Abstract
בלוטת התריס היא בלוטה האנדוקרינית bilobated המקומית בבסיס הצוואר, ייצור הורמוני בלוטת התריס T3, T4, וקלציטונין. T3 ו-T4 מיוצרים על ידי thyrocytes המובחן, שאורגן בתחומים סגורים הנקראים זקיקים, בעוד קלציטונין הוא מסונתז על ידי C-תאים, וביניהם בין הזקיקים ורשת צפופה של נימי דם. למרות שארכיטקטורה של בלוטת התריס למבוגרים ופונקציות כבר מתוארים בהרחבה ולמדו, היווצרות של היחידות "Angio-פוליקולרית", ההפצה של C-תאים בparenchyma והתקשורת אוטוקריני בין האפיתל ותאי האנדותל היא רחוק מלהיות מובן.
שיטה זו מתארת את השלבים רציפים של נתיחת עכבר בלוטת התריס עוברית anlagen ותרבותה על מסנני semiporous או בשקופיות פלסטיק מיקרוסקופית. בתוך פרק זמן של ארבעה ימים, מערכת זו התרבות בנאמנות משחזרת בהתפתחות בלוטת התריס vivo. ואכן, מיליארדים (i)obation של האיבר מתרחש (לexplants E12.5), (ii) thyrocytes מבשרים לארגן לתוך זקיקים ולקטב, (iii) thyrocytes ו-C-תאים להבדיל, וכן (iv) בתאי האנדותל הנמצאים ברקמה להתרבות microdissected, נודדים לתוך אונות של בלוטת התריס, ושיתוף הפעולה הדוק לקשר עם תאי אפיתל, כפי שהם עושים בגוף חי.
ניתן להשיג רקמות בלוטת התריס מסוג בר, נוקאאוט או עוברים מהונדסים ניאון. יתר על כן, explants תרבות ניתן להשפיע על ידי תוספת של מעכבים, חסימת נוגדנים, גורמי גדילה, או אפילו תאים או בינוניים מותנה. Ex vivo פיתוח ניתן לנתח בזמן אמת, או בכל עת של התרבות על ידי immunostaining וRT-qPCR.
לסיכום, התרבות explant בלוטת התריס בשילוב עם כל הר במורד הזרם או בפרופילי הדמיה סעיפים וביטוי גנים מספק מערכת רבת עוצמה עבור מניפולציה ולומד אירועי morphogenetic ובידול של o בלוטת התריסrganogenesis.
Introduction
בלוטת התריס היא אוסף של תחומים אפיתל עצמאיים, המכונה זקיקים, מוקף רשת צפופה של נימי דם אנדותל. ארגון זה מאפשר תפקוד בלוטת התריס: נימי אנדותל לספק thyrocytes עם יוד, הנדרש לסינתזת הורמון T3 ו-T4, ולהפיץ את אלה האחרונים לכל הגוף. מפוזר בין הזקיקים ונימי הדם, C-תאים לייצר את הורמון hypocalcemic calcitonin 1. למרות שהארכיטקטורה של בלוטת התריס למבוגרים ופונקציות ידועות, המנגנונים התאיים ומולקולריים המעורבים בהתפתחות בלוטת התריס עוברית (היווצרות זקיק ובידול) הם רחוקים מלהיות מובן.
במהלך עובר, thyrocytes אב מקורו כעיבוי (anlage קו האמצע) של קיר הגחון של האנדודרם המעי הקדמי ביום עוברי (ה) 8.5 בעובר של העכבר, ואילו אבות C-תאים שמקורם בE11.5 כבליטות דמוי טיפה ( bo ultimobranchialמת) של שקיות בלוע הרביעית 2-6. ניצן קו האמצע ואז מתנתק מהאנדודרם, מרחיב בילטרלי הפתיל בE13.5 עם גופי ultimobranchial בכל צד של קנה הנשימה. לבסוף, thyrocytes לארגן לתוך זקיקים ו-C-תאים להתמיין.
ידע הנוכחי על היווצרות בלוטת התריס בעיקר מגיע מניתוח היסטולוגית של רקמות קבועות, אבל אירועי morphogenetic המעורבים בהיווצרות בלוטת התריס הם דינמיים מאוד וכרוכים בתקשורת ויחסי גומלין בין תאים מסוגים שונים ועם מטריקס. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי אבות thyrocyte לייצר רמות גבוהות של VEGF לגייס תאי האנדותל לבלוטת התריס מתפתח, ו, בתורו, גייסו את תאי האנדותל לקדם היווצרות זקיק והתמיינות תאי C-7.
רוב מחקרי vivo לשעבר בבלוטת התריס בוצעו על תאי שמקורם בבלוטת תריס למבוגרים מבודדים, גדלו גם על ד פלסטיק תרבית רקמת 2Dishes או במטריצות 3D. שימוש בסוגים אלה של תרבויות, תאי זקיקי הבדיל או יישארו מקוטב ומאורגן כמו זקיקים או לרכוש מחדש ארגון 3D 8-10. עם זאת, תאים אלו טהורים אפיתל, explanted מהסביבה הפיזיולוגית שלהם, ותרבותיים ב2D, להתעלם מאינטראקציות עם מטריצה תאית, ציטוקינים, גורמי גדילה ועם סוגי תאים אחרים, כמו תאי האנדותל או עצבים שהם בדרך כלל נתקלים בגוף חי. מחקר נחמד מאוד לאחרונה תאר פרוטוקול התמיינות של תאי גזע עובריים לזקיקי בלוטת התריס באמצעות צעד תרבות סופי בmatrigel 3D 11. עם זאת, תרבויות 3D אלה חוסר מגע עם סוגי תאים אחרים.
בהתבסס על המומחיות קודמת בלבלב ובלוטות רוק תרבות איבר 12-14, שיטה לנתח anlagen בלוטת התריס העוברי של העכברים וculturing explants על מסנני semiporous או בשקופיות פלסטיק מיקרוסקופית פותחה.
כאשרעבודה עם עוברי E12.5, המקור הכפול של anlagen בלוטת התריס (anlage קו האמצע ושני גופי ultimobranchial לרוחב) שהוטל microdissection של שבר גדול של רקמה. זה הכיל את קנה הנשימה, אבל לא את הוושט, והוארך מעורקי קשת בלוע עד נפיחות arytenoid. כאשר בתרבית על מסננים, anlage קו האמצע משתרע רוחבי בכל צד של קנה הנשימה, שבו הם מתמזגים עם גופי ultimobranchial כדי ליצור את אונות בלוטת התריס שתיים, עדיין מחוברים על ידי מצר צר.
בתרבות, בתאי אפיתל להתרבות, לארגן לזקיקים ולהתמיין לthyrocytes ו-C-תאים, תלוי במוצא שלהם. תאי האנדותל המופיעים ברקמות microdissected גם להתרבות ולפלוש לאונות בלוטת התריס סוף סוף לקשר הדוק עם מבנה זקיקי אפיתל, ללא תלות בזרימת דם או גורמים במחזור. כמו פיתוח של explants בנאמנות משחזר in vivo לפתחment, מערכת זו התרבות היא אופטימלי ללמוד morphogenetic ואירועי בידול המתרחשים במהלך התפתחות בלוטת התריס.
ניתן להשיג רקמות בלוטת התריס מסוג בר, נוקאאוט או עוברים מהונדסים ניאון, ומערכת התרבות ניתנת להורדה ובניסויי רווח של הפונקציה. לבסוף, הזמן לשגות הדמיה של explants בלוטת התריס שכותרתו fluorescently על צלחות פלסטיק מיקרוסקופית ניתן לנצל כדי לחקור טוב יותר קינטיקה והמשכיות של תנועות morphogenetic המתרחשות בגוף חי. זמן לשגות הדמיה כבר נעשתה שימוש כדי ללמוד המורפוגנזה הסתעפות של הלבלב 15,16 או ניצן ureteric 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
עכברים הועלו וטופלו על פי העקרונות של טיפול בבעלי חיים במעבדה של ועדת צער בעלי החיים באוניברסיטה. כל הנהלים והפרוטוקולים אושרו על ידי ועדה זו.
1. ציפוי של מיקרוסקופית צ'יימברס תרבות פלסטיק
הערה: בצע את כל השלבים הבאים בתנאים סטריליים בזרימה למינרית. שני הסוגים של ציפוי הם ביצועים מקבילים.
- תאי תרבות פלסטיק מעיל עם פיברונקטין יום אחד לפני הבידוד של רקמות בלוטת התריס:
- לדלל פיברונקטין סטריליים לריכוז סופי 50 מיקרוגרם / מיליליטר במדיום M199 בתוספת 100 U / ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, fungizone 0.25 מיקרוגרם / מיליליטר ו -2 גלוטמין 12 מ"מ.
- מכסה את הבארות עם 200 μl של פיברונקטין המדולל ודגירת הלילה במקרר 4 ° C.
- ביום של הניתוח, לשאוב פיברונקטין, יש לשטוף את הבארות פעם אחת עם M199 ולהוסיף נפח מינימאלי של 200 μl של M199 בתוספת אנטיביוטיקה, גלוטמין ו10% עוברי עגל בסרום.
- השאר את התאים מצופים בחממה עד מוכן לצלחת explants.
- תאי תרבות פלסטיק מעיל עם סוג אני קולגן 2 שעות לפני הבידוד של רקמות בלוטת התריס:
- לדלל סוג סטרילי אני קולגן לריכוז סופי 50 מיקרוגרם / מיליליטר ב10 מ"מ HCl. הערה: שמור את פתרון מניות קולגן על קרח.
- מכסה את הבארות עם 200 μl מסוג מדולל אני קולגן ודגירה עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר (RT).
- לשאוב את הסוג קולגן אני פתרון, יש לשטוף את בארות פעם אחת עם M199 ולהוסיף נפח מינימאלי של 200 μl של M199 בתוספת אנטיביוטיקה, גלוטמין ו10% עוברי עגל בסרום.
- השאר את התאים מצופים בחממה עד מוכן לצלחת explants.
2. Dissection של רקמות Anlagen המכילות בלוטת התריס (E12.5) או בלוטת התריס אונות (E13.5-E14.5)
הערה: השתמש בכלים לנתח נקיים וצלחות פטרי / תרבות. הצעדים הכלליים והחתכים מפורטים להלן זהים עבור E12.5 וE14.5 עובר.
- להקריב מתוזמן בהריון נקבות עכברים בעובריים הרצוי היום (ה) (מE12.5 לE14.5) ולהסיר את הרחם באמצעות מכשירים לנתח.
- הנח את הרחם גזור בצלחת 10 סנטימטר המכילה HBSS.
- החזק את הגפיים אחת של הרחם עם מלקחיים ולפתוח את הרחם עם מספריים קטנים כדי לשחרר בהדרגה את כל העוברים.
- הפרד את העוברים מהשליה במספריים ולהעביר את העוברים עם ממברנות extraembryonic בצלחת 10 סנטימטר חדש המכילה HBSS.
- הסר את שק החלמון וamnion. הערה: מנקודה זו, לעבוד תחת סטראו עם שקוף מלמטה; הגדלת הגדלה בצעדים לנתיחה. משתמש במחטי טונגסטן בנימי זכוכית כמו לנתח כלים.
- שימוש במחטים כמוסכין ומזלג, להסיר את החלק העליון של הראש, כוללים הלסת העליונה והאוזניים (איור 1 א, לחתוך לאורך).
- החזק את העובר על הגב שלה ולהסיר ראשון חתיכה נוספת של הצינור העצבי (איור 1 א, לחתוך לאורך ב), ולאחר מכן את החלק התחתון של העובר, ממש מתחת לגפיים הקדמי ומעל ללב (איור 1).
- להעביר את פרוסת העובר המכילה את הלשון (כדי לכוון את הרקמה) ואזור צוואר בצלחת 10 סנטימטר חדש המכילה HBSS.
- הסר את הצינור העצבי ורקמות אחוריות לושט / קנה הנשימה (איור 1 ג, לחתוך לאורך).
- בעדינות סעיף פרוסת הרקמה לאורך שני הצדדים של הלשון (איור 1 ג, לחתוך לאורך B ו-B ').
- אתר את הוושט ואת קנה הנשימה, בהארכה של הלשון, ולנתח משם את הלשון, שעזב את arytenoid נפיחות (1D איור, לחתוך לאורך), והרקמות בבוטצדדים שעות של הוושט / קנה הנשימה (איור 1D, לחתוך לאורך B ו-B ').
- הסר את הוושט, ולמקם את קנה הנשימה עם צד הגחון שלה פונה כלפי מעלה.
- שם לנתח רקמות לא רצויות כמו התימוס (איור 1E) וכל הרקמות ממוקמות רוחבי לעורקי קשת בלוע. לE13.5 או E14.5 עובר, לדמיין את אונות בלוטת התריס בכל צד של קנה הנשימה (איור 1F; קווים מקווקווים אדומים) ולנתח עוד יותר את האונות מקנה הנשימה.
- העבר את האזור המבודד קנה הנשימה E12.5, או אונות בלוטת התריס E13.5-E14.5 לתוך צלחת תרבות 35 מ"מ המכילה בינוני M199 מחומם מראש בתוספת אנטיביוטיקה, גלוטמין ו10% עוברי עגל בסרום. העבר את explants באמצעות קצה מסנן prewetted על micropipette P-200. לexplants E12.5, לחתוך את הקצה של הקצה כדי להרחיב את הפתח. הערה: באופן שגרתי, ואם יש עוברים גנוטיפ זהה, לבצע שלבים 6 ו -7 על כל העוברים,n 9-11, ולבסוף 12 & 13.
3. ציפוי ותרבות של Explants בלוטת התריס
- שטוף את explants ידי העברה רצופה בשלוש בארות של צלחת 24 גם מכילה 1 מיליליטר של מדיום התרבות מחומם מראש (= M199 בתוספת אנטיביוטיקה, גלוטמין ו10% עוברי עגל בסרום).
- ציפוי של אונות בלוטת התריס על תאי תרבות מצופים פלסטיק מיקרוסקופית:
- מדיום התרבות לשאוב M199 מהתאים המצופה.
- בזהירות, להעביר את explants בלוטת התריס לתאי התרבות באמצעות טיפים micropipette ומסנן. הנח explant אחד במרכזו של כל תא.
- הסר בינוני עודף ולמקם את חדר התרבות בתרבית רקמת חממה (37 C °; CO 2 של 5%) עבור שעה 2 לתת explants לצרף למטריצה.
- בעדינות להוסיף 200-300 μl של מדיום התרבות מחומם מראש היטב כל אחד.
- דגירה לתרבות לטווח ארוך בחממה בתרבית הרקמה.
- ציפוי oאונות אזור קנה הנשימה ו או בלוטת התריס על מסנני semiporous:
- מלא את מספר הבארות של צלחת 24 גם נדרשה עם 330 μl של מדיום התרבות מחומם מראש.
- מסנני מקום (למשל 0.4 מיקרומטר סינון Millipore) על המדיום, לטפל כדי למנוע לכידה של בועות אוויר מתחת למסנן התרבות.
- בזהירות, תוך שימוש בטיפי micropipette ולסנן, להעביר את explants בלוטת התריס עם נפח מינימאלי של מדיום על גבי במרכז המסננים (4/filter המרבי).
- להסיר את העודפים של מדיום ומתוך חלל explants עם מחט טונגסטן.
- דגירה לתרבות לטווח ארוך בחממה בתרבית הרקמה. הערה: מדיום תרבות שינוי בכל יום אחר תחת הזרימה למינרית. תרבות explants עד 7 ימים.
4. כל הר Immunofluorescence מכתימים פרוטוקול Explants בלוטת התריס
לעקור explants גדל על מסננים (אחרי שלב 2 להלן) באמצעות מחטים או טונגסטןמלקחיים בסדר והעברה בצלחת 24 גם לכל השלבים, פרט לincubations ראשוני (שלב 5) והמשני (שלב 7) נוגדן (צלחת 96 היטב). לexplants חסיד תרבית על תאי פלסטיק מיקרוסקופית, לבצע את כל השלבים בתאי התרבות.
- לשאוב בינוני M199 התרבות ולתקן את explant עם paraformaldehyde 4% קרים כקרח (PFA) עבור 20 דקות (500 μl בצלחת 24 גם ו300 μl בשקופיות מיקרוסקופ).
- לשטוף 2x 10 דקות בטריס שנאגרו מלוח עם טריטון (TBST; 50 מ"מ טריס HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0,1% טריטון X-100) ב RT.
- לעבד את explants מייד או לאחסן ב -20 ° C. הערה: לאחסון לטווח ארוך ב -20 ° C, מייבשים את explants במתנול על ידי הגדלת בהדרגה ריכוז מתנול ב TBST להגיע מתנול 100%. כאשר מוכן להמשיך עם immunostaining (שלב 4), רעננות explants ידי הוספת TBST הדרגה למתנול.
- החלף TBST עם פתרון החסימה (10% עיזים סרום נורמלי בTBST) ו לדגור על כיסא נדנדה ים ראה ל30-60 דקות ב RT.
- לדלל נוגדן ראשוני בחסימת פתרון (100-200 μl לכל מצב). העבר את explants "לסנן" מצלחת 24 גם לצלחת 96 היטב. דגירה explants עם הנוגדנים הראשוניים על כיסא נדנדה ים ראה לילה בשעה 4 ° C.
- למחרת, לבטל את פתרון הנוגדן הראשוני, להעביר את explants "המסנן" חזרה בצלחת 24 גם, ולשטוף לפחות חמש פעמים עם TBST על כיסא נדנדה ים ראה ל45-60 דקות כל אחד ב RT.
- מדולל נוגדנים משני (למשל אנטי-X-Alexa פלואוריד עיזים ב1:2,000 דילול) ב TBST המכיל 1% מעזים בסרום נורמלי ודגירת explants עם דילול זה לילה על כיסא נדנדה ים נדנדה על 4 מעלות צלזיוס ובחושך. לcounterstaining הגרעיני, כולל 1 מיקרוגרם / מיליליטר של bis-Benzimide (Hoechst) יחד עם פתרון נוגדנים משני.
- למחרת, לבטל את פתרון נוגדנים משני ולשטוף 5x עם TBST על ים ראהנדנדה ל45-60 דקות כל אחד ב RT. במהלך שוטף, לשמור explants בחושך.
- לבצע שטיפה נוספת בTBST עדינות מתערבל הלילה ב 4 ° C בחושך.
- Postfix explants immunostained PFA 4% ב 4 ° C למשך 10 דקות.
- לשטוף 2x 10 דקות עם TBST.
- העבר את explants או במתנול בהדרגה 100% עבור אחסון לטווח ארוך ב -20 מעלות צלזיוס, או לנתח באופן מיידי. לexplants תרבית על מסננים, וimmunostained בצלחת 24 גם, העברה בתא מיקרוסקופית (למשל LabTek או Ibidi) עם TBST או בינוני הרכבה ניאון טוב יותר לפני ניתוח עם multiphoton או מיקרוסקופ confocal.
5. הפקת RNA מבלוטת התריס
לעבוד בסביבה נטול RNase. לכן, שימוש בחומצות גרעין וטיפים פיפטה nuclease חופשי ולנקות גם ספסל וציוד מהמזהמים וRNases. פרוטוקול זה שמבוסס על פנול / כלורופורם, לבצע את הצעד הראשוןים (1 עד 7) מתחת למכסת מנוע כימי.
- Homogenize explant בלוטת התריס אחד או שתי אונות של בלוטת התריס עם 300 μl של פתרון מיצוי RNA באמצעות העלי חד פעמי עבור 1.5 צינור מיליליטר. בין דגימות, לשטוף את העלי ב2% SDS, ולאחר מכן במים, ולאחר מכן אתנול.
- הוספה של פתרון מיצוי RNA עוד 100 μl, מערבולת 10 שניות ולדגור על RT עבור 10 דקות.
- ורטקס למשך 30 שניות ולהוסיף 20 ng של tRNA לכל דגימה.
- מערבולת דקות 1 ולהוסיף 80 μl של כלורופורם.
- וורטקס במרץ ל30 שניות והדגירה 15 דקות ב RT.
- ספין ל15 דקות ב 19,000 XG בצנטריפוגה בקירור (4 ° C).
- העבר בזהירות את השלב המימית העליון חסר הצבע בצינור טרי המכיל 20 מיקרוגרם של גליקוגן כcoprecipitant.
- ורטקס ולהוסיף 200 μl של 100% אלכוהול isopropanol.
- וורטקס במרץ ל15-30 שניות ולתת משקע RNA ב-20 מעלות צלזיוס למשך 2-3 שעות או ב-C ° -80 במשך שעה 1.
- ספין ל30 דקות ב 19,000XG ב 4 ° C, ולחסל את supernatant.
- שטוף את הכדור עם 450 μl אתנול 75% קרים ומערבולת כדי לסלק את הכדור.
- ספין 10 דקות ב 19,000 XG ב 4 ° C, ולחסל את supernatant.
- ייבש את הכדור מתחת למכסת המנוע למשך 5 דקות.
- Resuspend את הכדור עם 10 μl מים RNase ללא דגירה 10 דקות ב RT.
- ריכוז assay RNA, חנות ב -80 מעלות צלזיוס או להפוך לתמלל עבור ניתוח ביטוי גנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
anlages בלוטת התריס (קו האמצע וUB, יחד עם רקמות הסובבות), ואונות של בלוטת התריס הם גזורים מעוברי עכברים בE12.5 וe13.5/e14.5, בהתאמה (איור 1). לאחר יום אחד בתרבות במסנן, anlage קו האמצע הוא גלוי (איור 2 א) כרקמה מוארכת המשתרעת על גבי קנה הנשימה. זה בהדרגה יוצר שתי אונות בכל צד של קנה הנשימה. אם אונות מבודדות בלוטת התריס (E13.5 או E14.5) בתרבית, הם ירחיבו, לעבור המורפוגנזה ותאי האפיתל יארגנו לתוך מבני macroscopically גלויים פוליקולרית (איור 2).
ארגון וקיטוב של תאי אפיתל, שכותרתו עם E-cadherin, ניתן דמיינו ידי immunolabeling ezrin (איור 3 א). מבנים תאיים Ezrin החיוביים בהדרגה, ובאופן מרוכז, פתיל עם קוטב אחד של התא שיהפוך את מוט הפסגה. במהלך תהליך זה, תאי האנדותל חיובייםמופרז עבור להתרבות PECAM ולארגן סביב זקיקי פיתוח כדי ליצור יחידות Angio-פוליקולרית (איור 3 ב). כדי לכמת את הבידול של thyrocytes ו-C-תאים, ניתן לבודד RNA מן האונות של בלוטת התריס בתרבית, וביטוי גני assayed על ידי RT-qPCR (איור 3 ג). בעוד הביטוי של Nkx2.1 גורם שעתוק בלוטת התריס אינו משתנה במהלך התרבות, הביטוי של thyroglobulin thyrocyte הספציפי ושל C-תא ספציפי קלציטונין עלה באופן משמעותי, מה שמעיד בידול פונקציונלי.
איור 1. צעדים לנתיחה כדי לבודד את בלוטת התריס מעובר עכבר E14.5. חתכים מתוארים על ידי קווים מקווקווים צהובים. (א) בחלקו העליון של ראשו הוסר על ידי שני חתכים לחשוף את הלשון. (ב) לנמ"א אזור k מופרד משאר הגוף על ידי חתך את העובר מתחת לגפיים העליונים ומעל ללב. (ג) שמירת הלשון (ל) כמדריך, להסיר את הצינור העצבי (NT) ורקמות ואיברים לרוחב. (ד) הלשון, נפיחות arytenoid (*) והוושט / קנה הנשימה מיושרות בצורה מושלמת. להסיר תחילה את הלשון ואז רקמות לרוחב אזור וושט / קנה הנשימה. (ה) אונות בלוטת התריס הם מוסתרות בחלקו על ידי בלוטת התימוס (thym) שאמור להיות מושלכת. אונות (F) בלוטת התריס נראות בכל צד של קנה הנשימה (אובואיד אדום המנוקד), או יותר טוב דמיינו באמצעות עוברי כתב ניאון (Pax8-Cre; רוזה-stop-YFP; הבלעה). קיצורים:. ל( לשון), thym (התימוס), טרה (קנה הנשימה), * (arytenoid נפיחות) אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
n-page = "תמיד"> 
explants בלוטת התריס איור 2. גזור על אונות מסנן ובלוטת תריס בפיברונקטין יפה לפתח vivo לשעבר. () תצלומים של explant בלוטת התריס E12.5 בתרבית למשך 1, 2 ו 3 ימים במסנן semiporous, בממשק האוויר בינוני. תאי האפיתל של בלוטת התריס להעביר בילטרלי בכל צד של קנה הנשימה ויוצרים שתי אונות של בלוטת התריס גדלה. (ב) תמונות Brightfield ביום 1 ויום 2 של אונת בלוטת התריס E14.5 בתרבית תאים בתרבות פלסטיק מיקרוסקופית. שים לב להרחבה והשיפוץ של האפיתל שסופו של דבר ליצור זקיקים גדולים (20-100 מיקרומטר) סביב יום 7. קו מקווקו צהוב תוחם את הפריפריה האפיתל של בלוטת התריס. ברים סולם, 100 מיקרומטר. אנא CLICK כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. Folliculogenesis, אנגיוגנזה והתמיינות של בלוטת התריס בתרבות. אונות בלוטת התריס היו בתרבית למשך הזמן שצוין. () רקמות קבועות היו כל הר immunostained עם נוגדנים נגד E-cadherin סמן basolateral, וסמן קרום subapical Ezrin. לאחר יום אחד בתרבות, תאי האפיתל של בלוטת התריס מבני parenchyma ההווה הקטן ezrin החיובי שהמתאימות לשלפוחית תאית 7. היתוך מרוכז של שלפוחית מהתאים סמוכים יהווה לומן קטן ביום 2; הצמיחה שלהם מתקדמת, והארגון של התאים המקיפים סביב לומן תהיה להתוות מבנים טרום זקיקים אחרי 4 ימים. סרגל קנה מידה, 20 מיקרומטר. l בלוטת התריס (B)OBE immunostained עם נוגדנים נגד טסיות הדם ותאי האנדותל הידבקות המולקולה (PECAM) וEzrin. זקיקים מוקפים במבני אנדותל. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. RNA (C), שחולץ מן האונות של בלוטת התריס, היה עיבד הפוך לפני PCR כמוני. הביטוי של Nkx2.1 גורם השעתוק של בלוטת התריס, ושל שני גנים בידול, thyroglobulin וקלציטונין, נמדד באמצעות זוגות פריימר ספציפיים. כדי לחשב את ביטוי גנים יחסית, הייתה בשימוש בשיטת ΔΔ CT, באמצעות E-cadherin כגן ההתייחסות ונקודת הזמן האחרונה של התרבות כ100%. תמונות מוצגות בו-B הן סעיפים אופטיים confocal יחיד של אונות בלוטת התריס כל הר immunostained. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מתאר שיטה לניתוח, culturing explants בלוטת התריס (E12.5) או אונות (E14.5) על מנת ללמוד ולהבין טוב יותר את האירועים המורכבים שמוביל להיווצרות של בלוטת התריס. בשל המוצא הכפול של anlagen בלוטת התריס (anlage קו האמצע ושני הגופים ultimobranchial לרוחב), והגודל הקטן שלהם, שבר של מקורי מקומי רקמת E12.5 לעורקי קשת בלוע, ומכיל את קנה הנשימה, אבל לא את הוושט הוא microdissected. כפי שמודגם, בתוך פרק זמן של ארבעה ימים, מערכת זו תרבות בנאמנות משחזרת בהתפתחות בלוטת התריס vivo מאז: (i) anlage קו האמצע נודד בילטרלי ומרחיב בצורה, עם UB, שתי אונות בלוטת התריס מחוברים על ידי מצר צר (איור 2 א) , (Ii) מבשרי בלוטת התריס לארגן מחדש ממסה של תאים לתוך זקיקים וסופו של דבר לקטב (2B דמויות ו3A), (ג) בתאי אנדותל בהווה בלהתרבות רקמות microdissected, נודדים לתוך האונות של בלוטת התריס, ושיתוף פעולה הדוק לקשר עם תאי אפיתל (איור 3), וכן (iv) thyrocytes ו-C-תאים להבדיל איכותי (איור 3 ג), כפי שהם עושים בvivo 7. כמו נתיחה קוטעת פיזית בהתפתחות רחם ורקמות explanted יש להסתגל למצב תרבות, האירועים מורפולוגיים ובידול מעוכבים במקצת בהשוואה למצב in vivo.
שלבים קריטיים בפרוטוקול
ההיבט הקריטי של שיטה זו הוא בנתיחה. ראשית, הוא חיוני כדי להסיר רקמות לרוחב, כמו גם את הזכות ואונות שמאליות של בלוטת התימוס מן explants E12.5, כהרחבה שלהם בתרבות לעכב התפתחות תקינה של האונות של בלוטת התריס. שנית, מהירות היא קריטית גם אם רוצה לשמור על האנדותלתאי חיים. אם הנתיחה לא בוצעה תחת אווירה סטרילית, חשוב לשטוף מספר פעמים explants במדיום תרבות סטרילי. לבסוף, כאשר culturing explants על מסנני semiporous, חשוב להשתמש בנפח קטן של מדיום ולמקם את explants על המרכז של המסנן. יותר מדי בינוני יזרום לפריפריה של המסנן וליצור המניסקוס עם קיר המסנן. במקרה זה, explant יעקוב הבינוני ומגיע למניסקוס; הפיתוח שלה יהיה במדיום ולא באוויר / הממשק בינוני.
שינויים ומגבלות אפשריים
הפרוטוקול המתואר כאן חל על explants בלוטת התריס E12.5 וE13.5 וE14.5 מבודד אונות של בלוטת התריס. שלבי התפתחות צעירים ומבוגרים יכולים להיבדק בפונקציה של השאלה המדעית לטפל. תנאי תרבות אחרים גם יכולים להיבדק: explants או אונות של בלוטת התריס יכול להיות מבוגרים בmatrig 3Dאל, או הבינוני יכול להיות כהשלמה עם האינסולין / transferrin / סלניום ולא עם סרום 10%.
היבט חשוב של תרבית רקמה הוא ריכוז חמצן. כאשר גדלו בשקופיות פלסטיק מיקרוסקופית, ריכוז חמצן קשה להעריך כפי שהוא יקטן עם הגובה בינוני מעל explants. כאשר גדלו במסננים, בממשק אוויר / הבינוני, explants נמצא במגע עם האטמוספרה, ומכאן עם 21% מחמצן. במקרה אחרון זה, אפשר לנסות לשחזר את "חוסר חמצן" בסביבת רחם באמצעות ת.ד. 2 ריכוז נמוך בתוך האינקובטור.
אם מורכבות tissular של explants E12.5 היא יתרון לפיתוח נכון, זה גם חסרון עיקרי כמו התאים אפיתל אינם נגישים לוירוסים או חומרים כימיים transfection. מניפולציה יכולה להתבצע עם חומרים כימיים diffusible (מעכבים, נוגדנים חוסמים, גורמי גדילה, ציטוקינים, בינוני מותנה), לשמור עלing לזכור כי המתחם אקסוגניים משפיע על כל סוגי התאים. יתר על כן, מורכבות רקמה והגודל הקטן של האונות ביחס לכל explant הרקמות (ראה איור 2 א, פנל מימין), מפחית את טוהר תמציות (RNA או חלבון) מוכנות.
למרות שרוב הנתונים המוצגים במסמך זה התקבלו מ4-5 ימים explants התרבותי, זה אפשרי כדי לשמור על האיברים בתרבות במשך זמן ארוך יותר, עד 10 ימים על פלסטיק, עם פיתוח מתמיד של הזקיקים (ראה איור 2 ב ביום 7). אם תרבויות כבר לא צריכה להיות מבוצעות, יש לוודא שכל סוגי התאים, כוללים תאי אנדותל, לשרוד בexplants.
משמעות של הטכניקה ביחס לשיטות קיימות או שיטות אלטרנטיביות אחרות
בהשוואה לתרבות של אוכלוסיות טהורות של thyrocytes במנות 2D או 3D matriceים, מערכת תרבות איבר זה מציגה את היתרון של שמירה על ההרכב הטבעי ופיזיולוגי של שברי microdissected. ואכן, בנוסף לthyrocytes ואבות C-תאים, explants להכיל mesenchymal ותאי האנדותל כמו גם מטריקס. כפי שכבר הוכיח בבלוטות רוק, כליות, ריאות או לבלב, in vivo פיתוח יפה לחקות תרבויות איברים. יתר על כן, הוא מספק דרך לנתח במהירות ולטפל (רווח או הפסד של פונקציה) איברי סוג ונוקאאוט בטבע.
יישומים או כיוונים עתידיים לאחר השליטה בטכניקה זו
נייר זה מציג היבטים התאיים ומולקולריים של התפתחות בלוטת התריס יכולים להיות מנותחים עם מיקרוסקופ או על ידי RT-qPCR; הכלאה באתר או מערבי סופג גם יכול להתבצע. מערכת זו התרבות היא נוחה כדי להשיג וניסויי אובדן של הפונקציה באמצעות התוספת של מעכב ספציפיים, נוגדנים חוסמים, גורמי גדילה, ציטוקינים, או אפילו תאים במדיום התרבות 7. עם זאת, כל סוגי התאים הנמצאים ברקמות מושפעים. יהיה מעניין לפתח מיקוד תאים מסוג מסוים המבוסס על נגיף.
השימוש במתח כתב ניאון, עם מיקרוסקופ לנתח ניאון, מאפשר microdissection של היצירה (איור 1F, הבלעה) הרקמות, אלא גם, כפי שדווח על ידי משתמשים אחרים באמצעות חלבון פלואורסצנטי מתויג קרום 16, מאפשר לבצע בזמן אמת הדמיה של האיבר המתפתח ב15,16 3D, או לעקוב אחר אוכלוסיית תאים מסוימת בתרבות. פיתוח של זני כתב הניאון החדשים יהיה צורך לדמיין בקפידה אירועי morphogenetic.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile | proxylab | 80826 | |
| Collagen Type I, rat tail | Millipore | 08-115 | |
| Fibronectin from human plasma | Invitrogen | # 33010-018 | |
| M199 | Invitrogen | 31150-022 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025-100 | |
| Tungsten wire | Goodfellow | LS237450 | |
| culture plate insert (12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
| GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
| E-cadherin | BD Biosciences | 610182 | 1/1,000 |
| Ezrin | Thermo Scientific | MS-661-P1 | 1/400 |
| PECAM | BD Biosciences | 550274 | 1/100 |
| Hoechst | Sigma | B2261 |
References
- Colin, I. M., Denef, J. -F., Lengelé, B., Many, M. -C., Gérard, A. -C. Recent insights into the cell biology of thyroid angiofollicular units. Endocr. Rev. 34 (2), 209-238 (2013).
- Fagman, H., Andersson, L., Nilsson, M. The developing mouse thyroid embryonic vessel contacts and parenchymal growth pattern during specification budding, migration, and lobulation. Dev. Dyn. 235 (2), 444-455 (2006).
- Fagman, H., Nilsson, M. Morphogenesis of the thyroid gland. Mol. Cell. Endocrinol. 323 (1), 35-54 (2010).
- Fagman, H., Nilsson, M. Morphogenetics of early thyroid development. J. Mol. Endocrinol. 46 (1), (2011).
- De Felice, M., Di Lauro, R. Thyroid development and its disorders genetics and molecular mechanisms. Endocr. Rev. 25 (5), 722-746 (2004).
- De Felice, M., Di Lauro, R. Intrinsic and extrinsic factors in thyroid gland development: an update. Endocrinology. 152 (8), 2948-2956 (2011).
- Hick, A. -C., et al. Reciprocal epithelial paracrine interactions during thyroid development govern follicular organization and C-cells differentiation. Dev. Biol. 381 (1), 227-240 (2013).
- Toda, S., Koike, N., Sugihara, H. Cellular integration of thyrocytes and thyroid folliculogenesis: a perspective for thyroid tissue regeneration and engineering. Endocr. J. 48, 407-425 (2001).
- Toda, S., et al. Culture models for studying thyroid biology and disorders. ISRN Endocrinol. , (2011).
- Eggo, M. C., Quiney, V. M., Campbell, S. Local factors regulating growth and function of human thyroid cells in vitro and in vivo. 213, 47-58 (2003).
- Antonica, F., et al. Generation of functional thyroid from embryonic stem cells. Nature. 491, 66-71 (2012).
- van Eyll, J. M., Pierreux, C. E., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. Shh-dependent differentiation of intestinal tissue from embryonic pancreas by activin A. J. Cell Sci. 117, 2077-2086 (2004).
- Hick, A. -C., et al. Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1. BMC Dev. Biol. 9. , (2009).
- Pierreux, C. E., et al. Epithelial:Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas. Dev. Biol. 347, 216-227 (2010).
- Puri, S., Hebrok, M. Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging. Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).
- Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex-vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. , (2012).
- Watanabe, T., Costantini, F. Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis in vitro. Dev. Biol. 271, 98-108 (2004).
