Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Published: June 6, 2014 doi: 10.3791/51641
Automatic Translation
1, 1, *1, *1
1Pole of Cell Biology, Université catholique de Louvain & de Duve Institute
* These authors contributed equally

Abstract

Щитовидная железа двудольное эндокринная железа локализуется у основания шеи, производя гормоны щитовидной железы Т3, Т4, и кальцитонин. T3 и T4 производятся дифференцированные тироцитов, организованных в закрытых сферах называемых фолликулов, а кальцитонин синтезируется С-клеток, которые чередуются между фолликулов и густой сетью кровеносных капилляров. Хотя взрослый архитектура и функции щитовидной железы широко описаны и изучены, формирование "ангио-фолликулярных" единиц, распределения С-клеток в паренхиме и паракринных связи между эпителиальных и эндотелиальных клеток далеко не понял.

Этот метод описывает последовательные стадии эмбриональных щитовидной ANLAGEN вскрытия и ее культуры на semiporous фильтров или на микроскопии пластиковых горок. В течение четырех дней, эта система культуры добросовестно повторяет в развитии щитовидной естественных условиях. В самом деле, (я) млрд.obation органа происходит (для эксплантов E12.5), (II) тироцитов предшественники организовать в фолликулах и поляризации, (III) тиреоциты и C-клетки дифференцируются, и (IV) эндотелиальные клетки, присутствующие в микродиссекции ткани пролиферируют, мигрируют в доли щитовидной железы, и тесно общаться с эпителиальных клеток, как они это делают в естественных условиях.

Тканей щитовидной железы может быть получен из дикого типа, нокаутом или флуоресцентных трансгенных эмбрионов. Кроме того, эксплантов культуры можно манипулировать добавлением ингибиторов, блокирующих антител, факторы роста или даже клетки или кондиционированной среды. Экс естественных развитие могут быть проанализированы в реальном времени или в любое время в культуре иммунного окрашивания и RT-КПЦР.

В заключение эксплантата щитовидной культуры в сочетании с последующей целом монтажа или на разделы изображений и экспрессия генов профилирования предоставляет мощную систему для манипулирования и изучения морфогенетических и дифференциации события щитовидной Organogenesis.

Introduction

Щитовидная железа представляет собой набор независимых эпителиальных сферах, называется фолликулы, в окружении густой сетью эндотелиальных капилляров. Такая организация позволяет функция щитовидной железы: эндотелиальные капилляры обеспечивают тироцитов с йодом, необходимые для T3 и T4 синтеза гормонов, и распространять эти последние на все тело. Переменная между фолликулов и капилляров, C-клетки производят hypocalcemic гормон кальцитонин 1. Хотя архитектура и функции взрослых щитовидной хорошо известны, клеточные и молекулярные механизмы, участвующие в щитовидной эмбрионального развития (образование фолликул и дифференцировки) далеки от понимания.

Во время эмбриогенеза, тироцитов прародитель возникает как утолщение (по средней линии закладки в) брюшной стенки энтодермы передней кишки в эмбриональный день (е) 8,5 у эмбрионов мышей, в то время как C-клетки предшественники происходят на E11.5 как капли выступов ( ultimobranchial боумирает) четвертого глоточных карманов 2-6. Срединная линия бутон затем отделяется от энтодермы, расширяет двусторонней основе сплавить в E13.5 с ultimobranchial органов на каждой стороне трахеи. Наконец, тиреоциты организовать в фолликулов и С-клетки дифференцируются.

Современные знания о формировании щитовидной железы, главным образом, происходит от гистологического анализа основных тканей, но морфогенетические события, участвующие в формировании щитовидной железы обладают высокой динамической и включают связи и взаимодействия между различными типами клеток и с внеклеточным матриксом. Недавние работы показали, что клетки-предшественники тиреоцитов производить высокие уровни VEGF по набору эндотелиальных клеток в развивающемся щитовидной железы, и, в свою очередь, набранных эндотелиальные клетки способствуют образованию фолликула и C-клетки дифференциация 7.

Большинство Экс Vivo исследования щитовидной железы были выполнены на изолированных щитовидной железы клеток, полученных взрослых, выращиваются либо на 2D культуре ткани пластиковая дгибнет или в 3D матриц. Используя эти типы культур, дифференцированные фолликулярные клетки либо остаются поляризованы и организованные, как фолликулов или повторно приобрести 3D организацию 8-10. Тем не менее, эти чистые эпителиальные клетки, эксплантированной от их физиологической среде и культивировали в 2D, игнорировать взаимодействия с внеклеточного матрикса, цитокинов, факторов роста и с другими типами клеток, таких как эндотелиальные клетки или нервов, что они обычно сталкиваются в естественных условиях. Очень хороший Исследование, недавно описал дифференциации протокол ЭС клеток в фолликулах щитовидной железы с использованием последний шаг культуры в 3D матригеле 11. Однако эти 3D культур не имеют контакта с другими типами клеток.

