Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kombinert DNA-RNA Fluorescent Published: June 14, 2014 doi: 10.3791/51628
Automatic Translation
1, 1
1Department of Reproduction and Development, Erasmus MC - University Medical Center

Summary

Fluorescerende in situ hybridisering (FISH) tillater påvisning av nukleinsyrer i sitt opprinnelige miljø i cellene. Vi beskriver her en protokoll for det kombinerte, samtidig påvisning av RNA-og DNA ved hjelp av FISH, som kan brukes til å studere X-kromosom inaktivering i mus embryonale stamceller.

Abstract

Fluorescerende in situ hybridisering (FISH) er en molekylær teknikk som muliggjør påvisning av nukleinsyrer i celler. DNA FISH er ofte brukt i cytogenetikk og kreftdiagnostikk, og kan oppdage avvik av genomet, som ofte har viktige kliniske implikasjoner. RNA FISH kan brukes for å påvise RNA molekyler i celler og har gitt viktig innsikt i reguleringen av genekspresjon. Kombinere DNA og RNA FISH innen samme celle er teknisk utfordrende, ettersom forholdene er egnet for DNA FISH kan være for tøffe for skjøre, single strandet RNA-molekyler. Vi her presentere en lett anvendelig protokoll som gjør den kombinerte, samtidig påvisning av Xist RNA og DNA kodet av X-kromosomet. Denne kombinerte DNA-RNA FISH-protokollen kan sannsynligvis bli anvendt med andre systemer hvor både RNA-og DNA må bli detektert.

Introduction

Studerer celler og vev ved hjelp av fluorescerende in situ hybridisering (FISH) har siden introduksjonen i slutten av 1970-tallet en, tillot forskerne å studere gener, kromatin organisasjon og genekspresjon på subcellulært nivå. DNA FISH er hyppig brukt i cytogenetikk, karyotyping 2, kreftdiagnostikk 3 og pre-implantasjon genetisk screening fire, og har en viktig rolle i molekylær forskning 5-6 siden det tillater påvisning av nukleinsyrer i sitt opprinnelige miljø. Enkelt celle uttrykk analyse av RNA FISH kan oppdage innfødte primære transkripsjoner og noncoding RNA transkribert fra kromosomer, og gir fordeler til andre teknikker som vurdere genuttrykk på befolkningsnivå, herunder for eksempel kvantitativ RT-PCR, genom bredt uttrykk analyse eller Northern blotting . Ved å visualisere RNA transkripsjoner som stammer direkte fra sine områder av opprinnelse, har det for eksempel værtlagt merke til at genuttrykk er stokastisk 7, og kan noen ganger være allel spesifikk åtte. Forbedringer i teknikken har engang lov påvisning og kvantifisering av enkelt mRNA molekyler i cellene 9-11.

Det grunnleggende prinsipp for FISH består av hybridisering av nukleinsyrer i cellen til en nukleinsyre-probe ved hjelp av meget spesifikke Watson og Crick baseparing. Sonden kan være enten direkte eller indirekte påvist, noe som resulterer i et signal som kan mikroskopisk visualiseres. Innledende forsøk besto av radioaktivt merkede prober, som hadde ulemper basert på sikkerhet, begrensede romlig oppløsning og muligheten for å detektere bare en target i en tid av 12-14. Den videre utviklingen av ikke-radioaktive merkelapper, inkludert fluorokromer, haptener og enzymer, har tillatt den store spredningen bruk av fisk som en rutine molekylærbiologi teknikk. FISH probe kan enten være direkte merket med fluorochromes ved kjemisk binding av fluorescerende molekyler til nukleinsyresekvenser 15 og integrering av fluorescensmerkede nukleotider 16 til 19, eller sonden indirekte kan visualiseres etter integrasjon av haptener (inkludert biotin og Digoxigenin) og immunologisk påvisning av haptener ved hapten-spesifikke antistoffer konjugert til fluorescerende reporter molekyler 20-21. Sistnevnte tilnærming tillater signalforsterkning ved hjelp av flere lag av fluorescensmerkede antistoffer som anvendes for å forsterke det opprinnelige signal, og muliggjør deteksjon av RNA-arter som er uttrykt på lave nivåer. Ved å kombinere direkte og indirekte merkingsteknikker og forskjellige haptener, kan flere mål samtidig bli visualisert innenfor den samme cellen.

