Summary
Pour améliorer notre connaissance de la formation néo-tissu cellulaire et moléculaire, un modèle murin de la TEVG a été récemment mis au point. Les greffons ont été implantés en sous-rénaux des greffes de la veine cave d'interposition de souris C57BL / 6. Ce modèle permet d'obtenir des résultats similaires à ceux obtenus dans notre étude clinique, mais sur un temps bien sûr beaucoup plus courte.
Abstract
Échafaudages biodégradables ensemencées avec des cellules mononucléées de la moelle osseuse (BMC) sont souvent utilisés pour la chirurgie reconstructive pour traiter les anomalies cardiaques congénitales. Les résultats cliniques à long terme ont montré d'excellents taux de perméabilité, cependant, avec une incidence significative de la sténose. Pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la formation néo-tissu vasculaire et de prévenir le développement de la sténose dans l'ingénierie tissulaire greffons vasculaires (TEVGs), nous avons développé un modèle de souris de la greffe d'environ 1 mm de diamètre intérieur. Tout d'abord, les TEVGs ont été assemblés à partir d'échafaudages tubulaires biodégradables fabriqués à partir d'un non-tissé d'acide glycolique sentir maille enduit de copolymère ε-caprolactone et L-lactide. Les échafaudages ont ensuite été placés dans un lyophilisateur, l'aspirateur pendant 24 heures, et stockés dans un dessiccateur jusqu'à ce que l'ensemencement des cellules. Deuxièmement, la moelle osseuse a été recueillie à partir de souris donneuses et des cellules mononucléées ont été isolées par centrifugation en gradient de densité. Troisièmement, environ un million de cellules ont étéensemencées sur un échafaudage et incubées O / N. Enfin, les échafaudages graines ont ensuite été implantés en sous-rénaux greffes veine cave d'interposition dans C57BL / 6. Les greffons implantés démontré une excellente perméabilité (> 90%) sans preuve de complications thrombo-emboliques ou la formation d'anévrisme. Ce modèle murin nous aidera à comprendre et quantifier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la formation néo-tissu dans le TEVG.
Introduction
Les malformations cardiaques congénitales sont des affections graves qui touchent près de 8% des naissances vivantes aux États-Unis. Environ 25% de ces enfants atteints de malformations cardiaques congénitales ou 2,4 pour 1 000 naissances vivantes, nécessitent un traitement invasif dans la première année de leur vie 1. Le traitement le plus efficace pour une maladie cardiaque congénitale est la chirurgie reconstructive. Malheureusement, les complications résultant de l'utilisation de conduits vasculaires actuellement disponibles sont la cause la plus importante de la morbidité et de la mortalité post-opératoire.
Pour résoudre ce problème, nous avons développé les premiers ingénierie tissulaire greffons vasculaires (TEVGs) pour une utilisation clinique 2. TEVGs ont été construits à partir de tubes de polyester biodégradables ensemencées avec des cellules dérivées de l'mononucléaires autologues de moelle osseuse (BM-MNC) et implantés comme des conduits veineux en chirurgie cardiaque congénitale. Les résultats ont montré d'excellents taux de perméabilité à 1-3 ans de suivi, mais avec une incidence significative de la sténose
Le murin IVC modèle d'interposition fidèlement récapitulé le processus de néovaisseaux formation qui se produit dans les grands animaux et les humains, mais sur un parcours de temps beaucoup plus court 6-9. Ici, un protocole détaillé pour la fabrication de la greffe à petite échelle en utilisant des échafaudages biodégradables, BM-MNC récolte et l'isolement, BM-MNC semis sur l'échafaudage, et implantation du greffon dans un modèle murin ont été décrits.
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Protocol
NOTE: Toutes les procédures d'animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel Hôpital soin et l'utilisation des animaux de la Nationwide Children.
1. Fabrication de greffe
- Ajoutez la solution de ε-caprolactone et de L-lactide copolymère P (LA / CL) en ajoutant 100 mg de P (LA / CL) dans 2 ml de dioxane sous une hotte de laboratoire. Placer la solution sur un vortex et mélanger pendant 1-1,5 heures pour dissoudre complètement.
- Dans le même temps, retirer une feuille de l'acide glycolique (PGA) estime du congélateur et découpez plusieurs sections 5 x 8 mm. Également couper la pointe d'un pi pipette 0,1-10 juste au-dessus du filtre.
- Insérez une aiguille 19 G (1,5 de longueur) dans l'extrémité distale d'une pointe de pipette et envelopper le PGA estimé autour de l'aiguille à l'aide de micro pince.
- Poussez délicatement le feutre à l'extrémité distale de la pointe de la pipette, où la lumière est plus droit que la partie proximale, en utilisant une aiguille 18 G émoussée, tandis que l'aiguille 19 G est inséré.
- Pipette40 pl P (CL / LA) solution dans la pointe de la pipette à partir du haut. Saturer la PGA sentir avec la solution. Puis pousser les bulles d'air à l'aide d'un distributeur de pipette. Répétez cette procédure si nécessaire.
- La place des greffes dans un tube de 50 ml et le placer dans un congélateur à -80 ° C pendant 20 min. Assurez-vous que la tête des aiguilles face à la baisse.
- Transférer le tube dans un lyophilisateur et le vide pendant 24 heures. Assurez-vous d'ouvrir le couvercle du tube d'avoir le flux d'air.
- Sortez les greffes et les retirer des aiguilles. Couper les deux extrémités de la greffe en laissant une section ~ 5 mm et les remettre sur les aiguilles à maintenir leur forme. Gardez les greffons dans un dessiccateur.
- Placez l'échafaud sous la lumière UV dans un biosécurité capot O / N avant l'ensemencement des cellules.
2. Moelle osseuse mononucléaires récolte des cellules et isolement
- Euthanasier les souris avec une surdose de kétamine / xylazine (kétamine, 200 mg / kg et de xylazine, 20 mg / kg).
- Supprimer os (fémur uned tibias) de 3 souris pour 10 implantations de greffe et les placer dans une boîte de Pétri avec 10 cc RPMI. Couper les deux extrémités des os et de la moelle osseuse de chasse à l'aide d'une seringue avec une aiguille 25 G dans une nouvelle boîte de Pétri avec 3 cc RPMI. Recueillir os solution RPMI osseuse et dans un tube de 15 cc et laver la boîte de Pétri avec 2 cc supplémentaires RPMI pour recueillir le reste de BM.
- Prendre l'échantillon (5 à 10 pi) et compter les cellules en utilisant un compteur de cellules automatisé ou hémocytomètre. Notez le résultat.
- Mettre 5 cc Ficoll dans un tube de 15 cm de centrifugeuse et ajouter os solution RPMI osseuse et. Ajouter la solution très lentement pour éviter qu'il se mélange avec le Ficoll.
- Centrifuger à 528 g pendant 30 min avec "pas de frein" à 24 ° C.
- Enlever la couche supérieure de rose. Recueillir le moyen clair couche Figure 1, qui est la couche MNC, et diluer avec du PBS 1:1.
- Centrifuger la solution diluée de MNC à 528 g pendant 10 min à 24 ° C.
- Enlever le surnageant et diluth le culot avec 5 ml de PBS.
- Centrifuger la solution de granulés à 528 g pendant 10 min à 24 ° C.
- Retirer le surnageant. On dilue le culot avec le volume approprié de milieu RPMI (~ 200 ul).
- Prélever un échantillon de pl 5-10 et compter les cellules en utilisant un compteur de cellules automatisé ou hématimètre. Notez le résultat. Répétez la cellule compter une fois de plus et de calculer le nombre de cellules moyenne.
- Diluer la concentration des cellules à l'aide d'un million cellules/10 ul de RPMI.
3. Portable semis
- Échafaudage pré-imbibé en ajoutant 5 ul RPMI luminale pendant 5 min, puis retirez RPMI.
- Ajouter 10 ul cellules nucléaires de moelle osseuse provenant de mono dans RPMI de l'étape 2.12 de lumière d'échafaudage et attendre 10 min pour permettre aux cellules de se fixer sur l'échafaud.
- Couper une aiguille 19 G de 1 cm de longueur et mettre l'aiguille dans la lumière de l'échafaudage pour garder la forme de l'échafaud. Placer l'échantillon dans une plaque de 24 puits. </ Li>
- Ajouter 1000 pi de RPMI à chaque puits et incuber O / N dans un incubateur.
4. Implantation du greffon
- Autoclave tous les outils chirurgicaux avant la chirurgie: 1x ciseaux fins, micro pince 3x, micro pinces vasculaires 2x, 1x pince forceps applicables, titulaire de la micro-aiguille 1x, ciseaux à ressort 1x, 1x enrouleur.
- 6-8 semaines femelle C57BL / 6 sont utilisés comme vasculaires receveurs de greffe de l'ingénierie tissulaire. Débranchez la souris de sa cage et le peser, alors anesthésier par une injection intrapéritonéale dans le quadrant inférieur droit de l'abdomen avec un cocktail de kétamine / xylazine (kétamine, 100 mg / kg et de xylazine, 10 mg / kg). Le kétoprofène (5 mg / kg, IP) est utilisé comme analgésique pré-anesthésie.
- Vérifiez le niveau de sédation par pincement conte, puis couper les poils abdominale. Lubrifier les yeux avec pommade ophtalmique stérile, et placer la souris dans une position de décubitus dorsal sur un tapis. Désinfecter l'abdomen avec des tampons de bétadine et alcool. Cover la souris avec un champ stérile et d'exposer la zone d'incision seulement.
- Faire une laparotomie médiane incision du dessous de la xiphoïde à la région sus-pubienne, et insérer un écarteur auto-statique. Envelopper les intestins dans une solution saline humidifié gaze. Définir carrément l'aorte et la veine cave.
- Placez deux clamps vasculaires micro sur les deux côtés proximal et distal de l'aorte et la veine cave, puis carrément séparer l'aorte de la veine cave transect de la veine cave. Si nécessaire, ligaturer les branches de l'aorte abdominale avec un 10-0 sutures monofilament les aiguilles coniques.
- Implanter une veine cave inférieure avec interposition greffe extrémité proximale et distale de mettre fin à l'aide d'un anastomoses 10-0 suture stérile. Couper le greffon, habituellement de 1 à 2 mm, en fonction de l'anatomie de la souris. Fixer la greffe avec une maille sur les deux extrémités proximale et distale et commencer à suturer de façon continue avec 4-5 points de suture à partir de l'autre côté de la greffe. Après avoir terminé la face avant, retournez les pinces et les greffesde l'autre côté et de suturer le côté arrière de la greffe. Pendant l'implantation, rincer la greffe avec une solution d'héparine fréquemment pour prévenir la thrombose aiguë.
- Retirer la pince proximale et contrôler l'hémorragie en appliquant un agent hémostatique résorbable stérile d'actualité. Lorsque l'hémorragie s'arrête complètement, retirez la pince distale et contrôler l'hémorragie de la même façon. Assurez-vous que le sang coule à travers le greffon.
- Fermez la musculature abdominale et la peau en deux couches à l'aide d'un monofil 6-0 polyamide noir avec aiguille fileté inclus.
- Injecter 0,5 ml de solution saline sous-cutanée et placer la souris dans une cage de récupération sur un coussin chauffant jusqu'à ce que la souris est entièrement mobile. Lors de la récupération, le retour de la souris dans une nouvelle cage avec une literie de papier. Donner des médicaments de la douleur (ibuprofène, 30 mg / kg, eau potable) pendant 48 heures.
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Representative Results
Un schéma de TEVG implantation est représenté sur la figure 1. Moelle osseuse a été récoltée à partir d'une souris donneuse et des cellules mononucléaires ont été isolées par centrifugation de densité, puis ensemencées sur un échafaudage biodégradable. Les échafaudages ensemencées ont été incubées O / N et implantés à une souris receveuse comme une cave greffe d'interposition de la veine cave inférieure.
La figure 2 illustre la microscopie électronique à balayage de l'échafaudage PGA-P (CL / LA). Le diamètre intérieur était d'environ 1 mm et l'épaisseur de paroi est d'environ 0,17 mm. La porosité totale était de 78,5% et la moyenne des tailles de pores étaient de 45,4 ± 17,6 um.
L'image brute d'un TEVG interposé dans la veine cave inférieure de souris C57BL / 6 est représentée sur la Figure 3. Immédiatement après l'implantation (A) et 2 semaines après l'implantation (B). (C) montre l'image brute d'un natif IVC en comparaison. Il est évident quegreffage a été rempli de néo-tissu, cependant, elle a conservé son état d'origine de la greffe. Notre résultat précédent a montré que la dégradation de la greffe totale prend jusqu'à 12 semaines 10.
L'image échographique mode B et Doppler couleur de 2 semaines de implantées TEVG Figures 4A-B pour montrer la perméabilité des greffons implantés. Une image native IVC a été ajouté à titre de comparaison (figure 4, C). Cellule semis amélioré la perméabilité du greffon considérablement, perméabilités à 2 semaines pour les greffes non ensemencés et ensemencées sont 65% et 91%, respectivement (p <0,05, test exact de Fisher).
La figure 5 montre l'infiltration cellulaire et le dépôt de matrice extracellulaire dans TEVG après 2 semaines d'implantation. Greffons explantées colorées avec coloration H & E ont montré la formation néo-tissu tout au long de la greffe et des restes de matériau d'échafaudage (A). Harts et le trichrome de Masson ont montré dépôt de l'élastine dans ltimal couche (B) et du collagène dans la couche médiane (C). Revêtement de cellules endotheliales a été observé tout au long de la couche intimale (D) et les cellules musculaires lisses confluentes étaient présents pendant toute la TEVG, en particulier au-dessous de la garniture de CE (E), comme indiqué par CD31 et αSMA coloration, respectivement. Dès la deuxième semaine après l'implantation, l'infiltration des macrophages était évidente, comme indiqué par la coloration de F4/80 (F).
Figure 1. Schéma de TEVG implantation de cellules nucléaires. Moelle osseuse mono ont été récoltées à partir d'une souris donneuse, ensemencées sur un échafaudage biodégradable, et ensuite implantés comme une interposition greffe IVC à une souris receveuse.
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Images de microscopie électronique Figure 2. Numérisation d'un échafaudage. Le diamètre extérieur moyen était de 1,45 mm, diamètre luminal était de 1,1 mm et la longueur était de 3 mm.
Figure 3. Implanté TEVG après 2 semaines et IVC natif. A) immédiatement après l'implantation, B) 2 semaines après l'implantation, et C) à titre de comparaison native IVC.
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Figure 4. Images échographiques 2 semaines et natif IVC. A) l'image en mode B et B) Doppler couleur de TEVG après 2 semaines. C) Natif IVC pour la comparaison.
Figure 5. Images représentatives des 2 semaines après TEVG opératoire. A) H & E (lumière intérieure), B) Harts (rose = élastine), trichrome de C) Massion (bleu = collagène), D) CD31 (brun = de cellules endothéliales), E) αSMA (brun = de cellule musculaire lisse), et F ) F4/80 (brun = macrophages).
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Discussion
Le modèle de souris de TEVG est un outil précieux pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la formation néo-tissu et le développement de la sténose. La tête de série BM-MNC a été montré dans les deux images histologiques et SEM des cellules ensemencées sur la greffe 11. Efficacité cellule de semis a également été démontré en utilisant un test d'ADN 7. L'utilisation de ce système modèle, nous avons montré que l'ensemencement de cellules réduit l'incidence du développement d'une sténose TEVG, ce qui était le principal mode de défaillance dans notre essai clinique humain 3. Les cellules ensemencées ont disparu rapidement de la TEVG, ce qui suggère qu'ils exercent leur effet par un mécanisme paracrine 8,12. Il a également été montré que la formation de néovaisseaux est un processus de régénération à médiation immunitaire, et qui provient de la néovaisseaux interposition des cellules vasculaires (SMC) et de la CE à partir de la paroi du récipient voisin le long de la surface luminale de l'échafaudage. De plus, l'infiltration macrophagique normale est essentiel pour la formation néo-tissu vasculaire,mais lorsque ce processus est excessif, il conduit à la mise au point de sténose TEVG 7,8. Ces résultats démontrent la pertinence de ce modèle de souris de la maladie humaine. Les techniques de microchirurgie peuvent être adaptées à d'autres applications vasculaires y compris les greffes artérielles et 13 l'artère à fistule veineuse.
Nous exploitons plus de 1000 IVC interposition implantations greffés chaque année et le taux de mortalité est inférieur à 1%. Pour une implantation de la greffe réussie, il ya plusieurs points importants à mentionner.
Tout d'abord, l'anesthésie injectable est préféré pour cette opération, car il est nécessaire de tourner autour de la souris à plusieurs reprises au cours de l'anastomose. L'effet de l'anesthésie dure habituellement environ une heure et la durée de la chirurgie ensemble pour un micro chirurgien qualifié est d'environ 30-45 min, ce qui donne suffisamment de temps pour compléter la chirurgie. Si l'animal se réveille pendant la chirurgie, 0,05 à 0,1 ml d'un cocktail d'anesthésie peuvent être injectés par voie intramusrement.
En second lieu, la plupart des petites branches aortiques nécessaires à ligaturer pour empêcher la perte de sang tout en séparant l'excès de la veine cave inférieure et de l'aorte à partir de la région abdominale. Gardez également à l'esprit de ne pas blesser l'IVC quand il est séparé de l'aorte.
Troisièmement, lorsque le greffon a été suturée, les deux premiers points de suture sur les deux côtés sont les étapes les plus importantes de tout le processus. Quand ils ne sont pas placés avec soin, il est difficile de séparer les couches avant et arrière de la veine cave inférieure. Si les couches ne sont pas clairement identifiés, il ya une chance plus élevée de suturer accidentellement ensemble. Alors que la suture de la VCI à la greffe, il est important de ne pas trop étirer l'IVC, ce qui peut provoquer un larmoiement. Assurez-vous également de ne pas couper trop IVC pour remplacer la même longueur de la greffe. Habituellement, environ 1 à 2 mm d'IVC a été retiré pour remplacer un greffon de 3 à 5 mm en raison de la tension longitudinale de la veine cave inférieure. Si la même longueur de la veine cave inférieure est enlevée, il est anastomosemosis extrêmement difficile.
Quatrièmement, il ya pression importante à la souche variations par rapport à la formation et au développement de TEVG sténose. Par exemple, non ensemencée souris C57BL / 6 (type sauvage) a montré un taux beaucoup plus élevé de sténose que les souris SCID / bg (de souris immunodéficientes) 8,12. En outre, à partir de notre expérience, les souris SCID / bg sont beaucoup plus faciles à utiliser par rapport aux souris C57BL / 6 en raison de sa paroi IVC rigide 14. Gardez cela à l'esprit lors de l'utilisation d'une nouvelle souche de souris.
La fabrication de la greffe, BM-MNC récolte, et les processus d'ensemencement des cellules sont simples, il ya seulement un couple de processus pour être au courant de. Tout d'abord, pour la fabrication de la greffe, il est très important de ne pas «tas» le feutre tout pousser à l'aide de l'aiguille émoussée 18 G. Nous avons essayé différentes méthodes pour pousser le feutre vers le bas à l'extrémité distale des embouts de pipette. Pousser la greffe avec une aiguille émoussée montré le meilleur résultat, et de loin. L'intérieurdiamètre de l'aiguille émoussée est légèrement plus grand que le diamètre extérieur de l'aiguille que le feutre est enroulé autour. Par conséquent, la plus petite aiguille peut parfaitement coulisser dans l'aiguille émoussée plus grand et le feutre peut ensuite être poussé vers le bas avec des quantités égales de la force sur toute la circonférence du feutre, ce qui empêche l'entassement du feutre. Nous avons observé précédemment que les greffes nappes ont montré une perméabilité inférieure à 2 semaines. En outre, il est essentiel d'éliminer toutes les bulles parce que les bulles provoquent des trous sur la surface de l'échafaudage et le sang couler à travers le trou après l'implantation. Deuxièmement, lorsque les os sont séparés pour BM-MNC récolte, assurez-vous de nettoyer l'os autant que possible, de sorte qu'ils ne comprennent pas trop de muscle ou les cheveux. Si nécessaire, il est recommandé d'utiliser un tamis de tissu avant le processus de centrifugation par densité.
Ce modèle de TEVG a bien fonctionné sur la circulation veineuse, qui est un système à basse pression et d'écoulement élevé. Cependant, dans la circulation artérielle, unehaute pression et système d'écoulement élevé, nous avons observé des taux élevés de rupture avec les greffes de la PGA en raison de sa caractéristique de dégradation rapide. Ce qui signifie la greffe perd de sa force structurelle avant la néo-tissu gagne assez de force pour résister à la pression artérielle. Nous avons utilisé l'acide polylactique (PLA) greffes précédemment, mais a montré une prévalence élevée de la formation d'un anévrisme. En outre, il prend plus de 2 ans à se dégrader complètement PLA in vivo, ce qui est plus que la durée de vie des souris. Pour une application future des techniques de fabrication de la greffe de la circulation artérielle, par exemple, une greffe électrofilé est actuellement en cours de développement.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par une subvention du NIH (RO1 HL098228) de CKB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyglycolic acid (PGA) felt | Biomedical Structures | Custome ordered | |
| Pipet tip, 0.1-10 μl | Fisher Sientific | 02-707-456 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7070020 | |
| RPMI medium 1604 | Gibco | 11875-093 | |
| Petri dish | BD | 353003 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 15 cc tube | BD | 352096 | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100ml | Also called 'Histopaque' |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Littauer bone cutter 4.5" Straight | Roboz | RS-8480 | For BM harvesting |
| Forceps 4.5" | Roboz | RS-8120 | For BM harvesting |
| Scissors 4.5" | Roboz | RS-5912 | For BM harvesting |
| Microscope | Leica | M80 | |
| C57BL/6J (H-2b), Female | Jackson Laboratories | 664 | 8-12 weeks |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | |
| Ibuprofen | PrecisionDose | NDC 68094-494-59 | |
| Heparin sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | |
| Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| 0.9% Sodium chloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Petrolatum ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine prep pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol prep pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| Fine scissor | FST | 14028-10 | |
| Micro-adson forcep | FST | 11018-12 | |
| Clamp applying forcep | FST | 00072-14 | |
| S&T Vascular clamp | FST | 00396-01 | |
| Spring scissors | FST | 15008-08 | |
| Colibri retractors | FST | 17000-04 | |
| Dumont #5 forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #7 - fine forceps | FST | 11274-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Tish needle holder/forceps | Micrins | MI1540 | |
| Black polyamide monofilament suture, 10-0 | AROSurgical Instruments Corporation | TI638402 | For suturing the graft |
| Black polyamide monofilament suture, 6-0 | AROSurgical Instruments | SN-1956 | For musculature and skin closure |
| Non-woven sponges | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 | |
| 18 G 1.5 in, Needle | BD | 305190 | |
| 25 G 1 in, Needle | BD | 305125 | |
| 30 G 1 in, Needle | BD | 305106 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-700 | |
| Warming pad | Gaymar | TP-22G | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 |
References
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