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Neuroscience

Luciferase गतिविधि के माध्यम से रिसेप्टर सक्रियण के मापन: स्तनधारी घ्राण रिसेप्टर्स की उच्च throughput विश्लेषण

Published: June 2, 2014 doi: 10.3791/51640
Automatic Translation
1, 1, 1
1Monell Chemical Senses Center

Summary

घ्राण रिसेप्टर सक्रियण पैटर्न गंध पहचान सांकेतिक शब्दों में बदलना, लेकिन स्तनधारी घ्राण रिसेप्टर्स के लिए odorant ligands पहचान प्रकाशित डेटा की कमी गंध कोडिंग के लिए एक व्यापक मॉडल के विकास hinders. इस प्रोटोकॉल घ्राण रिसेप्टर ligands और रिसेप्टर सक्रियण की मात्रा का ठहराव के उच्च throughput पहचान की सुविधा के लिए एक विधि का वर्णन करता है.

Abstract

Odorants लगभग 1,000 murine और 400 मानव रिसेप्टर्स के एक परिवार odorants के हजारों पहचान करने के लिए अनुमति देता है, घ्राण रिसेप्टर सक्रियण की अनोखी और अतिव्यापी पैटर्न बना. Odorant ligands मानव रिसेप्टर्स 1-11 के कम से कम 6% के लिए प्रकाशित किया गया है. आंकड़ों के इस अभाव के हिस्से में कार्यात्मक heterologous सिस्टम में इन रिसेप्टर्स व्यक्त कठिनाइयों की वजह से है. यहाँ, हम एक luciferase संवाददाता परख का उपयोग घ्राण रिसेप्टर सक्रियण के उच्च throughput मूल्यांकन द्वारा पीछा Hana3A कोशिकाओं में घ्राण रिसेप्टर परिवार के बहुमत व्यक्त करने के लिए एक विधि का वर्णन. यह परख घ्राण रिसेप्टर्स के पैनल के खिलाफ odorants की (1) स्क्रीन पैनल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; (2) खुराक प्रतिक्रिया घटता के माध्यम से odorant / रिसेप्टर बातचीत की पुष्टि; और (3) रिसेप्टर वेरिएंट के बीच रिसेप्टर सक्रियण के स्तर की तुलना करें. हमारे नमूना डेटा में, 328 घ्राण रिसेप्टर्स 26 odorants के खिलाफ जांच की गई. अलग प्रतिक्रिया स्कोर के साथ odorant / रिसेप्टर जोड़े selec थेटेड और खुराक प्रतिक्रिया में परीक्षण किया गया. ये आंकड़े एक स्क्रीन, एक odorant के लिए एक वास्तविक संपत्ति प्रतिक्रिया है कि यानी रिसेप्टर्स एक खुराक प्रतिक्रिया प्रयोग समाप्त हो जाएगी कि odorant / रिसेप्टर जोड़े के लिए समृद्ध करने के लिए एक प्रभावी तरीका है कि संकेत मिलता है. इसलिए, यह उच्च throughput luciferase परख स्तनधारी घ्राण प्रणाली में गंध कोडिंग के एक मॉडल की ओर घ्राण रिसेप्टर्स-एक आवश्यक कदम चिह्नित करने के लिए एक प्रभावी तरीका है.

Introduction

स्तनधारी घ्राण प्रणाली का पता लगाने और odorants के हजारों के भेदभाव के लिए अनुमति देता है, सुगंधित उत्तेजनाओं की एक बड़ी संख्या के लिए प्रतिक्रिया करने की क्षमता है. घ्राण रिसेप्टर्स (ओआरएस) घ्राण उपकला 12 में घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स द्वारा व्यक्त की आणविक सेंसर कर रहे हैं. स्तनधारी गंध मान्यता odorants द्वारा अन्य रैंकों के अंतर सक्रियण के माध्यम से होता है, और या जीन परिवार मोटे तौर पर 1,000 murine और 400 मानव रिसेप्टर्स 12-16 से, व्यापक है. घ्राण न्यूरॉन्स में और heterologous कोशिकाओं में अन्य रैंकों के पिछले कार्यात्मक विश्लेषण अलग odorants अनूठा द्वारा मान्यता प्राप्त कर रहे हैं दिखाया, लेकिन अन्य रैंकों 10,17-20 ensembles में ओवरलैपिंग है. अन्य रैंकों को ligands मिलान घ्राण कोड और गंध की व्यवहार्य मॉडल के निर्माण के लिए आवश्यक समझने के लिए महत्वपूर्ण है. कारण odorants और अन्य रैंकों दोनों की बड़ी संख्या के साथ ही heterologous सिस्टम में अन्य रैंकों व्यक्त कठिनाइयों को, इस डेटा एफ से काफी हद तक अनुपस्थित कर दिया गया हैield; दरअसल, मानव अन्य रैंकों के कम से कम 6% एक प्रकाशित ligand 1-11 है. इस प्रोटोकॉल odorant / या बातचीत करने के लिए चिह्नित एक luciferase परख के उपयोग का वर्णन करता है. यह परख अन्य रैंकों के उच्च throughput लक्षण, odorant / या बातचीत को समझने के साथ ही गंध कोडिंग का एक मॉडल विकसित करने के लिए आवश्यक है कि किसी कार्य के लिए सक्षम बनाता है.

अन्य रैंकों के उच्च throughput पढ़ाई तीन प्रमुख चुनौतियों का सामना करते हैं. सबसे पहले, heterologous कोशिकाओं में व्यक्त अन्य रैंकों ईआर में बनाए रखा गया और बाद में परख प्रणाली 23-25 ​​में odorants के साथ बातचीत से अन्य रैंकों को रोकने, एंटीबॉडी 21,22 में अपमानित. यह समस्या अन्य रैंकों 19,26,27 के एक विस्तृत रेंज के स्थिर सेल सतह अभिव्यक्ति की सुविधा है कि गौण प्रोटीन की खोज ने भी संबोधित किया. रिसेप्टर ट्रांसपोर्टर प्रोटीन 1 और 2 (RTP1 और 2) को बढ़ावा देने या odorant उत्तेजना 19 के जवाब में सेल सतह अभिव्यक्ति और सक्रियण. इस काम के आधार पर, HEK293T कोशिकाओं थेstably Hana3A सेल लाइन 19,27, जिसके परिणामस्वरूप RTP1 लंबी (RTP1L) और RTP2, रिसेप्टर अभिव्यक्ति बढ़ाने प्रोटीन 1, और जी αolf व्यक्त करने के लिए संशोधित. इसके अलावा, 3 प्रकार मुस्कारिनिक acetylcholine रिसेप्टर (एम 3-R) कोशिका की सतह पर अन्य रैंकों के साथ सूचना का आदान प्रदान और odorants 26 के जवाब में सक्रियण को बढ़ाता है. कोशिका की सतह 27 अन्य रैंकों के एक विस्तृत रेंज के मजबूत, संगत, और कार्यात्मक अभिव्यक्ति में Hana3A कोशिकाओं के परिणाम में RTP1S और एम 3-R के साथ एक या सह अभिकर्मक. दूसरा, स्तनधारी या repertoires काफी बड़े हैं. मनुष्यों में, उदाहरण के लिए, या प्रदर्शनों की सूची स्वाद रिसेप्टर प्रदर्शनों की सूची से अधिक कई परिमाण के एक आदेश है, और दृश्य रिसेप्टर प्रदर्शनों की सूची से अधिक कई परिमाण के 2 आदेश. एक एकल क्लोनिंग या एक अपेक्षाकृत सरल प्रोटोकॉल है, महत्वपूर्ण अप सामने प्रयास एक व्यापक पुस्तकालय उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है. हम दृष्टि में पता चला है कि हालांकि तीसरा, तरंगदैर्ध्य रंग में तब्दील हो औरऑडिशन आवृत्ति पिच में तब्दील में, odors के संगठन खराब यह मुश्किल शोधकर्ताओं odorants का एक प्रतिनिधि नमूने से बैठाना के लिए बना समझा जाता है. कुछ प्रगति इस मोर्चे 10,28 पर बना दिया गया है, घ्राण परिदृश्य का नक्शा अधूरा रहता है. अन्य रैंकों के सैकड़ों के खिलाफ दसियों अणुओं के हजारों की स्क्रीनिंग के लिए एक चुनौतीपूर्ण काम है; इस क्षेत्र में उच्च throughput स्क्रीन ध्यान से परिभाषित अभियान की आवश्यकता है. प्रमुख शेष चुनौतियों बल्कि तकनीक के लिए निहित समस्याओं से रसद और लागत के हैं. Heterologous स्क्रीनिंग व्यापक रूप से शैक्षणिक समूहों द्वारा ligands की पहचान करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया है, एक निजी कंपनी 100 मानव अन्य रैंकों 29 के लिए ligands की पहचान करने के लिए एक ही तकनीक का इस्तेमाल किया गया है. दुर्भाग्य से, इन आंकड़ों मालिकाना रहते हैं.

यहाँ रेखांकित उच्च throughput luciferase परख का आकलन या सक्रियण के लिए इस्तेमाल वैकल्पिक तरीकों पर कई फायदे हैं. हालांकि जिम्मेदारीदेशी घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स के सत्र इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग मापा गया है, इन तकनीकों कठिनाई की वजह से घ्राण न्यूरॉन्स के लिए प्रतिक्रिया गुणों में ओवरलैप करने के लिए एक न्यूरॉन की प्रतिक्रिया की ओर जाता है जो या अलग चिढ़ा है. , एक GFP लेबल रिसेप्टर टाइप 30,31 में दस्तक 32,33 घ्राण न्यूरॉन्स murine को adenovirus के माध्यम से विशिष्ट रिसेप्टर्स पहुंचाने, या 17,24,33 एक रिसेप्टर प्रकार के लिए रिकॉर्डिंग लिंक कर सकते हैं रिकॉर्डिंग के बाद RT-पीसीआर प्रदर्शन, इन तरीकों यद्यपि कम throughput और बड़े पैमाने पर स्क्रीन के लिए उपयुक्त नहीं. Heterologous स्क्रीनिंग सिस्टम अधिक स्केलेबल होते हैं, और दो प्रमुख रूपों साहित्य में पाए जाते हैं: शिविर मार्ग पत्रकारों और inositol triphosphate (IP3) मार्ग संवाददाताओं से. गंध उत्तेजना पर, अन्य रैंकों चक्रीय एएमपी (शिविर) 12 के उत्पादन में यह परिणाम है कि एक जी αolf पारगमन झरना संकेत को सक्रिय करें. एसी के नियंत्रण में एक जुगनू luciferase संवाददाता जीन सह transfecting द्वाराएएमपी प्रतिक्रिया तत्व (रचनात्मक), luciferase उत्पादन की मात्रा का ठहराव या सक्रियण के लिए अनुमति देता है, गंध प्रतिक्रिया के एक समारोह के रूप में मापा जा सकता है. या सक्रियण भी ऐसे जी α15/16 या एक जी α15-OLF कल्पना 24,25,34 के रूप में जी प्रोटीन सह व्यक्त की IP3 मार्ग से जोड़ा जा सकता है. हम तीन कारकों के आधार पर यहाँ प्रस्तुत परख चुना है: रो टैग घ्राण रिसेप्टर्स के साथ RTP1 (1) के सह अभिव्यक्ति कोशिका की सतह 19,27 पर घ्राण रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति में सुधार; (2) एक शिविर उत्तरदायी रिपोर्टर जीन के उपयोग की माप या विहित दूसरा दूत मार्ग के माध्यम से सक्रियण के लिए अनुमति देता है; और (3) परख उच्च throughput स्क्रीन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है.

इस उच्च throughput luciferase परख महक के क्षेत्र में बहुमूल्य अध्ययन की एक किस्म के लिए लागू है. सबसे पहले, अन्य रैंकों की एक बड़ी संख्या में एक सपा के लिए रिसेप्टर सक्रियण पैटर्न निर्धारित करने के लिए एक एकल odorant के खिलाफ जांच की जा सकतीecific odorant. अध्ययन के इस प्रकार स्टेरॉयड odorant androstenone 8 का जवाब देने के लिए या जिम्मेदार के रूप में OR7D4 की पहचान की. इसके विपरीत, एक या रिसेप्टर प्रतिक्रिया प्रोफाइल 10 निर्धारित करने के क्रम में odorants के एक पैनल के खिलाफ जांच की जा सकती है. उम्मीदवार घ्राण odorant / या जोड़ों इन स्क्रीन के माध्यम से पहचाने जाते हैं, बातचीत odorant की बढ़ती सांद्रता के लिए या की प्रतिक्रिया की जांच एक खुराक प्रतिक्रिया प्रयोग का आयोजन से इसकी पुष्टि की जा सकती है. खुराक प्रतिक्रिया घटता भी एक या में आनुवंशिक परिवर्तन विट्रो odorant प्रतिक्रिया 8,9,11,35 में कैसे प्रभावित करता आकलन कर सकते हैं, और इन अध्ययनों विकास में प्रजातियों और कारण म्यूटेशन भर रिसेप्टर विकास की परीक्षा के लिए अनुमति देता है, जैसा या परिवर्तन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है 36,37, अंत में, इस परख विरोध करने में सक्षम या एक ज्ञात odorant / रिसेप्टर जोड़ी 38,39 के लिए एक विशेष odorant के जवाब हैं कि गंध विरोधी लिए स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. संक्षेप में, यह उच्चथ्रूपुट luciferase परख विशेषताएँ मदद या सक्रियण पैटर्न और घ्राण प्रणाली में गंध कोडिंग की एक बेहतर समझ प्रदान करेगा कि अध्ययन की एक श्रृंखला के लिए लागू है.

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Protocol

Hana3A प्रकोष्ठों के 1. संस्कृति

  1. 10% (v / v) FBS के साथ न्यूनतम आवश्यक मध्यम (सदस्य) सप्लीमेंट द्वारा M10 मीडिया तैयार करें.
  2. संस्कृति रखरखाव
    1. M10 मीडिया में कोशिकाओं को बनाए रखें. नोट: RTP1L, RTP2, REEP1, और जी के लिए अभिव्यक्ति वैक्टर Hana3A कोशिकाओं को puromycin प्रतिरोध प्रदान αolf, लेकिन इस एंटीबायोटिक के साथ कोशिकाओं को बनाए रखने में काफी परख परिणामों को प्रभावित नहीं करता है.
    2. 01:08 10 में सेमी व्यंजन हर 2-3 दिनों के अनुपात में उपसंस्कृति.
    3. 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.

अभिकर्मक के लिए 2. चढ़ाना कोशिकाओं

  1. Hana3A कोशिकाओं की एक 100% मिला हुआ 10 सेमी पकवान से महाप्राण मीडिया.
  2. , 10 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ने पकवान घूमता, और पीबीएस aspirating द्वारा कोशिकाओं को धो लें.
  3. 0.05% trypsin / EDTA के 3 मिलीलीटर जोड़ें और कोशिकाओं (लगभग 1 मिनट) को अलग कर देना करने के लिए इंतजार.
  4. 5 एमएल M10 जोड़कर trypsin निष्क्रिय और मोटे तौर पर 10x और triturating द्वारा सेल clumps को तोड़ने# 160; एक 10 मिलीलीटर विंदुक के साथ. पिपेट ध्यान से मीडिया में हवाई बुलबुले शुरू करने से बचने के लिए.
  5. प्रत्येक 96 अच्छी तरह से थाली, एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब, 5 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र में स्थानांतरण की कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर, और सेल गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला aspirate लिए.
  6. 2.5 कदम में हस्तांतरित कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर प्रति 6 मिलीग्राम M10 में कोशिकाओं Resuspend.
  7. पिपेट एक 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से कोशिकाओं के 50 μl और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं.

घ्राण रिसेप्टर्स की 3. अभिकर्मक

  1. प्लास्मिड डीएनए की तैयारी
    1. एक endotoxin मुक्त प्रोटोकॉल के माध्यम से प्लास्मिड डीएनए तैयार करें. नोट: उपयोग प्लास्मिड डीएनए तैयारी किट नामित "endotoxin मुक्त," या प्लास्मिड डीएनए तैयारी प्रोटोकॉल के लिए एक phenol के क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण कदम जोड़ें.
    2. ते बफर में 100 एनजी / μl के एक एकाग्रता के डीएनए पतला.
  2. Approxima के एक उचित confluency सुनिश्चित करने के लिए चढ़ाया कोशिकाओं (चरण 2.7) का निरीक्षणtely 30-50 प्रति अच्छी तरह से% और इनक्यूबेटर पर लौटें. नोट: इस confluency लिपिड अभिकर्मक अभिकर्मक के लिए इष्टतम नहीं है, इस चरण में 30-50% की एक confluency अभिकर्मक के बाद luciferase गतिविधि 24 घंटा मापने के लिए इष्टतम है.
  3. अभिकर्मक मिश्रण की तैयारी
    1. प्लास्मिड मिश्रण बनाने के लिए 1 टेबल में विस्तृत मात्रा में प्रति सदस्य मध्यम में पिपेट RTP1S-PCI, एम 3-R-PCI, PCRE ल्यूक, और pSV40-आरएल plasmids (संकेत मात्रा में 96 अच्छी तरह से थाली प्रति) कर रहे हैं. RTP1S-PCI
      प्लास्मिड मिश्रण
      अच्छी तरह से प्रति 96 अच्छी तरह से थाली प्रति
      सदस्य - 500 μl
      5 एनजी 480 एनजी
      एम 3-R-PCI 2.5 एनजी 240 एनजी
      PCRE ल्यूक 10 एनजी 960 एनजी
      pSV40-आरएल 5 एनजी 480 एनजी

      तालिका 1. प्लास्मिड मिश्रण घटकों. प्रति अच्छी तरह से और RTP1S-PCI, एम 3-R-PCI, PCRE ल्यूक, और pSV40-आर एल, और सदस्य के 96 अच्छी तरह से थाली संस्करणों प्रति.
    2. प्रत्येक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए, 450 μl सदस्य माध्यम में 18 μl लिपिड अभिकर्मक अभिकर्मक पतला.
    3. पिपेट प्लास्मिड मिश्रण (चरण 3.3.1 से), PCI प्लाज्मिड (रो या पीसीआई) में rhodopsin टैग घ्राण रिसेप्टर, और परिसर में विस्तृत बनाने के लिए (चरण 3.3.2 से) लिपिड अभिकर्मक मिश्रण तालिका 2 के अनुसार M10 जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो. नोट: इस प्रतिक्रिया समय के प्रति संवेदनशील है और अधिक से अधिक 30 मिनट के लिए जारी रखने के लिए अनुमति नहीं दी जानी चाहिए. अच्छी तरह + 10% गणना बाद के चरणों के लिए पर्याप्त मात्रा सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है. लिपिड अभिकर्मक मिश्रण
      जटिल
      अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह + 10% प्रति
      प्लास्मिड मिश्रण 4.2 μl 4.58 μl
      रो या PCI 0.05 एनजी 0.06 एनजी
      4.2 μl 4.58 μl
      M10 41.7 μl 45.83 μl

      तालिका 2. जटिल घटकों. प्रति अच्छी तरह से और प्लाज्मिड मिश्रण (1 टेबल) की अच्छी तरह से + 10% मात्रा में प्रति, घ्राण रिसेप्टर प्लाज्मिड (रो या पीसीआई), और लिपिड अभिकर्मक मिश्रण. M10 कमरे के तापमान पर एक 15 मिनट ऊष्मायन के बाद प्रतिक्रिया बुझाने के लिए कहा है.
  1. सेल प्लेटों पर मीडिया बाहर नल.
  2. पिपेट 50 अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए जटिल के μl और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं.

4. गंध उत्तेजना

  1. अच्छी तरह से प्रति 50-80% की एक उचित confluency सुनिश्चित करने और इनक्यूबेटर पर लौटने के लिए ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं का पालन. नोट: कोशिकाओं को कम से कम 50 कर रहे हैं% मिला हुआ, जुगनू luciferase और Renilla luciferase रीडिंग रिसेप्टर सक्रियण की माप के लिए भी कम हो सकता है. थाली छोड़ना सम्मिलित करता है.
  2. DMSO में प्रत्येक गंध के 1 एम स्टॉक समाधान तैयार करें.
  3. CD293 माध्यम में गंध उत्तेजना समाधान तैयार करें.
    1. स्क्रीनिंग प्रयोगों के लिए, 100 माइक्रोन के लिए गंध के शेयर समाधान पतला. इसके अलावा (केवल CD293) या पृष्ठभूमि सक्रियण के लिए नियंत्रित करने के क्रम में एक नहीं, गंध नियंत्रण तैयार करते हैं. नोट: स्क्रीनिंग प्रयोगों के लिए, प्रत्येक या / गंध जोड़ी केवल प्रयोग के प्रति एक बार परीक्षण किया है. वेल्स में कुछ गंध प्रसार संभव है, क्योंकि यह एक थाली के लिए एक odorant साथ प्रोत्साहित करने के लिए सिफारिश की है.
    2. खुराक प्रतिक्रिया प्रयोगों के लिए, तीन प्रतियों प्रत्येक रिसेप्टर के लिए 1 मिमी पर शुरू में गंध शेयर समाधान के सात से 10 गुना धारावाहिक dilutions तैयार करते हैं. इसके अलावा गंध पृष्ठभूमि सक्रियण के लिए नियंत्रित करने के क्रम में खाली वेक्टर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के लिए तीन प्रतियों में एक ही गंध dilutions तैयार करते हैं. नोट: खुराक प्रतिक्रिया प्रयोगों के लिए, प्रत्येक ओदोर एकाग्रता उपचार तीन प्रतियों में आयोजित किया जाना चाहिए.
  4. सेल प्लेटों पर मीडिया बाहर नल.
  5. पिपेट 25 अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए गंध उत्तेजना समाधान के μl और 4 घंटे के लिए सेते हैं.

Luciferase परख के माध्यम से 5. मापने या गतिविधि

  1. -80 डिग्री सेल्सियस पर निर्माता के निर्देशों और दुकान प्रति Resuspend जुगनू luciferase सब्सट्रेट
  2. 96 अच्छी तरह से थाली प्रति जुगनू luciferase सब्सट्रेट के 1 मिलीलीटर पिघलना.
  3. पेय ताजा जुगनू luciferase प्रतिक्रिया को तैयार है और Renilla luciferase सब्सट्रेट अभिकर्मक (बफर के 1 मिलीलीटर प्रति 5 μl luciferase पेय / Renilla luciferase सब्सट्रेट). नोट: अभिकर्मक के लगभग 1 एमएल 96 अच्छी तरह से थाली प्रति की जरूरत है.
  4. Luminescent microplate रीडर तैयार करें. Microplate रीडर सॉफ्टवेयर खोलें. सिस्टम चिह्न के भीतर:
    1. "पूर्व हीटिंग" टैब के अंतर्गत, "पर" के लिए चेक बॉक्स और 25 डिग्री करने के लिए मशीन का तापमान सेट, सी.
    2. "औषधि" टैब के तहत, 70% इथेनॉल के 1,000 μl के साथ प्रधानमंत्री प्रत्येक औषधि आसुत जल से 1,000 μl द्वारा पीछा किया. नोट: प्रत्येक निकालने की मशीन के लिए शराब और पानी की अलग aliquots का प्रयोग करें. इथेनॉल dispensers कीटाणुरहित किया, और पानी अवशिष्ट इथेनॉल को हटा रहा है.
    3. प्रधानमंत्री हवा की 1,500 μl के साथ प्रत्येक औषधि (तरल से dispensers निकालने के लिए). नोट: हवा के साथ आग लगाना luciferase substrates अवशिष्ट पानी से पतला नहीं कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करता है.
    4. (चरण 5.2 से) जुगनू luciferase सब्सट्रेट के 1,080 μl के साथ प्रधानमंत्री की मशीन 1. (5.3 कदम से) Renilla luciferase सब्सट्रेट के साथ प्रधानमंत्री की मशीन 2. नोट: नहीं पार दूषित luciferase substrates के लिए सावधान रहें. Luciferase substrates के साथ भड़काना अभिकर्मक dispensers में मृत अंतरिक्ष भरता है.
  5. दोनों जुगनू और Renilla luciferase luminescence पढ़ने के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल सेट करें. Microplate रीडर, संयुक्त राष्ट्र के साथ जुड़े सॉफ्टवेयर के भीतर"फाइल" मेनू der, "नया टास्क" पर क्लिक करें. "प्रोटोकॉल" हाइलाइट करें और "नया बनाएँ" पर क्लिक करें. अगले विंडो में, "मानक प्रोटोकॉल" मंडली का चयन किया जाना चाहिए. "ठीक है." क्लिक करें स्क्रीन के बाएं हाथ की ओर "प्रक्रिया" पर डबल क्लिक करें.
    1. औषधि 1 का उपयोग सभी कुओं को जुगनू luciferase सब्सट्रेट के 10 μl बग़ैर. "क्रियाएं" मेनू के तहत, "बग़ैर" पर क्लिक करें. "बांटना चरण" खिड़की में, सेट: कोई नहीं, 10 μl के लिए "बग़ैर वॉल्यूम" और 225 μl / सेक करने के लिए "दर" "आग लगाना" "मशीन" 1 करने के लिए,. "ठीक है" पर क्लिक करें.
    2. 30 सेकंड के लिए थाली हिलाएँ. "क्रिया" मेनू के तहत, "शेक" पर क्लिक करें. एस एस: "शेक कदम" खिड़की में, मध्यम और 00:30 एम.एम. को "अवधि" के लिए "तीव्रता" की स्थापना की. "ठीक है" पर क्लिक करें.
    3. अच्छी तरह से प्रति 0.5 सेकंड के लिए सभी कुओं की luminescence पढ़ें. "क्रिया" मेनू के तहत, "पढ़ें" पर क्लिक करें;. "पढ़ें चरण" खिड़की में, सेट: Luminescence को "जांच विधि", 00:00:50 एम.एम. के लिए, समापन बिंदु करने के लिए "एकीकरण के समय" "प्रकार पढ़ें": एस एस एस एस, "फिल्टर सेट" करने के लिए 1, "उत्सर्जन" हौले से ऊपर, "प्रकाशिकी स्थिति", 135 "लाभ", और 1.00 मिमी "ऊँचाई पढ़ें". "ठीक है" पर क्लिक करें.
    4. 2 औषधि का उपयोग सभी कुओं को Renilla luciferase सब्सट्रेट के 10 μl बग़ैर. सेट "औषधि" 2 को छोड़कर, चरण 5.6.1 में के रूप में शर्तों सेट करें.
    5. 30 सेकंड के लिए थाली हिलाएँ. चरण 5.6.2 में के रूप में शर्तों सेट करें.
    6. 0.5 सेकंड के लिए सभी कुओं की luminescence पढ़ें प्रति अच्छी तरह से. चरण 5.6.3 में के रूप में शर्तों सेट करें.
  6. 96 अच्छी तरह से थाली से ढक्कन हटाएँ और microplate रीडर में थाली प्लेस. थाली luminescence पढ़ने के लिए कदम 5.5 में स्थापित प्रोग्राम प्रारंभ करें.
  7. अभिकर्मक मशीन पंप्स साफ करें. "औषधि" टैब के तहत प्रणाली चिह्न से:
    1. एफ के 1000 μl पर्जएक वसूली ट्यूब में जुगनू luciferase मशीन से irefly luciferase सब्सट्रेट. नोट: जुगनू luciferase -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और पुन: उपयोग किया जा सकता है.
    2. प्रधानमंत्री 70% इथेनॉल के 1,000 μl द्वारा पीछा आसुत जल से 1,000 μl, और अंत में हवा के 1,500 μl के साथ प्रत्येक औषधि (तरल से dispensers निकालने के लिए). नोट: जल अभिकर्मक पंप, इथेनॉल disinfects, और हवा किसी भी अवशिष्ट इथेनॉल dries से luciferase substrates हटा.

6. डेटा विश्लेषण

  1. डेटा निर्यात
    1. Microplate रीडर सॉफ्टवेयर में, स्क्रीन के बाईं ओर पर "रिपोर्ट / निर्यात बिल्डरों" पर डबल क्लिक करें.
    2. बटन "एक्सेल में नई निर्यात" पर क्लिक करें और "ठीक" पर क्लिक करें.
    3. Export1 हाइलाइट करें और "संपादित करें" पर क्लिक करें.
      1. "सामग्री" "सिस्टम विवरण" जाँच, "प्रक्रिया", "थाली विवरण", और "थाली लेआउट मैट्रिक्स 'के तहत. "रॉ डाटा" एक शामिल करेंएन डी "डेटा की गणना".
      2. "कार्यप्रवाह" के तहत, "प्रक्रिया के पूरा होने पर Autoexecute" की जाँच करें. निर्यात मोड के तहत, "सभी एक ही कार्यपुस्तिका में प्लेटें" और "एक नए कार्यपत्रक के रूप में" जाँच.
      3. "फाइल" फ़ाइल नाम स्वरूप और फ़ाइल स्थान का चयन, और "ठीक" क्लिक करें.
      4. "रिपोर्ट / निर्यात बिल्डरों" विंडो को बंद करें.
  2. सामान्यीकृत luciferase मूल्यों को प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक के लिए अच्छी तरह Renilla luminescence पढ़ना (चरण 5.6.6) द्वारा प्रत्येक के लिए अच्छी तरह जुगनू luciferase luminescence पढ़ना (चरण 5.6.3) विभाजित करते हैं.

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Representative Results

एक प्राथमिक स्क्रीन 100 माइक्रोन की एकाग्रता में 26 odors के खिलाफ 328 अन्य रैंकों परीक्षण किया. इस गंध एकाग्रता प्रभावी रूप से जाना जाता है ligands के साथ 10 अन्य रैंकों का एक बड़ा हिस्सा सक्रिय करने के लिए प्रदर्शन किया गया है. सबसे पहले, सामान्यीकृत luciferase गतिविधि Renilla luciferase पढ़ने से जुगनू luciferase पढ़ने विभाजित करके गणना की गई. अगला, baselined मान प्रत्येक अच्छी तरह से (चित्रा 1) के लिए सामान्यीकृत luciferase रीडिंग से कोई गंध नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत luciferase रीडिंग घटाकर की गणना की गई. खुराक प्रतिक्रिया घटता 48 odorant पर प्रदर्शन / या जोड़ों बेतरतीब ढंग से baselined मूल्यों की रेंज भर में वितरित कर रहे थे, चित्रा 1 में रंग सलाखों के संकेत के रूप. अन्य रैंकों 1 मिमी तक 1 एनएम फैले odorant के 7 सांद्रता के साथ इलाज किया, और जिसके परिणामस्वरूप प्रतिक्रियाओं फिट थे nonlinear प्रतिगमन का उपयोग कर एक sigmoidal वक्र करने के लिए. यह तीन मानदंड पर खरे उतरे, तो एक odorant / या एक agonist माना जाता था: (1) मानक त्रुटि कीlogEC 50 कम से कम 1 प्रवेश इकाई थी; (2) वक्र के ऊपर और नीचे के मापदंडों के लिए 95% विश्वास अंतराल ओवरलैप नहीं था; और (3) अतिरिक्त रकम का चौकों परीक्षण odorant एक खाली वेक्टर साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे जो नियंत्रण कक्षों, की तुलना में काफी अधिक है या युक्त कोशिकाओं को सक्रिय पुष्टि की. खुराक प्रतिक्रिया परिणाम 3 तालिका में संक्षेप हैं.

ये आंकड़े तो एक प्राथमिक स्क्रीन में परख माप खुराक प्रतिक्रिया वक्र से परिणाम की भविष्यवाणी कितनी अच्छी तरह का निर्धारण किया गया. चित्रा 1 में नीले सलाखों लाल सलाखों के ऊपर उल्लिखित हमारे तीन मानदंडों को पूरा नहीं किया है, जबकि एक पूरी खुराक प्रतिक्रिया प्रयोग में agonists के रूप में वर्गीकृत किया गया है कि जोड़े के अनुरूप हैं. प्राथमिक स्क्रीन से मानों हमारे प्राथमिक स्क्रीन एक उपयोगी तरीका है कि यह दर्शाता है, (विशेषता वक्र (नीलामी) के संचालन के रिसीवर के तहत क्षेत्र = 0.68, पी <0.01, मान व्हिटनी यू परीक्षण) पूरी खुराक प्रतिक्रिया प्रयोग से परिणाम की भविष्यवाणी की पूरी खुराक प्रतिक्रिया प्रयोग (चित्रा 2) में agonists के रूप में वर्गीकृत किया जाएगा कि odorant / या जोड़ों के लिए समृद्ध है.

चित्रा 1
घ्राण रिसेप्टर्स और odorants प्राथमिक स्क्रीन में प्रत्येक odorant / या जोड़ी के लिए गणना baselined luciferase मूल्यों की आवृत्ति की. हिस्टोग्राम (गणना) के एक पैनल के साथ एक स्क्रीन के लिए baselined luciferase मूल्यों की चित्रा 1. फ्रीक्वेंसी. Odorant / रिसेप्टर सक्रियण जोड़े विरल हैं, मूल्यों के बहुमत शून्य पर केंद्रित है और बड़े केंद्रीय वितरण इस परख के लिए शोर वितरण का अनुमान कर रहे हैं. रंग सलाखों खुराक प्रतिक्रिया विश्लेषण के लिए चुना odorant / रिसेप्टर जोड़े संकेत मिलता है; नीले सलाखों पूरी खुराक प्रतिक्रिया पर आधारित agonists के रूप में वर्गीकृत किया, और लाल सलाखों agonists के रूप में वर्गीकृत नहीं किया गया है कि जोड़े थे कि जोड़े हैं.च = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51640/51640fig1highres.jpg" लक्ष्य = "_blank"> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
Odorant / रिसेप्टर स्क्रीन के लिए चित्रा 2. आरओसी वक्र. 48 odorant / रिसेप्टर जोड़े agonists जा रहा है या के रूप में एगोनिस्ट नहीं किया जा रहा के रूप में वर्गीकृत किया गया है. सच सकारात्मक दर (संवेदनशीलता) तो आर सांख्यिकीय पैकेज 40 का उपयोग कर झूठी सकारात्मक दर (1-विशिष्टता) के खिलाफ साजिश रची गई थी. वक्र (नीलामी) के तहत क्षेत्र में उच्च luciferase स्क्रीन मूल्यों के साथ odorant / रिसेप्टर जोड़े कम मूल्यों के साथ उन लोगों की तुलना में खुराक प्रतिक्रिया पारित होने की संभावना है यह दर्शाता है कि 0.68 है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

<टीआर ऊंचाई = "21"> ऊँचाई: 21px; "> ०.१६४६४७१५६ 1 "शैली =" ऊंचाई: 21px; "> -०.१०९०४८०४६
Baselined मूल्य खुराक प्रतिक्रिया
०.०५१७९३०६७ असफल
०.००६३७६९५६ असफल
.३३१९३६३९८ पास
0.५९१००६५१९ पास
०.०४,९०,९३,३६९ पास
0.३९६७८८९७६ पास
-०.०१३६५५७४३ पास
.०१,१०,८०,२१७ पास
०.००४२०३३४९ असफल
0.००,३९,७५,०४९ असफल
-0.०७,७९,३५,७१८ पास
-0.०८,४४,८८,३१७ पास
.०३,०२,३६,०७८ असफल
-.०४२९६३५७६ असफल
.०३१४६६४०६ असफल
०.०२५८९७७४७ असफल
-0.०३,०४,३४,६५१ असफल
-0.००,४१,२२,७९५ असफल
-०.०१००७५५३३ असफल
.०२,८८,८३,४५२ असफल
०.०१,९४,०२,३७३ असफल
0.०४,७५,०८,७४९ असफल
0.00255344 असफल
0.०१७२२१४४९ असफल
०.३४,०२,१६,६५५ पास
-०.०२६९१२१८१ असफल
.०३७१४०४२८ असफल
0.४६७७६३०१७ पास
0.०९७६६५३३७ असफल
.०८,०६,५७,२६७ पास
0.१७२८१९२११ पास
0.05568393 पास
-०.१०६७२१०६४ पास
०.१३६६१४८४९ पास
.४५,७८,३९,८४९ असफल
०.२१,१७,५१,७४१ असफल
0.1581464 पास
-0.६२०९९१५५ पास
-.०६६९४९४९१ पास
-0.७,८७,१२,०३५ पास
.७५,२५,०३,००७ पास
१.४३,३४,०७,५५८ पास
०.४७५४३१०९८ पास
१.४५,७९,३६,८१५ पास
.०४,८६,५२,५३७ असफल
.०२,७१,९६,७८२ असफल
0.१२९५९९८४२ असफल
-0.०६९७८१२७२ असफल
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-०.०२५६३९२०७ असफल
.१५८१५२१४१ असफल
-0.०३२५७००५५ असफल
०.१४,०१,३९,९२६ असफल
-.०५,२०,३०,२७६ असफल
.६५७१४०१३३ पास
१.०४,०४,१०,२९७ पास
पास
०.३९,९५,८८,७१२ पास
0.१८,८०,९४,३८७ पास
0.०३,९३,७१,४२४ पास
०.०१,६७,८४,३५२ पास
०.२२,९९,५९,५७१ पास
०.२३,८३,८१,९९७ असफल
.०७,४१,१८,९०९ असफल
०.४२,३९,०१,१२८ पास
०.१५,२६,२१,०२२ पास
पास
0.०७५३०१८०६ पास
0.३९५२३३९७२ पास
0.२६,१८,९२,९५८ पास
0.१५६६९३३०६ असफल
२.१६,३४,१८,१४७ पास
३.६४,९८,६२,१०४ पास
0.०२,५७,१६,१६९ पास
-0.०३,३२,५८,००८ पास
-0.०२६९८४१२७ असफल
-0.३३,८४,४१,८६८ पास
0.37398618 पास

खुराक प्रतिक्रिया में परीक्षण तालिका 3. घ्राण रिसेप्टर / गंध जोड़े. Baselined luciferase मूल्यों और स्क्रीन से चुना 48 या / गंध जोड़े के लिए खुराक प्रतिक्रिया परिणाम (पास या असफल). दो बार स्क्रीन में परीक्षण 30 जोड़े के लिए, दोनों baselined luciferase मूल्यों शामिल किए गए हैं.

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Discussion

Odorant पहचान घ्राण रिसेप्टर सक्रियण पैटर्न द्वारा इनकोडिंग है, लेकिन रिसेप्टर्स सक्रिय और क्या डिग्री करने के लिए कर रहे हैं जो सहित रिसेप्टर सक्रियण पैटर्न, मानव घ्राण रिसेप्टर्स 1-11 के कम से कम 6% के लिए जाना जाता है. घ्राण रिसेप्टर्स को चिह्नित करने के प्रयास घ्राण रिसेप्टर परिवार 17,23,24,33,34 का केवल एक उप के लिए अपने श्रम गहन तरीकों या प्रयोज्यता द्वारा सीमित किया गया है. Hana3A heterologous अभिव्यक्ति प्रणाली का परीक्षण किया घ्राण रिसेप्टर्स के बहुमत के मजबूत अभिव्यक्ति का समर्थन करता है, और घ्राण रिसेप्टर सक्रियण 19,26,27 नजर रखने के लिए एक शिविर उत्तरदायी luciferase संवाददाता प्रणाली के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. एक 96 अच्छी तरह प्रारूप में इस परख के प्रदर्शन बातचीत की पुष्टि करने के odorant / घ्राण रिसेप्टर जोड़े और खुराक प्रतिक्रिया घटता के लिए उम्मीदवारों की संभावना का निर्धारण और रिसेप्टर सक्रियण स्तरों वायुसेना रहे हैं कि कैसे आकलन करने के लिए स्क्रीन सहित उच्च throughput प्रयोगात्मक डिजाइन की एक संख्या का समर्थन करता हैअंतर और अंतर - विशिष्ट विविधताओं से fected. एक स्क्रीन में उच्च गतिविधि मूल्यों के साथ odorant / रिसेप्टर जोड़े एक महत्वपूर्ण खुराक प्रतिक्रिया को प्रदर्शित होने की संभावना है. ये आंकड़े इस स्क्रीनिंग विधि जिससे odorant ligands और घ्राण रिसेप्टर सक्रियण पैटर्न की पहचान की सुविधा, खुराक प्रतिक्रिया पारित करेंगे कि odorant / रिसेप्टर जोड़े के लिए समृद्ध करने के लिए सक्षम है कि सुझाव है.

घ्राण रिसेप्टर विश्लेषण के लिए अनुकूलित इस परख की सफलता कई कारकों पर निर्भर है. सभी प्लाज्मिड डीएनए एक endotoxin मुक्त प्रोटोकॉल के माध्यम से तैयार रहना चाहिए. कोशिका की सतह पर लगातार घ्राण रिसेप्टर अभिव्यक्ति महत्वपूर्ण है. Hana3A सेल लाइन stably में या अभिव्यक्ति है कि सहायता कई गौण प्रोटीन व्यक्त किया, लेकिन RTP1S और एम 3, आर के सह अभिकर्मक क्रमश: 27, रिसेप्टर अभिव्यक्ति और सक्रियण को बढ़ाता है. गौण प्रोटीन अभिव्यक्ति के इस संयोजन की अनुमति, सबसे घ्राण रिसेप्टर्स की विश्वसनीय अभिव्यक्ति में परिणाम comparisoके एन या प्रयोगों और रिसेप्टर्स के बीच सक्रियण. इसके अलावा, सेल confluency की निगरानी अनुरूप परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. मोटे तौर पर 100% मिला हुआ यहाँ बताया प्रोटोकॉल प्रयोग भर में विश्वसनीय सेल confluency में परिणाम होगा निम्नलिखित, मूल 10 2 सेमी पकवान में कोशिकाओं रहे हैं संभालने. महत्वपूर्ण बात है, पर्याप्त कोशिकाओं को एक औसत दर्जे का luciferase पढ़ने प्राप्त करने के लिए चढ़ाया जाएगा, लेकिन कोशिकाओं, odorant उत्तेजना के बाद रिसेप्टर सक्रियण प्रभावित कर सकता है एक शर्त है जो बड़े हो खत्म नहीं हो जाएगा. सेल घनत्व के लिए, लेकिन यह भी अभिकर्मक दक्षता के लिए न केवल विधान Renilla अभिव्यक्ति आगे नियंत्रण के लिए सामान्य. मतलब नीचे अधिक से अधिक 2.5 मानक विचलन पढ़ना एक Renilla luciferase सेल नुकसान का संकेत हो सकता. प्रकोष्ठों sparser कोशिकाओं की तुलना में थाली सतह से आसानी से अलग करें कि घने सजीले टुकड़े से बचने के लिए समान रूप से चढ़ाया जाना चाहिए, और अभिकर्मक और odorant समाधान detaching सेल से बचने के लिए अच्छी तरह से पक्ष को धीरे जोड़ा जाना चाहिएरास. सेल नुकसान भी odorant विषाक्तता, 0.5% नीचे DMSO सांद्रता रखने से बचा जा सकता है जो odorant एकाग्रता, या अत्यधिक DMSO, कम करके उन्हें धोखा दिया जा सकता है कि एक समस्या की वजह से कोशिका मृत्यु के कारण हो सकता है. अंत में, 1 माइक्रोन forskolin, शिविर उत्तरदायी प्रमोटर से luciferase संवाददाता अभिव्यक्ति का कारण बनता है कि एक adenylyl साइक्लेस उत्प्रेरक, के साथ प्रत्येक रिसेप्टर व्यक्त सेल की आबादी के इलाज परख के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा कर सकते हैं.

यहाँ बताया परख स्तनधारी घ्राण रिसेप्टर परिवार के लिए एक उच्च throughput प्रारूप और अधिक सामान्य प्रयोज्यता सहित वैकल्पिक तरीकों पर एक सुधार का प्रतिनिधित्व करता है, यह सीमाएँ हैं. सबसे पहले, हमारे इन विट्रो परख odorant बंधनकारी प्रोटीन, एक mucosal परत, intracellular अणुओं और सूँघने व्यवहार सहित एक Vivo में घ्राण प्रणाली के कई घटकों का अभाव है. दूसरा, इस विधि घ्राण रिसेप्टर को मापने के लिए एक luciferase संवाददाता प्रणाली पर निर्भर करता हैकैल्शियम इमेजिंग का उपयोग आम है कि वैकल्पिक तरीकों के विपरीत सक्रियण. हाल ही में काम इन दो तरीकों परस्पर विरोधी परिणामों का उत्पादन कर सकते हैं कि पता चलता है; कैल्शियम इमेजिंग लेकिन नहीं luciferase परख 41 के माध्यम से जांच की है जब वास्तव में, कुछ घ्राण रिसेप्टर्स एक विशेष odorant का जवाब. एक परख प्रकार मानव घ्राण धारणा का अध्ययन करने के लिए और अधिक प्रासंगिक है या अस्पष्ट बनी हुई है, लेकिन दोनों तरीकों संदर्भ और रिसेप्टर प्रकार के आधार पर उपयोगी हो सकता है. इस कार्यात्मक अभिव्यक्ति प्रणाली सफलतापूर्वक परीक्षण किया स्तनधारी घ्राण रिसेप्टर्स के बहुमत व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, जबकि तीसरा, कुछ अन्य रैंकों इस प्रणाली का उपयोग कर अभिव्यक्ति के लिए उत्तरदायी नहीं हो सकता है. पहले से uncharacterized रिसेप्टर्स एक गंध के लिए प्रतिक्रिया करने में विफल रहते हैं, बल्कि यह odorant और रिसेप्टर के बीच बातचीत की कमी से कोशिका की सतह पर अभिव्यक्ति की कमी के कारण हो सकता है. रिसेप्टर सेल सतह अभिव्यक्ति नकारात्मक परख से निष्कर्ष निकालने से पहले immunofluorescence के माध्यम से जांच की जा सकती 27,42 परिणाम 38,39 के लिए गंध विरोधी निर्धारित करने के लिए, सबसे रिसेप्टर्स पहले luciferase गतिविधि में कमी का निरीक्षण करने के क्रम में एक गंध के साथ प्रेरित किया जाना चाहिए.

इन सीमाओं के बावजूद, इस परख प्रणाली काफी महक के क्षेत्र में डाटा अधिग्रहण में वृद्धि करने की क्षमता है. सबसे पहले, उच्च throughput 96 अच्छी तरह प्रारूप बड़े पैमाने पर रिसेप्टर और / या गंध स्क्रीन संभव बनाता है. दूसरा, अपने heterologous अभिव्यक्ति प्रणाली स्तनधारी घ्राण रिसेप्टर्स की एक किस्म के लिए लागू है. तीसरा, luciferase गतिविधि एक विशेष odorant के लिए रिसेप्टर सक्रियण पैटर्न का वर्णन करने में मूल्यवान है जो घ्राण रिसेप्टर सक्रियण, मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चौथा, इसी तरह इन विट्रो परख सिस्टम से पिछले परिणामों मानव घ्राण धारणा 8,11,35 का अनुमान है. इन विशेषताओं खास हैंularly महत्वपूर्ण स्तनधारी घ्राण रिसेप्टर परिवार के बड़े आकार और विशिष्ट odors द्वारा हासिल या सक्रियण पैटर्न के बारे मे अपने सीमित ज्ञान दिया. घ्राण रिसेप्टर विश्लेषण के लिए अनुकूलित इस परख प्रणाली की व्यापक आवेदन घ्राण रिसेप्टर / odorant बातचीत और गंध कोडिंग के आणविक आधार की एक अधिक व्यापक तस्वीर के लिए योगदान देगा.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम R01 DC013339, R03 DC011373, और रूथ एल Kirschstein राष्ट्रीय अनुसंधान सेवा पुरस्कार T32 DC000014 द्वारा समर्थित किया गया. काम का एक हिस्सा एनआईएच NIDCD कोर अनुदान P30 DC011735 से धन के द्वारा, भाग में, समर्थित है जो Monell chemosensory रिसेप्टर संकेतन कोर, उपयोग किया गया था. लेखकों डेटा संग्रह के साथ मदद के लिए सी. Sezille धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hana3A cells Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request
RTP1S-pCI Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request
M3-R-pCI Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request
pCRE-luc Agilent 219076 LUC
pSV40-RL Promega E2231 RL
Minimum Essential Media, Eagle Sigma Aldrich M4655 MEM
FBS Life Technologies 16000-044 FBS
PBS (without Ca2+ and Mg2+) Cellgro 21-040-CV PBS
Trypsin (0.05% Trypsin EDTA) Life Technologies 25300 Trypsin
CD293 Life Technologies 11913-019 CD293
96-well PDL white/clear plate BD BioCoat 356693 plates
Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668-019 Lipofectamine
Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay Promega E2980 dual glo
Synergy S2  BioTek SLAD BioTek S2
Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software BioTek Gen5 Gen5
BIOSTACK BioTek BIOSTACK2WR BioStack
Multiflo BioTek MFP MultiFlo
300 μl GripTips Integra 4433 GripTips
12.5 μl GripTips Integra 4414 GripTips
300 μl GripTips ViaFlo96 Integra 6433 XYZ tips
12.5 μl GripTips 384 XYZ Integra 6403 XYZ tips
384ViaFlo Integra 6030 384ViaFlo
TE buffer Macherey Nagel 740797.1
DMSO Sigma Aldrich D2650-100ML DMSO
Forskolin Enzo Life Sciences BML-CN100-0010 FOR

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 88 जुगनू luciferase, दोहरे Glo luciferase परख गंध घ्राण रिसेप्टर odorant GPCR उच्च throughput
Luciferase गतिविधि के माध्यम से रिसेप्टर सक्रियण के मापन: स्तनधारी घ्राण रिसेप्टर्स की उच्च throughput विश्लेषण
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Trimmer, C., Snyder, L. L.,… More

Trimmer, C., Snyder, L. L., Mainland, J. D. High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity. J. Vis. Exp. (88), e51640, doi:10.3791/51640 (2014).

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