Et av de viktigste trinn i fisk protokoller er hybridiseringen av proben til målet. Selv om i teorien, vil en sonde spesifikt binder bare til målet, i praksis er dette spesifisiteter ikke alltid oppnådd, som prober kan binde seg til homologe regioner, og hybridiseringsbetingelser vil ikke alltid være ideelt for en viss DNA region eller RNA arter. Post-hybridiserings vasker er derfor av særlig betydning, da de kan øke stringensen av FISH prosedyre, og kan forhindre ikke-spesifikk binding av fiske prober, noe som ville resultere i et høyt nivå av bakgrunnsstøy. Som RNA-molekyler blir enkelt-trådet de lett kan hybridiseres til en probe FISK. I motsetning til dette må den dobbelt-trådet DNA-molekyl først et denatureringstrinn, hvoretter en probe kan hybridisere. Dette oppnås vanligvis ved oppvarming av prøven, hvilket resulterer i denaturering av DNA. Men under disse harde forholdene, skjøre, single strandet RNA-molekyler kan være tapt. Derfor krever kombinert DNA-RNA FISH vesentlig optimalisering av forholdene, og er mer teknisk krevende sammenlignet med separat deteksjon av bare RNA eller DNA.

Her har vi presenTA detaljert protokoll for kombinert, samtidig DNA-RNA FISH som har tillatt oss å studere X kromosom inaktivering (XCI) i differensierende kvinnelige mus embryonale stamceller 22-24. XCI er en avgjørende epigenetisk mekanisme for kvinnelig embryoutvikling 25, og resulterer i heterochromatinization og dermed stanse av en av de to X-kromosom i kvinnelige individer 26-27. Essential til denne prosessen er det kodende RNA Xist 28-30, som er regulert av RNF12 22-23 og Rex1 24 proteiner. Xist uttrykk blir oppregulert på fremtiden inaktive X-kromosom (Xi) under embryonal utvikling eller ved ES celledifferensiering in vitro , og kan spre seg langs X-kromosom og dermed tiltrekke kromatin remodeling enzymer som fører til transkripsjons nedleggelse av X kromosom 31. Denne spredning av Xist RNA kan visualiseres ved RNA FISH som et belegg av X chromonoe, som også er referert til som en Xist sky. Siden kvinnelige ES celler kan miste en av sine X-kromosomer grunn genomisk ustabilitet, har vi og andre næringsdrivende kombinert DNA-RNA FISH å studere XCI, for å sørge for at bare karyotypically stabile celler blir vurdert i analysen av denne viktige prosessen 22,32 -34. Som med hver molekylærbiologi teknikken flere forskjellige gode protokoller har blitt publisert, 35-38. Her presenterer vi foreliggende fremgangsmåte, som starter fra induksjon av differensiering i mus ES-celler, fiksering av celler, merking av fisk prober ved nick-translasjon, forbehandling av faste celler til å tillate permeabilization og påfølgende probe opptak, hybridisering av proben til målet, og til sist detekteringen av proben med fluorescensmerkede antistoffer. Den her presenteres protokollen lar den trofaste påvisning av Xist RNA og X-kromosomet i en periode på to dager, og det grunnleggende av denne teknikken kan trolig tilpasses othennes systemer og forskningsområder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Induksjon av Differensiering i Kvinne embryonale stamceller til Fremkall X kromosom inaktive

MERK: Kvinnelige mus embryonale stamceller (tilgjengelig på forespørsel) er dyrket under standard ES celle forhold på gelatin kultur retter belagt med mus embryonale fibroblaster (MEFs). Vi her anta at leseren er kjent med standard celle kultur teknikker 39-41. For å indusere differensiering, vil ES-celler dyrket i T25 retter skilles fra MEFs, og vil bli belagt i differensieringsmediet.

  1. Fjern ES medium fra ES-cellekultur, og vaskes to ganger med PBS cellekultur.
  2. Tilsett 1,5 ml trypsin-EDTA (forvarmet til 37 ° C) og inkuberes cellene ved 37 ° C i 7 min. Etter 3,5 min, riste fatet forsiktig å bryte opp koloniene.
  3. Inaktivere trypsin-EDTA ved tilsetning av 3,5 ml av differensieringsmedium til cellene. Pipettes celler opp og ned for å få tak i en enkelt celle-løsning, og samlei en 15 ml tube. Spin for 5 min ved 200 xg, og samle celler i 10 ml av differensiering medium.
  4. Til cellesuspensjonen til en ikke-gelatinized dyrkningsskål, og inkuberes i 1 time i en cellekulturinkubator. MERK: MEFs vil være i stand til å overholde den ikke-gelatinized kultur fatet, mens ES celler vil forbli i suspensjon.
  5. I mellomtiden, tilsett steriliserte glass-dekkglass (24 x 24 mm) til 6-brønns plater, tilsett 0,2% gelatin, og inkuber i minimal 5 min ved romtemperatur.
  6. Etter 1 time, samle supernatanten av den forhåndsbelagt ES cellekultur, som i det vesentlige vil bestå av ikke-man følger ES-celler. Plate ES celler til 6-brønn plater som inneholder Dekk. MERK: Bruk ⅙ th av et konfluent T25 parabolen for seks brønner på en seks-brønns plate. Dette vil tillate en konfluent differensiering godt etter 3 dager med differensiering. Endre medium på en daglig basis. For lengre differensiering tid kurs, plate pre-belagt ES-celler i differensiering medium i bakterie retter, og incubspiste på en celle shaker integrert i cellekulturinkubator. Dette vil tillate cellene å danne embryoid organer, som kan bli belagt i dekk 1-2 dager før fiksering.

2. Fiksering av Differensiert ES celler for påfølgende DNA-RNA FISH analyse

  1. Fjern differensiering medium fra differensiering kulturer, og vask to ganger med cellekultur PBS. MERK: Legg PBS nøye for å hindre at cellene blir vasket bort.
  2. Fjern cellekultur PBS og fikse-celler ved tilsetning av 4% paraformaldehyd (PFA) / PBS og inkuberes i 10 min ved romtemperatur. FORSIKTIG: PFA er giftig og kan føre til betydelig helserisiko når det blir inhalert eller når du er i kontakt til huden eller øynene. Videre er PFA kreftfremkallende.
  3. Fjern 4% PFA / PBS, og vaske Dekk 3x med 70% etanol. MERK: Riktig vask er viktig, som noen spor av PFA vil forstyrre påfølgende FISKE trinn. Dekkglass kan lagres i 70% etanol ved -20 ° C i flere måneder før FISH analyse.

Tre. Merking av DNA-prober for FISH Experiments

NB: For å skaffe et DNA-fragment av genet av interesse (minimal lengde> 2 kb for RNA FISH, eller> 20 kb av DNA FISH), eller i en BAC dekker genet av interesse. For RNA-deteksjon, kan en mindre sonde være tilstrekkelig i forhold til DNA-gjenkjenning, ettersom mest sannsynlig transkripsjon vil resultere i flere transkripter, som kan detekteres samtidig. For et sterkt signal på enkelt kopi DNA-tråden, er en lengre probe nødvendig, for å være i stand til å detektere et tilstrekkelig antall innlemmet haptener. Fortrinnsvis blir et ikke-transkribert genomisk region valgt for å utforme DNA-sonden. I tillegg, ved bruk av en mindre probe for å påvise RNA, vil det hindres at det genomiske loci hvorfra RNA blir transkribert som blir detektert i den kombinerte DNA-RNA FISH metode, selv om dette ikke kan fullstendig utelukkes. For å oppdage mus Xist, ble en 5,5 kb cDNA probe brukes. For Detection av X-kromosomet, kan flere BAC prober benyttes. Gode ​​resultater er oppnådd med en blanding av BAC RP23-100E1 og BAC CT7-474E4, som ligger i umiddelbar nærhet til Xist locus. Avhengig av genet eller kromosom av interesse, kan flere forskjellige prober være nødvendig for å oppnå optimale resultater. Når du arbeider med materialer som skal brukes for RNA-FISH, bruker sterile filterspisser, RNAse gratis H 2 O, og arbeid i et rent miljø.

  1. Ta 1 ug av DNA og fortynn i H 2 O i et totalt volum på 16 pl. Tilsett 4 mL av Digoxigenin eller biotin merking løsning (se reagenser), bland ved virvling og inkuberes ved 16 ° C i 90 min. MERK: biotin eller Digoxigenin-merkede nukleotider vil nå bli inkorporert ved nick-translasjon.
  2. I mellomtiden forbereder G50 kolonner for å fjerne ikke-integrerte nukleotider. Ta en 2 ml sprøyte, fjerne stamper, og legge sterilisert bomull inn i sprøyten. Legg G50 baller i løsning to fylle sprøyten, plassere sprøyten i et 15 ml rør og sentrifugert ved 642 x g i 1 min. MERK: Rundt 80% av sprøyten skal nå fylles med G50. Gjenta når mindre G50 er til stede.
  3. Etter 90 min, tilsett 40 pl av H2O til nick-translation reaksjonsblandingen og tilsett reaksjon på G50 kolonne. Til en tom tube under kolonnen, og sentrifuger ved 642 x g i 2 min. Samle strømmen gjennom i en reaksjonsrøret.
  4. Måle volumet av strømningen gjennom en pipette, og tilsett H 2 O for å oppnå et totalt volum på 200 ul. Utfelle strømmen gjennom ved å tilsette 13,3 ul laksesperm DNA (10 mg / ml), 13,3 pl gjær-tRNA (10 mg / ml), 26,7 pl muse Cot-1-DNA (1 mg / ml) og 28 ul 2 M NaAc, pH 5.6. Bland ved virvling, og legge til 533 mL iskald 100% etanol. Rist røret, og sentrifuger ved 16 200 xg i 30 min ved 4 ° C.
  5. Fjern supernatanten, og vask pellet to ganger med 70% etanol. Sentrifuger ved 16 200 xg i 5 min ved4 ° C, og lufttørker pellet. Tilsett 50 pl av 50 + hybridisering løsning, og inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter for å lette oppløsning. MERK: Merket probe kan lagres i flere år ved -20 ° C. FORSIKTIG: 50 + hybridisering løsning inneholder formamide, som er giftig, kan irritere huden, øynene og luftveiene, og er også en teratogen.

