Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

و Published: June 6, 2014 doi: 10.3791/51641
Automatic Translation
1, 1, *1, *1
1Pole of Cell Biology, Université catholique de Louvain & de Duve Institute
* These authors contributed equally

Abstract

الغدة الدرقية هي غدة الصماء bilobated المترجمة في قاعدة العنق، وتنتج هرمونات الغدة الدرقية T3، T4، والكالسيتونين. ويتم إنتاج T3 و T4 من قبل thyrocytes المتباينة، التي نظمت في مجالات مغلقة تسمى المسام، في حين يتم تصنيعه بواسطة C الكالسيتونين الخلايا، ويتخلل بين بصيلات وشبكة كثيفة من الشعيرات الدموية. على الرغم من أن العمارة الغدة الدرقية الكبار وظائف وقد وصفت على نطاق واسع، ودرس، وتشكيل وحدات "الوعاء الجريبي"، وتوزيع خلايا C-في لحمة والاتصالات نظير الصماوي بين الظهارية والخلايا البطانية بعيد كل البعد عن أن يكون مفهوما.

يصف هذا الأسلوب في خطوات متتابعة من الماوس الغدة الدرقية الجنينية ANLAGEN تشريح وثقافتها على مرشحات semiporous أو على شرائح البلاستيك المجهري. في غضون أربعة أيام، وهذا النظام الثقافة يلخص بأمانة في التنمية الغدة الدرقية الجسم الحي. في الواقع، (ط) مليارobation من الجهاز يحدث (لإإكسبلنتس E12.5)، (ب) تنظيم thyrocytes السلائف في بصيلات واستقطاب، (ج) C وthyrocytes الخلايا التفريق، و (iv) الخلايا البطانية موجودة في الأنسجة تتكاثر microdissected، تهاجر إلى فصوص الغدة الدرقية، وبشكل وثيق مع ربط الخلايا الظهارية، كما يفعلون في الجسم الحي.

ويمكن الحصول على أنسجة الغدة الدرقية من النوع البري، بالضربة القاضية أو الأجنة وراثيا الفلورسنت. علاوة على ذلك، إإكسبلنتس الثقافة يمكن التلاعب بها عن طريق إضافة مثبطات، ومنع الأجسام المضادة، عوامل النمو، أو حتى الخلايا أو المتوسطة مكيفة. يمكن تحليلها خارج الحي التنمية في الوقت الحقيقي، أو في أي وقت من الثقافة التي كتبها المناعية وRT-QPCR.

في الختام، والثقافة ازدراع الغدة الدرقية جنبا إلى جنب مع المصب كامل جبل أو على توفر أقسام التصوير والتعبير الجيني التنميط نظام قوي لمعالجة ودراسة التخلق والتمايز أحداث س الغدة الدرقيةrganogenesis.

Introduction

الغدة الدرقية هي عبارة عن مجموعة من المجالات الظهارية مستقلة، ودعا بصيلات، وتحيط بها شبكة كثيفة من الشعيرات الدموية البطانية. هذه المنظمة تسمح وظيفة الغدة الدرقية: توفير الشعيرات الدموية البطانية thyrocytes مع اليود، اللازمة لT3 و T4 هرمون التوليف، وتوزيع هذه الأخيرة إلى الجسم كله. منتشرة في بين بصيلات والشعيرات الدموية، C خلايا إنتاج هرمون الكالسيتونين نقص كلس الدم 1. على الرغم من أن العمارة الغدة الدرقية الكبار وظائف معروفة، الآليات الخلوية والجزيئية المشاركة في التطور الجنيني الغدة الدرقية (تشكيل المسام والتمايز) بعيدة كل البعد عن أن يكون مفهوما.

خلال مرحلة التطور الجنيني، thyrocytes السلف كما تنبع سماكة (بدأة خط الوسط) من الجدار البطني من الأديم الباطن المعى الأمامي في اليوم الجنينية (ه) 8.5 في جنين الفأر، في حين C خلايا الأسلاف تنشأ في E11.5 كما نتوءات على شكل قطرات ( بو التالية للخيشوميةيموت) من الحقائب البلعوم الرابع 2-6. برعم خط الوسط ثم يفصل من الأديم الباطن، ويوسع ثنائيا لتندمج في E13.5 مع الهيئات التالية للخيشومية على كل جانب من القصبة الهوائية. أخيرا، thyrocytes تنظيم في بصيلات وخلايا C-التفريق.

المعرفة الحالية على تشكيل الغدة الدرقية يأتي أساسا من التحليل النسيجي لأنسجة ثابتة، ولكن الأحداث التخلق المشاركة في تشكيل الغدة الدرقية هي ديناميكية للغاية وتنطوي على الاتصالات والتفاعلات بين أنواع مختلفة من الخلايا ومع المصفوفة خارج الخلية. وأظهرت الأعمال الأخيرة التي الأسلاف thyrocyte تنتج مستويات عالية من VEGF لتجنيد الخلايا البطانية إلى الغدة الدرقية النامية، وبدوره بتجنيد الخلايا البطانية تشجيع تشكيل بصيلات وخلايا C التمايز 7.

وقد أجريت معظم الدراسات المجراة سابقا على الغدة الدرقية على الخلايا المشتقة من الغدة الدرقية الكبار معزولة، ونمت إما على 2D البلاستيك زراعة الأنسجة ديتضاءل المجموع المذكور أعلاه أو في المصفوفات 3D. باستخدام هذه الأنواع من الثقافات، والخلايا الجريبي متباينة إما البقاء الاستقطاب وتنظيمها في بصيلات أو إعادة الاستحواذ على منظمة 3D 8-10. ومع ذلك، وهذه الخلايا الظهارية نقية، explanted من بيئتهم الفسيولوجية، والمثقف في 2D، تجاهل التفاعل مع المصفوفة خارج الخلية، السيتوكينات وعوامل النمو ومع أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا البطانية أو الأعصاب التي يواجهونها عادة في الجسم الحي. وصفت دراسة لطيفة جدا مؤخرا بروتوكول تمايز الخلايا ES في بصيلات الغدة الدرقية باستخدام الخطوة النهائية في الثقافة 3D matrigel 11. ومع ذلك، هذه الثقافات 3D تفتقر اتصال مع أنواع الخلايا الأخرى.

بناء على الخبرة السابقة على البنكرياس والغدد اللعابية ثقافة الجهاز 12-14، طريقة لتشريح الفأر الجنينية ANLAGEN الغدة الدرقية وزراعة لل explants على مرشحات semiporous أو على شرائح البلاستيك المجهر وقد وضعت.

عندماالعمل مع الأجنة E12.5، والأصل المزدوج للANLAGEN الغدة الدرقية (بدأة خط الوسط واثنين من الهيئات التالية للخيشومية الجانبي) فرضت تسليخ مجهري من جزء كبير من الأنسجة. يرد هذا القصبة الهوائية، ولكن ليس المريء، وامتدت من الشرايين البلعوم القوس حتى تورم الطرجهالي. عند تربيتها على مرشحات، وبدأة خط الوسط يمتد أفقيا على كل جانب من القصبة الهوائية، حيث تلتحم مع الهيئات التالية للخيشومية لتشكيل اثنين من فصوص الغدة الدرقية، لا تزال متصلة بواسطة برزخ ضيق.

في الثقافة، وتتكاثر الخلايا الظهارية، وتنظيم في بصيلات والتمايز إلى خلايا thyrocytes وC، اعتمادا على أصلهم. الخلايا البطانية الواردة في الأنسجة microdissected أيضا تتكاثر وتغزو فصوص الغدة الدرقية لربط أخيرا بشكل وثيق مع هيكل مسامي الظهارية، بصرف النظر عن تدفق الدم أو عوامل المنتشرة. كما تطور لل explants يلخص بأمانة في الجسم الحي تطويرمنة، وهذا النظام هو الأمثل الثقافة لدراسة التخلق والتمايز الأحداث التي تحدث أثناء نمو الغدة الدرقية.

ويمكن الحصول على أنسجة الغدة الدرقية من النوع البري، بالضربة القاضية أو الأجنة وراثيا الفلورسنت، ونظام الثقافة هي قابلة للخسارة والربح من وظيفة التجارب. أخيرا، يمكن استغلال الوقت الفاصل بين التصوير من إإكسبلنتس الغدة الدرقية fluorescently المسمى على أطباق البلاستيك المجهري للتحقيق أفضل حركية واستمرارية حركات التخلق التي تحدث في الجسم الحي. وقد تم بالفعل استخدام الوقت الفاصل بين التصوير لدراسة التشكل المتفرعة من البنكرياس 15،16 أو الحالبي برعم 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأثيرت الفئران ومعالجتها وفقا لمبادئ رعاية الحيوان المعملية لجنة رعاية الحيوان جامعة. تمت الموافقة على جميع الإجراءات والبروتوكولات التي كتبها هذه اللجنة.

1. طلاء من البلاستيك المجهر الثقافة الغرف

ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات التالية تحت ظروف معقمة في غطاء تدفق الصفحي. نوعين من الطلاء وظيفيا ما يعادلها.

  1. غرف الثقافة معطف من البلاستيك مع فبرونيكتين قبل يوم واحد إلى العزلة من أنسجة الغدة الدرقية:
    1. تمييع فبرونيكتين العقيمة إلى تركيز النهائي 50 ميكروغرام / مل في المتوسط ​​M199 تستكمل مع 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، 0.25 ميكروغرام / مل fungizone و 2 ملي الجلوتامين 12.
    2. تغطية الآبار مع 200 ميكرولتر من فبرونيكتين المخفف واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية الثلاجة.
    3. في يوم من تشريح، نضح فبرونيكتين، وشطف الآبار مرة واحدة مع M199 وإضافة الحد الأدنى من حجم 200 ميكرولتر من M199 تستكمل مع المضادات الحيوية، والجلوتامين و 10٪ مصل العجل الجنين.
    4. مغادرة الغرف المغلفة في الحاضنة حتى جاهزة للوحة لل explants.
  2. معطف من البلاستيك غرف الثقافة مع النوع الأول من الكولاجين 2 ساعة قبل عزل أنسجة الغدة الدرقية:
    1. تمييع نوع العقيمة الأول من الكولاجين لتركيز النهائي 50 ميكروغرام / مل في حمض الهيدروكلوريك 10 ملم. ملاحظة: حافظ على الكولاجين محلول المخزون على الجليد.
    2. تغطية الآبار مع 200 ميكرولتر من نوع المخفف الأول من الكولاجين واحتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    3. نضح نوع أنا الكولاجين الحل، شطف الآبار مرة واحدة مع M199 وإضافة الحد الأدنى من حجم 200 ميكرولتر من M199 تستكمل مع المضادات الحيوية، والجلوتامين و 10٪ مصل العجل الجنين.
    4. مغادرة الغرف المغلفة في الحاضنة حتى جاهزة للوحة لل explants.

2. تشريح الغدة الدرقية ANLAGEN التي تحتوي على الأنسجة (E12.5) أو الغدة الدرقية فصوص (E13.5-E14.5)

ملاحظة: استخدام أدوات تشريح نظيفة ولوحات بيتري / الثقافة. الخطوات العامة وشقوق المبينة أدناه هي نفسها بالنسبة للأجنة E14.5 E12.5 و.

  1. التضحية توقيت الحوامل إناث الفئران الجنينية المطلوب في (ه) يوم (من E12.5 لE14.5) وإزالة الرحم باستخدام أدوات تشريح.
  2. وضع الرحم تشريح في 10 سم لوحة تحتوي على HBSS.
  3. عقد واحد من أقصى الرحم مع ملقط وفتح الرحم مع مقص صغير لتحرير تدريجيا جميع الأجنة.
  4. فصل الأجنة من المشيمة مع مقص ونقل الأجنة مع الأغشية خارج الجنين في جديدة 10 سم لوحة تحتوي على HBSS.
  5. إزالة الكيس المحي والسلى. ملاحظة: من هذه النقطة، والعمل تحت stereomicroscope مع تضوء من أدناه؛ زيادة التكبير مع خطوات تشريح. استخدام الإبر التنغستن في الشعيرات الدموية الزجاج كأدوات تشريح.
  6. باستخدام الإبر مثلسكين وشوكة، وإزالة الجزء العلوي من الرأس، بما في ذلك الفك العلوي والأذنين (1A الشكل، وقطع على طول).
  7. عقد الجنين على ظهرها وإزالة أول قطعة اضافية من الأنبوب العصبي (1A الشكل، وقطع على طول ب)، ثم الجزء السفلي من الجنين، فقط تحت أطرافه الأمامية وفوق القلب (الشكل 1B).
  8. نقل الجنين شريحة تحتوي على اللسان (لتوجيه الأنسجة) ومنطقة الرقبة في جديدة 10 سم لوحة تحتوي على HBSS.
  9. إزالة الأنبوب العصبي والأنسجة الخلفية إلى المريء / القصبة الهوائية (الشكل 1C، وقطع على طول).
  10. بلطف القسم شريحة الأنسجة على جانبي اللسان (الشكل 1C، وقطع على طول ب وب ').
  11. تحديد موقع المريء والقصبة الهوائية، في إطالة اللسان، وتشريح بعيدا اللسان، وترك الطرجهالي تورم (1D الشكل، وقطع على طول)، والنسيج على بوتح الجانبين من المريء / القصبة الهوائية (الشكل 1D، وقطع على طول ب وب ').
  12. إزالة المريء، والقصبة الهوائية مع وضع جانبها بطني مواجهة.
  13. تشريح الأنسجة بعيدا غير مرغوب فيها مثل الغدة الصعترية (الشكل 1E) وجميع الأنسجة الموجودة أفقيا إلى الشرايين القوس البلعومية. لE13.5 أو E14.5 الأجنة، تصور فصوص الغدة الدرقية على كل جانب من القصبة الهوائية (الشكل 1F؛ الخطوط المنقطة الحمراء)، وكذلك تشريح فصوص من القصبة الهوائية.
  14. نقل معزولة المنطقة E12.5 القصبة الهوائية، أو فصوص الغدة الدرقية E13.5-E14.5 في لوحة الثقافة التي تحتوي على 35 مم قبل حرارة متوسطة M199 تستكمل مع المضادات الحيوية، والجلوتامين و 10٪ مصل العجل الجنين. نقل إإكسبلنتس باستخدام تلميح مرشح prewetted على micropipette P-200. لإإكسبلنتس E12.5، وقطع طرف من طرف لتوسيع الافتتاح. ملاحظة: بشكل روتيني، وإذا الأجنة لها نفس التركيب الوراثي، نفذ الخطوات 6 و 7 على جميع الأجنة، ون 9-11، وأخيرا 12 و13.

3. الطلاء وثقافة الغدة الدرقية إإكسبلنتس

  1. غسل لل explants عن طريق التحويل المتعاقبة في ثلاثة آبار من لوحة 24 أيضا يحتوي على 1 مل من قبل حرارة متوسطة الثقافة (= M199 تستكمل مع المضادات الحيوية، والجلوتامين و 10٪ مصل العجل الجنين).
  2. طلي من فصوص الغدة الدرقية على البلاستيك المغلفة المجهر غرف الثقافة:
    1. نضح M199 مستنبت من الغرف المغلفة.
    2. بعناية، ونقل لل explants الغدة الدرقية في غرف الثقافة باستخدام micropipette وتصفية النصائح. وضع ازدراع واحدة في وسط كل دائرة.
    3. إزالة الزائدة المتوسطة ووضع غرفة الثقافة في حاضنة زراعة الأنسجة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2) لمدة 2 ساعة للسماح لل explants نعلق على المصفوفة.
    4. إضافة بلطف 200-300 ميكرولتر من قبل حرارة متوسطة الثقافة إلى كل بئر.
    5. احتضان لثقافة طويلة الأمد في حاضنة زراعة الأنسجة.
  3. الطلاء سو منطقة القصبة الهوائية أو الغدة الدرقية فصوص على مرشحات semiporous:
    1. ملء عدد من الآبار من 24 لوحة جيدا المطلوبة مع 330 ميكرولتر من قبل حرارة متوسطة الثقافة.
    2. المكان مرشحات (مثل 0.4 ميكرون ميليبور فلتر) على المتوسط، مع الحرص على تجنب محاصرة من فقاعات الهواء تحت التصفية الثقافة.
    3. بعناية، باستخدام micropipette وتصفية نصائح، ونقل لل explants الغدة الدرقية مع حجم الحد الأدنى من المتوسط ​​على مركز للمرشحات (الحد الأقصى 4/filter).
    4. إزالة الزائدة المتوسطة والفضاء خارج لل explants مع إبرة التنغستن.
    5. احتضان لثقافة طويلة الأمد في حاضنة زراعة الأنسجة. ملاحظة: تغيير ثقافة المتوسط ​​كل يوم تحت غطاء تدفق الصفحي. ثقافة لل explants تصل إلى 7 أيام.

4. جبل لالجامع المناعي بروتوكول تلطيخ لالغدة الدرقية إإكسبلنتس

طرد إإكسبلنتس نمت على المرشحات (بعد الخطوة 2 أدناه) باستخدام الإبر التنغستن أوملقط غرامة ونقل في 24 لوحة جيدا لجميع الخطوات، باستثناء الأولية (الخطوة 5) والثانوية (الخطوة 7) حضانات الضد (لوحة 96 أيضا). لإإكسبلنتس تمسكا مثقف على المجهر غرف البلاستيك، وتنفيذ كافة الخطوات في غرف الثقافة.

  1. نضح M199 مستنبت وإصلاح يزدرع مع الثلج الباردة بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) لمدة 20 دقيقة (500 ميكرولتر في طبق 24 جيدا و 300 ميكرولتر في الشرائح المجهر).
  2. غسل 2X 10 دقيقة في تريس مخزنة المالحة مع تريتون (TBST؛ 50 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، 0،1٪ تريتون X-100) في RT.
  3. معالجة لل explants مباشرة أو تخزينها في -20 درجة مئوية. ملاحظة: للحصول على تخزين طويل الأجل في -20 درجة مئوية، يذوى لل explants في الميثانول من خلال زيادة التركيز تدريجيا الميثانول في TBST لتصل إلى 100٪ الميثانول. عندما استعداد لمواصلة مع المناعية (الخطوة 4)، ترطيب لل explants بإضافة TBST تدريجيا إلى الميثانول.
  4. استبدال TBST مع عرقلة الحل (10٪ مصل الماعز العادية في TBST)، واحتضان على الكرسي الهزاز ورأى البحر لمدة 30-60 دقيقة في RT.
  5. تمييع الأجسام المضادة الأولية في عرقلة الحل (100-200 ميكرولتر لكل حالة). نقل لل explants "تصفية" من 24 لوحة جيدا لوحة 96 جيدا. احتضان إإكسبلنتس مع الأجسام المضادة الأولية على الكرسي الهزاز البحر ورأى بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  6. في اليوم التالي، ونبذ الحل الأجسام المضادة الأولية، ونقل لل explants "تصفية" مرة أخرى في 24 لوحة جيدا، وغسل خمس مرات على الأقل مع TBST على الكرسي الهزاز البحر ورأى ل45-60 دقيقة لكل منهما في RT.
  7. تمييع الضد الثانوية (مثل الماعز المضادة للX-اليكسا فلور في 1:2،000 التخفيف) في TBST تحتوي على 1٪ من مصل الماعز العادي واحتضان لل explants مع هذا التخفيف بين عشية وضحاها على الكرسي الهزاز البحر ورأى في 4 درجات مئوية، وفي الظلام. لcounterstaining النووية، وتشمل 1 ميكروغرام / مل من مكرر Benzimide (هويشت) جنبا إلى جنب مع الحل الضد الثانوية.
  8. في اليوم التالي، ونبذ الحل الضد الثانوية وغسل 5X مع TBST على رأى البحرالروك ل45-60 دقيقة لكل منهما في RT. خلال يغسل، والحفاظ على إإكسبلنتس في الظلام.
  9. إجراء غسيل إضافية في TBST يحوم بلطف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في الظلام.
  10. POSTFIX لل explants immunostained في PFA 4٪ عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  11. غسل 2X 10 دقيقة مع TBST.
  12. نقل لل explants إما تدريجيا في الميثانول 100٪ للتخزين طويل الأجل في -20 درجة مئوية، أو تحليل الفور. لإإكسبلنتس مثقف على مرشحات، وimmunostained في 24 لوحة جيدا، ونقل في غرفة المجهر (على سبيل المثال LabTek أو Ibidi) مع TBST أو أفضل متوسط ​​الفلورسنت تصاعد قبل التحليل مع Multiphoton أو المجهر متحد البؤر.

5. استخراج الحمض النووي الريبي من الغدة الدرقية

العمل في بيئة خالية من ريبونوكلياز. وبالتالي، استخدام الحمض النووي ونوكلياز نصائح مجانية ماصة وتنظيف كل مقاعد البدلاء والمعدات من الملوثات وRNases. هذا البروتوكول كونها مبنية على الفينول / الكلوروفورم، نفذ الخطوة الأولىق (1-7) تحت غطاء الكيميائية.

  1. التجانس واحد ازدراع الغدة الدرقية أو الغدة الدرقية فصين مع 300 ميكرولتر من الحل استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مدقة المتاح للأنبوب 1.5 مل. في بين العينات، وغسل مدقة في 2٪ SDS، ثم الماء، ثم الايثانول.
  2. إضافة 100 ميكرولتر من حل آخر استخراج الحمض النووي الريبي، دوامة 10 ثانية واحتضان على RT لمدة 10 دقيقة.
  3. دوامة لمدة 30 ثانية وإضافة 20 نانوغرام من الحمض الريبي النووي النقال إلى كل عينة.
  4. دوامة لمدة 1 دقيقة وإضافة 80 ميكرولتر من الكلوروفورم.
  5. دوامة بقوة لمدة 30 ثانية واحتضان 15 دقيقة في RT.
  6. تدور لمدة 15 دقيقة في 19،000 XG في درجة حرارة مضبوطة (4 ° C) الطرد المركزي.
  7. نقل بعناية المرحلة المائية العليا عديم اللون في أنبوب الطازجة التي تحتوي على 20 ميكروغرام من الجليكوجين كما coprecipitant.
  8. دوامة وإضافة 200 ميكرولتر من 100٪ الأيزوبروبانول الكحول.
  9. دوامة بقوة لمدة 15-30 ثانية والسماح RNA يعجل في -20 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعة أو في -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  10. تدور لمدة 30 دقيقة في 19،000XG في 4 درجات مئوية، والقضاء طاف.
  11. غسل بيليه مع 450 ميكرولتر من الايثانول 75٪ البرد ودوامة لطرد بيليه.
  12. تدور لمدة 10 دقيقة في 19،000 XG في 4 درجات مئوية، والقضاء طاف.
  13. تجفيف بيليه تحت غطاء محرك السيارة لمدة 5 دقائق.
  14. resuspend الكرية مع 10 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه واحتضان 10 دقيقة في RT.
  15. تركيز الحمض النووي الريبي الفحص، مخزن في -80 درجة مئوية أو عكس نسخ لتحليل التعبير الجيني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم تشريح anlages الغدة الدرقية (خط الوسط وUB، جنبا إلى جنب مع الأنسجة المحيطة بها)، وفصوص الغدة الدرقية من أجنة الفئران في E12.5 وe13.5/e14.5، على التوالي (الشكل 1). بعد يوم واحد في الثقافة على مرشح، وبدأة خط الوسط مرئيا (الشكل 2A) باعتبارها نسيج ممدود تمتد على الجزء العلوي من القصبة الهوائية. أنها تشكل تدريجيا فصين على كل جانب من القصبة الهوائية. إذا فصوص الغدة الدرقية معزولة (E13.5 أو E14.5) هي مثقف، وسوف تتوسع، وسوف يخضع التشكل وتنظيم الخلايا الظهارية في الهياكل الجريبي مرئية ظاهريا (الشكل 2B).

تنظيم واستقطاب الخلايا الظهارية، وصفت مع كادهيرين E، يمكن تصور من قبل immunolabeling ezrin (الشكل 3A). هياكل داخل الخلايا Ezrin إيجابية تدريجيا، وبطريقة منسقة، والصمامات مع قطب واحد من الخلية التي ستصبح القطب القمي. أثناء هذه العملية، الخلايا البطانية POSITIVE لPECAM تتكاثر وتنظيم حول بصيلات النامية لتشكيل وحدات القسطرة-الجريبي (الشكل 3B). لتحديد تمايز الخلايا thyrocytes وC، RNA يمكن عزلها عن فصوص الغدة الدرقية مثقف، والتعبير الجيني يعاير بواسطة RT-QPCR (الشكل 3C). بينما لا يغير التعبير عن عامل النسخ الغدة الدرقية Nkx2.1 خلال الثقافة، والتعبير عن ثايروجلوبولين thyrocyte محددة وخلايا محددة C الكالسيتونين زادت بشكل كبير، مشيرا إلى التمايز الوظيفي.

الشكل 1
الشكل 1. تشريح الخطوات لعزل الغدة الدرقية من جنين فأر E14.5. وصفت الشقوق من قبل الخطوط المنقطة الصفراء. (أ) يتم إزالة الجزء العلوي من الرأس من قبل اثنين من الشقوق لفضح اللسان. (ب) اللجنة الوطنية للانتخابات يتم فصل المنطقة ك عن بقية الجسم عن طريق باجتزاء الجنين أدناه الأطراف العلوية وفوق القلب. (C) حفظ اللسان (إلى) كدليل، إزالة الأنبوب العصبي (الإقليم الشمالي) والأنسجة الجانبي وأطرافه. (D) واللسان، وتورم الطرجهالي (*) والمريء / القصبة الهوائية تتماشى تماما. أولا إزالة اللسان والأنسجة ثم الوحشي لمنطقة المريء / القصبة الهوائية. (E) يتم إخفاء فصوص الغدة الدرقية جزئيا من قبل الغدة الصعترية (زعتر) التي ينبغي التخلص منها. (F) فصوص الغدة الدرقية واضحة على كل جانب من القصبة الهوائية (البيضويات منقط الحمراء)، أو أفضل تصور باستخدام أجنة مراسل الفلورسنت (PAX8-لجنة المساواة العرقية؛ روزا وقفة وYFP؛ أقحم). الاختصارات: ل(اللسان)، زعتر (الغدة الصعترية)، هيئة تنظيم الاتصالات (القصبة الهوائية)، * (الطرجهالي تورم) الرجاء الضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ن = صفحة "دائما"> الرقم 2
الشكل 2. تشريح إإكسبلنتس الغدة الدرقية والغدة الدرقية على مرشح فصوص على فبرونيكتين تطوير طيف فيفو السابقين. (A) صور من E12.5 يزدرع الغدة الدرقية تربيتها لمدة 1 و 2 و 3 أيام على تصفية semiporous، في واجهة الهواء المتوسط. تهاجر الخلايا الظهارية الغدة الدرقية على المستوى الثنائي على كل جانب من القصبة الهوائية وشكل فصين الغدة الدرقية المتنامية. (B) وصور Brightfield في يوم 1 ويوم 2 من الفص الغدة الدرقية E14.5 مثقف على المجهر البلاستيك غرف الثقافة. ملاحظة توسيع وإعادة تشكيل ظهارة التي تشكل في نهاية المطاف كبير (20-100 ميكرون) بصيلات حول يوم 7. خط منقط الأصفر يحدد هامش الظهارية في الغدة الدرقية. أشرطة النطاق، و 100 ميكرومتر. الرجاء المبادرة القطريةCK هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. Folliculogenesis، الأوعية الدموية وتمايز الغدة الدرقية في الثقافة. كانت فصوص الغدة الدرقية مثقف للمرة المشار إليه. (A) والأنسجة الثابتة كله يشن immunostained مع الأجسام المضادة ضد basolateral علامة E-كادهيرين، وعلامة الغشاء تحت القمية Ezrin. بعد يوم واحد في الثقافة، والخلايا الظهارية للهياكل ezrin إيجابية حمة الغدة الدرقية هدية صغيرة التي تتوافق مع حويصلات داخل الخلايا 7. سوف الانصهار متضافرة من الحويصلات من الخلايا المجاورة تشكيل التجويف صغير في يوم 2؛ وسيكون معدل النمو التدريجي بهم، وتنظيم الخلايا المحيطة حول التجويف تحدد هياكل ما قبل الجريبي بعد 4 أيام. شريط النطاق، 20 ميكرومتر. (ب) الغدة الدرقية لOBE immunostained مع الأجسام المضادة ضد صفائح الدم والخلايا البطانية التصاق جزيء (PECAM) وEzrin. محاصرون من قبل هياكل بصيلات البطانية. شريط النطاق، 50 ميكرومتر. (C) الحمض النووي الريبي المستخرج من فصوص الغدة الدرقية، وقد كتب العكسي قبل PCR الكمي. التعبير عن الغدة الدرقية عامل النسخ Nkx2.1، واثنين من الجينات التمايز، ثايروجلوبولين والكالسيتونين، تم قياسها باستخدام أزواج التمهيدي محددة. لحساب التعبير الجيني النسبي، تم استخدام أسلوب ΔΔ ط م، وذلك باستخدام-E كادهيرين كما الجين مرجعية ونقطة آخر مرة من ثقافة إلى 100٪. الصور المبينة في A و B المقاطع البصرية متحد البؤر واحد من فصوص الغدة الدرقية بأكملها جبل immunostained. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وتصف هذه الورقة طريقة لتشريح وزراعة إإكسبلنتس الغدة الدرقية (E12.5) أو فصوص (E14.5) من أجل دراسة وفهم أفضل للأحداث المعقدة التي تفضي إلى تشكيل الغدة الدرقية. ويرجع ذلك إلى الأصل المزدوج للANLAGEN الغدة الدرقية (بدأة خط الوسط واثنين من الهيئات التالية للخيشومية الجانبية)، وصغر حجمها، وهو جزء من النسيج E12.5 المترجمة منقاري إلى الشرايين البلعوم القوس، والتي تحتوي على القصبة الهوائية، ولكن ليس المريء وmicrodissected. كما يتضح، في غضون فترة أربعة أيام، وهذا النظام الثقافة يلخص بأمانة في التنمية الغدة الدرقية الجسم الحي منذ: (ط) بدأة خط الوسط يهاجر الثنائي وتوسع لتشكيل، مع UB، فصين الغدة الدرقية متصلة بواسطة برزخ ضيق (الشكل 2A) ، (ب) السلائف الغدة الدرقية إعادة تنظيم من كتلة من الخلايا في بصيلات واستقطاب نهاية المطاف (أرقام 2B و3A)، (ج) الخلايا البطانية موجودة فيتتكاثر أنسجة microdissected، تهاجر إلى فصوص الغدة الدرقية، وبشكل وثيق مع ربط الخلايا الظهارية (الشكل 3B)، و (iv) thyrocytes وخلايا C-التفريق نوعيا (الشكل 3C)، كما يفعلون في الجسم الحي 7. كما تشريح يقطع فعليا في التنمية الرحم والأنسجة explanted ديها للتكيف مع حالة الثقافة، ويتم تأخير طفيف في الأحداث المورفولوجية والتمايز بالمقارنة مع الوضع في الجسم الحي.

الخطوات الحاسمة في البروتوكول

على الجانب الحاسم من هذه الطريقة في تشريح. أولا، لا بد من إزالة الأنسجة الجانبي، فضلا عن الحق وترك فصوص الغدة الصعترية من لل explants E12.5، وتوسعها في الثقافة تعوق التنمية السليمة للفصوص الغدة الدرقية. الثانية، سرعة أمر بالغ الأهمية أيضا إذا كان أحد يريد الحفاظ على البطانيةالخلايا على قيد الحياة. إذا لم يتم تنفيذ تشريح تحت أجواء معقمة، فمن المهم أن يغسل عدة مرات لل explants في معقمة متوسطة الثقافة. أخيرا، عندما زرع إإكسبلنتس على مرشحات semiporous، فمن المهم استخدام كمية صغيرة من المتوسطة ووضع لل explants على مركز للتصفية. وكثيرا المتوسطة تتدفق إلى المحيط الخارجي للتصفية وإنشاء الغضروف المفصلي مع الجدار التصفية. في هذه الحالة، سوف ازدراع اتبع المتوسط ​​وتصل إلى الغضروف المفصلي؛ وسوف يكون تطوره في المتوسط ​​وليس في الهواء / متوسطة واجهة.

التعديلات الممكنة والقيود

بروتوكول الموصوفة هنا ينطبق على E12.5 إإكسبلنتس الغدة الدرقية وE13.5 E14.5 ومعزولة فصوص الغدة الدرقية. يمكن اختبار مراحل النمو الأصغر والأكبر سنا في وظيفة من مسألة علمية معالجتها. ويمكن أيضا أن تختبر الظروف الثقافة الأخرى: يمكن أن تزرع إإكسبلنتس الغدة الدرقية أو فصوص في 3D matrigش، أو وسيلة يمكن أن تستكمل مع الأنسولين / ترانسفيرين / السيلينيوم بدلا من 10٪ مصل.

جانب هام من جوانب زراعة الأنسجة هو تركيز الأكسجين. عندما نمت على المجهر الشرائح البلاستيكية، وتركيز الأوكسجين من الصعب أن نقدر لأنها سوف تتناقص مع ارتفاع متوسط ​​فوق إإكسبلنتس. عندما نمت على المرشحات، في واجهة الهواء / المتوسطة، إإكسبلنتس على اتصال مع الغلاف الجوي، وبالتالي مع 21٪ من الأوكسجين. في هذه الحالة الأخيرة، يمكن للمرء أن حاول إعادة إنشاء "ميتة" في بيئة الرحم باستخدام أقل تركيز ص 2 داخل الحاضنة.

إذا التعقيد نسيجي لللل explants E12.5 هي ميزة للتنمية الصحيح، وإنما هو أيضا العيب الرئيسي كما في الخلايا الظهارية ليست في متناول الفيروسات أو الكواشف ترنسفكأيشن. التلاعب لا يمكن أن يؤديها مع الكواشف إنتشاري (مثبطات، والأجسام المضادة ومنع، عوامل النمو، السيتوكينات، مكيفة المتوسطة)، والحفاظ علىجي في الاعتبار أن المركب خارجية تؤثر على جميع أنواع الخلايا. علاوة على ذلك، التعقيد الأنسجة وصغر حجم الفصوص نسبة إلى يزدرع الأنسجة بأكمله (انظر الشكل 2A، اللوحة اليمنى)، ويقلل من نقاء مقتطفات (RNA أو البروتين) أعدت.

على الرغم من أن تم الحصول على معظم البيانات الواردة في هذا الورق من 4-5 أيام إإكسبلنتس مثقف، فمن الممكن للحفاظ على الجهاز في الثقافة لوقت أطول، وتصل إلى 10 أيام على البلاستيك، مع التطوير المستمر لبصيلات (انظر الشكل 2B في يوم 7). إذا الثقافات يعد لدينا ليتم تنفيذها، ينبغي للمرء أن تحقق من أن جميع أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا البطانية، البقاء على قيد الحياة في إإكسبلنتس.

أهمية هذه التقنية فيما يتعلق بأساليب القائمة أو طرق بديلة أخرى

بالمقارنة مع ثقافة السكان نقية من thyrocytes في أطباق 2D أو 3D matriceق، ويقدم هذا النظام ثقافة الجهاز ميزة الحفاظ على التركيبة الطبيعية والفسيولوجية للشظايا microdissected. في الواقع، بالإضافة إلى thyrocytes وC خلايا الأسلاف، إإكسبلنتس تحتوي الوسيطة والخلايا البطانية وكذلك المصفوفة خارج الخلية. كما أثبتت بالفعل مع الغدد اللعابية، الكلى، الرئة أو البنكرياس، الجهاز الثقافات تقليد جيد في الجسم الحي التنمية. وعلاوة على ذلك، فإنه يوفر وسيلة لتحليل والتلاعب بسرعة (الربح أو الخسارة من وظيفة) نوع وخروج المغلوب البرية الأجهزة.

التطبيقات المستقبلية أو الاتجاهات بعد اتقان هذه التقنية

ويبين هذا البحث أن الجوانب الخلوية والجزيئية للتنمية الغدة الدرقية يمكن تحليلها باستخدام المجهر أو عن طريق RT-QPCR؛ الموقع التهجين أو النشاف الغربية في ويمكن أيضا أن يؤديها. هذا النظام الثقافة هي قابلة للكسب والخسارة من وظيفة التجارب عن طريق إضافة مثبطات محددةق، والأجسام المضادة ومنع، عوامل النمو، السيتوكينات، أو حتى الخلايا في مستنبت 7. ومع ذلك، تتأثر جميع أنواع الخلايا الموجودة في الأنسجة. سيكون من المثير للاهتمام أن تطوير خلية من نوع الاستهداف المحددة القائمة على الفيروس.

استخدام سلالة مراسل الفلورسنت، مع مجهر تشريح فلوري، يسهل تسليخ مجهري للقطعة النسيج (الشكل 1F، أقحم)، ولكن أيضا، كما ذكرت من قبل الآخرين باستخدام الموسومة غشاء البروتين الفلوري 16، يسمح لأداء في الوقت الحقيقي التصوير من الجهاز النامية في 3D 15،16، أو لمتابعة السكان خلية معينة في الثقافة. وسوف تطور سلالات مراسل الفلورسنت الجديدة تكون ضرورية لتصور الأحداث بعناية التخلق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile proxylab 80826
Collagen Type I, rat tail Millipore 08-115
Fibronectin from human plasma Invitrogen # 33010-018
M199 Invitrogen 31150-022
HBSS Invitrogen 14025-100
Tungsten wire Goodfellow LS237450
culture plate insert (12 mm diameter) Millipore PICM01250
GlycoBlue Invitrogen AM9516
E-cadherin BD Biosciences 610182 1/1,000
Ezrin Thermo Scientific MS-661-P1 1/400
PECAM BD Biosciences 550274 1/100
Hoechst Sigma B2261

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Colin, I. M., Denef, J. -F., Lengelé, B., Many, M. -C., Gérard, A. -C. Recent insights into the cell biology of thyroid angiofollicular units. Endocr. Rev. 34 (2), 209-238 (2013).
  2. Fagman, H., Andersson, L., Nilsson, M. The developing mouse thyroid embryonic vessel contacts and parenchymal growth pattern during specification budding, migration, and lobulation. Dev. Dyn. 235 (2), 444-455 (2006).
  3. Fagman, H., Nilsson, M. Morphogenesis of the thyroid gland. Mol. Cell. Endocrinol. 323 (1), 35-54 (2010).
  4. Fagman, H., Nilsson, M. Morphogenetics of early thyroid development. J. Mol. Endocrinol. 46 (1), (2011).
  5. De Felice, M., Di Lauro, R. Thyroid development and its disorders genetics and molecular mechanisms. Endocr. Rev. 25 (5), 722-746 (2004).
  6. De Felice, M., Di Lauro, R. Intrinsic and extrinsic factors in thyroid gland development: an update. Endocrinology. 152 (8), 2948-2956 (2011).
  7. Hick, A. -C., et al. Reciprocal epithelial paracrine interactions during thyroid development govern follicular organization and C-cells differentiation. Dev. Biol. 381 (1), 227-240 (2013).
  8. Toda, S., Koike, N., Sugihara, H. Cellular integration of thyrocytes and thyroid folliculogenesis: a perspective for thyroid tissue regeneration and engineering. Endocr. J. 48, 407-425 (2001).
  9. Toda, S., et al. Culture models for studying thyroid biology and disorders. ISRN Endocrinol. , (2011).
  10. Eggo, M. C., Quiney, V. M., Campbell, S. Local factors regulating growth and function of human thyroid cells in vitro and in vivo. 213, 47-58 (2003).
  11. Antonica, F., et al. Generation of functional thyroid from embryonic stem cells. Nature. 491, 66-71 (2012).
  12. van Eyll, J. M., Pierreux, C. E., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. Shh-dependent differentiation of intestinal tissue from embryonic pancreas by activin A. J. Cell Sci. 117, 2077-2086 (2004).
  13. Hick, A. -C., et al. Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1. BMC Dev. Biol. 9. , (2009).
  14. Pierreux, C. E., et al. Epithelial:Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas. Dev. Biol. 347, 216-227 (2010).
  15. Puri, S., Hebrok, M. Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging. Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).
  16. Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex-vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. , (2012).
  17. Watanabe, T., Costantini, F. Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis in vitro. Dev. Biol. 271, 98-108 (2004).

Tags

علم الأحياء الخلوية، العدد 88، التنمية، البيولوجيا الخلوية، والغدة الدرقية، والثقافة، الجهاز، التشكل الظهارية، المناعية، والتصوير، RNA
و<em&gt; خارج الحي</em&gt; نظام الثقافة لدراسة التنمية الغدة الدرقية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Delmarcelle, A. S., Villacorte, M.,… More

Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development. J. Vis. Exp. (88), e51641, doi:10.3791/51641 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter