Summary
Para melhorar o nosso conhecimento da formação neotissue celular e molecular, um modelo murino da TEVG foi recentemente desenvolvida. Os enxertos foram implantados como infra-enxertos na veia cava de interposição em camundongos C57BL / 6. Este modelo consegue resultados semelhantes aos obtidos em nossa investigação clínica, mas ao longo de um curso de tempo muito reduzido.
Abstract
Scaffolds biodegradáveis semeado com células mononucleares da medula óssea (BMCS) são muitas vezes utilizados para a cirurgia reconstrutiva para tratar anomalias cardíacas congênitas. Os resultados clínicos a longo prazo mostrou excelentes taxas de permeabilidade, porém, com significativa incidência de estenose. Para investigar os mecanismos celulares e moleculares da formação neotissue vascular e prevenir o desenvolvimento de estenose em engenharia de tecidos enxertos vasculares (TEVGs), foi desenvolvido um modelo do rato do enxerto com aproximadamente 1 mm de diâmetro interno. Em primeiro lugar, os TEVGs foram montados a partir de andaimes tubulares biodegradáveis fabricadas a partir de um tecido não urdido de ácido poliglicólico sentida malha revestida com ε-caprolactona e L-lactido copolímero. Os suportes foram então colocados num liofilizador, aspirado durante 24 h, e armazenado num excicador até sementeira celular. Em segundo lugar, a medula óssea foi colhida a partir de ratinhos dadores e as células mononucleares foram isoladas por centrifugação em gradiente de densidade. Em terceiro lugar, aproximadamente um milhão de células foramsemeadas num andaime e incubadas O / N. Finalmente, os andaimes sem sementes foram então implantados como infra-enxertos na veia cava de interposição em camundongos C57BL / 6. Os enxertos implantados demonstraram excelente patência (> 90%) sem evidência de complicações tromboembólicas ou formação de aneurisma. Este modelo murino nos ajudará a compreender e quantificar os mecanismos celulares e moleculares da formação neotissue no TEVG.
Introduction
As cardiopatias congênitas são doenças graves que afetam cerca de 8% dos nascidos vivos nos Estados Unidos. Aproximadamente 25% desses recém-nascidos com defeitos cardíacos congênitos ou 2,4 por 1.000 nascidos vivos, necessitam de tratamento invasivo no primeiro ano de sua vida 1. O tratamento mais eficaz para a doença cardíaca congênita é a cirurgia reconstrutiva. Infelizmente, as complicações decorrentes da utilização de condutas vasculares actualmente disponíveis são a causa mais importante de morbidade e mortalidade no pós-operatório.
Para resolver este problema, desenvolvemos os primeiros da engenharia de tecidos enxertos vasculares (TEVGs) para uso clínico 2. TEVGs foram construídos a partir de tubos de poliéster biodegradável semeados com medula óssea autólogo de células derivadas de mononucleares (BM-PTM) e implantados como canais venosos para cirurgia cardíaca congênita. Os resultados mostraram excelentes taxas de permeabilidade em 1-3 anos de follow-up, mas com significativa incidência de estenose
O modelo murino de interposição IVC fielmente recapitulado o processo de formação Neovaso formado que ocorre em animais de grande porte e seres humanos, mas ao longo de um curso de tempo muito mais curto de 6-9. Aqui, um protocolo detalhado para a fabricação de enxerto de pequena escala utilizando matrizes biodegradáveis, foram descritos colheita BM-MNC e isolamento, BM-MNC semeadura no andaime, e implantação de enxerto no modelo murino.
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Protocol
NOTA: Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional Hospital Animal Care e Use do Nationwide Children.
1. Graft Manufacturing
- Tornar a solução ε-caprolactona e L-lactido copolímero P (AL / CL) por adição de 100 mg P (AL / CL) em 2 ml de dioxano sob uma coifa. Colocar a solução em um vórtice e misturar continuamente durante 1-1,5 horas para dissolver completamente.
- Enquanto isso, retire a folha de ácido poliglicólico (PGA) senti do freezer e cortar várias seções 5 x 8 mm. Também cortou a ponta de uma pipeta mL 0,1-10 logo acima do filtro.
- Inserir uma agulha 19 G (1,5 comprimento) na extremidade distal de uma ponta de pipeta e enrole o PGA sentiu ao redor da agulha usando micro fórceps.
- Cuidadosamente empurre o feltro para a extremidade distal da ponta de pipeta, em que o lúmen é mais reto do que a parte proximal, usando uma agulha 18 G romba, enquanto a agulha G 19, é inserida no mesmo.
- PipetaSolução de 40 ul de P (CL / LA) para a ponta da pipeta a partir do topo. Saturar o PGA sentida com a solução. Em seguida, empurre as bolhas de ar, utilizando um dispensador de pipeta. Repita esse processo, se necessário.
- Colocar enxertos em um tubo de 50 ml e colocá-lo em um congelador a -80 ° C durante 20 min. Certifique-se que a cabeça das agulhas voltada para baixo.
- Transferir o tubo para um liofilizador e vácuo durante 24 horas. Certifique-se de abrir a tampa do tubo de ter fluxo de ar.
- Retire os enxertos e removê-los das agulhas. Cortar ambas as extremidades do enxerto deixando uma secção de ~ 5 mm e colocá-los de volta para as agulhas para manter a sua forma. Manter os enxertos num exsicador.
- Coloque o andaime sob luz UV em um biossegurança capô O / N antes da semeadura de células.
2. Medula Óssea Mononuclear colheita de células e isolamento
- Eutanásia os ratos com uma sobredosagem de cetamina / xilazina (cetamina 200 mg / kg e xilazina, 20 mg / kg).
- Retire os ossos (fêmur umd tíbias) a partir de 3 camundongos por 10 implantações de enxerto e coloque em uma placa de Petri com 10 cc RPMI. Corte ambas as extremidades dos ossos e da medula óssea nivelada, utilizando uma seringa com uma agulha de 25 G em uma nova placa de Petri com 3 cc RPMI. Recolha de medula óssea e solução de RPMI em um tubo de 15 cc e lava-se a placa de Petri com meio RPMI de 2 cc adicionais para recolher o remanescente da BM.
- Tome amostra (5-10 mL) e contagem de células utilizando um contador de células automatizado ou hemocitômetro. Anote o resultado.
- Colocar 5 ml de Ficoll em um tubo de centrífuga de 15 cc e adicionar medula óssea e solução de RPMI. Adicionar a solução muito cuidadosamente para evitar que a mistura com Ficoll.
- Centrifugar a 528 xg por 30 minutos com "NO FREIO" a 24 ° C.
- Retire a camada rosa superior. Recolhe-se o meio clara camada Figura 1, que é a camada de EMN, e diluir com PBS 01:01.
- Centrifugar a solução diluída de MNC a 528 xg durante 10 min a 24 ° C.
- Remover o sobrenadante e dilute a pelota com 5 ml de PBS.
- Centrifugar a solução do agregado a 528 xg durante 10 min a 24 ° C.
- Remover o sobrenadante. Diluir o sedimento com o volume apropriado de meio RPMI (~ 200 mL).
- Tomar uma amostra mL 5-10 e contagem de células utilizando um contador de células automatizado ou hemocitômetro. Anote o resultado. Repetir a contagem de células mais uma vez e calcular o número médio de célula.
- Dilui-se a concentração das células para um milhão células/10 ul usando RPMI.
3. Sementeira celular
- Andaime Prewet pela adição de 5 mL RPMI luminally por 5 min, em seguida, retire RPMI.
- Adicionar 10 mL de medula óssea derivados mono células nucleares em RPMI a partir do Passo 2,12 a lúmen andaime e aguarde 10 minutos para permitir que as células para anexar para o cadafalso.
- Cortar uma agulha 19 G 1 cm de comprimento e colocar a agulha para dentro do lúmen do andaime para manter a forma do andaime. Coloque a amostra em uma placa de 24 poços. </ Li>
- Adicionar 1000 mL de RPMI a cada poço e incubar S / N na incubadora.
4. Graft Implantation
- Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia: 1x tesoura fina, micro fórceps 3x, pinças vasculares micro 2x, braçadeira 1x fórceps de aplicação, suporte da agulha micro 1x, tesoura primavera 1x, 1x afastador.
- 6-8 semanas de idade do sexo feminino C57BL / 6 são usados como engenharia de tecidos receptores de enxertos vasculares. Remover o rato da sua gaiola e pesá-lo, em seguida, através de anestesiar uma injecção intraperitoneal no quadrante inferior direito do abdómen com um cocktail de cetamina / xilazina (cetamina 100 mg / kg e xilazina, 10 mg / kg). O cetoprofeno (5 mg / kg, IP) é usado como um analgésico de pré-anestesia.
- Verifique o nível de sedação por beliscar conto, em seguida, prenda o cabelo abdominal. Lubrifique os olhos com pomada oftálmica estéril, e coloque o mouse em uma posição de decúbito dorsal sobre uma almofada. Desinfetar o abdômen com Betadine e álcool pads. CoVer o mouse com um campo estéril e expor apenas a área da incisão.
- Faça uma laparotomia mediana incisão abaixo do xifóide até a região suprapúbica, e inserir um afastador auto-retenção. Enrole os intestinos em salina umedecido gaze. Sem rodeios definir a aorta infra-renal e veia cava.
- Coloque duas pinças vasculares micro em ambos os lados proximal e distal da aorta ea veia cava, em seguida, sem rodeios separar a aorta da veia cava Transecto veia cava. Se necessário, ligadura dos ramos da aorta abdominal com 10-0 suturas monofilamento as agulhas cônicos.
- Implantar uma veia cava inferior, com interposição de enxerto extremidade proximal e distal à anastomose de acabar usando uma estéril 10-0 sutura. Apare o enxerto, geralmente 1-2 mm, dependendo da anatomia do mouse. Fixar o enxerto com um ponto em ambas extremidades proximais e distais e iniciar a sutura contínua com 4-5 stiches do outro lado do enxerto. Depois de terminar a parte da frente, vire as braçadeiras e enxertospara o outro lado e suturar o lado de trás do enxerto. Durante a implantação, lave o enxerto com solução de heparina com frequência para prevenir a trombose aguda.
- Retirar a braçadeira proximal e controlar a hemorragia através da aplicação de um agente hemostático estéril absorvível tópica. Quando a hemorragia parar completamente, retirar a pinça distai e controlar a hemorragia da mesma maneira. Faça fluxos sanguíneos certeza através do enxerto.
- Feche a musculatura abdominal e pele em duas camadas usando uma sutura de monofilamento 6-0 poliamida preto com agulha rosqueada incluído.
- Injetar 0,5 ml por via subcutânea de solução salina e coloque o rato em uma gaiola de recuperação em um bloco de aquecimento até que o mouse é totalmente móvel. Após a recuperação, o retorno do mouse para uma nova gaiola com roupa de cama de papel. Dar medicação para dor (Ibuprofeno, 30 mg / kg, a água potável) para 48 horas.
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Representative Results
Um esquema de implantação TEVG é mostrado na Figura 1. Medula óssea foi colhida a partir de um rato dador e células mono nucleares foram isolados usando centrifugação de densidade e em seguida semeadas num andaime biodegradável. Os andaimes semeados foram incubados O / N e implantado a um mouse destinatário como uma veia cava inferior interposição de enxerto.
A figura 2 ilustra a microscopia eletrônica de varredura da PGA-P (CL / LA) andaime. O diâmetro interno é de aproximadamente 1 mm e a espessura da parede era cerca de 0,17 milímetros. A porosidade total foi de 78,5% ea média de tamanho de poros foram 45,4 ± 17,6 mM.
A imagem bruta de um TEVG interposta para a VCI de ratinhos C57BL / 6 é mostrada na Figura 3. Logo após a implantação (A) e 2 semanas após a implantação (B). (C) mostra a imagem bruta de um VCI nativa em comparação. É evidente queenxerto foi preenchido com neotissue, no entanto, que ainda manteve a forma do enxerto inicial. Nosso resultado anterior mostrou que a degradação total do enxerto leva até 12 semanas 10.
A imagem de ultra-som Doppler B-mode e cor de uma duas semanas implantados TEVG Figuras 4A-B para mostrar a patência dos enxertos implantados. Uma imagem da VCI nativa foi adicionado para comparação (Figura 4, C). Semeadura celular melhorou a permeabilidade do enxerto significativamente, patencies após 2 semanas para enxertos unseeded e sem sementes são 65% e 91%, respectivamente (p <0,05, teste exato de Fisher).
A Figura 5 mostra a infiltração celular e a deposição de matriz extracelular em TEVG após 2 semanas de implantação. Enxertos explantados corados com H & E coloração mostrou formação neotissue todo o enxerto e restos de material de andaime (A). Harts e tricrômico de Masson mostraram deposição de elastina na emcamada Timal (B) e de colágeno na camada média (C). Revestimento de células endoteliais foi observada ao longo da camada da íntima (D) e confluentes de células de músculo liso estava presente em todo o TEVG, especialmente inferior a CE forro (E), como mostrado por coloração com CD31 e αSMA, respectivamente. Na segunda semana após a implantação, a infiltração de macrófagos era evidente, conforme indicado com a coloração F4/80 (F).
Figura 1. Esquema de implantação TEVG. Células nucleares mono de medula óssea foram colhidas a partir de um camundongo doador, semeados em um andaime biodegradável, e em seguida implantado como uma interposição de enxerto IVC a um rato destinatário.
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Imagens de microscopia eletrônica Figura 2. Digitalização de um andaime. O diâmetro externo médio foi de 1,45 mm, diâmetro luminal foi de 1,1 mm, e comprimento é de 3 mm.
Figura 3. Implantado TEVG após 2 semanas e VCI nativa. A) Imediatamente após a implantação, B) 2 semanas após a implantação, e C) CIV nativo para comparação.
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Figura 4. Imagens de ultra-som de 2 semanas e IVC nativa. A) imagem B-Mode e B) com Doppler colorido de TEVG após 2 semanas. C) Native IVC para comparação.
Figura 5. Imagens representativas dos 2 semanas após TEVG operatório. A) H & E (lúmen interno), B) Harts (rosa = elastina), tricrômico C) do Massion (azul = colágeno), D) CD31 (marrom = células endoteliais), E) αSMA (marrom = células musculares lisas) e F ) F4/80 (marrom = macrófagos).
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Discussion
O modelo de rato de TEVG é uma ferramenta valiosa para estudar os mecanismos celulares e moleculares da formação neotissue e o desenvolvimento de estenose. O semeado BM-MNC foi mostrado em ambas as imagens histológicas e SEM das células semeadas sobre o enxerto 11. Eficiência sementeira celular também foi demonstrado utilizando um ensaio de ADN 7. Utilizando este sistema modelo, mostrou que a sementeira de células, reduz a incidência do desenvolvimento de estenose TEVG, que foi o modo principal de falha em nosso ensaio clínico humano 3. As células semeadas desapareceu rapidamente da TEVG, sugerindo que eles exercem o seu efeito através de um mecanismo parácrino 8,12. Mostrou-se também que a formação de Neovaso formado é um processo regenerativo imune-mediada, e que o Neovaso formado surge de crescimento interno das células vasculares (CE e SMC) da parede do vaso vizinha ao longo da superfície luminal do andaime. Além disso, a infiltração de macrófagos normais é essencial para a formação neotissue vascularmas quando este processo é excessiva que leva ao desenvolvimento de estenose TEVG 7,8. Estes resultados mostram a relevância desse modelo de rato à doença humana. As técnicas microcirúrgicas pode ser adaptado para outras aplicações vasculares incluindo enxertos arteriais 13 e a artéria venosas.
Operamos mais de 1.000 IVC implantações de enxerto de interposição de cada ano ea taxa de mortalidade é inferior a 1%. Para uma implantação bem-sucedida do enxerto, há vários pontos importantes a mencionar.
Em primeiro lugar, a anestesia injetável é o preferido para esta operação, porque é necessário para ligar o mouse várias vezes durante a anastomose. O efeito de anestesia geralmente dura cerca de uma hora e durante todo o tempo da cirurgia para um cirurgião micro especialistas é de aproximadamente 30-45 min, o que proporciona um tempo suficiente para completar a cirurgia. Se o animal acorda durante a cirurgia, ,05-0,1 ml de um cocktail anestesia pode ser injetado intramuscularcularmente.
Em segundo lugar, a maioria dos pequenos ramos da aorta necessário para ser ligado a evitar perda excessiva de sangue durante a separação da VCI e da aorta a partir da zona abdominal. Também tenha em mente para não ferir o IVC quando é separada da aorta.
Em terceiro lugar, quando o enxerto é suturado, os dois primeiros suturas em ambos os lados são as etapas mais importantes de todo o processo. Quando eles não são colocados com cuidado, é difícil separar as camadas da frente e de trás do IVC. Se as camadas não estão claramente identificados, há uma maior chance de suturar acidentalmente juntos. Enquanto sutura do IVC para o enxerto, é importante para não mais esticar o IVC, o que pode causar lacrimejamento. Também certifique-se de não cortar demais IVC para substituir o mesmo comprimento do enxerto. Normalmente, cerca de 1 a 2 mm de VCI foi removido para substituir um 3 a 5 mm de enxerto devido à tensão longitudinal do IVC. Se o mesmo comprimento do IVC é removido, faz anastomosemosis extremamente desafiador.
Em quarto lugar, há pressão significativa para esticar as variações no que diz respeito à formação e desenvolvimento TEVG estenose. Por exemplo, não semeado C57BL / 6 (tipo selvagem) mostrou uma taxa muito mais elevada do que a estenose de SCID / bg ratinhos (ratinhos imunodeficientes) 8,12. Além disso, com a nossa experiência, ratinhos SCID / bg são muito mais fáceis de operar em comparação com os ratinhos C57BL / 6, devido à sua rígida parede da VCI 14. Tenha isso em mente quando estiver operando em uma nova linhagem de camundongos.
A fabricação do enxerto, BM-MNC colheita e processos de semeadura de células são para a frente, há apenas um par de processos para estar cientes. Em primeiro lugar, para a fabricação do enxerto, é muito importante não 'bando' o feltro enquanto empurrá-lo usando a agulha romba 18 G. Tentámos métodos diferentes para empurrar o feltro até a extremidade distai das pontas de pipeta. Empurrando o enxerto com uma agulha sem corte apresentou o melhor resultado, de longe. O interiordiâmetro da agulha romba é ligeiramente maior do que o diâmetro exterior da agulha que o feltro está enrolado. Portanto, a agulha inferior pode perfeitamente deslizar para dentro da agulha romba maior e o feltro pode, posteriormente, ser empurrado para baixo com a mesma quantidade de força de toda a circunferência do feltro, que impede aglomeração do feltro. Nós já observamos que os enxertos agrupados apresentaram menor patência em 2 semanas. Além disso, é essencial para eliminar todas as bolhas porque bolhas vai causar furos na superfície de andaime e o sangue irá escapar-se através do orifício, após o implante. Em segundo lugar, quando os ossos são separados para BM-MNC colheita, certifique-se de limpar o osso, tanto quanto possível, para que não incluem muito músculo ou cabelo. Se necessário, é recomendada a utilização de um filtro de tecido, antes do processo de centrifugação de densidade.
Este modelo de TEVG funcionou bem na circulação venosa, o que é uma baixa pressão e sistema de fluxo elevado. No entanto, na circulação arterial, umsistema de fluxo de alta pressão alta e, observou-se altas taxas de ruptura com enxertos PGA, devido à sua característica de degradação rápida. O que significa que o enxerto perde sua força estrutural antes do neotissue ganha força suficiente para resistir à pressão arterial. Temos usado o ácido polilático (PLA) enxertos anteriormente, mas apresentaram alta prevalência de formação de aneurismas. Também leva mais de 2 anos para se degradar completamente PLA in vivo, o que é mais do que o tempo de vida de camundongos. Para uma futura aplicação em técnicas de fabricação enxerto circulação arterial, por exemplo, um enxerto electrospun está atualmente em desenvolvimento.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado, em parte, por uma concessão do NIH (RO1 HL098228) para CKB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyglycolic acid (PGA) felt | Biomedical Structures | Custome ordered | |
| Pipet tip, 0.1-10 μl | Fisher Sientific | 02-707-456 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7070020 | |
| RPMI medium 1604 | Gibco | 11875-093 | |
| Petri dish | BD | 353003 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 15 cc tube | BD | 352096 | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100ml | Also called 'Histopaque' |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Littauer bone cutter 4.5" Straight | Roboz | RS-8480 | For BM harvesting |
| Forceps 4.5" | Roboz | RS-8120 | For BM harvesting |
| Scissors 4.5" | Roboz | RS-5912 | For BM harvesting |
| Microscope | Leica | M80 | |
| C57BL/6J (H-2b), Female | Jackson Laboratories | 664 | 8-12 weeks |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | |
| Ibuprofen | PrecisionDose | NDC 68094-494-59 | |
| Heparin sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | |
| Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| 0.9% Sodium chloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Petrolatum ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine prep pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol prep pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| Fine scissor | FST | 14028-10 | |
| Micro-adson forcep | FST | 11018-12 | |
| Clamp applying forcep | FST | 00072-14 | |
| S&T Vascular clamp | FST | 00396-01 | |
| Spring scissors | FST | 15008-08 | |
| Colibri retractors | FST | 17000-04 | |
| Dumont #5 forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #7 - fine forceps | FST | 11274-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Tish needle holder/forceps | Micrins | MI1540 | |
| Black polyamide monofilament suture, 10-0 | AROSurgical Instruments Corporation | TI638402 | For suturing the graft |
| Black polyamide monofilament suture, 6-0 | AROSurgical Instruments | SN-1956 | For musculature and skin closure |
| Non-woven sponges | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 | |
| 18 G 1.5 in, Needle | BD | 305190 | |
| 25 G 1 in, Needle | BD | 305125 | |
| 30 G 1 in, Needle | BD | 305106 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-700 | |
| Warming pad | Gaymar | TP-22G | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 |
References
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