4. Permeabilization, Pre-behandling og Hybridisering av faste celler for kombinert DNA-RNA FISH

  1. Rehydrere faste cellene på dekkglass, ved å fjerne 70% etanol og tilsetning av cellekultur PBS til 6-brønns plater. Inkuber i 5 min. Gjenta i totalt tre ganger.
  2. Fjern cellekultur PBS, og tilsett 0,2% pepsin til 6-brønns plater, for å permeabilize cellene. Inkuber 6-brønns plater i et vannbad ved 37 ° C i 4 min. Fjern pepsin, og inaktivere med RNAse gratis H 2 O.
  3. Post-fix cellene ved inkubering med 4% PFA / PBS i 5 min ved romtemperatur. Etter fixation, vaskes to ganger med cellekultur PBS i 5 min.
  4. Dehydrate cellene ved inkubering med 70% etanol i 3 min, 90% etanol i 3 min til 100% etanol i 3 min. Overføring Dekk ut av 6-brønn plater, og lufttørke Dekk i flere minutter.
  5. Alder cellene ved inkubering av dekkglass ved 65 ° C i 1 time på en varmeplate.
  6. Pre-hybridisere FISH probe med mus Cot-1 DNA ved å legge sammen for hver dekkglass som skal analyseres, 25 pl av 50 + hybridiserings-løsning, 0,5 ul mus Cot-1 DNA, 1 pl av biotin-merket probe Xist og 1 pl av Digoxigenin merket BAC probe oppdage X-kromosomet. Bland ved virvling, og denatureres ved 99 ° C i 5 min. Inkuber umiddelbart ved 37 ° C i 45 min, for å tillate Cot-1 DNA til å hybridisere til å gjenta sekvenser tilstede i sondene.
  7. Etter aldring, spot 50 mL av denaturering buffer (som består av 70% formamide/2x SSC/10 mM fosfatbuffer) på et glass lysbilde, og sette Dekk på toppen med celler vendt towards denaturering buffer. Inkuber ved 65 ° C i 2 min.
  8. Legg Dekk tilbake til 6-brønns plater og post-fix cellene ved inkubering i iskald 70% etanol i 5 min.
  9. Dehydrate celler ved etterfølgende inkubering i 70% etanol i 3 min, 90% etanol i 3 min til 100% etanol i 3 min. Fjern Dekk fra 6-brønn plater, og la lufttørke i flere minutter.
  10. Spot pre-hybridisert probe på et glass lysbilde, og inkuber dekkglass på toppen. Plasser lysbilder i en fuktet kammer fylt med 50 ml 50% formamide/2x SSC, og inkuberes over natten ved 37 ° C.

5. Post-hybridisering vasker og Antistoff mediert Påvisning av Probe

  1. Fyll 6-brønn plater med 2x SSC, og pre-varm til 42 ° C. Legg Dekk etter inkubering over natten, og inkuberes ved 42 ° C i 5 min.
  2. Fjern 2x SSC, og inkuber Dekk med 50% formamide/2x SSC for 10 minutter ved 42 ° C. Gjenta i totalt tre ganger (30 min med å vaske helt). Fjern 50% formamide/2x SSC, og vaske slides med Tris-saltvann-Tween (TST) i 2 x 5 minutter ved romtemperatur.
  3. Spot 50 ul Tris-saltvann-BSA (TSBSA) per dekkglass på nye glassplater, og inkuber dekkglass opp-ned for å blokkere i 30 minutter ved romtemperatur i en TST-fuktet mørke kammer.
  4. Overføring Dekk tilbake til 6-brønns plater og vaskes 2 x 5 min med TST.
  5. Spot 50 mL av sau-anti-dig antistoff (1:500 i TSBSA) per dekkglass på nye glassplater, og ruge Dekk opp-ned for første inkuberingstrinnet under 30 min ved romtemperatur i en TST-fuktet mørkt kammer.
  6. Overføring Dekk tilbake til 6-brønns plater og vaskes 2 x 5 min med TST.
  7. Spot 50 ul av kanin-anti-sau-antistoff konjugert med FITC (1:250 i TSBSA) per dekkglass på nye glassplater, og inkuber dekkglass opp ned for det andre trinnet under inkubering i 30 minutter ved romtemperatur i en TST-fuktet mørke kammer .
  8. Transfer Dekk tilbake til 6-brønn plater, og vaske 2 x 5 min med TST.
  9. Spot 50 ul av geit-anti-kanin antistoff konjugert med FITC (1:250 i TSBSA) per dekkglass på nye glassplater, og inkuber dekkglass opp ned for tredje inkubering under trinnet 30 minutter ved romtemperatur i en TST-fuktet mørke kammer .
  10. Overføring Dekk tilbake til 6-brønns plater og vaskes 2 x 5 min med TST.
  11. Spot 50 pl av mus-anti-biotin-antistoff (1:200 i TSBSA) per dekkglass for nye glassplater og inkuberes dekkglass opp ned for fjerde trinn i løpet av inkubasjon i 30 minutter ved romtemperatur i en TST-fuktet mørke kammer.
  12. Overføring Dekk tilbake til 6-brønns plater og vaskes 2 x 5 min med TST.
  13. Spot 50 mL av esel-anti-mus antistoff konjugert med Rhodamine (1:250 i TSBSA) per dekkglass på nye glassplater, og ruge Dekk opp ned for femte inkuberingstrinnet under 30 min ved romtemperatur i en TST-fuktet mørkt chambeh.
  14. Overføring Dekk tilbake til 6-brønns plater og vaskes 2 x 5 min med TST.
  15. Spot 50 mL av geit-anti-hest antistoff konjugert med Rhodamine (1:250 i TSBSA) per dekkglass på nye glassplater, og inkuber Dekk opp ned for sjette inkuberingstrinnet under 30 min ved romtemperatur i en TST-fuktet mørkt kammer . MERK: geit-anti-hest antistoff vil gjenkjenne esel-anti-mus antistoff; når den er tilgjengelig for forskeren, vil en geit-anti-esel antistoff fungerer like godt.
  16. Overføring Dekk tilbake til 6-brønns plater og vaskes 2 x 5 min med TST. Vask ytterligere 5 min med Tris-saltoppløsning (TS).
  17. Dehydrate celler ved etterfølgende inkubering i 70% etanol i 3 min, 90% etanol i 3 min til 100% etanol i 3 min. Fjern Dekk fra 6-brønn plater, og la lufttørke i flere minutter.
  18. Spot en dråpe monteringsmedium med DAPI (se reagenser) på et glass lysbilde, og legge dekkglass opp ned på toppen. Tett lysbilder med neglelakk ogvurdere FISH resultatene etter fluorescerende mikroskopi (Figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjelp av de ovennevnte protokoll for kombinerte DNA-RNA FISH, har vi vært i stand til å visualisere X inaktive i differensierende hunn embryonale stamceller. Figur 1 viser et representativt eksempel på en DNA-RNA FISH eksperiment, hvor vi har oppdaget både Xist (som er synlig som en såkalt Xist RNA skyen på inaktive X-kromosomet, og en basal transkripsjon presisere på den aktive X-kromosomet), og et område av X-kromosomet, som er synlig som et ubetydelig signal. Legg merke til at en av presisere signalene ligger innenfor Xist sky, og dermed viser at Xist skyen er faktisk lokalisere sammen, og belegg på X-kromosomet. I mer enn 99% av cellene, oppdager vi ved hjelp av vår protokoll en riktig DNA-signal (data ikke vist). Sammenlignet med RNA-FISH, Xist skyer visualisert ved hjelp av den kombinerte DNA-RNA FISH prosedyre ser noen ganger større, som det denaturerte DNA ser ut til å oppta et større område. Vi har obholdt lignende resultater ved hjelp av humane ES-celler, humane lymfocytter og ulike fibroblast cellelinjer av ulike arter, og den samme protokollen har blitt brukt til å studere genuttrykk av ulike X-linked loci, inkludert Rnf12. I tillegg, når denne protokoll ble anvendt for å udifferensiert hunn ES-celler, basal Xist ekspresjon av både X-kromosomer kunne påvises, noe som viser at det ved bruk av denne protokollen også gener uttrykt på lave nivåer kan visualiseres (data ikke vist).

Figur 1
Figur 1. Kombinert DNA-RNA FISH i differensierte hunn ES-celler. Representative resultater oppnådd etter de her beskrevne protokoll for kombinert DNA-RNA FISK. X-kromosomet (X chr.) Er oppdaget ved hjelp av en Digoxigenin-merket BAC probe, som er visualisert ved hjelp av antistoffer konjugert til FITC (grønne skiltal). I nesten alle celler, er to X-kromosomer detektert. Xist RNA blir detektert ved hjelp av en biotin-merket cDNA som probe, som blir visualisert ved hjelp av antistoffer konjugert til rhodamin (rødt signal). Både store Xist ansamlinger på inaktive X-kromosom (Xist skyer) og basal Xist uttrykk fra det aktive X-kromosom (Xist peikt) blir oppdaget (merk: ved differensiering denne basal Xist uttrykk er opphørt på fremtiden aktivt X kromosom, og derfor ikke oppdaget i hver kjerne). Nuclei er kontrafarget med DAPI (blå). Scale bar representerer 10 mikrometer. Klikk her for å se større bilde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kombinert DNA-RNA FISH kan være teknisk utfordrende, ettersom forholdene er egnet for DNA FISH kan være for tøffe for mindre stabile RNA-molekyler. Flere tilnærmingsmåter har blitt anvendt for å studere både DNA og RNA i samme celle, omgå behovet for samtidig inkubering med prober som detekterer både DNA og RNA. For eksempel, i en overlagring metode, blir først RNA FISH utføres, og cellene blir fotografert, og koordinatene er tatt. Deretter blir de samme slides brukt for DNA FISH, der signalet fra RNA FISH går tapt. Etter DNA FISH, blir cellene på nytt avbildes, og bildene oppnådd fra både RNA-og DNA-fisk er overlagret. Selv om denne tilnærmingen vil fungere i nesten alle tilfeller, som DNA av faste celler er stabil, og er ikke påvirket av nødvendig behandling for første RNA FISH, er dette en svært arbeidskrevende tilnærming som vil koste minst fire dager. I en annen tilnærming, først RNA fisken er utført, blir RNA FISH signalet løst ved tilsetning of fiksativ, etter som DNA FISH er brukt. Selv om også denne fremgangsmåten kan arbeide, kan noe av det fluorescerende signal avledet fra RNA FISH tapt i forbindelse med fiksering. Dette kan spesielt hindre deteksjon av transkripter som bare uttrykkes på et lavt nivå. Den heri presenteres tilnærmingen er optimalisert for den samtidige påvisning av både en RNA target og en target DNA i et enkelt eksperiment FISH, og har den fordel at begge resultater kan oppnås i et enkelt eksperiment i løpet av to dager, med pålitelige resultater.

Flere trinn i FISH protokollen er avgjørende for å oppnå optimale resultater. Først når arbeider med RNA-molekyler, bør man være forsiktig med å innføre RNAse i noen buffer eller løsning som brukes. Derfor bør et rent arbeidsmiljø skal etableres, og filterspisser bør brukes når pipetteringsprogrammer reagenser som brukes for FISH. Forsiktighet bør utvises for å bruke RNase frie forbindelser (for eksempel RNAse gratis vann, cellekultur grade PBS, absoluttely ren etanol etc.). Når disse enkle regler følges, er det vanligvis ikke nødvendig å bruke ytterligere RNase inhibitorer supplert til de reagenser som brukes. For det andre er det permeabilization prosedyren ved hjelp av pepsin en mild likevekt mellom for lite, eller for mye permeabilization. Avhengig av den spesielle celletype som brukes, kan det være nødvendig for å optimalisere den tid som tillates for permeabilization, eller pepsin konsentrasjoner. Sistnevnte er også avhengig av din spesielle batch av pepsin, som aktiviteten kan variere. Som et alternativ, permeabilization bruker 0,1% Triton-X100/PBS for 5 min resulterer i gode resultater under visse betingelser, og har den fordelen at FISH bruker denne metoden for permeabilization kan kombineres med farging å oppdage kjernefysiske eller cytoplasmatiske proteiner. Som et tredje viktig aspekt av FISH, bør den aldrende, denaturering, hybridisering og vasketemperaturer holdes konstant. Selv små avvik fra ønsket temperatur kan resultere i mindre efficient denaturering, hybridisering, eller mindre strenge vasker, noe som vil resultere i mer bakgrunnsfarging. Som et alternativ til den 1 t aldringstrinn ved 65 ° C etterfulgt av denaturering ved 65 ° C i 2 min, også en innledende denaturering ved 80 ° C i 5 min, uten aldring, kan gi gode resultater. Vi foretrekker den aldrende prosedyren, som generelt denne prosedyren gir mer pålitelige DNA FISK signaler. Endelig, vil visse DNA-prober være så spesifikk, at de ikke vil kreve tre lag av antistoffer for tilstrekkelig deteksjon. Dette bør være empirisk testet for hver nygenererte sonde.

Selv om den aktuelle protokoll virker robust i studiet av X-kromosom inaktivering og påvisning av Xist, kombinert deteksjon av RNA-og DNA kan være mer komplisert i andre sammenhenger. Dette kan spesielt være tilfelle når RNA-arter som er rettet for å bli detektert kun uttrykt ved meget lave nivåer, er full av repeterte sekvenser, eller er et relativt kortavskrift. I slike situasjoner kan det være ganske vanskelig å utforme en optimal probe, noe som vil tillate effektiv hybridisering til et begrenset, ikke optimal tilgjengelige mengden av target. I slike situasjoner kan det være verdt å optimalisere første vilkår for RNA FISH. Flere alternative prober kan bli forsøkt, og varigheten av sonden merking ved nick-translasjon kan bli titrert for å optimalisere mengden av innlemmet haptener. Viktigere, bør det bekreftet at det ønskede RNA uttrykkes i cellene som skal undersøkes, ved for eksempel å kontrollere ekspresjon ved RT-PCR. Også ved analyse av en annen type av celler, er det viktig å omfatte celler som uttrykket er tidligere blitt detektert som positive kontroller, da dette kan føre til at skillet mellom et teknisk, FISH relaterte problemer, den enkle fravær av ekspresjon i den nye typen av celler analyseres. Når, til tross verifisert uttrykk, bruk av ulike prober og optimalisering av merking forhold, gjør RNA FISH not resultere i en klar-signal, kan det være verdt å endre hybridiseringsbetingelser, ved å variere mengden av formamid anvendes, eller varigheten og temperaturen av probe-hybridisering. Alternativt kan direkte merkede oligonukleotidprober anvendes 9-10. De samme optimalisering trinn kan deretter bli anvendt for å forbedre DNA FISH, og den samtidige deteksjon av DNA og RNA.

Ved hjelp av den kombinerte DNA-RNA FISH-protokollen, har vi vært i stand til å studere X kromosom inaktivering i differensierende kvinnelige ES-celler. Lignende resultater er oppnådd i våre studier med ulike celletyper og embryoer, og vi er nå ytterligere å optimalisere forholdene for å søke kombinert DNA-RNA FISH på vevssnitt. Når den viktige rollen til ikke-kodende RNA i mange biologiske prosesser blir mer og mer verdsatt, ser vi for oss at den samme protokollen kan sannsynligvis bli brukt til å studere andre ikke-kodende RNA i sammenheng med deres spesifikke kromatin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
female mouse embryonic stem cells will be made available upon request
mouse embryonic fibroblasts can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g. Millipore
ES cell culture medium DMEM, 15% fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM γ-mercaptoethanol, and 1,000 U/ml LIF. Filter sterilize and store at 4 °C for maximum of 2 weeks.
LIF Chemicon ESG1107
DMEM Invitrogen 11960085
Fetal Calf Serum Invitrogen 10099141
Penicillin–streptomycin (100x) Invitrogen 15140-122
Non-essential aminoacids Invitrogen 11140-050
γ-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M7522
ES cell differentiation medium IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 μl/L monothioglycerol and 50 μg/ml ascorbic acid
IMDM-Glutamax Invitrogen 31980-030
Ascorbic acid (50 mg/ml) Sigma-Aldrich A4403
monothioglycerol Sigma-Aldrich M6145
T25 cell culture dishes Greiner Bio-one 690160
6-well cell culture dishes Greiner Bio-one 662160
cell culture grade PBS Sigma-Aldrich D8537
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS Gibco 25200-056
Falcon tubes Falcon 352196
24 x 24 mm coverslips Menzle 780882
gelatin Sigma-Aldrich G1890-100G prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave
Pepsin Sigma-Aldrich P7000 Dilute to 0.2% in 0.01 M HCl (pH 2.0)
absolute 100% ethanol Sigma-Aldrich 32221-2.5L use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions
RNAse free water Baxter TKF7114
sterile filter tips Rainin Bio Clean GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation) Roche 11745816910
biotin-labeling kit (Biotin Nick translation) Roche 11745824910
Sephadex G50 Sigma-Aldrich G5080
2 ml syringe BD Plastipak 300013
sterilized cotton
Eppendorf tubes Eppendorf 30120086
yeast tRNA 10 mg/ml Invitrogen 15401-029
Salmon Sperm DNA 10 mg/ml Invitrogen 15632-011
mouse cot-1 DNA 1 mg/ml Invitrogen 18440-016
Eppendorf bench top microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Eppendorf refrigerated centrifuge Eppendorf Model 5810R
2 M NaAc, pH 5.6 Sigma-Aldrich S7670
50+ hybridization solution 50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7
formamide Acros organics 3272350000
dextran sulfate Fluka 31403
10 mM phosphate buffer, pH 7 add 57.7 ml of 1 M Na2HPO4 and 42.3 ml 1 M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave
denaturation buffer 70% formamide/2x SSC/10 mM phosphate buffer pH 7
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287
2 M Tris pH 7.5 solution
Tris-saline-Tween washing solution (TST) 100 ml 10x saline, 50 ml 2M Tris, 500 μl Tween-20, add RNAse free water till 1 L
10x saline solution dissolve 85 g NaCl in 1 L RNAse free H2O, and autoclave
Tris-saline-BSA (TSBSA) 500 μl 10x saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3.25 ml RNAse free H2O
BSA, purified, 100x New England Biolabs B9001S
sheep-anti-dig antibody Roche diagnostics use 1:500 diluted in TSBSA
rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
mouse-anti-biotin antibody Roche diagnostics use 1:200 diluted in TSBSA
donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
Tris-saline washing solution (TS) 10 ml 10x saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O
Vectashield mounting medium with DAPI Vectorlabs H-1200
nail varnish
fluorescent miscroscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rudkin, G. T., Stollar, B. D. High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence. Nature. 265, 472-473 (1977).
  2. Imataka, G., Arisaka, O. Chromosome analysis using spectral karyotyping (SKY). Cell Biochem Biophys. 62, 13-17 (2012).
  3. Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
  4. Mastenbroek, S., et al. Preimplantation genetic screening: a systematic review and meta-analysis of RCTs. Hum Reprod Update. 17, 454-466 (2011).
  5. Martins-Taylor, K., Xu, R. H. Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 22-27 (2012).
  6. Rens, W., et al. Resolution and evolution of the duck-billed platypus karyotype with an X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5 male sex chromosome constitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16257-16261 (2004).
  7. Munsky, B., et al. Using gene expression noise to understand gene regulation. Science. 336, 183-187 (2012).
