Abstract
Sköldkörteln är en bilobated endokrin körtel lokaliserad vid basen av halsen, som producerar sköldkörtelhormon T3, T4, och kalcitonin. T3 och T4 produceras av differentierade thyrocytes, organiserade i slutna sfärer som kallas folliklar, medan kalcitonin syntetiseras av C-celler, insprängda i mellan folliklar och ett tätt nätverk av blod kapillärerna. Även vuxen sköldkörtel arkitektur och funktioner har utförligt beskrivits och studerats, är bildningen av "angio-follikulära" enheter, distribution av C-celler i parenkymet och parakrina kommunikationer mellan epitel-och endotelceller långt ifrån klarlagda.
Denna metod beskriver sekventiella steg av mus embryonala sköldkörtel anlagen dissekering och dess kultur på semiporous filter eller på mikroskopi plastglasen. Inom en period av fyra dagar, denna kultur systemet troget rekapitulerar in vivo sköldkörtelutveckling. I själva verket (i) miljarderobation av orgeln inträffar (E12.5 explantat), (ii) thyrocytes prekursorer organisera sig i hårsäckarna och polarisera, (iii) thyrocytes och C-celler differentierar, och (iv) endotel-celler närvarande i den microdissected vävnad föröka, migrera in i sköldkörtel lober och noga förknippar med epitelceller, som de gör i vivo.
Sköldkörtel vävnader kan erhållas från vildtypen, knockout eller fluorescerande transgena embryon. Dessutom explants kultur kan manipuleras genom tillsättning av inhibitorer, blockerande antikroppar, tillväxtfaktorer, eller till och med celler eller konditionerat medium. Ex vivo-utveckling kan analyseras i realtid, eller vid någon tidpunkt av kulturen genom immunfärgning och RT-qPCR.
Sammanfattningsvis, sköldkörtel Explantation kultur kombinerat med nedströms hel-fäste eller på sektioner imaging och genuttryck profilering ger ett kraftfullt system för att manipulera och studera morfogenetiska och differentierings händelser av sköldkörtel organogenesis.
Introduction
Sköldkörteln är en samling av oberoende epiteliala sfärer, som kallas folliklar, som omges av ett tätt nätverk av endothelial kapillärer. Denna organisation möjliggör sköldkörtelfunktionen: endothelial kapillärer ger thyrocytes med jod, som krävs för T3 och T4 hormonsyntes och distribuera dessa senare till hela kroppen. Utspridda i mellan folliklar och kapillärer, C-celler producerar hypokalcemisk hormonet kalcitonin 1. Även vuxna sköldkörtel arkitektur och funktioner är väl kända, de cellulära och molekylära mekanismer som är involverade i sköld embryonal utveckling (follikelstimulerande bildning och differentiering) är långt ifrån klarlagda.
Under embryogenes, thyrocytes stamfader sitt ursprung som en förtjockning (mittlinjen anlage) av den ventrala väggen i framtarmen endoderm på embryonala dag (e) 8.5 i musen embryot, medan C-celler gångare ursprung vid E11.5 som droppformade utsprång ( den ultimobranchial bodör) i den fjärde faryngeala påsarna 2-6. Mittlinje knopp lossnar därefter från endoderm, expanderar bilateralt att smälta vid E13.5 med ultimobranchial kroppar på vardera sidan av luftstrupen. Slutligen thyrocytes organisera sig i hårsäckarna och C-celler differentierar.
Aktuell kunskap om sköldkörtelbildningen kommer huvudsakligen från histologisk analys av fasta vävnader, men de morfogenetiska händelser som är involverade i sköldkörtel bildning är mycket dynamisk och involverar kommunikation och samspel mellan olika celltyper och med den extracellulära matrisen. Senare arbeten visade att thyrocyte progenitorceller producerar höga nivåer av VEGF för att rekrytera endotelceller till framkallnings sköldkörtel, och i sin tur rekryterade endotelceller främjar follikel bildning och C-celler differentiering 7.
De flesta ex vivo studier på sköldkörteln har utförts på isolerade vuxna thyroid-härledda celler odlas antingen på 2D vävnadsodling plast dishes eller i 3D-matriser. Med hjälp av dessa typer av kulturer, differentierade follikulära celler antingen förblir polariserat och organiserade som folliklar eller återförvärva en 3D organisation 8-10. Men dessa rena epitelceller, explanterade från deras fysiologiska miljön, och odlade i 2D, ignorera interaktioner med extracellulära matrix, cytokiner, tillväxtfaktorer och med andra celltyper, såsom endotelceller eller nerver celler som de normalt möter in vivo. En mycket trevlig studie beskrev nyligen en differentieringsprotokoll av ES-celler i sköldkörteln folliklar med en sista kultur steg i 3D matrigel 11. Emellertid är dessa 3D-kulturer saknar kontakt med andra celltyper.
Baserat på tidigare kunskap om bukspottkörtel och spottkörtlar organkultur 12-14, en metod för att dissekera mus embryonala sköldkörtel anlagen och odling explantaten på semiporous filter eller på mikroskopi plastglas utvecklades.
Närarbetar med E12.5 embryon, det dubbla ursprunget av sköld anlagen (mittlinjen anlage och de två sido ultimobranchial organ) införde microdissection av ett stort fragment av vävnad. Denna innehöll luftstrupen, men inte i matstrupen, och sträckte sig från svalg arch artärer upp till arytenoid svullnad. När de odlas på filter, sträcker sig mittlinjen anlage lateralt på vardera sidan av luftstrupen, där de smälter samman med de ultimobranchial organ för att bilda de två sköldkörtel lober, fortfarande förbundna genom ett smalt näs.
I kultur, epitelceller föröka sig, organisera sig i hårsäckarna och differentierar till thyrocytes och C-celler, beroende på deras ursprung. Endotelceller som finns i microdissected vävnaden föröka också och invadera sköld lober att äntligen associera nära med epitelial follikulära struktur, oberoende av blodflödet eller cirkulerande faktorer. Eftersom utvecklingen av explantaten rekapitulerar troget in vivo utvecklaning, är denna kultur systemet optimalt för att studera morfogenetisk och differentierings händelser som inträffar under sköldkörtel utveckling.
Sköldkörtel vävnader kan erhållas från vildtypen, knockout eller fluorescerande transgena embryon, och odlingssystemet är mottaglig för förlust-och gain-of-function experiment. Slutligen kan tidsförlopp avbildning av fluorescerande sköldkörtel explants på mikroskopi plastskålar utnyttjas för att bättre undersöka kinetiken och kontinuitet morfogenetiska rörelser som sker in vivo. Time-lapse avbildning har redan använts för att studera förgrening morfogenes i bukspottkörteln 15,16 eller ureteric knoppen 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Möss upp och behandlas i enlighet med principerna för försöksdjurs hand om universitetet djurskyddskommittén. Alla procedurer och protokoll godkändes av denna kommitté.
1. Beläggning av Mikroskopi Plast Kultur Chambers
OBSERVERA: Utför alla de följande stegen under sterila förhållanden i ett dragskåp med laminärt flöde. De två typer av beläggning är funktionellt likvärdiga.
- Coat plast kultur kammare med fibronektin en dag före isolering av sköldkörtelvävnad:
- Späd steril fibronektin till en 50 | ig / ml slutlig koncentration i M199-medium kompletterat med 100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin, 0,25 | ig / ml fungizon och 2 mM glutamin 12.
- Täck brunnarna med 200 pl av utspädd fibronektin och inkubera över natten i en 4 ° C kylskåp.
- På dagen för dissektion, aspirera fibronektin, skölj brunnarna en gång med M199 och lägga till en minimal volym av 200 | il M199 som kompletterats med antibiotika, glutamin och 10% fetalt kalvserum.
- Låt belagda kammare i inkubatorn tills den ska tallriken explantaten.
- Coat plastkulturkammare med typ I-kollagen 2 tim före isolering av sköldkörtelvävnad:
- Späd steril typ I-kollagen till en 50 | ig / ml slutlig koncentration i 10 mM HCl. OBS: Håll kollagenstamlösning på is.
- Täck brunnarna med 200 pl av utspädd kollagen typ I och inkubera i 2 h vid rumstemperatur (RT).
- Sug typ I-kollagen lösning, skölj brunnarna en gång med M199 och lägga en minimivolym av 200 ni M199 kompletterad med antibiotika, glutamin och 10% fetalt kalvserum.
- Låt belagda kammare i inkubatorn tills den ska tallriken explantaten.
2. Dissektion av Thyroid Anlagen-innehållande vävnader (E12.5) eller Sköldkörtel Lobes (E13.5-e14,5)
OBS: Använd rena dissekera verktyg och Petri / odlingsplattor. De allmänna steg och snitt som beskrivs nedan är samma för E12.5 och E14.5 embryon.
- Offra tidsinställda-gravida honmöss vid önskad embryonala (e) dag (från E12.5 till E14.5) och ta bort livmodern med hjälp dissekera instrument.
- Placera dissekerade livmodern i en 10 cm platta innehåller HBSS.
- Håll ena änden av livmodern med pincett och öppna livmodern med en liten sax för att befria successivt alla embryon.
- Separera de embryon från moderkakan med sax och överföra embryon med sina extraembryonic membran i en ny 10 cm platta innehållande HBSS.
- Ta gulesäcken och amnion. OBS: Från och med nu, arbeta under ett stereomikroskop med genomlysning underifrån; öka förstoringen med dissektion steg. Använd volfram nålar i glaskapillärer som dissekera verktyg.
- Använda nålar somen kniv och gaffel, ta bort den övre delen av huvudet, inklusive den övre käften och öronen (figur 1A, skärs längs en).
- Håll embryot på dess baksida och avlägsna först en extra bit av neuralröret (Figur 1A, skuren längs b), då den nedre delen av embryot, precis under de främre extremiteterna och ovanför hjärtat (Figur 1B).
- Överför embryot skiva innehåller tungan (för att orientera vävnaden) och halsregionen i ett nytt 10 cm platta innehåller HBSS.
- Ta neuralröret och vävnader posteriort matstrupen / luftstrupe (Figur 1C, skär längs en).
- Försiktigt avsnittet vävnaden slice längs båda sidor av tungan (Figur 1C, klippa längs b och b ').
- Leta reda på matstrupen och luftstrupen, i förlängning av tungan, och dissekera bort tungan, lämnar arytenoid svullnad (figur 1D, skär längs en), och vävnaden på both sidor av matstrupen / luftstrupe (Figur 1D, klippa längs b och b ').
- Ta matstrupen, och placera luftstrupen med sin ventrala sidan uppåt.
- Dissekera bort de oönskade vävnader såsom tymus (Fig. 1E) och alla de vävnader som är belägna i sidled med svalg arch artärer. För E13.5 eller E14.5 embryon, visualisera sköldkörtel lober på varje sida av luftstrupe (Figur 1F, röda streckade linjer) och ytterligare dissekera loberna från luftstrupen.
- Överför den isolerade E12.5 trakea region eller de E13.5-E14.5 sköldkörtel lober in i en 35 mm odlingsplatta innehållande förvärmda M199-medium kompletterat med antibiotika, glutamin och 10% fetalt kalvserum. Överför explants använder en förvätas filterspets på en P-200 mikropipett. För E12.5 explants, skär den yttersta spetsen för att vidga öppningen. OBS: Rutinmässigt, och om embryon har samma genotyp, utför steg 6 och 7 om alla embryon, detn 9 till 11, och slutligen 12 & 13.
3. Plating och kultur i Sköldkörtel Explantat
- Tvätta explantaten genom successiv överföring i tre brunnar i en 24-brunnsplatta innehållande 1 ml av förvärmt odlingsmedium (= M199 utökat med antibiotika, glutamin och 10% fetalt kalvserum).
- Plätering av sköldkörtel lober på belagda mikroskopi plast kultur kammare:
- Sug M199 odlingsmedium från de belagda kammare.
- Försiktigt, överföra sköldkörtel explants i kulturkammare som använder en mikropipett och filterspetsar. Placera en Explantation i mitten av varje kammare.
- Avlägsna överskott av medium och placera odlingskammare i en vävnadsodlingsinkubator (37 ° C, 5% CO2) under 2 h för att låta explantaten fästa till matrisen.
- Försiktigt lägga 200 till 300 | il av förvärmt odlingsmedium till varje brunn.
- Inkubera under långtidsodling i vävnadsodlingsinkubator.
- Plätering of luftstrupen region eller sköld lober på semiporous filter:
- Fyll på antalet brunnar i en 24-brunnars platta krävs med 330 | il av förvärmt odlingsmedium.
- Placera filter (t.ex. 0,4 um Millipore filter) på mediet, ta hand för att undvika fångst av luftbubblor under kulturfilter.
- Försiktigt, med hjälp av en mikropipett och filterspetsar, överföra sköldkörtel explants med en minimal volym av medium på mitten av filtren (max 4/filter).
- Ta bort överskottet av mediet och utrymme ut explantaten med en volfram nål.
- Inkubera under långtidsodling i vävnadsodlingsinkubator. OBS: Byt odlingsmedium varannan dag under laminärt flöde huva. Kultur explantaten upp till 7 dagar.
4. Hela montering immunofluorescensfärgning protokoll för Sköldkörtel Explantat
Rubba explantat odlas på filter (efter steg 2 nedan) med hjälp av volfram nålar ellerfin pincett och överföring i en 24-brunnar för alla steg, med undantag för primär (steg 5) och sekundär (steg 7) inkubationer antikroppar (96 brunnar). För anhängare explantat odlade på mikroskopi plastkammare, utföra alla steg i kulturkammare.
- Sug M199 odlingsmedium och fixera Explantation med iskall 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 min (500 pl i 24-bra maträtt och 300 pl i mikroskopi diabilder).
- Tvätta 2x 10 minuter i Tris-buffrad saltlösning med Triton (TBST, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100) vid rumstemperatur.
- Process explantaten omedelbart eller förvara vid -20 ° C. NOTERA: För långtidslagring vid -20 ° C, dehydrera explantaten i metanol genom att successivt öka metanolkoncentrationen i TBST att nå 100% metanol. När du är redo att fortsätta med immunfärgning (steg 4), rehydrate explantaten genom att gradvis lägga TBST till metanol.
- Ersätt TBST med blockeringslösningen (10% normalt getserum i TBST) Och inkubera på ett hav-saw vippa för 30 till 60 min vid RT.
- Späd primär antikropp i blockerande lösningen (100-200 l per tillstånd). Överför "filter" explants från en 24-brunnar på en 96-brunnar. Inkubera explantat med de primära antikropparna på ett hav-saw vippa över natten vid 4 ° C.
- Nästa dag, kasta den primära antikroppen lösningen, överför det "filter" explants tillbaka i en 24-brunnar, och tvätta minst fem gånger med TBST på en havs såg rocker för 45-60 min vardera vid RT.
- Späd sekundär antikropp (t.ex. get-anti-X-Alexa Fluor vid 1:2000 utspädning) i TBST innehållande 1% normalt getserum och inkubera explantaten med denna spädning över natt på ett hav-saw rocker vid 4 ° C och i mörker. För kärn motfärgning, inkluderar 1 ng / ml av bis-bensimid (Hoechst) tillsammans med den sekundära antikroppslösningen.
- Nästa dag, kassera den sekundära antikroppslösningen och tvätta 5x med TBST på ett hav-sawVippa för 45-60 min vardera vid RT. Under tvättarna, hålla explantaten i mörker.
- Utför ytterligare en tvätt i TBST snurra över natten vid 4 ° C i mörker.
- Postfix immunostained explantat i 4% PFA vid 4 ° C under 10 min.
- Tvätta 2x 10 min med TBST.
- Överför explantaten antingen gradvis i metanol 100% för långtidsförvaring vid -20 ° C, eller analysera omedelbart. För explantat odlade på filter, och immunostained i en 24-brunnar, överföring i ett mikroskop kammare (t.ex. LabTek eller Ibidi) med TBST eller bättre fluorescerande monteringsmedium före analys med en multi eller konfokalmikroskop.
5. Extraktion av RNA från Sköldkörtel
Arbete i en RNas-fri miljö. Använd därför nukleinsyra och nukleas gratis pipettspetsar och rengör både bänk och utrustning från föroreningar och RNaser. Protokollet bygger på fenol / kloroform, utför det första stegets (1 till 7) i ett dragskåp.
- Homogenisera en sköldkörtel explantatet eller två sköldkörtel lober med 300 | il av RNA-extraktionslösning med användning av en engångsmortelstöt för 1,5 ml rör. I mellan prover, tvätta morteln i 2% SDS, sedan vatten, sedan etanol.
- Lägg till ytterligare 100 | il av RNA-extraktionslösning, vortexa 10 sekunder och inkubera vid RT i 10 min.
- Vortexa i 30 sek och tillsätt 20 ng tRNA till varje prov.
- Vortex under 1 min och tillsätt 80 | il av kloroform.
- Vortexa kraftigt i 30 sek och inkubera 15 minuter vid RT.
- Centrifugering under 15 minuter vid 19000 x g i en kyld (4 ° C), centrifugera.
- Överför försiktigt den färglösa övre vattenfasen i ett nytt rör som innehåller 20 mikrogram av glykogen som samutfällare.
- Vortexa och tillsätt 200 | il av 100% isopropanol alkohol.
- Vortexa kraftigt i 15-30 sek och låt RNA fällningen vid -20 ° C under 2-3 h eller vid -80 ° C under 1 timme.
- Centrifugera under 30 min vid 19000xg vid 4 ° C och avlägsna supernatanten.
- Tvätta pelleten med 450 | il kall 75% etanol och virveln för att driva bort pelleten.
- Spin 10 min vid 19.000 xg vid 4 ° C och avlägsna supernatanten.
- Torka pelleten under huven i 5 min.
- Resuspendera pelleten med 10 ^ il RNas-fritt vatten och inkubera 10 minuter vid RT.
- Analys RNA-koncentration, förvara vid -80 ° C eller vända transkribera för genuttryck analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sköldkörtel anlages (mittlinjen och UB, tillsammans med omgivande vävnader) och sköldkörtel lober dissekeras från musembryon vid E12.5 och e13.5/e14.5, respektive (Figur 1). Efter en dag i odling på filter, är mittlinjen anlage synliga (figur 2A) som en långsträckt vävnad som spänner på toppen av luftstrupen. Den bildar successivt två lober på varje sida av luftstrupen. Om isolerade sköldkörtel lober (E13.5 eller E14.5) odlas, kommer de att expandera, genomgår morfogenes och epitelceller kommer att organisera sig i makroskopiskt synliga follikulära strukturer (Figur 2B).
Anordning och polarisering av epitelceller, märkta med E-cadherin, kan visualiseras genom ezrin immunmärkning (Figur 3A). Ezrin-positiva intracellulära strukturer successivt och på ett samordnat sätt, säkring med en pol av cellen som kommer att bli den apikala polen. Under denna process, endotelceller positiv för PECAM föröka sig och organisera sig kring utvecklings folliklar att bilda angio-follikulära enheter (Figur 3B). För att kvantifiera differentiering av thyrocytes och C-celler, kan RNA isoleras från de odlade sköldkörtel lober och genuttryck analyserades genom RT-qPCR (Figur 3C). Medan uttrycket av sköld transkriptionsfaktör Nkx2.1 inte ändras under odlingen, expression av thyrocyte specifika tyroglobulin och av C-cellspecifik kalcitonin ökat dramatiskt, vilket indikerar funktionell differentiering.
Figur 1. Dissektionsverktyg stegen att isolera sköldkörtel från E14.5 musembryo. Snitt avbildas av gula streckade linjer. (A) Den övre delen av huvudet avlägsnas genom två snitt för att exponera tungan. (B) NECk-regionen är skild från resten av kroppen genom sektione embryot under de övre extremiteterna och ovanför hjärtat. (C) Att hålla tungan (till) som guide, ta bort neuralrörsdefekter (nt) och de laterala vävnader och lemmar. (D) Tungan, arytenoid svullnad (*) och matstrupen / luftstrupen är perfekt i linje. Ta först bort tungan och sedan vävnader sidled till matstrupen / luftstrupe region. (E) De sköldkörtel lober är delvis dolda av bräss (thym) som ska kasseras. (F) Sköldkörtel lober är synliga på vardera sidan av luftstrupen (röd streckade ovoids) eller bättre visualiserades med användning av fluorescerande reporter embryon (Pax8-Cre, Rosa-stop-YFP; infälld). Förkortningar:. Till (tunga), thym (brässen), tra (luftstrupe), * (arytenoid svullnad) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Dissekerad sköldkörtel explantaten på filtrera och sköldkörtel lober på fibronektin snyggt utveckla ex vivo. (A) Fotografier av en E12.5 thyroid explantat odlades under 1, 2 och 3 dagar på semiporous filter, vid luftmediet gränssnitt. Sköldkörtel epitelceller migrerar bilateralt på vardera sidan av luftstrupen och bildar två växande sköldkörtel lober. (B) bright bilder på dag 1 och dag 2 av en E14.5 thyroid lob odlades på mikroskopi plastodlingskamrarna. Notera expansion och ombyggnad av epitelet som i slutändan bildar stora (20-100 mikrometer) folliklar runt dag 7. Gul streckad linje skisserar den epiteliala periferi sköldkörteln. Skala barer, 100 nm. Please click här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Folliculogenesis, angiogenes och differentiering av sköldkörtel i kultur. Sköldkörtel lober odlades under den angivna tiden. (A) Fast vävnader hel-mount immunostained med antikroppar mot basolaterala markör E-cadherin, och subapical membranmarkör Ezrin. Efter en dag i kultur, epitelceller i sköld parenkymet nuvarande små ezrin-positiva strukturer som motsvarar intracellulära vesiklar 7. Samordnade fusion av blåsor från angränsande celler bildar små lumen på dag 2; deras gradvisa tillväxt och organisation av de omgivande cellerna runt lumen kommer att avgränsa före follikulära strukturer efter 4 dagar. Scale bar, 20 | im. (B) Sköldkörtel lOBE immunostained med antikroppar mot trombocyter och endotelceller Adhesion Molecule (PECAM) och Ezrin. Folliklar är omgivna av endotel strukturer. Scale bar, 50 | im. (C)-RNA, extraherat från sköldkörtel lober, transkriberades omvänt före kvantitativ PCR. Expressionen av sköld transkriptionsfaktör Nkx2.1, och av två differentieringsgener, tyroglobulin och kalcitonin, mättes med användning av specifika primerpar. För att beräkna det relativa genuttrycket var ΔΔ Ct metod, med hjälp av E-cadherin som referensgenen och den sista tidpunkten av kulturen som 100%. Bilder som visas i A och B är ensamstående konfokala optiska delar av hel-mount immunostained sköldkörtel lober. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta dokument beskriver en metod för att dissekera och odling av sköldkörtel explants (E12.5) eller lober (E14.5) i syfte att studera och bättre förstå de komplexa händelser som leder till sköldkörteln bildas. På grund av den dubbla ursprung i sköld anlagen (mittlinjen anlage och de två laterala ultimobranchial kroppar) och sin ringa storlek, ett fragment av E12.5 vävnad lokaliserad rostralt till svalg arch artärer och innehållande i luftstrupen, men inte i matstrupen är microdissected. Som visas, inom en period av fyra dagar, denna kultur systemet troget rekapitulerar in vivo sköldkörtel utveckling sedan: (i) mittlinjen anlage vandrar bilateralt och expanderar för att bilda, med UB, två sköldkörtel lober som förbinds med en smal landtunga (Figur 2A) (ii) sköldkörtel prekursorer omorganisera från en massa av celler in i folliklar och slutligen polarisera (fig 2B och 3A), (III) endotelceller finns närvarande imicrodissected vävnad föröka sig, vandrar in i sköldkörteln lober, och nära associerar med epitelcellerna (Figur 3B), och (iv) thyrocytes och C-celler differentierar kvalitativt (figur 3C), som de gör i vivo 7. Som dissektion avbryter fysiskt i livmodern utveckling och explanterad vävnad har att anpassa sig till kultur skick, är de morfologiska och differentieringshändelser något fördröjd jämfört med situationen in vivo.
Kritiska steg i protokollet
Den kritiska aspekten av denna metod är i dissekering. För det första är det viktigt att ta bort sido vävnader, samt höger och vänster lober tymus från E12.5 explantat, som sin expansion i kultur hindrar ordentlig utveckling av sköld lober. För det andra, är snabbhet också avgörande om man vill behålla endothelialceller levande. Vid dissektion inte utförs under en steril atmosfär, är det viktigt att tvätta flera gånger explantaten i sterilt odlingsmedium. Slutligen, när odling av explantat om semiporous filter, är det viktigt att använda en liten volym av medium och placera explantaten på mitten av filtret. För mycket mediet kommer att strömma mot periferin av filtret och skapa en menisk med filterväggen. I detta fall kommer explantatet följa mediet och når menisken; dess utveckling kommer att vara i medel snarare än på luft / medel gränssnitt.
Möjliga ändringar och begränsningar
Protokollet som beskrivs här gäller E12.5 sköldkörtel explants och E13.5 och E14.5 isolerade sköldkörtel lober. Yngre och äldre utvecklingsstadier kunde testas i funktion av den vetenskapliga frågan behandlas. Andra odlingsbetingelser kan också testas: sköldkörtel vävnadsdelar och lober kan odlas i 3D matrigel, eller mediet skulle kunna kompletteras med insulin / Transferrin / Selen snarare än med 10% serum.
En viktig aspekt av vävnadskultur är syrekoncentrationen. När odlas på mikroskopi plastglasen är syrehalt svårt att uppskatta eftersom det kommer att minska med höjden av media över explantaten. När odlas på filter, vid luft / medelgränssnitt, explantat är i kontakt med atmosfären, alltså med 21% syre. I det senare fallet kan man försöka återskapa den "hypoxiska" i livmodern miljö med hjälp av lägre PO2 koncentration inne i inkubatorn.
Om tissular komplexitet E12.5 explants är en fördel för korrekt utveckling, är det också en största nackdelen som epitelcellerna inte är tillgängliga för virus eller transfektion reagens. Manipulering kan utföras med diffunderbara reagens (inhibitorer, blockerande antikroppar, tillväxtfaktorer, cytokiner, konditionerat medium), hållning i åtanke att den exogena förening påverkar alla celltyper. Dessutom vävnad komplexitet och den lilla storleken på loberna i förhållande till hela vävnads explantatet (se figur 2A, högra panelen), minskar renheten av extrakten (RNA eller protein) som framställts.
Även om de flesta av de data som presenteras i detta papper erhölls från 4-5 dagar odlade explantat, är det möjligt att hålla det orgel i kultur under längre tid, upp till 10 dagar på plast, med en kontinuerlig utveckling av folliklar (se figur 2B vid dag 7). Om längre kulturer måste utföras, bör man kontrollera att alla celltyper, bland annat endotelceller, överleva i explantaten.
Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga metoder eller andra alternativa metoder
Jämfört med odling av rena populationer av thyrocytes i 2D rätter eller 3D matrices, presenterar denna organkultursystem fördelen av att upprätthålla den fysiska och fysiologiska sammansättningen av de microdissected fragment. I själva verket, förutom att thyrocytes och C-celler progenitorer explantat innehåller mesenkymala och endotelceller samt extracellulära matrisen. Som redan visats med spottkörtlar, njure, lunga eller bukspottkörtel, kulturer organ fint härma in vivo-utveckling. Dessutom ger det ett sätt att snabbt analysera och manipulera (vinst eller förlust-av-funktion) vildtyp och knockout organ.
Framtida applikationer eller riktningar efter att behärska denna teknik
Denna uppsats visar att de cellulära och molekylära aspekter av sköldkörtel utveckling kan analyseras i mikroskop eller med RT-qPCR, in situ hybridisering eller western blotting kan också utföras. Denna kultur-systemet är mottaglig för att få-och förlust-av-funktion experiment via tillägg av specifika hämmares, blockerande antikroppar, tillväxtfaktorer, cytokiner, eller till celler i odlingsmediet 7. Emellertid är alla de celltyper som är närvarande i vävnaden påverkas. Det skulle vara intressant att utveckla virusbaserade cell-typ specifik inriktning.
Användning av en fluorescerande reporterstam med en fluorescerande dissektionsmikroskop underlättar mikrodissektion av vävnadsstycket (figur 1F, inlägg), men också, som rapporterats av andra som använder ett membran-märkta fluorescerande protein 16, gör det möjligt att utföra realtid avbildning av utvecklingsorganet i 3D 15,16, eller för att följa en viss cellpopulation i kulturen. Utveckling av nya fluorescerande reporterstammar kommer att vara nödvändigt att noggrant visualisera morfogenetiska händelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile | proxylab | 80826 | |
| Collagen Type I, rat tail | Millipore | 08-115 | |
| Fibronectin from human plasma | Invitrogen | # 33010-018 | |
| M199 | Invitrogen | 31150-022 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025-100 | |
| Tungsten wire | Goodfellow | LS237450 | |
| culture plate insert (12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
| GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
| E-cadherin | BD Biosciences | 610182 | 1/1,000 |
| Ezrin | Thermo Scientific | MS-661-P1 | 1/400 |
| PECAM | BD Biosciences | 550274 | 1/100 |
| Hoechst | Sigma | B2261 |
References
- Colin, I. M., Denef, J. -F., Lengelé, B., Many, M. -C., Gérard, A. -C. Recent insights into the cell biology of thyroid angiofollicular units. Endocr. Rev. 34 (2), 209-238 (2013).
- Fagman, H., Andersson, L., Nilsson, M. The developing mouse thyroid embryonic vessel contacts and parenchymal growth pattern during specification budding, migration, and lobulation. Dev. Dyn. 235 (2), 444-455 (2006).
- Fagman, H., Nilsson, M. Morphogenesis of the thyroid gland. Mol. Cell. Endocrinol. 323 (1), 35-54 (2010).
- Fagman, H., Nilsson, M. Morphogenetics of early thyroid development. J. Mol. Endocrinol. 46 (1), (2011).
- De Felice, M., Di Lauro, R. Thyroid development and its disorders genetics and molecular mechanisms. Endocr. Rev. 25 (5), 722-746 (2004).
- De Felice, M., Di Lauro, R. Intrinsic and extrinsic factors in thyroid gland development: an update. Endocrinology. 152 (8), 2948-2956 (2011).
- Hick, A. -C., et al. Reciprocal epithelial paracrine interactions during thyroid development govern follicular organization and C-cells differentiation. Dev. Biol. 381 (1), 227-240 (2013).
- Toda, S., Koike, N., Sugihara, H. Cellular integration of thyrocytes and thyroid folliculogenesis: a perspective for thyroid tissue regeneration and engineering. Endocr. J. 48, 407-425 (2001).
- Toda, S., et al. Culture models for studying thyroid biology and disorders. ISRN Endocrinol. , (2011).
- Eggo, M. C., Quiney, V. M., Campbell, S. Local factors regulating growth and function of human thyroid cells in vitro and in vivo. 213, 47-58 (2003).
- Antonica, F., et al. Generation of functional thyroid from embryonic stem cells. Nature. 491, 66-71 (2012).
- van Eyll, J. M., Pierreux, C. E., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. Shh-dependent differentiation of intestinal tissue from embryonic pancreas by activin A. J. Cell Sci. 117, 2077-2086 (2004).
- Hick, A. -C., et al. Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1. BMC Dev. Biol. 9. , (2009).
- Pierreux, C. E., et al. Epithelial:Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas. Dev. Biol. 347, 216-227 (2010).
- Puri, S., Hebrok, M. Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging. Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).
- Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex-vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. , (2012).
- Watanabe, T., Costantini, F. Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis in vitro. Dev. Biol. 271, 98-108 (2004).
