Summary
Olfactory reseptor aktivering mønstre kode lukt identitet, men mangel på publiserte data som identifiserer odorant ligander for pattedyr luktereseptorer hindrer utviklingen av en helhetlig modell av lukt koding. Denne protokollen beskriver en metode for å legge til rette for high-throughput identifisering av olfactory reseptorligander og kvantifisering av reseptor-aktivering.
Abstract
Dufter lage unike og overlappende mønstre av olfactory reseptor aktivering, slik at en familie på ca 1000 murine og 400 menneskelige reseptorer å gjenkjenne tusenvis av luktstoffer. Odorant ligander har blitt publisert for færre enn 6% av menneskelige reseptorer 1-11. Denne manglende data er delvis på grunn av vanskelighetene funksjonelt uttrykke disse reseptorene i heterologe systemer. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å uttrykke de fleste av de olfaktoriske reseptorfamilien i Hana3A-celler, etterfulgt av high-throughput vurdering av lukte reseptor aktivering ved hjelp av et luciferase reporter-assay. Denne analysen kan brukes til å (1) skjermpaneler av odorants mot paneler av olfaktoriske reseptorer; (2) bekrefte odorant / reseptor interaksjon via dose-responskurver; og (3) sammenligne reseptor aktiveringsnivå blant reseptor varianter. I datautvalget, ble 328 olfactory reseptorer skjermet mot 26 odorants. Odorant / reseptorpar med varierende respons score var selected og testet i doserespons. Disse dataene indikerer at en skjerm er en effektiv metode for å berike for odorant / reseptor parene som vil passere en dose respons eksperiment, dvs. reseptorer som har en bona fide svar på en odorant. Derfor er dette high-throughput luciferase assay en effektiv metode for å karakterisere olfaktoriske reseptorer, en viktig skritt i retning av en modell av lukt koding i pattedyr olfaktoriske system.
Introduction
Pattedyr luktsystemet har evnen til å svare på et stort antall illeluktende stimuli, noe som åpner for deteksjon og diskriminering av tusenvis av luktstoffer. Olfactory reseptorer (ORS) er de molekylære sensorer uttrykt av olfactory sensoriske nerveceller i lukteepitelet 12. Pattedyr lukt anerkjennelse oppstår gjennom differensial aktivering av ORs av luktstoffer, og ELLER genet familien er omfattende, med omtrent 1000 murine og 400 menneskelige reseptorer 12-16. Tidligere funksjonelle analyser av ORs i olfactory nerveceller og i heterologe celler har vist at ulike dufter er anerkjent av unike, men overlappende ensembler av ORs 10,17-20. Matchende ligander til ORs er kritisk for å forstå lukte kode og viktig for å bygge levedyktige modeller av luktesans. På grunn av vanskeligheter uttrykker ORs i heterologe systemer samt det store antall både dufter og ORs, har disse dataene stort sett vært fraværende fra field; ja, færre enn 6% av menneske ORs ha publisert et ligand 1-11. Denne protokollen beskriver bruken av et luciferase assay for å karakterisere odorant / eller interaksjoner. Denne analysen gjør det mulig for high-throughput karakterisering av ORs, en oppgave som er nødvendig for å forstå odorant / ELLER interaksjoner, så vel som å utvikle en modell for lukt koding.
Høy gjennomstrømming studier av ORs overfor tre store utfordringer. Først ble ORs uttrykt i heterologe celler beholdes på akuttmottaket og senere degradert i proteasome 21,22, hindrer ORS fra samspill med luktstoffer i analysesystemet 23-25. Dette problemet ble løst ved oppdagelsen av tilbehørs proteiner som letter stabil celle-overflate uttrykk for et bredt spekter av ORs 19,26,27. Reseptor-transporter-proteiner 1 og 2 (RTP1 og 2) å fremme eller celle-overflate ekspresjon og aktivering i respons til stimulering odorant 19.. Basert på dette arbeidet, HEK293T cellene varmodifisert til å stabilt uttrykke RTP1 lang (RTP1L) og RTP2, reseptorekspresjon forbedrende protein 1, og G αolf, noe som resulterer i Hana3A cellelinje 19,27. I tillegg er den type 3 muskarine acetylcholin-reseptor (M3-R) samvirker med ORs på celleoverflaten og forbedrer aktivering i respons til odorants 26. Co-transfeksjon av en OR med RTP1S og M3-R inn Hana3A celler resultater i robust, konsekvent og funksjonelt uttrykk for et bredt spekter av ORs på celleoverflaten 27. For det andre, pattedyr ELLER repertoar er ganske stor. Hos mennesker, for eksempel, er OR repertoar en størrelsesorden mer tallrik enn gustatory reseptor repertoaret, og to størrelsesordener mer tallrik enn den visuelle reseptor repertoaret. Selv om kloning en singel eller er en relativt enkel protokoll, er betydelig opp-front innsats som kreves for å generere et omfattende bibliotek. Tredje, selv om vi vet at i et syn, overs bølgelengde i farge ogi audition frekvens settes til tonehøyde, er organiseringen av lukt dårlig forstått, noe som gjør det vanskelig for forskere å interpolere fra et representativt utvalg av dufter. Selv om noen fremgang har blitt gjort på denne fronten 10,28, kartet av lukte landskapet forblir ufullstendig. Screening titusenvis av molekyler mot hundrevis av ORs er en skremmende oppgave; high-throughput skjermer i dette domenet krever nøye definerte kampanjer. De store utfordringene som gjenstår er de av logistikk og kostnader snarere enn problemene som ligger til teknikken. Selv heterolog screening ikke har vært mye brukt for å identifisere ligander av akademiske grupper, har et privat selskap brukt samme teknikk for å identifisere ligander for 100 menneske ORs 29. Dessverre er disse dataene forblir fortrolig.
Den high-throughput luciferase-analysen beskrevet her har en rekke fordeler fremfor alternative metoder for å beregne eller aktivering. Selv om ansvaretses av innfødte olfactory sensoriske nerveceller har blitt målt ved hjelp av elektrofysiologi og kalsium bildebehandling, disse teknikkene har problemer med å erte hverandre som OR fører til et nevron respons på grunn av overlapping i responsegenskaper for olfactory nerveceller. Selv banke-i en GFP-merket reseptor type 30,31, levere spesifikke reseptorer via adenovirus overfor murine olfactory nevroner 32,33, eller utføre RT-PCR etter opptak 17,24,33 kan knytte opptak til enkelt reseptor typer, disse metodene er lav gjennomstrømning og ikke egnet for storskala-skjermer. Heterologe screening systemer er mer skalerbar, og to store former er funnet i litteraturen: cAMP veien journalister og inositol trifosfat (IP3) pathway journalister. Ved lukt stimulering, ORs aktivere en G αolf transduksjon signalering kaskade som resulterer i produksjon av syklisk AMP (cAMP) 12. Ved ko-transfeksjon av et ildflue luciferase reporter-genet under kontroll av acAMP responselement (CRE), kan luciferase produksjon måles som en funksjon av lukt respons, noe som muliggjør kvantifisering av OR aktivering. ELLER aktivering kan også være knyttet til IP3 pathway av co-uttrykke G-proteiner som G α15/16 eller en G α15-olf chimera 24,25,34. Vi har valgt den analysen som presenteres her basert på tre faktorer: (1) co-uttrykk for RTP1 med Rho-merket olfactory reseptorer forbedrer uttrykk for olfactory reseptorer på celleoverflaten 19,27; (2) bruk av et cAMP-responsive reporter-genet muliggjør måling av OR aktivering gjennom den kanoniske andre messenger sti; og (3) analyse er vel-egnet til high-throughput-skjermer.
Denne high-throughput luciferase-analysen kan anvendes på en rekke studier verdifulle til feltet av luktesans. For det første kan et stort antall ORs bli screenet mot et enkelt odorant for å bestemme reseptoraktivering mønster for en specific odorant. Denne typen studier identifisert OR7D4 som OR ansvarlig for å svare på steroidet odorant androstenon åtte. Omvendt kan en ELLER bli screenet mot et panel bestående av luktstoffer for å bestemme reseptor responsprofilen 10.. Når kandidat olfactory odorant / ELLER parene er identifisert via disse skjermer kan interaksjonen bli bekreftet ved å gjennomføre en doseresponseksperiment undersøke responsen fra OR til økende konsentrasjoner av odorant. Dose responskurver kan også vurdere hvordan genetisk variasjon i en OR påvirker in vitro odorant respons 8,9,11,35, og disse studiene kan bli utvidet til interspecific ELLER variasjon, noe som åpner for undersøkelse av reseptor evolusjon over arter og årsaks mutasjoner i evolusjonen 36,37, Endelig, denne analysen kan brukes til å screene for lukt-antagonister som er i stand til å antagonisere eller som svar på en bestemt odorant for en kjent odorant / reseptor-par 38,39. I sammendrag, denne høyeGjennomstrømming luciferase assay er aktuelt for en rekke studier som vil hjelpe karakter ELLER aktiveringsmønstre og gir en bedre forståelse av lukt koding i luktesystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Culture of Hana3A Cells
- Forbered M10-Reklame ved å supplere minimum essensielt medium (MEM) med 10% (v / v) FBS.
- Kultur Vedlikehold
- Opprettholde cellene i M10 media. MERK: Ekspressjonsvektorene for RTP1L, RTP2, REEP1, og G αolf konferere puromycin motstand mot Hana3A celler, men opprettholde cellene med denne antibiotika ikke i særlig grad påvirker analyseresultatene.
- Subkultur i forholdet 1:08 i 10 cm retter hver 2-3 dager.
- Inkuber ved 37 ° C med 5% CO 2.
2. Plating Cells for Transfection
- Sug media fra en 100% konfluent 10 cm rett av Hana3A celler.
- Vask cellene ved å legge til 10 ml PBS, virvlende fatet, og aspirere PBS.
- Tilsett 3 ml av 0,05% trypsin / EDTA og vente på cellene til å dissosiere (ca. 1 min.)
- Inaktivere trypsin ved å tilsette 5 ml M10 og bryte opp celle klumper ved triturating omtrent 10x &# 160, med en 10 ml pipette. Pipetter forsiktig for å unngå å introdusere luftbobler inn i media.
- For hver 96-brønns plate, overføre 1 ml av celler i et 15 ml konisk rør, sentrifuger ved 200 xg i 5 min, og suge supernatanten uten å forstyrre cellepelleten.
- Suspender cellene i 6 ml M10 per 1 ml av celler som er overført i trinn 2.5.
- Pipetter 50 ul celler til hver brønn i en 96-brønns plate og inkuberes over natten ved 37 ° C med 5% CO2.
Tre. Transfection olfactory reseptorer
- Utarbeidelse av plasmid DNA
- Forbered plasmid DNA via en endotoksin frie protokollen. MERK: Bruk plasmid DNA forberedelse kits utpekt "endotoksin-free", eller legge til en fenol-kloroform ekstraksjon skritt til plasmid DNA forberedelse protokollen.
- Fortynn DNA til en konsentrasjon på 100 ng / pl i TE-buffer.
- Observer belagt celler (trinn 2.7) for å sikre en forsvarlig confluency av approximately 30-50% per brønn og gå tilbake til inkubatoren. MERK: Selv om dette konfluens er ikke optimalt for lipid transfeksjon reagens, er optimal for måling av luciferase aktivitet 24 timer etter transfeksjon en konfluens på 30-50% på dette trinnet.
- Utarbeidelse av Transfection Mix
- Pipette RTP1S-PCI, M3-R-PCI, pcre-Luc, og pSV40-RL plasmider i MEM medium per volumene beskrevet i Tabell 1 for å gjøre Plasmid mix (volum er oppgitt per 96-brønns plate).
Plasmid mix per brønn per 96-brønns plate MEM - 500 mL RTP1S-pci 5 ng 480 ng M3-R-pci 2,5 ng 240 ng pcre-Luc 10 ng 960 ng pSV40-RL 5 ng 480 ng
Tabell 1. Plasmidkart mix komponenter. Per brønn og per 96-brønners plate volumer av RTP1S-PCI, M3-R-PCI, pcre-Luc, og pSV40-RL, og MEM. - For hver 96-brønns plate, fortynnes 18 ul lipid transfeksjon reagens i 450 ul MEM-medium.
- Pipette Plasmid mix (fra Trinn 3.3.1), rhodopsin-merket olfactory reseptor i PCI plasmid (Rho-ELLER-PCI), og lipid transfeksjon mix (fra Trinn 3.3.2) for å gjøre Complex detaljert i
Complex per brønn per brønn + 10% Plasmid mix 4,2 mL 4,58 mL Rho-ELLER-pci 0,05 ng 0,06 ng Lipid transfeksjon mix 4,2 mL 4,58 mL M10 41,7 mL 45,83 mL
Tabell 2. Komplekse komponenter. Per brønn og pr brønn + 10% volum av plasmid blanding (tabell 1), lukte reseptor-plasmid (Rho-ELLER-PCI), og lipid transfeksjon blanding. M10 blir tilsatt for å stanse reaksjonen etter en 15 min inkubering ved romtemperatur.
- Pipette RTP1S-PCI, M3-R-PCI, pcre-Luc, og pSV40-RL plasmider i MEM medium per volumene beskrevet i Tabell 1 for å gjøre Plasmid mix (volum er oppgitt per 96-brønns plate).
- Tapp ut medie på celleplatene.
- Pipetter 50 mL av komplekset til hver brønn og inkuberes over natten ved 37 ° C med 5% CO2.
4. Lukt Stimulering
- Observer de transfekterte cellene for å sikre en forsvarlig confluency på 50-80% per brønn og gå tilbake til inkubatoren. MERK: Hvis cellene er mindre enn 50% Konfluente, ildflueluciferase og Renilla luciferase avlesninger kan være for lavt for måling av reseptor aktivering. Vurdere å forkaste plate.
- Forbered en M lager løsninger for hver lukt i DMSO.
- Forbered lukt stimulering løsninger i CD293 medium.
- For screeningeksperimenter, fortynne stamløsning av lukt til 100 uM. Også utarbeide en no-luktkontroll (CD293 kun) for å kontrollere for eller bakgrunn aktivering. MERK: For screening eksperimenter, er hver OR / lukt paret testet bare én gang per forsøk. Fordi noen lukt diffusjon over brønner er mulig, anbefales det å stimulere med en odorant for hver plate.
- For dose-responsforsøk, forberede sju ti-ganger serie-fortynninger av stamoppløsning lukt i triplikat starter på 1 mM for hver reseptor. Også fremstille de samme lukt fortynninger i triplikat for tomme vektor-transfekterte celler for å kontrollere for lukt bakgrunn aktivering. MERK: For dose respons eksperimenter, hver odor konsentrasjon behandling bør gjennomføres i tre eksemplarer.
- Tapp ut medie på celleplatene.
- Pipetter 25 mL av lukt stimulering løsning til hver brønn og inkuberes i 4 timer.
5. Måling eller aktivitet via Luciferase Assay
- Resuspender ildflueluciferase substrat per produsentens instruksjoner og oppbevar ved -80 ° C.
- Tin 1 ml av ildflue luciferase substrat per 96-brønns plate.
- Forbered frisk ildflueluciferase reaksjon drikk og Renilla luciferase underlaget reagens (5 mL luciferase drikk / Renilla luciferase substrat per 1 ml buffer). MERK: Omtrent 1 ml av reagens som er nødvendig per 96-brønns plate.
- Klargjør lysende mikroplateleser. Åpne mikroplateleser programvare. Innenfor systemet ikonet:
- Under "Pre-heating" Tab, sjekk boksen for "ON" og sett temperaturen på maskinen til 25 °; C.
- Under "dispenser"-kategorien, prime hver dispenser med 1000 pl av 70% etanol, etterfulgt av 1,000 mL av destillert vann. MERK: Bruk separate porsjoner av alkohol og vann for hver dispenser. Etanol anvendes til å desinfisere beholderne, og vann, fjernes den gjenværende etanol.
- Prime hver dispenser med 1500 mL av luft (fjern dispensere fra væske). MERK: Grunne med luft sikrer at luciferase underlag som ikke er fortynnet med restvann.
- Prime dispenser en med 1080 mL av ildflueluciferase substrat (fra trinn 5.2). Prime dispenser 2 med Renilla luciferase substrat (fra trinn 5.3). MERK: Vær forsiktig så du ikke å kryss-forurense luciferase underlag. Grunne med luciferase underlag fyller dead space i reagensdispensere.
- Sett opp følgende protokoll å lese både ildflue og Renilla luciferase luminescens. Innenfor programvaren tilknyttet mikroplateleser, unDer "Fil"-menyen, klikk på "Ny oppgave". Marker "Protokoller" og klikk på "Opprett ny". I det neste vinduet, bør sirkelen ved siden av "Standard Protocol" velges. Klikk "OK." Dobbeltklikk på "Prosedyre" på venstre side av skjermen.
- Tilsett 10 mL av ildflueluciferase underlaget til alle brønnene ved hjelp av dispenser en. Under "Handlinger" menyen, klikk "Dispense". I "Tilsett Step"-vinduet, satt: "Dispenser" til en "Grunning" stykke, "Doser Volume" til 10 mL og "Rate" til 225 mL / sek. Klikk "OK".
- Rist platen i 30 sekunder. Under "Handlinger" menyen, klikk "Shake". I "Shake Step"-vinduet, sett "Intensitet" til Medium og "Varighet" til 00:30 MM: SS. Klikk "OK".
- Les luminescens av alle brønnene på 0,5 sek per brønn. Under "Handlinger" menyen, klikk på "Les";. I "Les Step"-vinduet, satt: "Detection Method" til luminescens, "Les Type" til Endpoint, "Integrasjon Time" til 0:00:50 MM: SS: ss, "Filter Sets" til en, "Emission" til Hole, "Optics Position" til toppen, "Gain" til 135, og "Les Høyde" til 1,00 mm. Klikk "OK".
- Tilsett 10 mL av Renilla luciferase underlaget til alle brønnene ved hjelp av dispenser to. Sett forholdene som i trinn 5.6.1, unntatt sett "Disp" til to.
- Rist platen i 30 sekunder. Setter premissene som i trinn 5.6.2.
- Les luminescens av alle brønner for 0,5 sek per brønn. Setter premissene som i trinn 5.6.3.
- Fjern lokket fra 96-brønns plate og legg platen i mikroplateleser. Start programmet satt opp i trinn 5.5 å lese plate luminescens.
- Rengjør reagensdispenseren pumper. Fra systemet ikonet under "Disp"-fanen:
- Rens 1000 mL av firefly luciferase substrat fra ildflue luciferase spring inn i en utvinningsrøret. MERK: ildflueluciferase kan lagres ved -80 ° C og gjenbrukes.
- Prime hver dispenser med 1000 mL destillert vann, etterfulgt av 1,000 mL av 70% etanol, og til slutt 1,500 mL av luft (fjern dispensere fra væske). MERK: Vann fjerner luciferase underlag fra reagenstyper pumper, etanol desinfiserer og luft tørker alle rester av etanol.
6. Data Analysis
- Dataeksport
- I mikroplateleser programvare, dobbeltklikk på "Rapporter / Export Builders" på venstre side av skjermen.
- Klikk på knappen "Ny Eksporter til Excel" og klikk "OK".
- Marker Eksporter1 og klikk "Rediger".
- Under "Innhold" check "Systembeskrivelse", "Prosedyre", "Plate Beskrivelse", og "Plate Layout Matrix". Inkluder "rådata" ennd "Beregnet data".
- Under "Arbeidsflyt", sjekk "Autoexecute på fullføring av prosedyren". Under Export Mode, sjekk "Alle plater i samme arbeidsbok" og "som et nytt regneark".
- Under "File" velge filnavnformat og-plasseringen, og klikk "OK".
- Lukk "Rapporter / Eksport Builders"-vinduet.
- For å få normalisert luciferase verdier, dele ildflueluciferase luminescens lesning for hver brønn (Trinn 5.6.3) av Renilla luminescens lesing for hver brønn (Trinn 5.6.6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En primærskjerm testet 328 ORs mot 26 lukt i en konsentrasjon på 100 uM. Denne lukt konsentrasjon har vist seg å effektivt aktivere en stor andel av ORs med kjente ligander 10. Først ble normalisert luciferase-aktivitet beregnes ved å dividere ildflue luciferase lesing av Renilla luciferase lesing. Deretter ble baselined verdier beregnet ved å subtrahere den normaliserte luciferase avlesninger for den ingen lukt-kontroll fra den normaliserte luciferase avlesninger for hver brønn (figur 1). Dose-responskurver ble utført på 48 odorant / ELLER parene tilfeldig fordelt over rekken av baselined verdier, som angitt av fargede søyler i figur 1. ORs ble behandlet med syv konsentrasjoner av odorant som strekker seg over en nM til 1 mM, og de resulterende responser var passe til en sigmoidal kurve ved hjelp av ikke-lineær regresjon. En odorant / eller ble ansett som en agonist hvis det møtte tre kriterier: (1) standardfeilen forden logEC 50 var mindre enn 1 log-enhet; (2) de 95% konfidensintervall for topp-og bunn parametre for kurven ikke overlapper hverandre; og (3) den ekstra-summene av firkantene-test bekreftet at odorant aktivert ELLER-celler inneholdende vesentlig mer enn kontroll-celler, som ble transfektert med tom vektor. Doseresponsresultatene er oppsummert i tabell 3.
Disse data ble deretter brukt for å bestemme hvor godt assay-målinger i en primær skjerm forutsi resultatene fra doseresponskurven. Blå søylene i figur 1 tilsvarer parene som ble klassifisert som agonister i en full dose respons eksperiment, mens røde streker ikke oppfyller våre tre kriteriene som er skissert ovenfor. Verdier fra primærskjerm predikerte resultatene fra den fulle dose-respons eksperiment (areal under mottakeren opererer karakteristiske kurven (AUC) = 0,68, p <0,01, Mann-Whitney U-test), som indikerer at vår grunn skjermen er en nyttig metode å berike for odorant / eller par som vil bli klassifisert som agonister i en full dose respons forsøket (Figur 2).
Figur 1. Frekvens av baselined luciferase verdier for en skjerm med et panel av olfactory reseptorer og dufter. Histogram av frekvensen (Count) av baselined luciferase verdier beregnet for hver odorant / OR pair i primærskjermen. Som odorant / reseptor-aktivering parene er tynt, er de fleste av verdiene sentrert på null, og det store sentrale fordelings estimerer støyfordeling for denne analysen. Fargede linjer indikerer odorant / reseptorpar valgt for doseresponsanalyse; Søylene er parene som ble klassifisert som agonister basert på full dose respons, og røde søyler er parene som ikke var klassifisert som agonister.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51640/51640fig1highres.jpg" target = "_blank"> Klikk her for å se større bilde.
Figur 2. ROC kurven for odorant / reseptor-skjermen. 48 odorant / reseptorpar ble klassifisert som agonister eller som ikke er agonister. Sann positiv rate (følsomhet) ble deretter plottet mot falsk positiv rate (1-spesifisitet) ved å bruke R statistikkpakke 40. Arealet under kurven (AUC) er 0,68, noe som indikerer at odorant / reseptorpar med høyere luciferase skjerm verdier er større sannsynlighet for å passere doserespons enn de med lavere verdier. for å vise større bilde.
| Baselined Verdi | Dose Response |
| 0,051793067 | mislykkes |
| 0,006376956 | mislykkes |
| 0,331936398 | passere |
| 0,591006519 | passere |
| 0,049093369 | passere |
| 0,396788976 | passere |
| -0,013655743 | passere | 0,011080217 | passere |
| 0,004203349 | mislykkes |
| 0,003975049 | mislykkes |
| -,077935718 | passere |
| -,084488317 | passere |
| 0,030236078 | mislykkes |
| -0,042963576 | mislykkes |
| 0,031466406 | mislykkes |
| 0,025897747 | mislykkes |
| -0,030434651 | mislykkes |
| -,004122795 | mislykkes |
| -,010075533 | mislykkes |
| 0,028883452 | mislykkes |
| 0,019402373 | mislykkes |
| 0,047508749 | mislykkes |
| 0.00255344 | mislykkes |
| 0,017221449 | mislykkes |
| 0,340216655 | passere |
| -0,026912181 | mislykkes |
| 0,037140428 | mislykkes |
| 0,467763017 | passere |
| 0,097665337 | mislykkes |
| 0,080657267 | passere |
| 0,172819211 | passere |
| 0.05568393 | passere |
| -0,106721064 | passere |
| 0,136614849 | passere |
| 0,457839849 | mislykkes |
| 0,211751741 | mislykkes |
| 0.1581464 | passere |
| -,62099155 | passere |
| -,066949491 | passere |
| -0,78712035 | passere |
| 0,752503007 | passere |
| 1,433407558 | passere |
| 0,475431098 | passere |
| 1,457936815 | passere |
| 0,048652537 | mislykkes |
| 0,027196782 | mislykkes |
| 0,129599842 | mislykkes |
| -0,069781272 | mislykkes |
| 0,016450039 | mislykkes |
| -0,025639207 | mislykkes |
| 0,158152141 | mislykkes |
| -,032570055 | mislykkes |
| 0,140139926 | mislykkes |
| -0,052030276 | mislykkes |
| 0,657140133 | passere |
| 1,040410297 | passere |
| passere | |
| 0,399588712 | passere |
| 0,188094387 | passere |
| 0,039371424 | passere |
| 0,016784352 | passere |
| 0,229959571 | passere |
| 0,238381997 | mislykkes |
| 0,074118909 | mislykkes |
| 0,423901128 | passere |
| 0,152621022 | passere |
| passere | |
| 0,075301806 | passere |
| 0,395233972 | passere |
| 0,261892958 | passere |
| 0,156693306 | mislykkes |
| 2,163418147 | passere |
| 3,649862104 | passere |
| 0,025716169 | passere |
| -0,033258008 | passere |
| -0,026984127 | mislykkes |
| -0,338441868 | passere |
| 0.37398618 | passere |
Tabell 3. Olfactory reseptor / lukt parene testet i doserespons. Baselined luciferase verdier og doserespons resultater (bestått eller ikke bestått) for 48 OR / lukt parene valgt fra skjermen. For 30 parene testet i to ganger på skjermen, er begge baselined luciferase verdiene inkludert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Odorant identitet er kodet av olfactory reseptor aktivering mønstre, men reseptor aktivering mønstre, herunder hvilke reseptorer er aktivert og i hvilken grad, er kjent for færre enn 6% av menneskelige luktereseptorer 1-11. Arbeidet med å karakterisere luktreseptorer har blitt begrenset av deres arbeidsintensive metoder eller anvendbarhet til bare en undergruppe av lukte reseptor familien 17,23,24,33,34. Den Hana3A heterologt ekspresjonssystem støtter robust uttrykk for de fleste testede olfaktoriske reseptorer, og kan brukes i forbindelse med en cAMP-responsive luciferase reporter-system for å overvåke olfactory reseptoraktivering 19,26,27. Utførelse av denne analysen i en 96-godt-formatet støtter en rekke high-throughput eksperimentelle design, inkludert skjermer for å avgjøre sannsynlige kandidater for odorant / olfactory reseptor parene og dose-responskurver for å bekrefte interaksjoner og vurdere hvordan reseptoraktivering nivåer er affected av intra-og interspesifikke variasjoner. Har større sannsynlighet for å påvise en signifikant dose-respons odorant / reseptorpar med høyere aktivitetsverdier i en skjerm. Disse dataene antyder at denne screeningmetoden er i stand til å berike for odorant / reseptor parene som vil passere dose respons, og dermed legge til rette for identifisering av odorant ligander og olfactory reseptor aktivering mønstre.
Suksessen til denne analysen er optimalisert for olfaktoriske reseptorer analysen er avhengig av flere faktorer. Alle plasmid DNA må være forberedt via en endotoksin fritt protokollen. Konsistent olfactory reseptor ekspresjon på celleoverflaten er kritisk. Den Hana3A cellelinje stabilt uttrykker flere tilbehørs proteiner som hjelpemiddel i eller uttrykk, men co-transfeksjon av RTP1S og M3-R forbedrer reseptor uttrykk og aktivering, henholdsvis 27. Denne kombinasjonen av tilbehøret protein ekspresjon resulterer i pålitelig uttrykk for de olfaktoriske reseptorer, slik at sammenlikningenn av OR aktivisering blant eksperimenter og reseptorer. I tillegg, er overvåkning av celle konfluens viktig for å få reproduserbare resultater. Under forutsetning av at cellene i den opprinnelige 10 cm 2-fatet er omtrent 100% konfluent, etter den protokoll som er beskrevet her vil resultere i pålitelig celle confluency gjennom hele eksperimentet. Viktigere, vil nødvendige celler være belagt for å oppnå en målbar luciferase avlesning, men celler vil ikke bli over-vokst, en tilstand som kan påvirke reseptor-aktivering odorant etter stimulering. Normalisering for konstitutive Renilla uttrykk ytterligere kontroller, ikke bare for celletetthet, men også for transfeksjon effektivitet. En Renilla luciferase leser mer enn 2,5 standardavvik under gjennomsnittet kan indikere celle tap. Cellene bør være belagt jevnt for å unngå å tette plaques som løsner lettere fra plateoverflaten enn stormasket celler, og transfeksjon og odorant løsninger bør tilsettes forsiktig til siden av brønnen for å unngå frakobling cells. Cell tapet kan også skyldes celledød forårsaket av odorant toksisitet, et problem som kan omgås ved å senke odorant konsentrasjon, eller overdreven DMSO, noe som kan unngås ved å holde DMSO-konsentrasjoner under 0,5%. Endelig kan behandlingen av hver reseptor-uttrykkende cellepopulasjon med 1 uM forskolin, en adenylat cyclase aktivator som fører luciferase reporter ekspresjon av cAMP-responsive promoter, tjener som en positiv kontroll for analysen.
Selv om analysen beskrevet heri representerer en forbedring i forhold til alternative metoder, inkludert en high-throughput-format og mer generell anvendbarhet til pattedyr olfactory reseptor-familien, har det begrensninger. For det første mangler våre in vitro assay mange komponenter av en in vivo olfaktoriske system, inkludert odorant bindende proteiner, kan en slimhinnelaget, intracellulære molekyler og sniffing atferd. For det andre, er avhengig av denne metoden på en luciferase reporter system for å måle olfactory reseptoraktivering i motsetning til vanlige alternative metoder som anvender kalsium-avbildning. Nyere arbeider tyder på at disse to metodene kan produsere motstridende resultater; faktisk noen luktreseptorene svare til en bestemt odorant når undersøkt via kalsium tenkelig, men ikke luciferase assay 41.. Enten man assaytypen er mer relevant for studier av menneskets lukte oppfatning er fortsatt uklart, men begge metoder kan være nyttige, avhengig av kontekst og reseptor type. For det tredje, når denne funksjonelle ekspresjonssystem har med hell blitt brukt for å uttrykke de fleste testede pattedyr olfaktoriske reseptorer, noe ORs er ikke mottagelig for ekspresjon ved hjelp av dette system. Ved tidligere uncharacterized reseptorer unnlater å svare på en lukt, kan det være på grunn av mangel på ekspresjon på celleoverflaten i stedet for en mangel på interaksjon mellom odorant og reseptor. Receptor celleoverflaten uttrykk kan bli undersøkt via immunfluorescens før trekke konklusjoner fra negative analyseresultater 27,42 38,39, må de fleste reseptorer først bli stimulert med en lukt for å observere en reduksjon i luciferase aktivitet.
Til tross for disse begrensninger har denne bestemmelsessystem evnen til å øke datainnsamling på området luktesans. For det første gjør den high-throughput 96-brønners format i stor skala-reseptor-og / eller lukt skjermer bart. For det andre, er dens heterologt ekspresjonssystem anvendes på et utvalg av pattedyr olfaktoriske reseptorer. For det tredje kan luciferase-aktivitet kan brukes for å måle olfactory reseptoraktivering, noe som er verdifullt i å beskrive reseptor aktivering mønstre for en bestemt odorant. Fjerde, tidligere resultater fra tilsvarende in vitro analysesystemer forutsi menneskelige lukte oppfatning 8,11,35. Disse egenskapene er spesielt viktig gitt den store størrelsen på pattedyr lukte reseptor familien og vår begrensede kunnskap om eller aktiveringsmønstre oppstår ved spesielle lukt. Bred anvendelse av denne analysen som er optimert for olfactory reseptor analysen vil bidra til et mer helhetlig bilde av olfactory reseptor / odorant samhandling og det molekylære grunnlaget for lukt koding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av R01 DC013339, R03 DC011373, og Ruth L. Kirschstein National Research Service Award T32 DC000014. En del av arbeidet ble utført ved hjelp av Monell chemosensory Receptor Signa Core, som er støttet, delvis ved midler fra NIH-NIDCD Kjerne Grant P30 DC011735. Forfatterne takker C. Sezille for hjelp med datainnsamling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hana3A cells | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| RTP1S-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| M3-R-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| pCRE-luc | Agilent | 219076 | LUC |
| pSV40-RL | Promega | E2231 | RL |
| Minimum Essential Media, Eagle | Sigma Aldrich | M4655 | MEM |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | FBS |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-040-CV | PBS |
| Trypsin (0.05% Trypsin EDTA) | Life Technologies | 25300 | Trypsin |
| CD293 | Life Technologies | 11913-019 | CD293 |
| 96-well PDL white/clear plate | BD BioCoat | 356693 | plates |
| Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Lipofectamine |
| Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay | Promega | E2980 | dual glo |
| Synergy S2 | BioTek | SLAD | BioTek S2 |
| Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Gen5 | Gen5 |
| BIOSTACK | BioTek | BIOSTACK2WR | BioStack |
| Multiflo | BioTek | MFP | MultiFlo |
| 300 μl GripTips | Integra | 4433 | GripTips |
| 12.5 μl GripTips | Integra | 4414 | GripTips |
| 300 μl GripTips ViaFlo96 | Integra | 6433 | XYZ tips |
| 12.5 μl GripTips 384 XYZ | Integra | 6403 | XYZ tips |
| 384ViaFlo | Integra | 6030 | 384ViaFlo |
| TE buffer | Macherey Nagel | 740797.1 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | DMSO |
| Forskolin | Enzo Life Sciences | BML-CN100-0010 | FOR |
References
- Wetzel, C. H., Oles, M., Wellerdieck, C., Kuczkowiak, M., Gisselmann, G., Hatt, H. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
- Spehr, M., et al. Identification of a testicular odorant receptor mediating human sperm chemotaxis. Science. 299 (5615), 2054-2058 (2003).
- Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical senses. 30 (1), 69-80 (2005).
- Matarazzo, V., et al. Functional characterization of two human olfactory receptors expressed in the baculovirus Sf9 insect cell system. Chemical senses. 30 (3), 195-207 (2005).
- Jacquier, V., Pick, H., Vogel, H. Characterization of an extended receptive ligand repertoire of the human olfactory receptor OR17-40 comprising structurally related compounds. Journal of neurochemistry. 97 (2), 537-544 (2006).
- Neuhaus, E. M., Mashukova, A., Zhang, W., Barbour, J., Hatt, H. A specific heat shock protein enhances the expression of mammalian olfactory receptor proteins. Chemical senses. 31 (5), 445-452 (2006).
- Shirokova, E., et al. Identification of specific ligands for orphan olfactory receptors. G protein-dependent agonism and antagonism of odorants. The Journal of biological chemistry. 280 (12), 11807-11815 (2005).
- Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468-472 (2007).
- Menashe, I., et al. Genetic elucidation of human hyperosmia to isovaleric acid. PLoS biology. 5 (11), (2007).
- Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science signaling. 2 (60), (2009).
- Jaeger, S. R., et al. A Mendelian Trait for Olfactory Sensitivity Affects Odor Experience and Food Selection. Current Biology. 23, 1-5 (2013).
- DeMaria, S., Ngai, J. The cell biology of smell. The Journal of cell biology. 191 (3), 443-452 (2010).
- Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nature nauroscience. 5 (2), 124-1233 (2002).
- Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome research. 11 (5), 685-702 (2001).
- Olender, T., Lancet, D., Nebert, D. W. Update on the olfactory receptor (OR) gene superfamily. Human Genomics. 3 (1), 87 (2008).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nature reviews. Neuroscience. 5 (4), 263-278 (2004).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
- Araneda, R. C., Kini, aD., Firestein, S. The molecular receptive range of an odorant receptor. Nature. 3 (12), 1248-1255 (2000).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
- Katada, S., Hirokawa, T., Oka, Y., Suwa, M., Touhara, K. Structural basis for a broad but selective ligand spectrum of a mouse olfactory receptor: mapping the odorant-binding site. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25 (7), 1806-1815 (2005).
- Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic Reticulum Retention, Degradation, and Aggregation of Olfactory G-Protein Coupled Receptors. Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).
- McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain research. Molecular brain research. 48 (2), 270-278 (1997).
- Zhao, H. Functional Expression of a Mammalian Odorant Receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Kajiya, K., Inaki, K., Tanaka, M., Haga, T., Kataoka, H., Touhara, K. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
- Krautwurst, D., Yau, K., Reed, R. R., Hughes, H. Identification of Ligands for Olfactory Receptors. Cell. 95, 917-926 (1998).
- Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Science signaling. 4 (155), (2011).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature. 3 (9), 1402-1413 (2008).
- Haddad, R., Khan, R., Takahashi, Y. K., Mori, K., Harel, D., Sobel, N. A metric for odorant comparison. Nature methods. 5 (5), 425-429 (2008).
- Veithen, A., Wilkin, F., Philippeau, M., Van Osselaer, C., Chatelain, P. Olfactory Receptors: From basic science to applications in flavors and fragrances. Perfumer and Flavorist. 35 (1), 38-40 (2010).
- Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (8), 3033-3043 (2002).
- Oka, Y., Katada, S., Omura, M., Suwa, M., Yoshihara, Y., Touhara, K. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
- Zhao, H., Ivic, L., Otaki, J. M., Hashimoto, M., Mikoshiba, K., Firestein, S. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 4040-4045 (1999).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. The Journal of biological chemistry. 282 (20), 15284-15293 (2007).
- McRae, J. F., Mainland, J. D., Jaeger, S. R., Adipietro, K. A., Matsunami, H., Newcomb, R. D. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the "grassy" smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical senses. 37 (7), 585-593 (2012).
- Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS genetics. 8 (7), (2012).
- Zhuang, H., Chien, M. -S., Matsunami, H. Dynamic functional evolution of an odorant receptor for sex-steroid-derived odors in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21247-21251 (2009).
- Oka, Y., Nakamura, A., Watanabe, H., Touhara, K. An odorant derivative as an antagonist for an olfactory receptor. Chemical senses. 29 (9), 815-822 (2004).
- Oka, Y., Omura, M., Kataoka, H., Touhara, K. Olfactory receptor antagonism between odorants. The EMBO journal. 23 (1), 120-126 (2004).
- Fawcett, T. An introduction to ROC analysis. Pattern Recognition Letters. 27 (8), 861-874 (2006).
- Baghaei, K. A. Olfactory Receptors. Olfactory Recept. Methods Protoc. 1003, 229-238 (2013).
- Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. Assaying surface expression of chemosensory receptors in heterologous cells. Journal of visualized experiments JoVE. (48), (2011).
