAPI (mavi) ile ters. Ölçek çubuğu 10 mm temsil eder. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DNA FISH için uygun koşullar daha az istikrarlı RNA molekülleri için çok sert olabilir gibi kombine DNA-RNA FISH, teknik olarak zor olabilir. Çeşitli yaklaşımlar hem DNA hem RNA'yı tespit probları ile aynı anda inkübasyon için ihtiyaç engellemeyi, aynı hücre içerisinde DNA ve RNA hem de çalışma uygulanmıştır. Örneğin, bir bindirilmesi yaklaşımda, birinci RNA FISH gerçekleştirilir ve hücre görüntülenmiş ve koordinatlar alınır. Daha sonra, aynı slaytlar RNA FISH sinyalinin kaybolması sırasında, DNA FISH için kullanılır. DNA FISH sonra hücreler tekrar görüntüsü, ve RNA ve DNA FISH hem de elde edilen resim üst üste. Sabit hücrelerin DNA stabildir ve ilk RNA FISH için gerekli olan tedavi ile etkilenmez olarak bu yaklaşım, hemen hemen tüm durumlarda çalışacak olmasına rağmen, bu en az dört gün mal olacak bir çok zahmetli bir yaklaşımdır. Bir başka yaklaşımda, birinci RNA FISH gerçekleştirilir, RNA FISH sinyal o eklenerek sabitlenirDNA FISH tatbik edildiği sonra f sabitleyici. Ayrıca bu yaklaşım, çalışabilir, ancak RNA FISH türetilen fluoresan sinyalinin bir tespit üzerine kaybolabilir. Bu, özellikle, sadece düşük bir seviyede ifade edilir transkript tespit engelleyebilir. Burada sunulan bir yaklaşım tek FISH deneyde bir RNA hedefi ve bir DNA hedef hem de eş zamanlı saptanması için optimize edilmiş, ve her iki sonuç güvenilir sonuçlar, iki gün içinde tek bir deneyde elde edilebilir avantajına sahiptir.

FISH protokolde çeşitli adımlar en iyi sonucu elde etmek için çok önemlidir. RNA molekülleri ile ilgili her Birincisi, tek kullanılan herhangi bir tampon ya da çözelti içinde RNAse tanıtmak için dikkatli olmalıdır. Bu nedenle, temiz bir çalışma ortamı tesis edilmelidir, ve pipetleme reaktifler FISH için kullanıldığında filtre ipuçları kullanılmalıdır. Care RNAse serbest bileşikler (örneğin RNAse içermeyen su gibi, hücre kültürü dereceli PBS, mutlak kullanımı alınmalıdırly saf etanol vb.) Bu basit kurallar takip edilir, bu kullanılan reaktiflere karşı takviye ilave RNAse inhibitörlerinin kullanımı genellikle gerekli değildir. İkincisi, pepsin kullanarak permeabilization prosedür çok az, ya da çok fazla geçirgenleştirmeden arasında yumuşak bir denge olduğunu. Kullanılan özel hücre tipine bağlı olarak, nüfuziyet izin verilen zaman veya pepsin konsantrasyonları optimize etmek için gerekli olabilir. Etkinlik değişebilir gibi İkincisi de, pepsin sizin özel toplu bağlıdır. Belirli koşullar altında iyi sonuçlar 5 dakika sonuçlar için% 0.1 Triton-X100/PBS kullanılarak ve nüfuziyet bu yöntemi kullanarak FISH nükleer ya da sitoplazmik proteinleri saptamak için immüno-lekeleme ile birleştirilebilir avantajına sahip bir alternatif olarak, nüfuziyet. Üçüncü bir balık önemli bir yönü olarak, yaşlanma, denatürasyon, hibridizasyon ve yıkama sıcaklıkları sabit tutulmalıdır. Hedef sıcaklık küçük sapmalar bile daha az neden olabilir effdaha fazla arka plan boyaması neden olur icient denatürasyon, hibritleme ya da daha az sıkı yıkama. Ayrıca, 2 dakika, 5 dakika boyunca 80 ° C'de bir ilk denatürasyon için 65 ° C 'de denatürasyon, ardından 65 ° C de 1 saat yaşlanma aşamasına bir alternatif olarak, yaşlanma olmaksızın iyi sonuçlar verebilir. Genel olarak bu işlem daha güvenilir DNA FISH sinyallerini verir gibi Biz, yaşlanma prosedürü tercih ederim. Son olarak, belirli DNA probları bunlar yeterli tespiti için antikorların üç kat ihtiyaç olmaz, bu nedenle spesifik olacaktır. Bu ampirik oluşturulan her yeni sonda için test edilmelidir.

Mevcut protokol X kromozomu inaktivasyonu ve Xist tespiti, RNA ve DNA araya tespiti çalışmaya güçlü şekilde çalışmasına rağmen başka ortamlarda daha karmaşık olabilir. Bu, özellikle, tespit edilecek amaçlanmaktadır RNA türleri, sadece çok düşük seviyelerde ifade edilir durumda olabilir, tekrar dizileri dolu ya da nispeten kısatranskript. Bu gibi durumlarda, bu hedefin sınırlı, uygun mevcut miktarı etkili hibridizasyon sağlayacak optimum bir prob, tasarımı oldukça zor olabilir. Bu gibi durumlarda, bu RNA FISH için ilk koşulları optimize değer olabilir. Birçok alternatif probları denenebilir ve Nick-çeviri tarafından prob etiketleme süresi dahil haptenler miktarını optimize etmek için, titre edilebilir. Önemli olarak, bu amaçlı bir RNA, örneğin RT-PCR ile ifade doğrulayarak, araştırılacak olan hücrelerde ifade edilir doğrulanmalıdır. Hücre farklı bir tür analiz Ayrıca, bu teknik, ilgili bir sorun FISH ya da yeni tip ifade basit yokluğu arasındaki ayrımı izin verebilir, daha önce, pozitif kontroller olarak tespit edilmiş olan sentezleme hücreleri dahil etmek çok önemlidir hücreleri analiz edildi. Doğrulanmış ifadesine rağmen, çeşitli prob ve etiketleme koşullarının optimizasyonu kullanımı, RNA balık n yaptığında,açık bir sinyal ot sonuç, kullanılan formamid miktarını veya süresini ve prob hibridizasyon sıcaklığı değiştirilerek, hibridizasyon koşulları değiştirilerek değer olabilir. Seçenek olarak ise, doğrudan etiketlenmiş oligonükleotid probları 9-10 kullanılabilir. Aynı optimizasyon adımları takiben DNA FISH, ve DNA ve RNA 'nın aynı anda algılanmasını iyileştirmek için uygulanabilir.

Kombine DNA-RNA FISH protokolü kullanarak, kadın ES hücrelerinin ayırt X kromozomu inaktivasyonu incelemek mümkün olmuştur. Benzer sonuçlar farklı hücre tipleri ve embriyolarını kullanarak bizim çalışmalarda elde edilmiştir, ve biz şu anda daha fazla doku kesitlerinde kombine DNA-RNA BALIK uygulamak için koşullar optimize edilir. Birçok biyolojik süreçlerde olmayan kodlama RNA'lar önemli rolü daha fazla takdir hale geldikçe, biz aynı protokol muhtemelen kendi özel kromatin bağlamında diğer kodlayıcı olmayan RNA'lar incelemek için kullanılabileceğini öngörüyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
female mouse embryonic stem cells will be made available upon request
mouse embryonic fibroblasts can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g. Millipore
ES cell culture medium DMEM, 15% fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM γ-mercaptoethanol, and 1,000 U/ml LIF. Filter sterilize and store at 4 °C for maximum of 2 weeks.
LIF Chemicon ESG1107
DMEM Invitrogen 11960085
Fetal Calf Serum Invitrogen 10099141
Penicillin–streptomycin (100x) Invitrogen 15140-122
Non-essential aminoacids Invitrogen 11140-050
γ-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M7522
ES cell differentiation medium IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 μl/L monothioglycerol and 50 μg/ml ascorbic acid
IMDM-Glutamax Invitrogen 31980-030
Ascorbic acid (50 mg/ml) Sigma-Aldrich A4403
monothioglycerol Sigma-Aldrich M6145
T25 cell culture dishes Greiner Bio-one 690160
6-well cell culture dishes Greiner Bio-one 662160
cell culture grade PBS Sigma-Aldrich D8537
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS Gibco 25200-056
Falcon tubes Falcon 352196
24 x 24 mm coverslips Menzle 780882
gelatin Sigma-Aldrich G1890-100G prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave
Pepsin Sigma-Aldrich P7000 Dilute to 0.2% in 0.01 M HCl (pH 2.0)
absolute 100% ethanol Sigma-Aldrich 32221-2.5L use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions
RNAse free water Baxter TKF7114
sterile filter tips Rainin Bio Clean GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation) Roche 11745816910
biotin-labeling kit (Biotin Nick translation) Roche 11745824910
Sephadex G50 Sigma-Aldrich G5080
2 ml syringe BD Plastipak 300013
sterilized cotton
Eppendorf tubes Eppendorf 30120086
yeast tRNA 10 mg/ml Invitrogen 15401-029
Salmon Sperm DNA 10 mg/ml Invitrogen 15632-011
mouse cot-1 DNA 1 mg/ml Invitrogen 18440-016
Eppendorf bench top microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Eppendorf refrigerated centrifuge Eppendorf Model 5810R
2 M NaAc, pH 5.6 Sigma-Aldrich S7670
50+ hybridization solution 50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7
formamide Acros organics 3272350000
dextran sulfate Fluka 31403
10 mM phosphate buffer, pH 7 add 57.7 ml of 1 M Na2HPO4 and 42.3 ml 1 M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave
denaturation buffer 70% formamide/2x SSC/10 mM phosphate buffer pH 7
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287
2 M Tris pH 7.5 solution
Tris-saline-Tween washing solution (TST) 100 ml 10x saline, 50 ml 2M Tris, 500 μl Tween-20, add RNAse free water till 1 L
10x saline solution dissolve 85 g NaCl in 1 L RNAse free H2O, and autoclave
Tris-saline-BSA (TSBSA) 500 μl 10x saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3.25 ml RNAse free H2O
BSA, purified, 100x New England Biolabs B9001S
sheep-anti-dig antibody Roche diagnostics use 1:500 diluted in TSBSA
rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
mouse-anti-biotin antibody Roche diagnostics use 1:200 diluted in TSBSA
donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
Tris-saline washing solution (TS) 10 ml 10x saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O
Vectashield mounting medium with DAPI Vectorlabs H-1200
nail varnish
fluorescent miscroscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rudkin, G. T., Stollar, B. D. High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence. Nature. 265, 472-473 (1977).
  2. Imataka, G., Arisaka, O. Chromosome analysis using spectral karyotyping (SKY). Cell Biochem Biophys. 62, 13-17 (2012).
  3. Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
  4. Mastenbroek, S., et al. Preimplantation genetic screening: a systematic review and meta-analysis of RCTs. Hum Reprod Update. 17, 454-466 (2011).
  5. Martins-Taylor, K., Xu, R. H. Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 22-27 (2012).
  6. Rens, W., et al. Resolution and evolution of the duck-billed platypus karyotype with an X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5 male sex chromosome constitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16257-16261 (2004).
  7. Munsky, B., et al. Using gene expression noise to understand gene regulation. Science. 336, 183-187 (2012).
  8. Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
  9. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Rep. 46, 65-72 (2013).
  10. Ji, N., van Oudenaarden, A. Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos. WormBook. , 1-16 (2012).
  11. Femino, A. M., et al. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  12. Buongiorno-Nardelli, M., Amaldi, F. Autoradiographic detection of molecular hybrids between RNA and DNA in tissue sections. Nature. 225, 946-948 (1970).
  13. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).
  14. John, H. A., et al. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature. 223, 582-587 (1969).
  15. Bauman, J. G., et al. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
  16. Wiegant, J., et al. In situ hybridization with fluoresceinated DNA. Nucleic Acids Res. 19, 3237-3241 (1991).
  17. Langer, P. R., et al. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 6633-6637 (1981).
  18. Manuelidis, L., et al. High-resolution mapping of satellite DNA using biotin-labeled DNA probes. J Cell Biol. 95, 619-625 (1982).
  19. Kislauskis, E. H., et al. Isoform-specific 3'-untranslated sequences sort alpha-cardiac and beta-cytoplasmic actin messenger RNAs to different cytoplasmic compartments. J Cell Biol. 123, 165-172 (1993).
  20. Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 79, 7331-7335 (1982).
  21. Corput, M. P., et al. Fluorescence in situ hybridization using horseradish peroxidase-labeled oligodeoxynucleotides and tyramide signal amplification for sensitive DNA and mRNA detection. Histochem Cell Biol. 110, 431-437 (1998).
  22. Jonkers, I., et al. RNF12 is an X-Encoded dose-dependent activator of X chromosome inactivation. Cell. 139, 999-101 (2009).
  23. Barakat, T. S., et al. RNF12 activates Xist and is essential for X chromosome inactivation. PLoS Genet. 7, (2011).
  24. Gontan, C., et al. RNF12 initiates X-chromosome inactivation by targeting REX1 for degradation. Nature. 485, 386-390 (2012).
  25. Lyon, M. F. Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L). Nature. 190, 372-373 (1961).
  26. Barakat, T. S., Gribnau, J. X. chromosome inactivation in the cycle of life. Development. 139, 2085-2089 (2012).
  27. Augui, S., et al. Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre. Nat Rev Genet. 12, 429-442 (2011).
  28. Brown, C. J., et al. A gene from the region of the human X inactivation centre is expressed exclusively from the inactive X chromosome. Nature. 349, 38-44 (1991).
  29. Brockdorff, N., et al. Conservation of position and exclusive expression of mouse Xist from the inactive X chromosome. Nature. 351, 329-331 (1991).
  30. Borsani, G., et al. Characterization of a murine gene expressed from the inactive X chromosome. Nature. 351, 325-329 (1991).
  31. Barakat, T. S., Gribnau, J. X chromosome inactivation and embryonic stem cells. Adv Exp Med Biol. 695, 132-154 (2010).
  32. Chaumeil, J., et al. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
  33. Okamoto, I., et al. Eutherian mammals use diverse strategies to initiate X-chromosome inactivation during development. Nature. 472, 370-374 (2011).
  34. Gribnau, J., et al. X chromosome choice occurs independently of asynchronous replication timing. J Cell Biol. 168, 365-373 (2005).
  35. Namekawa, S. H., Lee, J. T. Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos. Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).
  36. Van Tine, B. A., et al. Simultaneous in situ detection of RNA, DNA, and protein using tyramide-coupled immunofluorescence. Methods Mol Biol. 292, 215-230 (2005).
  37. Pollex, T., et al. Live-Cell Imaging Combined with Immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to Study the Nuclear Dynamics and Expression of the X-Inactivation Center. Methods Mol Biol. 1042, 13-31 (2013).
  38. Chaumeil, J., et al. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
  39. Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 690, 31-56 (2011).
  40. Meissner, A., et al. Derivation and manipulation of murine embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 482, 3-19 (2009).
  41. Nichols, J., Ying, Q. L. Derivation and propagation of embryonic stem cells in serum- and feeder-free culture. Methods Mol Biol. 329, 91-98 (2006).

Tags

Biyokimya Sayı 88 Floresan DNA-RNA FISH ES hücre sitogenetik tek bir hücre analizi X kromozomu inaktivasyonu (XCI), Bakteriyel yapay kromozom (BAC) DNA probu,
Kombine DNA-RNA Floresan<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH) Farklılaştırılmış Kadın Fare Embriyonik Kök Hücreleri X kromozomu inaktivasyonu Eğitim için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined … More

Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (88), e51628, doi:10.3791/51628 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter