Summary
Luktreceptoraktiveringsmönster koda lukt identitet, men bristen på publicerade data som identifierar doftligander för däggdjursluktreceptorer hindrar utvecklingen av en heltäckande modell av lukt kodning. Detta protokoll beskriver en metod för att underlätta hög genomströmning för identifiering av luktreceptorligander och kvantifiering av receptoraktivering.
Abstract
Odörer skapa unika och överlappande mönster av luktreceptoraktivering, vilket gör att en familj på ca 1.000 murina och 400 humana receptorer för att känna igen tusentals luktämnen. Doftligander har publicerats för färre än 6% av humana receptorer 1-11. Denna brist på information beror delvis på svårigheter funktionellt uttrycker dessa receptorer i heterologa system. Här beskriver vi en metod för att uttrycka de flesta av det olfaktoriska receptorfamiljen i Hana3A celler, följt av hög genomströmning bedömning av luktreceptoraktivering med användning av en luciferas-reporteranalys. Denna analys kan användas för att (1) skärmpaneler av odörer mot paneler av luktreceptorer; (2) bekräfta lukt / receptor interaktion via dos-responskurvor; och (3) jämföra receptoraktiveringsnivåer bland receptorvarianter. I vår exempeldata har 328 luktreceptorer screenas mot 26 doftämnen. Luktämne / receptorpar med varierande svars ställningar var urvalted och testas i dos respons. Dessa data indikerar att en skärm är en effektiv metod att anrika odorant / receptor par som kommer att passera en dos-responsexperiment, dvs receptorer som har en bona fide-svar på ett luktämne. Därför är denna hög genomströmning luciferasanalys en effektiv metod för att karaktärisera olfaktoriska receptorer-ett väsentligt steg i riktning mot en modell av lukt kodning i däggdjurens olfaktoriska systemet.
Introduction
Den däggdjur luktsinne har förmågan att svara på ett stort antal luktande stimuli, gör det möjligt att upptäcka och diskriminering av tusentals luktämnen. Luktreceptorer (OR) är de molekylära sensorer som uttrycks av lukt sensoriska nervceller i luktepitel 12. Däggdjurs lukt erkännande sker genom differentiell aktivering av yttersta randområdena av luktämnen, och OR genfamiljen är omfattande, med ungefär 1.000 murina och 400 humana receptorer 12-16. Tidigare funktionella analyser av de yttersta randområdena i doft nervceller och i heterologa celler har visat att olika doftämnen är erkända av unika, men överlappande ensembler av yttersta rand 10,17-20. Matchande ligander till de yttersta randområdena är avgörande för förståelsen av lukt kod och nödvändiga för att bygga hållbara modeller av luktsystemet. På grund av svårigheter som uttrycker yttersta randområdena i heterologa system samt det stora antal både luktämnen och de yttersta randområdena, har dessa data i stort sett varit frånvarande från field; Färre än 6% av den mänskliga yttersta randområdena har en publicerad ligand 1-11. Detta protokoll beskriver användningen av en luciferasanalys att karakterisera odorant / ELLER interaktioner. Denna analys möjliggör hög genomströmning karakterisering av yttersta randområdena, en uppgift som är nödvändig för att förstå luktämnen / ELLER interaktioner samt att utveckla en modell för lukt kodning.
Hög genomströmning studier av yttersta randområdena står inför tre stora utmaningar. Först var de yttersta randområdena som uttrycks i heterologa celler kvar i ER och degraderas därefter i proteasomen 21,22, hindrar de yttersta randområdena från att interagera med odörer i analyssystemet 23-25. Detta problem togs upp av upptäckten av tillbehör proteiner som underlättar stabila cellytan uttryck för ett brett spektrum av yttersta randområdena 19,26,27. Receptor-transportör-protein 1 och 2 (RTP1 och 2) främja ELLER cellyteexpression och aktivering som svar på luktämnen stimulering 19. Baserat på detta arbete, HEK293T cellermodifieras för att stabilt uttrycka RTP1 lång (RTP1L) och RTP2, receptorexpressionsförstärkande protein 1 och G αolf, vilket resulterar i Hana3A cellinjen 19,27. Dessutom typ 3 muskarinacetylkolinreceptorn (M3-R) samverkar med ORs vid cellytan och förbättrar aktivering som svar på doftämnen 26. Co-transfektion av en OR med RTP1S och M3-R in Hana3A celler resulterar i robusta, konsekvent och funktionellt uttryck av ett brett spektrum av ORs vid cellytan 27. För det andra, däggdjurs-eller repertoarer är ganska stora. Hos människor, till exempel, är det OR repertoar en storleksordning talrikare än den smakreceptorrepertoar, och 2 storleksordningar talrikare än den visuella receptorrepertoar. Trots att klona en enda OR är en relativt enkelt protokoll, är betydande initiala insatser som krävs för att skapa ett omfattande bibliotek. För det tredje, även om vi vet att i en syn, översätter våglängd i färg ochi audition frekvens leder till beck, är organisationen av lukter dåligt kända, vilket gör det svårt för forskare att interpolera från ett representativt urval av doftämnen. Även om vissa framsteg har gjorts på den fronten 10,28, kartan över lukt landskapet är fortfarande ofullständig. Screening tiotusentals molekyler mot hundratals yttersta randområdena är en svår uppgift; hög genomströmning skärmar på detta område kräver noga definierade kampanjer. De stora utmaningar som återstår är de av logistik och kostnader snarare än problem inneboende i tekniken. Även heterologa screening inte har i stor utsträckning använts för att identifiera ligander med akademiska grupper, har ett privat företag använt samma teknik för att identifiera ligander för 100 mänskliga yttersta randområdena 29. Tyvärr är dessa uppgifter förblir äganderätt.
Den hög genomströmning luciferasanalysen beskrivs här har flera fördelar jämfört med alternativa metoder för att bedöma eller aktivering. Fastän ansvarigtses av inhemska lukt sensoriska neuroner har mätts med hjälp av elektrofysiologi och kalcium avbildning, dessa tekniker har svårt att retas isär vilket ELLER leder till en neuron svar på grund av överlappningen i svarsegenskaper för lukt nervceller. Trots att knacka in en GFP-märkt receptor typ 30,31, leverera specifika receptorer via adenovirus att murina lukt nervceller 32,33, eller utförande av RT-PCR efter inspelningar 17,24,33 kan länka inspelningar till enstaka receptortyper, dessa metoder är låg genomströmning och inte lämpar sig för storskalig skärmar. Heterologa screening system är mer skalbara, och två stora former finns i litteraturen: cAMP vägen reportrar och inositol trifosfat (IP3) pathway reportrar. Vid luktstimulering, ORs aktivera ett G αolf transduktion signalkaskad som resulterar i produktionen av cykliskt AMP (cAMP) 12. Genom sam-transfektera en eldfluga luciferas-reportergenen under kontroll av acAMP-responselement (CRE), kan luciferas produktion mätas som en funktion av luktsvar, vilket möjliggör kvantifiering av ELLER-aktivering. Eller aktivering kan också vara kopplade till IP3 pathway genom samuttrycker G-proteiner såsom G α15/16 eller en G α15-olf chimären 24,25,34. Vi har valt den analys som presenteras här bygger på tre faktorer: (1) samuttrycket av RTP1 med Rho-taggade luktreceptorer ökar uttrycket av luktreceptorer på cellytan 19,27; (2) användning av ett cAMP-reportergen möjliggör mätning av eller aktivering genom den kanoniska andra budbärarreaktionsväg; och (3) analysen är väl lämpad för hög genomströmning skärmar.
Denna high-throughput luciferas-analysen kan tillämpas på en mängd olika studier värdefulla för området olfaction. För det första kan ett stort antal ORs screenas mot ett enda luktämne för att bestämma receptoraktiveringsmönster för en specific luktämne. Denna typ av studie identifierade OR7D4 som OR ansvarig för att svara på steroider luktämnen androstenon 8. Omvänt, en ELLER kan screenas mot en panel av luktämnen i syfte att bestämma profilen receptorsvar 10. När kandidaten lukt odorant / ELLER paren identifieras via dessa skärmar, kan interaktion bekräftas genom att utföra en dos-responsexperiment undersöka svaret från ELLER till ökande koncentrationer av luktämnen. Dos-responskurvor kan också bedöma hur genetisk variation i en OR påverkar in vitro luktämnen svar 8,9,11,35, och dessa studier kan utökas till mellanarts ELLER variation, gör det möjligt att undersöka receptor evolution mellan arter och kausala mutationer i evolutionen 36,37, slutligen denna analys kan användas för att screena för lukt antagonister, som är i stånd att antagonisera ELLER svar på en särskild luktämne för en känd odorant / receptorparet 38,39. I sammanfattning, denna högaGenomströmning luciferas-analysen är tillämplig på en rad studier som hjälper karakterisera ELLER aktiveringsmönster och ge en bättre förståelse av lukt kodning i luktsinnet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kultur av Hana3A Cells
- Förbered M10 media genom att komplettera minimalt essentiellt medium (MEM) med 10% (volym / volym) FBS.
- Kultur Underhåll
- Behåll celler i M10 media. ANMÄRKNING: expressionsvektorer för RTP1L, RTP2, REEP1 och G αolf förläna puromycinresistens till Hana3A celler, men att upprätthålla cellerna med detta antibiotikum inte signifikant påverka analysresultat.
- Subkultur vid ett förhållande av 1:08 i 10 cm skålar var 2-3 dagar.
- Inkubera vid 37 ° C med 5% CO2.
2. Utstrykning av celler för transfektion
- Aspirera media från en 100% sammanflytande 10 cm skål av Hana3A celler.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 10 ml PBS, virvlande skålen och aspirera PBS.
- Lägg 3 ml av 0,05% trypsin / EDTA och vänta på celler för att dissociera (ca 1 min).
- Inaktivera trypsin genom tillsats av 5 ml M10 och bryta upp cellklumpar genom finfördelning ungefär 10x &# 160, med en 10 ml pipett. Pipettera försiktigt för att undvika att införa luftbubblor i materialet.
- För varje 96-brunnsplatta, överföring 1 ml av cellerna till ett 15 ml koniskt rör, centrifugera vid 200 xg under 5 min och aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten.
- Resuspendera cellerna i 6 ml M10 per 1 ml av celler som överförs i steg 2,5.
- Pipettera 50 | il av celler till varje brunn i en 96-brunnars platta och inkubera över natten vid 37 ° C med 5% CO2.
3. Transfektion av luktreceptorer
- Framställning av plasmid-DNA
- Bered-plasmid-DNA via en endotoxinfri protokoll. OBS: Använd plasmid DNA förberedelsepaket betecknas "endotoxin-fria" eller lägga till en fenol-kloroform extraktion steg till plasmid-DNA förberedelse protokollet.
- Späd ut DNA till en koncentration av 100 ng / pl i TE-buffert.
- Observera pläterade celler (steg 2,7) för att säkerställa en korrekt confluency av tillnärmningtely 30-50% per brunn och återgå till inkubatorn. OBS: Även om detta sammanflytning inte är optimalt för lipid transfektion reagens, är optimalt för att mäta luciferasaktivitet 24 timmar efter transfektion en sammanflytning av 30-50% vid detta steg.
- Framställning av Transfektion Mix
- Pipett RTP1S-PCI M3-R-PCI pCRE-luc och pSV40-RL plasmider i MEM-medium per volymerna anges i tabell 1 för att göra plasmid mix (volymer är per 96-brunnar).
Plasmid mix per brunn per 96-brunnars platta MINNE - 500 | il RTP1S-PCI- 5 ng 480 ng M3-R-PCI- 2,5 ng 240 ng pCRE-luc 10 ng 960 ng pSV40-RL 5 ng 480 ng
Tabell 1. Plasmid mix komponenter. Per brunn och per 96-hålsplatta volymer RTP1S-PCI M3-R-PCI pCRE-luc och pSV40-RL, och MEM. - För varje 96-brunnsplatta, späd 18 | il lipid transfektion reagens i 450 pl MEM-medium.
- Pipett Plasmid mix (från steg 3.3.1), rhodopsin-taggad luktreceptor i pCI plasmid (Rho-ELLER-PCI), och lipid transfektion mix (från steg 3.3.2) för att göra det komplexa i detalj i
Complex per brunn per brunn + 10% Plasmid mix 4,2 ^ il 4,58 | il Rho-OR-pCI 0,05 ng 0,06 ng Lipid transfektion mix 4,2 ^ il 4,58 | il M10 41,7 | il 45,83 ^ il
Tabell 2. Komplexa komponenter. Per brunn och per brunn + 10% volymer av plasmid-blandning (tabell 1), luktreceptor plasmid (Rho-ELLER-pCI) och lipid-transfektion mix. M10 tillsätts för att stoppa reaktionen efter en 15 minuters inkubation vid rumstemperatur.
- Pipett RTP1S-PCI M3-R-PCI pCRE-luc och pSV40-RL plasmider i MEM-medium per volymerna anges i tabell 1 för att göra plasmid mix (volymer är per 96-brunnar).
- Knacka ut media på plattorna.
- Pipettera 50 pl av komplexet till varje brunn och inkubera över natten vid 37 ° C med 5% CO2.
4. Lukt Stimulering
- Följ de transfekterade cellerna för att säkerställa en korrekt confluency på 50-80% per brunn och återgå till inkubatorn. OBS: Om celler är mindre än 50% Sammanflytande, eldfluga luciferas och Renilla luciferas avläsningar kan vara för låg för mätning av receptoraktivering. Överväg att kasta plattan.
- Bered en M stamlösningar av varje lukt i DMSO.
- Förbered lukt stimulerings lösningar i CD293-medium.
- För screeningexperiment, späd stamlösning av lukt till 100 iM. Förbereder även en no-luktkontroll (CD293 endast) för att kontrollera för eller bakgrundsaktivering. OBS: För screeningexperiment är varje OR / lukt paret testas bara en gång per experiment. Eftersom vissa lukt diffusion över brunnar är möjligt, rekommenderas att stimulera med ett luktämne för varje platta.
- För dos responsexperiment, förbereda sju 10-faldiga spädningar av luktstamlösning i tre exemplar med början på 1 mM för varje receptor. Också förbereda samma lukt spädningar i tre exemplar för tomma vektor-transfekterade celler för att kontrollera för lukt bakgrund aktivering. OBS: För dos responsexperiment, varje obehandlings dor koncentration bör ske i tre exemplar.
- Knacka ut media på plattorna.
- Pipettera 25 | il av lukt stimulering lösning till varje brunn och inkubera under 4 timmar.
5. Mätning eller aktivitet via luciferas analys
- Resuspendera eldfluga luciferas substrat per tillverkarens anvisningar och förvara vid -80 ° C.
- Tina 1 ml eldflugeluciferas substrat per 96-brunnar.
- Bered färsk eldflugeluciferas reaktionssläckare och Renilla-luciferas substratreagens (5 | il luciferas quencher / Renilla-luciferas-substrat per 1 ml buffert). OBS: Cirka 1 ml av reagens behövs per 96-brunnar.
- Förbered luminiscerande mikroplattläsare. Öppna mikroplattläsare programvara. Inom ikonen systemet:
- Under "Förvärmning" fliken, kryssa i rutan för "ON" och ställa in temperaturen i maskinen till 25 °; C.
- Under "Dispenser" fliken, prime varje dispenser med 1.000 l av 70% etanol följt av 1.000 il destillerat vatten. OBS: Använd separata alikvoter av alkohol och vatten för varje dispenser. Etanol används för att desinficera de automater, och vatten avlägsnar rester av etanol.
- Prime varje dispenser med 1.500 l av luft (ta bort automater från vätska). OBS: grundning med luft ser till att luciferas substrat inte späds med resterande vatten.
- Prime dispenser 1 med 1,080 l av eldfluga luciferas substrat (från steg 5,2). Prime dispenser 2 med Renilla luciferas substrat (från steg 5,3). OBS: Var noga med att inte kors förorena luciferas substrat. Grundning med luciferas substrat fyller döda utrymmet i reagens automater.
- Ställ in följande protokoll för att läsa både eldfluga och Renilla luciferas luminiscens. I mjukvaran i samband med mikroplattläsare, under menyn "File", klicka på "Ny aktivitet". Markera "Protokoll" och klicka på "Skapa nytt". I nästa fönster, bör cirkeln bredvid "Standardprotokollet" väljas. Klicka på "OK." Dubbelklicka på "hantering" på vänster sida av skärmen.
- Fördela 10 pl eldfluga luciferas substrat till alla brunnarna med dispenser 1. Under menyn "Åtgärder", klicka på "Hoppa över". I "Fördela Step"-fönstret, ange: "Dispenser" till 1, "Priming" till inga, "Dispense Volume" till 10 l och "Rate" till 225 l / sek. Klicka på "OK".
- Skaka plattan under 30 sek. Under menyn "Åtgärder", klicka på "Shake". I "Shake Step"-fönstret, ställa in "Intensity" till Medium och "Varaktighet" till 0:30 MM: SS. Klicka på "OK".
- Läs luminescensen av alla brunnar för 0,5 sek per brunn. Under menyn "Åtgärder", klicka på "Läs",. I "Läs Step"-fönstret, ange: "Detection Method" till Luminescence, "Läs Type" till Endpoint, "Integration Time" till 00:00:50 MM: SS: ss, "Filter Sets" till 1, "Emission" till Hole, "Optik Position" Topp, "Gain" till 135, och "Läs höjd" till 1.00 mm. Klicka på "OK".
- Fördela 10 pl Renilla luciferas substrat till alla brunnarna med dispenser 2. Ställ förutsättningar som i steg 5.6.1, utom set "Dispenser" till 2.
- Skaka plattan under 30 sek. Ange de villkor som i steg 5.6.2.
- Läs luminiscens av alla brunnar för 0,5 sek per brunn. Ange de villkor som i steg 5.6.3.
- Ta bort locket från den 96-brunnsplatta och placera plattan i mikroplattavläsare. Starta programmet inrättades i steg 5,5 för att läsa platta luminiscens.
- Rengör dispenserpumpar reagens. Från ikonen systemet under "Dispenser"-fliken:
- Purge 1.000 l av firefly luciferassubstrat från eldfluga luciferas dispenser i en återvinningsröret. Anmärkning Eldflugeluciferas kan lagras vid -80 ° C och återanvändas.
- Prime varje dispenser med 1000 | il destillerat vatten, följt av 1000 | il av 70% etanol, och slutligen 1500 pl av luft (avlägsna dispensrar från vätska). OBS: Vatten tar bort luciferas substrat från reagens pumpar, etanol desinficerar och luft torkar alla rester av etanol.
6. Dataanalys
- Data Export
- I mikroplattläsare programvara, dubbelklicka på "Rapport / Export Builders" på vänster sida av skärmen.
- Klicka på knappen "Ny Exportera till Excel" och klicka på "OK".
- Markera Export1 och klicka på "Redigera".
- Under "Innehåll" check "Systembeskrivning", "Procedure", "Plate Beskrivning", och "Plate Layout Matrix". Inkludera "Rådata" and "Beräknad data".
- Under "Workflow", kolla "Autoexecute om förfarandet slutförs". Enligt Exportläge, kolla "Alla plattor i samma arbetsbok" och "Som ett nytt kalkylblad".
- Under "File" välja filnamn format och sökväg, och klicka på "OK".
- Stäng "Rapport / Export Builders" fönstret.
- För att erhålla normaliserade luciferas värden, dela eldflugeluciferas luminiscens läsning för varje brunn (steg 5.6.3) av Renilla luminiscens läsning för varje brunn (steg 5.6.6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En primär skärm testade 328 yttersta randområdena mot 26 lukter vid en koncentration av 100 mikroM. Denna lukt koncentration har demonstrerats att effektivt aktivera en stor andel av ORs med kända ligander 10. Först var normaliserad luciferasaktivitet beräknas genom att dividera eldflugeluciferas behandlingen i Renilla luciferas läsning. Därefter har baselined värden beräknas genom att subtrahera de normaliserade luciferas avläsningar för ingen lukt kontroll från de normaliserade luciferas avläsningar för varje brunn (Figur 1). Dos-responskurvor utfördes på 48 odorant / ELLER paren slumpmässigt fördelade över hela skalan av baselined värden, såsom indikeras av färgade staplarna i Figur 1. ORs behandlades med 7 koncentrationer av luktämnen som spänner över 1 nM till 1 mM, och de resulterande svaren var passform till en sigmoidal kurva med användning av icke-linjär regression. Ett doftämne / ELLER ansågs vara en agonist om den träffade tre kriterier: (1) det standardfelden logEC 50 var mindre än 1 log enhet; (2) De 95% konfidensintervall för de övre och nedre parametrar hos kurvan inte överlappar; och (3) den extra belopp-av-kvadrater-test bekräftade att odorant aktiverat de ELLER-innehållande celler signifikant fler än kontrollceller, vilka transfekterades med en tom vektor. Dos-respons Resultaten sammanfattas i Tabell 3.
Dessa data användes sedan för att avgöra hur väl analysmätningar i en primär screening förutsäga resultaten från dosresponskurvan. Blå staplar i figur 1 motsvarar par som klassificerades som agonister i en full dos svarsexperiment, medan röda staplar inte uppfyllde våra tre kriterier som anges ovan. Värden från den primära skärmen förutspådde resultat från full dos svarsexperiment (område under mottagaren kurva (AUC) = 0,68, p <0,01, Mann-Whitney U-test), vilket tyder på att vår primära skärmen är en användbar metod att anrika lukt / eller par som kommer att klassificeras som agonister i en full dos svarsexperiment (Figur 2).
Figur 1. Frekvens av baselined luciferas värden för en skärm med en panel av luktreceptorer och luktämnen. Histogram av frekvensen (greve) av baselined luciferas värden som beräknas för varje doftämne / ELLER par i den primära skärmen. Som luktämnen / receptoraktivering paren är gles, är majoriteten av värdena centrerad vid noll och den stora, centrala distributions uppskattar brusfördelningen för denna analys. Färgade staplar indikerar odorant / receptorpar valts för dos-responsanalys; blå staplar är par som klassificerades som agonister månads svars full dos, och röda staplarna är par som inte var klassificerade som agonister.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51640/51640fig1highres.jpg" target = "_blank"> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. ROC-kurva för lukt / receptor-skärmen. 48 luktämnen / receptorpar klassificerades som agonister eller som inte är agonister. Sant positivt frekvens (känslighet) sattes sedan plottas mot den falska positiva hastigheten (1-specificitet) med användning av R statistikpaketet 40. Arean under kurvan (AUC) är 0,68, vilket tyder på att luktämnen / receptor par med högre värden luciferas skärm är mer benägna att passera dos respons än de med lägre värden. Klicka här för att visa en större bild.
| Baselined Standard | Dose Response |
| 0,051793067 | misslyckas |
| 0,006376956 | misslyckas |
| 0,331936398 | passera |
| 0,591006519 | passera |
| 0,049093369 | passera |
| 0,396788976 | passera |
| -0,013655743 | passera | 0,011080217 | passera |
| 0,004203349 | misslyckas |
| 0,003975049 | misslyckas |
| -0,077935718 | passera |
| -0,084488317 | passera |
| 0,030236078 | misslyckas |
| -0,042963576 | misslyckas |
| 0,031466406 | misslyckas |
| 0,025897747 | misslyckas |
| -0,030434651 | misslyckas |
| -0,004122795 | misslyckas |
| -0,010075533 | misslyckas |
| 0,028883452 | misslyckas |
| 0,019402373 | misslyckas |
| 0,047508749 | misslyckas |
| 0.00255344 | misslyckas |
| 0,017221449 | misslyckas |
| 0,340216655 | passera |
| -0,026912181 | misslyckas |
| 0,037140428 | misslyckas |
| 0,467763017 | passera |
| 0,097665337 | misslyckas |
| 0,080657267 | passera |
| 0,172819211 | passera |
| 0.05568393 | passera |
| -0,106721064 | passera |
| 0,136614849 | passera |
| 0,457839849 | misslyckas |
| 0,211751741 | misslyckas |
| 0.1581464 | passera |
| -0,62099155 | passera |
| -0,066949491 | passera |
| -0,78712035 | passera |
| 0,752503007 | passera |
| 1,433407558 | passera |
| 0,475431098 | passera |
| 1,457936815 | passera |
| 0,048652537 | misslyckas |
| 0,027196782 | misslyckas |
| 0,129599842 | misslyckas |
| -0,069781272 | misslyckas |
| 0,016450039 | misslyckas |
| -0,025639207 | misslyckas |
| 0,158152141 | misslyckas |
| -0,032570055 | misslyckas |
| 0,140139926 | misslyckas |
| -0,052030276 | misslyckas |
| 0,657140133 | passera |
| 1,040410297 | passera |
| passera | |
| 0,399588712 | passera |
| 0,188094387 | passera |
| 0,039371424 | passera |
| 0,016784352 | passera |
| 0,229959571 | passera |
| 0,238381997 | misslyckas |
| 0,074118909 | misslyckas |
| 0,423901128 | passera |
| 0,152621022 | passera |
| passera | |
| 0,075301806 | passera |
| 0,395233972 | passera |
| 0,261892958 | passera |
| 0,156693306 | misslyckas |
| 2,163418147 | passera |
| 3,649862104 | passera |
| 0,025716169 | passera |
| -0,033258008 | passera |
| -0,026984127 | misslyckas |
| -0,338441868 | passera |
| 0.37398618 | passera |
Tabell 3. Olfactory receptor / lukt paren testas i dos respons. Baselined luciferas värden och dos-respons resultat (godkänd eller underkänd) för 48 OR / lukt par väljs från skärmen. För 30 par som testades i två gånger på skärmen, är båda baselined luciferas värdena inkluderade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Luktämnen identitet kodas av luktreceptoraktiveringsmönster, men receptoraktiveringsmönster, bland vilka receptorer aktiveras och i vilken utsträckning, är kända för färre än 6% av den mänskliga luktreceptorer 1-11. Arbetet med att karakterisera luktreceptorer har begränsats av deras arbetsintensiva metoder eller tillämplighet på endast en delmängd av luktreceptorfamiljen 17,23,24,33,34. Den Hana3A heterologa expressionssystemet stöder robust uttryck av majoriteten av testade luktreceptorer, och kan användas i samverkan med en cAMP-responsiva luciferas reportersystem för att övervaka olfaktoriska receptoraktivering 19,26,27. Utförande av denna analys i ett 96-brunnsformat stöder ett antal high-throughput experimentell design, inklusive skärmar för att fastställa troliga kandidater för luktämnen / luktreceptor par och dos-responskurvor för att bekräfta interaktioner och bedöma hur receptoraktiveringsnivåerna är afkas av variationer intra-och interspecifika. Luktämne / receptor par med högre aktivitetsvärden i en skärm är mer benägna att visa en signifikant respons dos. Dessa data tyder på att denna screeningmetod kan berika för luktämnen / receptor par som kommer att passera dos respons, vilket underlättar identifieringen av luktligander och luktreceptoraktiveringsmönster.
Framgången för denna analys optimerad för luktreceptoranalys är beroende av flera faktorer. Alla plasmid-DNA måste förberedas genom en endotoxin fritt protokoll. Konsekvent olfaktoriska receptoruttryck på cellytan är kritisk. Den Hana3A cellinje uttrycker stabilt flera tillbehör proteiner som stöd i eller uttryck, men co-transfektion av RTP1S och M3-R förstärker receptoruttryck och aktivering, respektive 27. Denna kombination av accessoriskt protein expression resulterar i tillförlitlig uttryck av de flesta luktreceptorer, vilket tillåter JÄMFÖRELSEn ELLER aktivering bland experiment och receptorer. Dessutom är det viktigt för att få konsekventa resultat övervakning av cellsammanflytning. Förutsatt att cellerna i den ursprungliga 10 cm 2 maträtt är ungefär 100% konfluenta, enligt det protokoll som beskrivits häri resulterar i tillförlitlig cellsammanflytning genom hela experimentet. Viktigt är att tillräckligt många celler vara klädd för att erhålla en mätbar luciferas läsning, men celler kommer inte att övervuxen, ett tillstånd som kan påverka receptoraktivering efter luktämnen stimulering. Normalisera för konstitutiva Renilla expressionsvektorer styr vidare inte endast för celltäthet, men även för transfektionseffektivitet. En Renilla luciferas läser mer än 2,5 standardavvikelser under medelvärdet kan tyda på cellförlust. Celler bör pläteras likformigt för att undvika täta placker som frigörs lättare från plattans yta än glesare celler och transfektions-och luktämnen lösningar bör läggas försiktigt på sidan av brunnen för att undvika frånkoppling cells. Cellförlust kan också vara på grund av celldöd som orsakas av luktämnen toxicitet, ett problem som kan kringgås genom att sänka odorant koncentration, eller överdriven DMSO, vilket kan undvikas genom att hålla DMSO-koncentrationer under 0,5%. Slutligen kan behandla varje receptor-uttryckande cellpopulation med en pM forskolin, en adenylylcyklas aktivator som orsakar luciferas reporter expression från den cAMP-responspromotor, tjänar som en positiv kontroll för analysen.
Även om analysen som beskrivs här är en förbättring jämfört med alternativa metoder, bland annat en hög genomströmning format och mer generell tillämplighet på däggdjurens luktreceptorfamiljen, den har begränsningar. Först, vår in vitro-analys saknar många komponenter i en in vivo luktsystemet, inklusive doft bindande proteiner, en slemhinneskiktet, intracellulära molekyler och sniffar beteenden. För det andra bygger denna metod på ett luciferas reporter system för att mäta luktreceptoraktivering i motsats till vanliga alternativa metoder som utnyttjar kalcium avbildning. Senaste arbete tyder på att dessa två metoder kan ge motstridiga resultat; ja, några luktreceptorer svarar på en viss luktämnen vid undersökning via kalcium avbildning men inte luciferasanalysen 41. Oavsett om en analys typ är mer relevant för studier av människans lukt uppfattning är fortfarande oklart, men båda metoderna kan vara användbara beroende på sammanhang och receptortypen. För det tredje, medan det funktionella expressionssystem har med framgång använts för att uttrycka de flesta testade däggdjursluktreceptorer, vissa yttersta randområdena kanske inte är mottaglig för uttryck med hjälp av det här systemet. Om tidigare okarakteriserade receptorer inte svarar på en lukt, kan det bero på bristande uttryck på cellytan snarare än en brist på samspel mellan lukt och receptor. Receptor cellyteexpression kan undersökas via immunofluorescens innan några slutsatser dras från negativa analysresultat 27,42 38,39, måste de flesta receptorer först stimuleras med en doft för att observera en minskning av luciferasaktivitet.
Trots dessa begränsningar har detta analyssystem förmåga att i hög grad öka datainsamling inom olfaction. För det första gör high-throughput 96-brunnsformat storskaliga receptor-och / eller lukt skärmar genomförbart. För det andra är dess heterologa expressionssystem som är tillämplig på en mängd olika däggdjurs olfaktoriska receptorer. För det tredje kan luciferasaktiviteten användas för att mäta olfaktoriska receptoraktivering, vilket är värdefullt vid beskrivningen av receptoraktiveringsmönster för en viss luktämne. För det fjärde, tidigare resultat från liknande in vitro-testsystem förutse människans lukt uppfattning 8,11,35. Dessa egenskaper är particbundet viktigt med tanke på den stora storleken på däggdjur luktreceptorfamiljen och vår begränsade kunskap om de eller aktiveringsmönster som framkallas av vissa lukter. Bred tillämpning av detta analyssystem optimerat för luktreceptoranalys kommer att bidra till en mer heltäckande bild av luktreceptor / luktämnen interaktion och den molekylära grunden för lukt kodning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av R01 DC013339, R03 DC011373, och Ruth L. Kirschstein National Research Service Award T32 DC000014. En del av det arbete som utfördes med hjälp av Monell Chemosensory Receptor Signa Core, som stöds, delvis, genom finansiering från NIH-NIDCD Kärna Grant P30 DC011735. Författarna tackar C. Sezille för hjälp med datainsamling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hana3A cells | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| RTP1S-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| M3-R-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| pCRE-luc | Agilent | 219076 | LUC |
| pSV40-RL | Promega | E2231 | RL |
| Minimum Essential Media, Eagle | Sigma Aldrich | M4655 | MEM |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | FBS |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-040-CV | PBS |
| Trypsin (0.05% Trypsin EDTA) | Life Technologies | 25300 | Trypsin |
| CD293 | Life Technologies | 11913-019 | CD293 |
| 96-well PDL white/clear plate | BD BioCoat | 356693 | plates |
| Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Lipofectamine |
| Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay | Promega | E2980 | dual glo |
| Synergy S2 | BioTek | SLAD | BioTek S2 |
| Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Gen5 | Gen5 |
| BIOSTACK | BioTek | BIOSTACK2WR | BioStack |
| Multiflo | BioTek | MFP | MultiFlo |
| 300 μl GripTips | Integra | 4433 | GripTips |
| 12.5 μl GripTips | Integra | 4414 | GripTips |
| 300 μl GripTips ViaFlo96 | Integra | 6433 | XYZ tips |
| 12.5 μl GripTips 384 XYZ | Integra | 6403 | XYZ tips |
| 384ViaFlo | Integra | 6030 | 384ViaFlo |
| TE buffer | Macherey Nagel | 740797.1 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | DMSO |
| Forskolin | Enzo Life Sciences | BML-CN100-0010 | FOR |
References
- Wetzel, C. H., Oles, M., Wellerdieck, C., Kuczkowiak, M., Gisselmann, G., Hatt, H. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
- Spehr, M., et al. Identification of a testicular odorant receptor mediating human sperm chemotaxis. Science. 299 (5615), 2054-2058 (2003).
- Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical senses. 30 (1), 69-80 (2005).
- Matarazzo, V., et al. Functional characterization of two human olfactory receptors expressed in the baculovirus Sf9 insect cell system. Chemical senses. 30 (3), 195-207 (2005).
- Jacquier, V., Pick, H., Vogel, H. Characterization of an extended receptive ligand repertoire of the human olfactory receptor OR17-40 comprising structurally related compounds. Journal of neurochemistry. 97 (2), 537-544 (2006).
- Neuhaus, E. M., Mashukova, A., Zhang, W., Barbour, J., Hatt, H. A specific heat shock protein enhances the expression of mammalian olfactory receptor proteins. Chemical senses. 31 (5), 445-452 (2006).
- Shirokova, E., et al. Identification of specific ligands for orphan olfactory receptors. G protein-dependent agonism and antagonism of odorants. The Journal of biological chemistry. 280 (12), 11807-11815 (2005).
- Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468-472 (2007).
- Menashe, I., et al. Genetic elucidation of human hyperosmia to isovaleric acid. PLoS biology. 5 (11), (2007).
- Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science signaling. 2 (60), (2009).
- Jaeger, S. R., et al. A Mendelian Trait for Olfactory Sensitivity Affects Odor Experience and Food Selection. Current Biology. 23, 1-5 (2013).
- DeMaria, S., Ngai, J. The cell biology of smell. The Journal of cell biology. 191 (3), 443-452 (2010).
- Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nature nauroscience. 5 (2), 124-1233 (2002).
- Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome research. 11 (5), 685-702 (2001).
- Olender, T., Lancet, D., Nebert, D. W. Update on the olfactory receptor (OR) gene superfamily. Human Genomics. 3 (1), 87 (2008).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nature reviews. Neuroscience. 5 (4), 263-278 (2004).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
- Araneda, R. C., Kini, aD., Firestein, S. The molecular receptive range of an odorant receptor. Nature. 3 (12), 1248-1255 (2000).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
- Katada, S., Hirokawa, T., Oka, Y., Suwa, M., Touhara, K. Structural basis for a broad but selective ligand spectrum of a mouse olfactory receptor: mapping the odorant-binding site. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25 (7), 1806-1815 (2005).
- Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic Reticulum Retention, Degradation, and Aggregation of Olfactory G-Protein Coupled Receptors. Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).
- McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain research. Molecular brain research. 48 (2), 270-278 (1997).
- Zhao, H. Functional Expression of a Mammalian Odorant Receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Kajiya, K., Inaki, K., Tanaka, M., Haga, T., Kataoka, H., Touhara, K. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
- Krautwurst, D., Yau, K., Reed, R. R., Hughes, H. Identification of Ligands for Olfactory Receptors. Cell. 95, 917-926 (1998).
- Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Science signaling. 4 (155), (2011).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature. 3 (9), 1402-1413 (2008).
- Haddad, R., Khan, R., Takahashi, Y. K., Mori, K., Harel, D., Sobel, N. A metric for odorant comparison. Nature methods. 5 (5), 425-429 (2008).
- Veithen, A., Wilkin, F., Philippeau, M., Van Osselaer, C., Chatelain, P. Olfactory Receptors: From basic science to applications in flavors and fragrances. Perfumer and Flavorist. 35 (1), 38-40 (2010).
- Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (8), 3033-3043 (2002).
- Oka, Y., Katada, S., Omura, M., Suwa, M., Yoshihara, Y., Touhara, K. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
- Zhao, H., Ivic, L., Otaki, J. M., Hashimoto, M., Mikoshiba, K., Firestein, S. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 4040-4045 (1999).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. The Journal of biological chemistry. 282 (20), 15284-15293 (2007).
- McRae, J. F., Mainland, J. D., Jaeger, S. R., Adipietro, K. A., Matsunami, H., Newcomb, R. D. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the "grassy" smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical senses. 37 (7), 585-593 (2012).
- Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS genetics. 8 (7), (2012).
- Zhuang, H., Chien, M. -S., Matsunami, H. Dynamic functional evolution of an odorant receptor for sex-steroid-derived odors in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21247-21251 (2009).
- Oka, Y., Nakamura, A., Watanabe, H., Touhara, K. An odorant derivative as an antagonist for an olfactory receptor. Chemical senses. 29 (9), 815-822 (2004).
- Oka, Y., Omura, M., Kataoka, H., Touhara, K. Olfactory receptor antagonism between odorants. The EMBO journal. 23 (1), 120-126 (2004).
- Fawcett, T. An introduction to ROC analysis. Pattern Recognition Letters. 27 (8), 861-874 (2006).
- Baghaei, K. A. Olfactory Receptors. Olfactory Recept. Methods Protoc. 1003, 229-238 (2013).
- Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. Assaying surface expression of chemosensory receptors in heterologous cells. Journal of visualized experiments JoVE. (48), (2011).