  8. Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
  9. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Rep. 46, 65-72 (2013).
  10. Ji, N., van Oudenaarden, A. Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos. WormBook. , 1-16 (2012).
  11. Femino, A. M., et al. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  12. Buongiorno-Nardelli, M., Amaldi, F. Autoradiographic detection of molecular hybrids between RNA and DNA in tissue sections. Nature. 225, 946-948 (1970).
  13. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).
  14. John, H. A., et al. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature. 223, 582-587 (1969).
  15. Bauman, J. G., et al. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
  16. Wiegant, J., et al. In situ hybridization with fluoresceinated DNA. Nucleic Acids Res. 19, 3237-3241 (1991).
  17. Langer, P. R., et al. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 6633-6637 (1981).
  18. Manuelidis, L., et al. High-resolution mapping of satellite DNA using biotin-labeled DNA probes. J Cell Biol. 95, 619-625 (1982).
  19. Kislauskis, E. H., et al. Isoform-specific 3'-untranslated sequences sort alpha-cardiac and beta-cytoplasmic actin messenger RNAs to different cytoplasmic compartments. J Cell Biol. 123, 165-172 (1993).
  20. Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 79, 7331-7335 (1982).
  21. Corput, M. P., et al. Fluorescence in situ hybridization using horseradish peroxidase-labeled oligodeoxynucleotides and tyramide signal amplification for sensitive DNA and mRNA detection. Histochem Cell Biol. 110, 431-437 (1998).
  22. Jonkers, I., et al. RNF12 is an X-Encoded dose-dependent activator of X chromosome inactivation. Cell. 139, 999-101 (2009).
  23. Barakat, T. S., et al. RNF12 activates Xist and is essential for X chromosome inactivation. PLoS Genet. 7, (2011).
  24. Gontan, C., et al. RNF12 initiates X-chromosome inactivation by targeting REX1 for degradation. Nature. 485, 386-390 (2012).
  25. Lyon, M. F. Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L). Nature. 190, 372-373 (1961).
  26. Barakat, T. S., Gribnau, J. X. chromosome inactivation in the cycle of life. Development. 139, 2085-2089 (2012).
  27. Augui, S., et al. Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre. Nat Rev Genet. 12, 429-442 (2011).
  28. Brown, C. J., et al. A gene from the region of the human X inactivation centre is expressed exclusively from the inactive X chromosome. Nature. 349, 38-44 (1991).
  29. Brockdorff, N., et al. Conservation of position and exclusive expression of mouse Xist from the inactive X chromosome. Nature. 351, 329-331 (1991).
  30. Borsani, G., et al. Characterization of a murine gene expressed from the inactive X chromosome. Nature. 351, 325-329 (1991).
  31. Barakat, T. S., Gribnau, J. X chromosome inactivation and embryonic stem cells. Adv Exp Med Biol. 695, 132-154 (2010).
  32. Chaumeil, J., et al. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
  33. Okamoto, I., et al. Eutherian mammals use diverse strategies to initiate X-chromosome inactivation during development. Nature. 472, 370-374 (2011).
  34. Gribnau, J., et al. X chromosome choice occurs independently of asynchronous replication timing. J Cell Biol. 168, 365-373 (2005).
  35. Namekawa, S. H., Lee, J. T. Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos. Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).
  36. Van Tine, B. A., et al. Simultaneous in situ detection of RNA, DNA, and protein using tyramide-coupled immunofluorescence. Methods Mol Biol. 292, 215-230 (2005).
  37. Pollex, T., et al. Live-Cell Imaging Combined with Immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to Study the Nuclear Dynamics and Expression of the X-Inactivation Center. Methods Mol Biol. 1042, 13-31 (2013).
  38. Chaumeil, J., et al. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
  39. Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 690, 31-56 (2011).
  40. Meissner, A., et al. Derivation and manipulation of murine embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 482, 3-19 (2009).
  41. Nichols, J., Ying, Q. L. Derivation and propagation of embryonic stem cells in serum- and feeder-free culture. Methods Mol Biol. 329, 91-98 (2006).

Tags

Biokjemi Fluorescent kombinert DNA-RNA FISH ES cell cytogenetikk enkelt celle analyse X kromosom inaktivering (XCI), Bacterial kunstig kromosom (BAC) DNA-probe,
Kombinert DNA-RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH) for å studere X kromosom inaktivering i Differensiert Kvinne Mouse Embryonale stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined … More

Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (88), e51628, doi:10.3791/51628 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter