Summary
Per migliorare la nostra conoscenza della formazione neotissue cellulare e molecolare, un modello murino della TEVG è stata sviluppata di recente. Gli innesti sono stati impiantati come infrarenali innesti vena cava interposizione di C57BL / 6 topi. Questo modello raggiunge risultati simili a quelli ottenuti nella nostra ricerca clinica, ma nel corso di un time-course di gran lunga ridotto.
Abstract
Scaffold biodegradabili seminati con cellule mononucleari del midollo osseo (BMC) sono spesso utilizzati per la chirurgia ricostruttiva per il trattamento di anomalie cardiache congenite. I risultati clinici a lungo termine hanno mostrato ottimi tassi di pervietà, tuttavia, con una significativa incidenza di stenosi. Per studiare i meccanismi cellulari e molecolari della formazione neotissue vascolare e prevenire lo sviluppo di stenosi in ingegneria tessutale innesti vascolari (TEVGs), abbiamo sviluppato un modello murino dell'innesto con circa 1 mm di diametro interno. In primo luogo, le TEVGs stati assemblati da impalcature tubolari biodegradabili fabbricate da un tessuto non tessuto di acido poliglicolico feltro maglia rivestito con ε-caprolattone e L-lattide copolimero. I ponteggi sono stati poi collocati in un liofilizzatore, aspirati per 24 ore, e conservati in un essiccatore fino semina delle cellule. In secondo luogo, midollo osseo è stato prelevato da topi donatori e cellule mononucleari sono stati isolati da centrifugazione in gradiente di densità. Terzo, circa un milione di cellule eranoseminate su un ponteggio e incubati O / N. Infine, i ponteggi seminati stati impiantati come infrarenali innesti vena cava interposizione di C57BL / 6 topi. Gli innesti impiantati dimostrato eccellente pervietà (> 90%), senza evidenza di complicanze tromboemboliche o di formazione aneurismatica. Questo modello murino ci aiuterà a comprendere e quantificare i meccanismi cellulari e molecolari della formazione neotissue nel TEVG.
Introduction
Difetti cardiaci congeniti sono condizioni gravi che colpiscono circa l'8% dei nati vivi negli Stati Uniti. Circa il 25% di questi neonati con difetti cardiaci congeniti o 2,4 per 1.000 nati vivi, richiedono un trattamento invasivo nel primo anno della loro vita 1. Il trattamento più efficace per la malattia cardiaca congenita è la chirurgia ricostruttiva. Purtroppo, complicazioni derivanti dall'uso di condotti vascolari attualmente disponibili sono la causa più importante di morbilità e mortalità postoperatoria.
Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato i primi di ingegneria tessutale innesti vascolari (TEVGs) per uso clinico 2. TEVGs sono stati costruiti con tubi in poliestere biodegradabile seminati con autologo di midollo osseo cellule derivate-mononucleari (BM-MNC) e impiantati come condotti venosi per la chirurgia cardiaca congenita. I risultati hanno mostrato ottimi tassi di pervietà a 1-3 anni di follow-up, ma con una significativa incidenza di stenosi
Il murino IVC modello interposizione fedelmente ricapitolato il processo di neovessel di formazione che si verifica in grandi animali e nell'uomo, ma nel corso di un corso di tempo molto più breve 6-9. Qui, un protocollo dettagliato per la produzione innesto su piccola scala utilizzando scaffold biodegradabili, BM-MNC raccolta e l'isolamento, BM-MNC semina sull'impalcatura, e l'impianto innesto in un modello murino sono stati descritti.
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Protocol
NOTA: Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dalla Hospital Institutional Animal Care ed uso Comitato dei Bambini di Nationwide.
1. Graft Manufacturing
- Rendere la soluzione ε-caprolattone e L-lattide copolimero P (LA / CL) aggiungendo 100mg P (LA / CL) in 2 ml di diossano sotto una cappa aspirante. Mettere la soluzione in un vortice e mescolare continuamente per 1-1,5 ore per sciogliere completamente.
- Nel frattempo, rimuovere un foglio di acido poliglicolico (PGA) feltro dal congelatore e tagliare diverse sezioni 5 x 8 mm. Anche tagliare la punta di una pipetta microlitri 0,1-10 appena sopra il filtro.
- Inserire un ago G 19 (1,5 di lunghezza) nella estremità distale di un puntale e avvolgere il PGA sentire in tutto il ago utilizzando micro pinze.
- Attentamente spingere il feltro all'estremità distale della punta della pipetta, dove il lume è dritto di parte prossimale, utilizzando un ottuso ago 18 G, mentre il ago G 19 è inserito in esso.
- PipettaSoluzione al 40 microlitri P (CL / LA) nella punta della pipetta dall'alto. Saturare il PGA feltro con la soluzione. Poi spingere le bolle d'aria utilizzando un dispenser pipetta. Ripetere questo processo, se necessario.
- Luogo innesti in un tubo da 50 ml e collocarlo in una -80 ° C freezer per 20 minuti. Assicurarsi che la testa degli aghi faccia verso il basso.
- Trasferire la provetta in un liofilizzatore e vuoto per 24 ore. Assicurarsi di aprire il coperchio del tubo di avere il flusso d'aria.
- Estrarre gli innesti e rimuoverli dagli aghi. Tagliare entrambe le estremità dell'innesto lasciando una sezione ~ 5 mm e riporli sugli aghi per mantenere la loro forma. Mantenere gli innesti in un essiccatore.
- Posizionare il patibolo sotto la luce UV in una cappa di biosicurezza O / N prima della semina delle cellule.
2. Midollo osseo Mononuclear raccolta di cellule e di isolamento
- Euthanize i topi con overdose di ketamina / xylazina (ketamina, 200 mg / kg e xylazina, 20 mg / kg).
- Rimuovere le ossa (femore di und tibie) da 3 topi per 10 impiantazioni innesto e posto in una capsula di Petri con 10 cc RPMI. Tagliare le due estremità delle ossa e filo midollo osseo utilizzando una siringa con un ago 25 G in una nuova piastra di Petri con 3 cc RPMI. Raccogliere midollo osseo e soluzione RPMI in una provetta da 15 cc e lavare la capsula di Petri con ulteriori RPMI 2 cc per raccogliere la restante BM.
- Prendere campione (5-10 microlitri) e conta delle cellule utilizzando un contatore di cellule automatico o emocitometro. Registrare il risultato.
- Mettere 5 cc Ficoll in una provetta da 15 cc centrifuga e aggiungere midollo osseo e soluzione RPMI. Aggiungere la soluzione molto delicatamente per evitare che la miscelazione con Ficoll.
- Centrifugare a 528 xg per 30 minuti con "NO FRENO" a 24 ° C.
- Rimuovere lo strato superiore di colore rosa. Raccogliere lo strato centrale chiara Figura 1, che è lo strato MNC, e diluire con PBS 1:1.
- Centrifugare la soluzione diluita MNC a 528 xg per 10 min a 24 ° C.
- Rimuovere il surnatante e diliuto il pellet con 5 ml di PBS.
- Centrifugare pellet a 528 xg per 10 min a 24 ° C.
- Rimuovere il surnatante. Diluire il pellet con il volume appropriato di RPMI (~ 200 microlitri).
- Prelevare un campione microlitri 5-10 e contare le cellule utilizzando un contatore di cellule automatico o emocitometro. Registrare il risultato. Ripetere la cella contando ancora una volta e calcolare il numero medio di cellule.
- Diluire la concentrazione cellulare a 1.000.000 cells/10 microlitri utilizzando RPMI.
3. Semina cellulare
- Scaffold Prewet con l'aggiunta di 5 ml RPMI luminally per 5 minuti, quindi rimuovere RPMI.
- Aggiungere 10 ml di midollo osseo derivate mono cellule nucleari in RPMI dal punto 2.12 al lume ponteggio e attendere 10 minuti per consentire alle cellule di attaccare sul patibolo.
- Tagliare un ago 19 G per 1 cm di lunghezza e mettere l'ago nel lume del ponteggio per mantenere la forma del ponteggio. Trasferire il campione in una piastra da 24 pozzetti. </ Li>
- Aggiungere 1,000 ml RPMI a ciascun pozzetto e incubare O / N in un incubatore.
4. Graft impianto
- Sterilizzare in autoclave tutti gli strumenti chirurgici prima della chirurgia: 1x forbici sottili, 3x micro pinze, pinze vascolari micro 2x, 1x morsetto pinze applicano, porta-aghi micro 1x, forbici primavera 1x, 1x divaricatore.
- 6-8 settimane vecchia femmina C57BL / 6 sono usati come ingegneria tessutale destinatari innesto vascolare. Rimuovere il mouse dalla gabbia e si pesa, poi anestetizzare attraverso un'iniezione intraperitoneale nel quadrante inferiore destro dell'addome con un cocktail di ketamina / xilazina (ketamina, 100 mg / kg e xilazina, 10 mg / kg). Ketoprofene (5 mg / kg, IP) è usato come un analgesico pre-anestesia.
- Controllare il livello di sedazione da pizzicare racconto, poi ritagliare i capelli addominale. Lubrificare gli occhi con pomata oftalmica sterile, e posizionare il mouse in una posizione prona dorsale su un taccuino. Disinfettare l'addome con Betadine e alcool pastiglie. Cover il mouse con un telino sterile ed esporre solo la zona di incisione.
- Effettuare una laparotomia mediana incisione da sotto la xifoidea alla regione sovrapubica, e inserire un divaricatore di auto-conservazione. Avvolgere l'intestino in soluzione salina inumidito garza. Senza mezzi termini definire l'aorta sottorenale e la vena cava.
- Inserire due micro pinze vascolari su entrambi i lati prossimale e distale della aorta e vena cava poi senza mezzi termini separare l'aorta dalla vena cava Transect la vena cava. Se necessario, legare i rami dell'aorta addominale con un 10-0 monofilamento sugli aghi conici.
- Impiantare una vena cava inferiore interposizione di innesto con l'estremità prossimale e distale di anastomosi terminare con una sterile 10-0 sutura. Tagliare il trapianto, di solito 1-2 mm, a seconda dell'anatomia del mouse. Fissare l'innesto con un punto su entrambi estremità prossimale e distale e inizia a suturare continuamente con 4-5 stiches dall'altro lato dell'innesto. Dopo aver terminato la parte anteriore, capovolgere i morsetti e innestiverso l'altro lato e suturare il lato posteriore dell'innesto. Durante l'impianto, lavare l'innesto con la soluzione di eparina frequentemente per evitare la trombosi acuta.
- Rimuovere il morsetto prossimale e controllare l'emorragia applicando una topica agente emostatico sterile riassorbibile. Quando l'emorragia si arresta completamente, rimuovere il morsetto distale e controllare l'emorragia allo stesso modo. Assicurarsi che il sangue scorre attraverso l'innesto.
- Chiudere la muscolatura addominale e la pelle in due strati con un 6-0 nera in poliammide monofilamento di sutura con ago filettato incluso.
- Iniettare 0,5 ml di soluzione fisiologica per via sottocutanea e posizionare il mouse in una gabbia di recupero su un rilievo di riscaldamento fino a quando il mouse è completamente mobile. Al momento del recupero, ritorno il mouse in una nuova gabbia con biancheria da letto di carta. Dare farmaci antidolorifici (ibuprofene, 30 mg / kg, acqua potabile) per 48 ore.
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Representative Results
Uno schema di TEVG impianto è mostrato in Figura 1. Midollo osseo è stato raccolto da un topo donatore e mono cellule nucleari sono stati isolati mediante centrifugazione densità e quindi seminate su uno scaffold biodegradabile. Gli scaffold seminati sono stati incubati O / N e impiantati a un mouse destinatario come la vena cava inferiore interposizione innesto.
La Figura 2 illustra la microscopia elettronica a scansione del ponteggio PGA-P (CL / LA). Il diametro interno è di circa 1 mm e lo spessore della parete era circa lo 0,17 mm. Porosità totale è 78,5% e media dimensioni dei pori erano 45,4 ± 17,6 micron.
L'immagine lordo di un TEVG interposto nella IVC di C57BL / 6 topi è mostrato in Figura 3. Subito dopo l'impianto (A) e 2 settimane dopo l'impianto (B). (C) mostra l'immagine lordo di un IVC nativo in confronto. È evidente cheinnesto è stato riempito con neotissue, tuttavia, ha mantenuto ancora la forma dell'innesto originale. Il nostro risultato precedente ha mostrato che il degrado totale innesto prende fino a 12 settimane 10.
L'immagine Doppler ad ultrasuoni B-mode e il colore di un 2 settimane impiantati TEVG Figure 4A-B per mostrare la pervietà degli innesti impiantati. Una immagine IVC nativo è stato aggiunto per confronto (Figura 4, C). Semina delle cellule ha migliorato la pervietà della protesi in modo significativo, pervietà a 2 settimane per innesti non teste di serie e seminate sono 65% e 91%, rispettivamente (p <0,05, test esatto di Fisher).
La Figura 5 mostra l'infiltrazione di cellule e deposizione di matrice extracellulare in TEVG dopo 2 settimane di impianto. Innesti espiantati colorate con colorazione H & E ha mostrato la formazione neotissue tutta l'innesto e resti di materiale scaffold (A). Cervi e macchia tricromica di Masson ha mostrato deposizione di elastina in areatimal strato (B) e collagene nello strato mediale (C). Rivestimento delle cellule endoteliali è stata osservata in tutto lo strato intimale (D) e cellule muscolari lisce confluenti erano presenti in tutto il TEVG, in particolare al di sotto del rivestimento CE (E) come dimostrato da CD31 e αSMA colorazione, rispettivamente. Entro la seconda settimana dopo l'impianto, infiltrazione di macrofagi era evidente, come indicato con F4/80 colorazione (F).
Figura 1. Schema di TEVG impianto midollo osseo mono cellule nucleari. State raccolte da un topo donatore, seminate su un ponteggio biodegradabile, e poi impiantato come interposizione innesto IVC ad un mouse destinatario.
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Immagini Figura 2. Microscopia elettronica a scansione di un ponteggio. Il diametro medio esterno era 1,45 millimetri, diametro luminale è stata di 1,1 mm e la lunghezza era di 3 mm.
Figura 3. Impiantati TEVG dopo 2 settimane e IVC nativo. A) Subito dopo l'impianto, B) 2 settimane dopo l'impianto, e C) nativo IVC per il confronto.
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Figura 4. Immagini ad ultrasuoni 2 settimane e nativo IVC. A) l'immagine B-Mode e B) color Doppler di TEVG dopo 2 settimane. C) Native IVC per un confronto.
Figura 5. Immagini rappresentative delle due settimane inserisci TEVG operativa. A) H & E (lume interno), B) Harts (rosa = elastina), Tricromica C) di Massion (blu = collagene), D), CD31 (marrone = cellule endoteliali), E) αSMA (marrone = cellule muscolari lisce), e F ) F4/80 (marrone = macrofagi).
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Discussion
Il modello murino di TEVG è uno strumento prezioso per studiare i meccanismi cellulari e molecolari della formazione neotissue e lo sviluppo di stenosi. La testa di serie BM-MNC stato mostrato in entrambe le immagini istologiche e SEM delle cellule inseminate sulla marza 11. Efficienza semina delle cellule è stata anche dimostrata utilizzando un test DNA 7. Usando questo sistema modello abbiamo dimostrato che semina delle cellule riduce l'incidenza dello sviluppo di TEVG stenosi, che era la principale modalità di guasto nel nostro studio clinico umano 3. Le cellule seminate rapidamente scomparsi dal TEVG, suggerendo che essi esercitano il loro effetto attraverso un meccanismo paracrino 8,12. È stato anche dimostrato che la formazione neovessel è un processo rigenerativo immuno-mediata, e che il neovessel nasce dalla crescita interna delle cellule vascolari (EC e SMC) dalla parete del vaso confinante lungo la superficie luminale del ponteggio. Inoltre, normale infiltrazione macrofagica è essenziale per la formazione neotissue vascolare,ma quando questo processo è eccessiva porta allo sviluppo di TEVG stenosi 7,8. Questi risultati dimostrano l'importanza di questo modello di topo alla malattia umana. Le tecniche di microchirurgia possono essere adattati ad altre applicazioni vascolari compresi innesti arteriosi 13 e arteria per fistola venosa.
Operiamo in oltre 1.000 IVC interposizione implantologia innesti ogni anno e il tasso di mortalità è inferiore all'1%. Per un impianto innesto di successo, ci sono diversi punti importanti da menzionare.
Primo, anestesia iniettabile è preferito per questa operazione poiché è necessario ruotare il mouse più volte durante anastomosi. L'effetto dell'anestesia solito dura circa un'ora e tutto il tempo intervento chirurgico per un micro chirurgo esperto è di circa 30-45 minuti, che fornisce il tempo necessario per completare l'intervento chirurgico. Se l'animale si sveglia durante l'intervento chirurgico, 0,05-0,1 ml di un cocktail anestesia possono essere iniettati intramuslare.
In secondo luogo, la maggior parte dei piccoli rami aortici dovevano essere ligati per prevenire la perdita di sangue in eccesso mentre separa la IVC e l'aorta dalla zona addominale. Anche tenere a mente per non ferire l'IVC quando è separata dalla aorta.
In terzo luogo, quando l'innesto è stato suturato, i primi due suture su entrambi i lati sono i passi più importanti dell'intero processo. Quando non sono posizionati accuratamente, è difficile separare gli strati anteriore e posteriore della IVC. Se gli strati non sono chiaramente identificati, vi è una maggiore probabilità di loro suturare accidentalmente insieme. Mentre la sutura del IVC per l'innesto, è importante non tendere la IVC, che può causare strappi. Inoltre, fare attenzione a non tagliare troppo IVC per sostituire la stessa lunghezza della protesi. Di solito circa 1 a 2 mm di IVC è stato rimosso per sostituire un 3 a 5 mm innesto a causa della tensione longitudinale della IVC. Se la stessa lunghezza della IVC viene rimosso, rende anastomosis estremamente impegnativo.
In quarto luogo, ci sono sforzo significativo per la tensione variazioni rispetto alla formazione TEVG e allo sviluppo di stenosi. Ad esempio, testa di serie C57BL / 6 topi (wild type) ha mostrato un tasso molto più elevato di stenosi rispetto SCID / bg topi (topi immunodeficienti) 8,12. Inoltre, dalla nostra esperienza, SCID / bg topi sono molto più facili da usare rispetto a C57BL / 6 topi grazie alla sua rigida parete IVC 14. Tenetelo a mente quando si opera su un nuovo ceppo di topi.
La produzione innesto, BM-MNC raccolta, e dei processi di semina cellulare sono dritto in avanti, ci sono solo un paio di processi per essere consapevoli di. In primo luogo, per la produzione dell'innesto, è molto importante non 'branco' il feltro, mentre spingerlo utilizzando l'ago smussato 18 G. Abbiamo provato diversi metodi per spingere il feltro verso l'estremità distale dei puntali. Spingere l'innesto con un ago smussato ha mostrato il risultato migliore, di gran lunga. L'internodiametro dell'ago smussato è leggermente più grande del diametro esterno dell'ago che il feltro è avvolto intorno. Pertanto, l'ago più piccolo può comodamente scivolare nel ago smussato più grande e il feltro può successivamente essere spinto verso il basso con pari quantità di forza tutta la circonferenza del feltro, che impedisce eccessi di feltro. Abbiamo già osservato che gli innesti raggruppato mostrato la pervietà inferiore a 2 settimane. Inoltre, è fondamentale per rimuovere tutte le bolle bolle perché causano fori sulla superficie scaffold ed il sangue fuoriuscire attraverso il foro dopo l'impianto. In secondo luogo, quando le ossa sono separati per BM-MNC raccolta, assicurarsi di pulire l'osso, per quanto possibile in modo da non includono troppo muscolare o capelli. Se necessario, si raccomanda di utilizzare un filtro tessuto prima del processo di centrifugazione densità.
Questo modello di TEVG funzionava bene sulla circolazione venosa, che è una bassa pressione e sistema a flusso elevato. Tuttavia, in circolazione arteriosa, unalta pressione e sistema a flusso elevato, abbiamo osservato alti tassi di rottura con innesti PGA grazie alla sua caratteristica di degradazione rapida. Il che significa che l'innesto perde la sua forza strutturale prima della neotissue guadagna abbastanza forza per resistere alla pressione arteriosa. Abbiamo usato l'acido polilattico (PLA) innesta in precedenza, ma ha mostrato un'alta prevalenza di formazione di aneurismi. Inoltre, ci vogliono più di 2 anni a degradare completamente PLA in vivo, che è più che la durata della vita dei topi. Per una futura applicazione in arteriosi tecniche di produzione innesto circolazione, ad esempio, un innesto electrospun è in corso di produzione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto, in parte, da una sovvenzione del NIH (RO1 HL098228) per CKB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyglycolic acid (PGA) felt | Biomedical Structures | Custome ordered | |
| Pipet tip, 0.1-10 μl | Fisher Sientific | 02-707-456 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7070020 | |
| RPMI medium 1604 | Gibco | 11875-093 | |
| Petri dish | BD | 353003 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 15 cc tube | BD | 352096 | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100ml | Also called 'Histopaque' |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Littauer bone cutter 4.5" Straight | Roboz | RS-8480 | For BM harvesting |
| Forceps 4.5" | Roboz | RS-8120 | For BM harvesting |
| Scissors 4.5" | Roboz | RS-5912 | For BM harvesting |
| Microscope | Leica | M80 | |
| C57BL/6J (H-2b), Female | Jackson Laboratories | 664 | 8-12 weeks |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | |
| Ibuprofen | PrecisionDose | NDC 68094-494-59 | |
| Heparin sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | |
| Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| 0.9% Sodium chloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Petrolatum ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine prep pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol prep pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| Fine scissor | FST | 14028-10 | |
| Micro-adson forcep | FST | 11018-12 | |
| Clamp applying forcep | FST | 00072-14 | |
| S&T Vascular clamp | FST | 00396-01 | |
| Spring scissors | FST | 15008-08 | |
| Colibri retractors | FST | 17000-04 | |
| Dumont #5 forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #7 - fine forceps | FST | 11274-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Tish needle holder/forceps | Micrins | MI1540 | |
| Black polyamide monofilament suture, 10-0 | AROSurgical Instruments Corporation | TI638402 | For suturing the graft |
| Black polyamide monofilament suture, 6-0 | AROSurgical Instruments | SN-1956 | For musculature and skin closure |
| Non-woven sponges | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 | |
| 18 G 1.5 in, Needle | BD | 305190 | |
| 25 G 1 in, Needle | BD | 305125 | |
| 30 G 1 in, Needle | BD | 305106 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-700 | |
| Warming pad | Gaymar | TP-22G | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 |
References
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