Summary
为了提高我们的细胞和分子neotissue形成的知识，最近被开发的TEVG小鼠模型。移植物植入在C57BL / 6小鼠肾下腔静脉移植物插入。该模型能达到类似的结果那些在我们的临床调查来实现，但在一个远缩短时间过程。
Abstract
接种骨髓单个核细胞（骨髓细胞）生物可降解支架通常用于重建手术治疗先天性心脏畸形。长期的临床结果显示出优异的通畅率，但是，与狭窄的显著发病率。为了探讨血管neotissue形成的细胞和分子机制，防止狭窄发展组织工程血管移植（TEVGs），我们制定了移植物的小鼠模型大约1毫米的直径。首先，TEVGs被从聚乙醇酸无纺布制成可生物降解的管状支架组装毡网眼涂有ε-己内酯和L-丙交酯共聚物。的支架，然后放置于冷冻干燥机，抽真空24小时，并在干燥器中储存直到细胞接种。第二，骨髓是从供体小鼠中收集和单核细胞中分离出密度梯度离心。第三，约百万细胞接种于支架培养的O / N。最后，将种子支架，然后注入在C57BL / 6小鼠肾下腔静脉移植物插入。植入移植物表现出良好的通畅性（> 90％），无血栓栓塞并发症或动脉瘤形成的证据。这种小鼠模型将有助于我们理解和量化neotissue形成的TEVG的细胞和分子机制。
Introduction
先天性心脏缺陷是影响近8％的活产婴儿在美国的严重情况。约25％的婴儿患有先天性心脏缺陷或2.4每1000活产的，需要侵入性治疗在他们的生活1的第一年。最有效的治疗先天性心脏疾病是重建手术。不幸的是，从使用目前可用的血管导管引起的并发症是术后发病率和死亡率的最显著的原因。
为了解决这个问题，我们开发了第一个组织工程血管移植（TEVGs）的临床应用2。 TEVGs从播种与自体骨髓单个核细胞（BM-跨国公司），并作为植入静脉导管先天性心脏手术的可生物降解聚酯管构成。结果表明，优秀的通畅率在1-3年的随访，但狭窄的发生率显著
鼠下腔静脉插入模型忠实扼要重述，发生在大动物和人类的新血管形成的过程，但在短得多的时间过程6-9。这里，对于使用可生物降解的支架小型接枝制造一个详细的协议中，BM-MNC收获并进行隔离，脚手架BM-MNC播种，并在小鼠模型中移植物植入进行了描述。
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Protocol
注：所有动物的程序批准了全国儿童医院实验动物管理和使用委员会。
1，嫁接制造
- 通过在通风橱中加入100毫克P（LA / CL）在2毫升二氧杂环己烷使ε-己内酯和L-丙交酯共聚物P（LA / CL）的溶液。将解决方案在涡不断为1-1.5小时至完全溶解混匀。
- 在此期间，除去聚乙醇酸片材（PGA），从冷冻库毡和切出几个5毫米x 8毫米的部分。也切断0.1-10微升移液器只是过滤器上方的一角。
- 插入19号针头（1.5长度）成吸管尖的前端和包裹在PGA毡针周围采用微型镊子。
- 小心地将毛毡的吸管头，其中所述管腔是比近侧部分直，用钝18号针头的前端，而19号针头插入它。
- 移液器40微升P（CL / LA）的溶液成从顶部枪头。饱和PGA毡用的解决方案。然后用移液管分配器推气泡出来。 如果需要，重复此过程。
- 在50毫升试管移植地点，并将其放置在-80℃下冷冻20分钟。确保针的头部朝下。
- 传输管放入冻干机及真空24小时。请务必打开管盖有气流。
- 取出移植物，并从针头中删除。剪下移植留下了约5 mm截面的两端，把他们放回针来保持其形状。保持在干燥器的移植。
- 在生物安全罩O / N前细胞种植放置支架在紫外光下。
2，骨髓单核细胞收获和隔离
- 安乐死的小鼠用氯胺酮/赛拉嗪过量（氯胺酮，200 mg / kg和甲苯噻嗪，20毫克/千克）。
- 除去骨（股骨的ð胫骨）从3老鼠10移植植入并将其放置在培养皿中与10毫升的RPMI。切使用注射器用25号针头进入一个新的培养皿中以3毫升的RPMI骨骼和冲洗骨髓的两端。采集骨髓和RPMI解决方案在一个15毫升管，并与另外2毫升的RPMI洗培养皿收集BM的其余部分。
- 取样品（5-10微升），并使用自动细胞计数器或血球计数细胞。记录结果。
- 把5毫升聚蔗糖在15毫升离心管中，加入骨髓和RPMI解决方案。添加解决方案非常平缓，以防止它与聚蔗糖混合。
- 在24℃下离心528×g离心30分钟，“没有刹车”
- 拆下上部粉红色层。收集的中间透明层图1，这是在MNC层，并用PBS 1点01稀释。
- 离心跨国公司稀溶液在528×g离心10分钟，在24°C。
- 除去上清液和二琵琶用5ml PBS中沉淀。
- 离心沉淀溶液在528×g离心10分钟，在24℃下
- 除去上清液。淡化沉淀的RPMI（约200微升）的适当的音量。
- 取5-10微升样品，并使用自动细胞计数器或血球计数细胞。记录结果。重复该细胞计数一次，并计算平均细胞数。
- 稀释细胞浓度为1,000,000 cells/10微升用RPMI。
3。细胞种植
- 预湿脚手架加入5μLRPMI肠腔5分钟，然后取出RPMI。
- 从步骤2.12中添加10μl的骨髓来源的单核细胞在RPMI到支架内腔并等待10分钟，以使细胞附着在支架上。
- 切割一个19号针头至1厘米长，并把针头插入支架的内腔，以保持支架的形状。将样品在一个24孔板中。</ LI>
- 新增1,000微升RPMI到每口井和孵化O / N中的孵化器。
4，移植物植入
- 高压灭菌所有的外科手术工具手术前：1倍罚款剪刀，3微型镊子，微型2倍血管钳，1x夹紧应用镊子，1个微型针器，1个弹簧剪刀，1卷收器。
- 6-8周龄雌性C57BL / 6被用作组织工程血管移植受者。从笼中取出小鼠并称重，然后通过腹膜内注射麻醉与氯胺酮/赛拉嗪混合物（氯胺酮，100 mg / kg和甲苯噻嗪，10毫克/千克）腹部的右下象限。酮洛芬（5毫克/公斤，腹腔注射）被用作预麻醉止痛剂。
- 通过故事捏检查镇静水平，然后夹腹毛。润滑眼睛用无菌眼药膏，然后将鼠标在垫背部靠着位置。消毒腹部与优碘和酒精垫。合作VER鼠标用无菌的悬垂性和唯一暴露在切口区域。
- 使从剑突到耻骨上区域下方的中线剖腹手术切口，并插入一个自保持牵开器。在包裹蘸生理盐水纱布的肠子。说白了定义下腹主动脉和腔静脉。
- 放置在近端与主动脉和腔静脉的远端侧上的两个微血管钳然后直截了当地从腔静脉断面腔静脉分离主动脉。如果有必要，结扎腹主动脉分支与上锥形针10-0单丝缝线。
- 植入的下腔静脉插入移植物的近端和远端用无菌10-0缝合结束吻合。修剪嫁接，一般1-2毫米，依赖于鼠标的解剖结构。固定移植物与一个线圈在两个近端和远端，并开始与来自移植物的另一侧4-5拆线连续缝合。整理正面后，翻转夹具和移植到另一侧，并缝合移植物的背面。在植入，冲洗移植物与肝素溶液频繁，以防止急性血栓形成。
- 取出近端钳和通过应用外用无菌可吸收止血剂控制出血。当出血完全停止后，取出远端夹具和控制出血的方法相同。通过嫁接确保血液流量。
- 使用6-0黑色尼龙单丝缝合线与包括螺纹针关闭腹部肌肉和皮肤的两层。
- 注射0.5毫升皮下注射生理盐水，然后将鼠标在一个变暖垫恢复笼，直到鼠标是完全移动。恢复后，返回鼠标到一个新的笼子纸床上用品。给予止痛药（布洛芬，30毫克/千克，生活饮用水）48小时。
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Representative Results
的TEVG植入的示意图示于图1。骨髓被从供体小鼠收获并用密度离心的单核细胞中分离出，然后接种到生物可降解的支架。该种子支架培养的O / N和植入到受体小鼠为下腔静脉介入移植。
图2示出了PGA-P（CL / LA）支架材料的扫描电子显微镜。内部直径约为1毫米的壁厚为约0.17毫米。总孔隙度为78.5％，平均孔径分别为45.4±17.6微米。
插入到C57BL / 6小鼠的下腔静脉一TEVG的总图像如图3所示。右植入（A）及第2周植入后（B）之后。 （C）显示本机下腔静脉的比较严重的形象。显而易见的是接枝充满neotissue，然而，它仍保持了原有的移植物的形状。我们以前的结果表明，接枝总降解需要长达12周10。
的2周植入TEVG超声B模式和彩色多普勒图像图4A-B显示了植入移植物的通畅性。一个土生土长的下腔静脉图像加入进行比较（ 图4，C）。细胞种植提高了通畅的移植显著，通畅率在第2周的非种子选手，接种移植为65％和91％，分别为（P <0.05，Fisher精确检验）。
图5显示了细胞浸润和在TEVG细胞外基质沉积2周植入后。染色用H＆E染色植移植显示整个支架材料（A）的移植和剩余物neotissue形成。牡鹿和Masson三色染色显示弹性蛋白沉积在中timal层（B）和胶原在内侧层（C）。观察整个内膜层（D）内皮细胞衬里和融合平滑肌细胞存在于整个TEVG，特别是低于欧盟衬（E），就表明了CD31和αSMA染色分别。通过植入后的第二个星期，巨噬细胞浸润明显，与F4/80染色（F）表示。
图1原理图的TEVG植入骨髓单核细胞从供体鼠收获，接种到可降解支架，然后植入作为一种干预下腔静脉移植到受体小鼠。
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支架的图2。扫描电子显微镜图像。平均外径为1.45毫米，管腔直径为1.1mm和长度为3mm。
图3。植入TEVG 2周，原生腔静脉后。 a）在紧接植入后，B）植入后2周，C）本地IVC进行比较。
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图4。超声图像2周，原生IVC。 A）2个星期。C）下腔静脉本地人比较后，B型和B）彩色多普勒TEVG的形象。
图5。代表2个星期图像术后TEVG。 A）H＆E（内腔），B），牡鹿（粉红色=弹性蛋白），C）趣的三色（蓝=胶原），D）CD31（棕色=内皮细胞），E）αSMA（棕色=平滑肌细胞） 和 F ）F4/80（棕色=巨噬细胞）。
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Discussion
TEVG的小鼠模型是研究细胞和分子neotissue形成和狭窄的发展机制的重要工具。引晶的BM-MNC中所示的移植物11的种子细胞的两个组织学和SEM图像。细胞接种效率是利用DNA测定7还示出。利用该模型系统中，我们发现，细胞接种降低TEVG狭窄，这是失败的主模式在我们的人体临床试验3的发展的发生率。将接种的细胞迅速从TEVG消失，这表明它们通过旁分泌机制8,12发挥它们的作用。它也表明，新血管形成是一种免疫介导的再生过程，而新血管源于从相邻血管壁沿着所述支架的腔表面的血管细胞（EC和SMC）的向内生长。此外，正常的巨噬细胞浸润的血管neotissue形成至关重要，但是当这个过程是过度它导致的TEVG 7,8狭窄的发展。这些结果表明这种小鼠模型与人类疾病的相关性。在显微外科技术可以适应其它血管应用，包括动脉移植物13和动脉到静脉瘘。
我们每年工作超过1000 IVC介入移植植入和死亡率小于1％。对于一个成功的移植物植入，也有提几个要点。
第一，可注射麻醉，优选进行此操作，因为它是要打开鼠标周围几次吻合术中。麻醉的效果通常持续约一个小时，并在整个手术时间对于一个熟练的微外科医生是约30-45分钟，它提供了足够的时间来完成手术。如果动物在手术中醒来，0.05-0.1毫升的麻醉鸡尾酒的可以注射intramuscularly。
第二，大多数小主动脉分支需要被连接，以防止过量的血液损失，同时分离出下腔静脉，并从腹部主动脉。还要记住不要伤到下腔静脉时，从主动脉分离。
第三，当接枝缝合，两侧的第2缝合线是整个过程中最重要的步骤。当它们不小心地放置，这是难以分开的下腔静脉的前面和后面的层。如果该层是不明确，有较高机会无意中缝合在一起。而缝合下腔静脉的移植，它不要过度伸展下腔静脉，可引起流泪是很重要的。另外，还要确保不切断太多IVC取代移植物的长度相同。一般IVC的约1至2毫米除去更换3〜5毫米接枝由于下腔静脉的纵向张力。如果下腔静脉的长度相同被除去，它使吻合口MOSIS极具挑战性。
第四，有显著应变应变变化就TEVG形成和狭窄的发展。例如，非种子选手C57BL / 6小鼠（野生型）呈狭窄的一种更高的速率比SCID / BG小鼠（免疫缺陷小鼠）8,12。此外，根据我们的经验，SCID / BG小鼠更容易在比较C57BL / 6小鼠进行操作，由于其更硬的下腔静脉壁14。对小鼠的新菌株操作时牢记这一点。
接枝制造，BM-MNC收获和细胞种植过程是直线前进，有的只是一对夫妇的过程中要弄清。首先，对于接枝的制造，这是很重要的是不要'叠'毡，同时使用18G的钝针推。我们已经尝试了不同的方法，以毛毡下推到的移液管尖端的远端。推移植用钝针显示最好的结局，到目前为止。内钝针的直径比毡缠绕在针的外径稍大一点。因此，较小的针可紧贴地滑进更大的钝针与毡可以随后被向下推的力相等的量都围绕毡，从而防止毛毯的聚拢的周围。我们以前观察到的成束移植具有较低的通畅2周。此外，以消除所有的泡沫这是至关重要的，因为气泡会造成支架表面和血液孔穿过孔植入后会泄漏。其次，当骨头分开，BM-MNC收获，一定要清洁骨骼尽可能使它们不包括太多的肌肉或头发。如果需要的话，则建议的密度离心过程之前，使用纸巾过滤器。
TEVG的这个模型运作良好的静脉循环，这是一个低压力和高流速的系统。然而，在动脉循环中，一个高压和高流量系统中，我们观察到的破裂带，由于其快速降解特性的PGA移植物的高利率。这意味着该接枝失去了它的结构强度之前neotissue获得足够的强度以抵抗动脉压。我们已经用聚乳酸（PLA）以前移植，但表现出的动脉瘤形成患病率较高。也需要超过2年才能完全降解PLA 在体内 ，这是超过小鼠的寿命。对于动脉循环移植的制造技术未来的应用程序，例如，静电移植是目前正在开发中。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是支持的，部分由一个津贴从美国国立卫生研究院（RO1 HL098228）到CKB。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyglycolic acid (PGA) felt | Biomedical Structures | Custome ordered | |
| Pipet tip, 0.1-10 μl | Fisher Sientific | 02-707-456 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7070020 | |
| RPMI medium 1604 | Gibco | 11875-093 | |
| Petri dish | BD | 353003 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 15 cc tube | BD | 352096 | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100ml | Also called 'Histopaque' |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Littauer bone cutter 4.5" Straight | Roboz | RS-8480 | For BM harvesting |
| Forceps 4.5" | Roboz | RS-8120 | For BM harvesting |
| Scissors 4.5" | Roboz | RS-5912 | For BM harvesting |
| Microscope | Leica | M80 | |
| C57BL/6J (H-2b), Female | Jackson Laboratories | 664 | 8-12 weeks |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | |
| Ibuprofen | PrecisionDose | NDC 68094-494-59 | |
| Heparin sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | |
| Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| 0.9% Sodium chloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Petrolatum ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine prep pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol prep pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| Fine scissor | FST | 14028-10 | |
| Micro-adson forcep | FST | 11018-12 | |
| Clamp applying forcep | FST | 00072-14 | |
| S&T Vascular clamp | FST | 00396-01 | |
| Spring scissors | FST | 15008-08 | |
| Colibri retractors | FST | 17000-04 | |
| Dumont #5 forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #7 - fine forceps | FST | 11274-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Tish needle holder/forceps | Micrins | MI1540 | |
| Black polyamide monofilament suture, 10-0 | AROSurgical Instruments Corporation | TI638402 | For suturing the graft |
| Black polyamide monofilament suture, 6-0 | AROSurgical Instruments | SN-1956 | For musculature and skin closure |
| Non-woven sponges | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 | |
| 18 G 1.5 in, Needle | BD | 305190 | |
| 25 G 1 in, Needle | BD | 305125 | |
| 30 G 1 in, Needle | BD | 305106 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-700 | |
| Warming pad | Gaymar | TP-22G | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 |
References
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