Основываясь на предыдущем экспертизы по поджелудочной железы и слюнных желез органов культуры 12-14, метод рассечения мышиных эмбриональных Anlagen щитовидной железы и культивирования эксплантов на semiporous фильтров или на микроскопии пластиковых горок была разработана.

Когдаработы с эмбрионами E12.5, двойной происхождение зачатков железы (по средней линии закладки в и две боковые ultimobranchial органы) ввел микродиссекции большого фрагмента ткани. Это содержится в трахею, но не пищевода, и простиралась от глотки арки артерий до черпаловидного набухания. При культивировании на фильтрах, по средней линии закладка проходит в поперечном направлении на каждой стороне трахеи, где они соединяются с ultimobranchial органов с образованием двух долей щитовидной железы, все еще соединенных узкой перемычкой.

В культуре, эпителиальные клетки размножаются, организовывать в фолликулах и дифференцироваться в тироцитов и С-клеток, в зависимости от их происхождения. Эндотелиальные клетки, содержащиеся в микродиссекции ткани также пролиферируют и проникают в долей щитовидной железы, наконец, связать в тесном контакте с эпителиальной фолликулярной структуры, независимо кровотока или циркулирующих факторов. Как развитие эксплантов добросовестно повторяет в естественных условиях развиватьния, эта система культуры является оптимальным для изучения морфогенетических и дифференциация события, происходящие во время развития щитовидной железы.

Ткани щитовидной железы могут быть получены из дикого типа, нокаутом или люминесцентных трансгенных эмбрионов, и система культуры поддается потери-и амплитудно-на-функции экспериментов. Наконец, покадровой визуализации флюоресцентно меченых эксплантатах щитовидной железы на микроскопии пластиковой посуды может быть использована, чтобы лучше исследовать кинетики и непрерывность морфогенетических движений, которые происходят в естественных условиях. Покадровой обработки изображений уже используется для изучения морфогенеза ветвления поджелудочной железы 15,16 или зачатка мочеточника 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Мыши были подняты и обработаны в соответствии с принципами лабораторной ухода за животными Комитета университета защиты животных. Все процедуры и протоколы были одобрены этого Комитета.

1. Покрытие микроскопии пластической культуры палат

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все следующие шаги в стерильных условиях в ламинарном боксе. Два типа покрытия функционально эквивалентны.

  1. Пальто пластической культуры камеры с фибронектина один день перед выделением тканей щитовидной железы:
    1. Разбавленные стерильные фибронектин к 50 мкг / мл конечной концентрации в среде M199 с добавлением 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 0,25 мкг / мл Fungizone и 2 мМ глутамина 12.
    2. Покройте скважин с 200 мкл разбавленного фибронектина и инкубировать в течение ночи в 4 ° C холодильник.
    3. В день вскрытия, аспирации фибронектин, промыть лунки один раз M199 и добавить минимального объема 200 мкл M199, дополненной антибиотиками, глутамина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки.
    4. Оставьте покрытых камеры в инкубаторе до готовности к пластине эксплантов.
  2. Пальто пластической культуры камеры с типом коллагена 2 ч перед выделением тканей щитовидной железы:
    1. Разбавленные стерильные типа I коллагена в 50 мкг / мл конечной концентрации в 10 мМ HCl. ПРИМЕЧАНИЕ: Держите коллагена маточного раствора на льду.
    2. Накройте лунки 200 мкл разбавленного типа I коллагена и инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре (RT).
    3. Аспирируйте тип раствора коллагена I, промыть лунки один раз M199 и добавить минимального объема 200 мкл M199, дополненной антибиотиками, глутамина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки.
    4. Оставьте покрытых камеры в инкубаторе до готовности к пластине эксплантов.

2. Рассечение щитовидной железы Anlagen-содержащих тканей (E12.5) или щитовидной железы Лопасти (E13.5-e14.5)

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте чистые инструменты рассекает и Петри / Культура пластины. Основные этапы и разрезы, описанные ниже, являются одинаковыми для E12.5 и эмбрионов E14.5.

  1. Жертвоприношение приуроченный беременных самок мышей в нужной эмбриональных (е) день (от E12.5 к E14.5) и удалить матку с помощью рассекает инструментов.
  2. Поместите расчлененный матку в 10 см пластины, содержащей HBSS.
  3. Держите один оконечность матки щипцами и открыть матку с маленькими ножницами по освобождению постепенно все эмбрионы.
  4. Отдельные эмбрионов из плаценты с помощью ножниц и передачи эмбрионов с их внеэмбриональные мембран в новом 10 см пластины, содержащей HBSS.
  5. Снимите желточный мешок и амнион. Примечание: С этой точки, работать под стереомикроскопа с просвечивания снизу; увеличение увеличение с шагом рассечение. Используйте вольфрама иглы в стеклянных капилляров как рассечения инструменты.
  6. Использование иглы, какнож и вилка, снимите верхнюю часть головы, в том числе верхней челюсти и ушах (рис. 1А, разрезать вдоль).
  7. Держите эмбриона на его спине и удалите первый дополнительный кусок нервной трубки (рис. 1А, разрезать вдоль б), то нижняя часть зародыша, просто под передних конечностей и выше сердца (рис. 1В).
  8. Передача эмбриона кусочек, содержащий язык (ориентировать ткани) и шеи в новом 10 см пластины, содержащей HBSS.
  9. Снимите нервной трубки и ткани кзади от пищевода / трахеи (рис. 1в, разрезанной вдоль).
  10. Осторожно раздел ткани ломтик вдоль обеих сторон языка (рис. 1в, разрезанной вдоль В и В ').
  11. Найдите пищевод и трахею, в продлении языком и отсечь язык, оставляя черпаловидный отек (рис. 1D, разрезать вдоль), и ткань на ботач стороны пищевода / трахеи (Рисунок 1D, разрезанной вдоль В и В ').
  12. Снимите пищевод, и поместить в трахею с его вентральной стороной вверх.
  13. Отсечь нежелательные ткани, такие как тимуса (рис. 1E) и всех тканей, расположенных сбоку от глотки арки артерий. Для E13.5 или эмбрионов E14.5, визуализировать долей щитовидной железы на каждой стороне трахеи (рис. 1F, красный пунктирными линиями) и далее анализировать лепестки из трахеи.
  14. Перенести изолированный E12.5 трахея область или долей щитовидной железы E13.5-E14.5 в 35 мм планшет для культивирования, содержащей подогретого M199 среду, дополненную антибиотиков, глутамина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Трансфер эксплантов использованием prewetted наконечник фильтра на Р-200 микропипетки. Для E12.5 эксплантов, сократить оконечность кончике расширить отверстие. ПРИМЕЧАНИЕ: Регулярно, и если эмбрионы имеют одинаковый генотип, выполните шаги 6 & 7 на всех эмбрионов,N 9-11, и, наконец, 12 и 13.

3. Покрытие и культура щитовидной железы эксплантов

  1. Промыть эксплантов путем последовательного перевода в трех лунках 24-луночного планшета, содержащего 1 мл подогретого культуральной среде (= M199 с добавкой антибиотиков, глутамина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки).
  2. Покрытие из долей щитовидной железы на покрытых микроскопии пластиковых культуры камер:
    1. Аспирируйте M199 культуральной среды из камер покрытием.
    2. Осторожно, трансфер эксплантов щитовидной железы в культуре камер с помощью микропипетки и фильтров советы. Поместите один эксплантов в центре каждой камере.
    3. Удалите излишки среды и поместите культуры камеру, в инкубаторе для тканевых культур (37 ° C, 5% СО 2) в течение 2 часов, чтобы экспланты приложить к матрице.
    4. Осторожно добавьте 200 до 300 мкл подогретого культуральной среды в каждую лунку.
    5. Выдержите в течение долгосрочного культуры в культуре ткани инкубаторе.
  3. Покрытие ое область трахеи или щитовидной доли на semiporous фильтров:
    1. Заполните количество лунки 24-луночного планшета с требуемой 330 мкл подогретого культуральной среде.
    2. Место фильтры (например, 0,4 мкм Millipore фильтр) на носителе, заботясь, чтобы избежать захвата пузырьков воздуха ниже фильтра культуры.
    3. Осторожно, с помощью микропипетки и фильтров советы, трансфер эксплантов щитовидной железы с минимальным объемом среды на центр фильтров (максимальная 4/filter).
    4. Удалить избыток среды и пространства вне эксплантов с вольфрамовой иглы.
    5. Выдержите в течение долгосрочного культуры в культуре ткани инкубаторе. ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение культуральной среды через день под капотом ламинарного потока. Культура экспланты до 7 дней.

4. Целом монтажа Иммунофлуоресценции Протокол окрашивания для щитовидной железы эксплантов

Выбить эксплантов, выращенных на фильтрах (после шага 2 ниже), используя вольфрамовые иглы илитонкие щипцы и передачи в 24-луночный планшет для всех шагов, для первичного (этап 5) и вторичной (этап 7) антител инкубации (96-луночный планшет), за исключением. Для прикрепленных эксплантов, культивируемых на микроскопии пластиковых камер, выполнить все шаги в культуре камер.

  1. Аспирируйте M199 культуральной среды и исправить эксплантов с ледяной 4% параформальдегида (PFA) в течение 20 мин (500 мкл в 24-и блюдо и 300 мкл в микроскопии слайдов).
  2. Промыть 2x 10 мин в Трис-буферного раствора с Тритон (TBST; 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 0,1% Тритон Х-100) при комнатной температуре.
  3. Процесс эксплантов немедленно или хранить при -20 ° С Примечание: для длительного хранения при -20 ° С, обезвоживают эксплантов в метаноле с постепенным увеличением концентрации метанола в TBST, чтобы достичь 100% метанола. Когда все будет готово, чтобы продолжить иммуноокрашивания (шаг 4), увлажняет эксплантов путем постепенного добавления TBST в метанол.
  4. Заменить TBST с блокирующим раствором (10% нормальной козьей сывороткой в ​​TBST) И инкубировать на море пильного рокера в течение 30-60 минут при комнатной температуре.
  5. Развести первичного антитела в блокирующем растворе (100-200 мкл на состоянии). Перенесите "фильтр" эксплантов из 24-луночный планшет с 96-луночный планшет. Выдержите эксплантов с первичными антителами на море пильного рокера в течение ночи при 4 ° С.
  6. На следующий день, отменить решение первичного антитела, передача "фильтр" эксплантов назад в 24-луночный планшет, и мыть по крайней мере, пять раз TBST на море пильного рокера в течение 45-60 мин каждого при комнатной температуре.
  7. Развести вторичного антитела (например, антитела козы X-Alexa Fluor на 1:2000 разбавления) в TBST содержащей 1% нормальной козьей сывороткой и инкубировать эксплантов с этого разведения на ночь на море пильного рокер при 4 ° С и в темноте. Для ядерной контрастного, есть 1 мкг / мл бис-Benzimide (Hoechst) вместе с раствором вторичного антитела.
  8. На следующий день, отменить решение вторичного антитела и мыть 5x с TBST на морском пилырокер в течение 45-60 мин каждого при комнатной температуре. Во время промывок, держать эксплантов в темноте.
  9. Выполните дополнительный мыть в TBST мягко закрученной в течение ночи при 4 ° С в темноте.
  10. Postfix в иммуноокрашиванию эксплантаты в 4% PFA при 4 ° С в течение 10 мин.
  11. Вымойте 2x 10 мин с TBST.
  12. Передача эксплантов либо постепенно в метаноле 100% для длительного хранения при -20 ° С или анализировать немедленно. Для эксплантатов культивируемых на фильтрах, и иммунологически окрашивали в 24-луночный планшет, передачи в камере микроскопии (например, LabTek или Ibidi) с TBST или лучше флуоресцентного монтажной среды перед анализом с многофотонной или конфокальной микроскопии.

5. Добыча РНК из щитовидной железы

Работа в РНКазы свободной среде. Таким образом, использовать нуклеиновых кислот и нуклеазам бесплатно наконечники и очистить как скамейки и оборудование от загрязнений и РНКаз. Этот протокол основываясь на фенол / хлороформ, выполните первый шагс (от 1 до 7), при химическом капюшоном.

  1. Однородный один эксплантов щитовидной железы или две лопасти щитовидной железы с 300 мкл экстракционного раствора РНК с использованием одноразового пестиком в течение 1,5 мл пробирку. В между образцами, мыть пестик в 2% SDS, затем водой, затем этанолом.
  2. Добавить еще 100 мкл экстракционного раствора РНК, вихрь 10 сек и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.
  3. Vortex в течение 30 сек и добавить 20 нг тРНК к каждому образцу.
  4. Vortex в течение 1 мин и добавляют 80 мкл хлороформа.
  5. Vortex энергично в течение 30 сек и инкубировать 15 минут при комнатной температуре.
  6. Спин течение 15 мин при 19000 х г в охлажденном (4 ° C) центрифуги.
  7. Передача тщательно бесцветный верхнюю водную фазу в свежую пробирку, содержащую 20 мкг гликогена в качестве соосадителя.
  8. Vortex и добавить 200 мкл 100% изопропанол алкоголя.
  9. Vortex энергично в течение 15-30 сек, и пусть Осадок РНК при -20 ° С в течение 2-3 ч, или при -80 ° С в течение 1 часа.
  10. Спин течение 30 мин при 19000XG при 4 ° С, и устранить супернатант.
  11. Вымойте гранул с 450 мкл холодного 75% этанола и вихря выбить осадок.
  12. Спин течение 10 мин при 19000 х г при 4 ° С, и устранить супернатант.
  13. Сушат гранулы под капотом в течение 5 мин.
  14. Ресуспендируют гранул с 10 мкл РНКазы свободной воды и инкубируют 10 мин при комнатной температуре.
  15. Концентрация РНК Анализ, хранить при температуре -80 ° С или назад транскрибировать для анализа экспрессии генов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Закладок щитовидной железы (срединной линии и UB, вместе с окружающими тканями), а доли щитовидной железы расчленены из мышиных эмбрионов в E12.5 и e13.5/e14.5, соответственно (рис. 1). После одного дня в культуре на фильтре, по средней линии закладка видна (Фиг.2А) в виде удлиненной ткани, охватывающей на верхней части трахеи. Это постепенно образует две лопасти на каждой стороне трахеи. Если выделенные доли щитовидной железы (E13.5 или E14.5) культивируют, они будут расширяться, пройти морфогенез и эпителиальные клетки организует в макроскопически видимых фолликулярных структур (рис. 2б).

Организация и поляризация эпителиальных клеток, меченных Е-кадгерина, могут быть визуализированы эзрина иммунного (рис. 3а). Эзрин-положительные внутриклеточные структуры постепенно, и в согласованном порядке, предохранитель с одним полюсом клетки, которая станет верхушечный полюс. Во время этого процесса, эндотелиальные клетки положенииTive для PECAM размножаться и организовать вокруг развивающихся фолликулов с образованием ангио-фолликулярных (рис. 3б). Для количественной дифференциации тироцитов и С-клеток, РНК может быть выделена из культивированных долей щитовидной железы, и экспрессия гена анализировали с помощью RT-КПЦР (фиг.3С). В то время как выражение фактора транскрипции щитовидной Nkx2.1 не меняется во время культивирования, выражение тиреоцитов конкретных тиреоглобулина и С-соты кальцитонина резко возросло, что свидетельствует функциональной дифференциации.

Рисунок 1
Рисунок 1. Шаги Препарирование изолировать щитовидную железу от E14.5 эмбриона мыши. Разрезы изображены желтые пунктирными линиями. (A) В верхней части головы удаляют двух разрезов, чтобы обнажить язык. (B) включенные в другие группировкиК область отделена от остальной части тела секционирования эмбрион ниже верхних конечностей и выше сердца. (C) Хранение языка (к) в качестве ориентира, удалите нервной трубки (NT) и боковые тканей и конечностей. (D) язык, черпаловидный отек (*) и пищевод / трахеи идеально ровные. Сначала снимите язык, а затем ткани боковая в регион пищевода / трахеи. (Е) Доли щитовидной железы частично скрыты тимуса (Thym), который должен быть уничтожен. (F) доли щитовидной железы могут видеть на каждой стороне трахеи (красная пунктирная окатыши), или лучше визуализируются с помощью флуоресцентного репортера эмбрионов (Pax8-Cre; Роза-стоп-YFP, вставка). Сокращения:. До (язык), Thym (тимус), тра (трахеи), * (черпаловидный отек) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.


Рисунок 2. Расчлененный эксплантов щитовидной железы фильтр и щитовидной долей на фибронектина приятно развивать экс естественных. (A) Фотографии с E12.5 эксплантата щитовидной культивировали в течение 1, 2 и 3 дня на semiporous фильтра, на границе воздуха и средних. Щитовидной железы эпителиальные клетки мигрируют в двустороннем на каждой стороне трахеи и образуют два растущих долей щитовидной железы. (В) Светлопольные изображения на 1 день и 2-й день в доле E14.5 щитовидной культивировали на микроскопии пластиковых культуры камер. Обратите внимание на расширение и реконструкцию эпителия, что, в конечном счете образуют крупные (20-100 мкм) фолликулов вокруг 7-й день. Желтый пунктир очерчивает эпителиальных периферию щитовидной железы. Масштабные бары, 100 мкм. Пожалуйста климатобы здесь, чтобы посмотреть увеличенное рисунке.

Рисунок 3
Рисунок 3. Фолликулогенеза, ангиогенез и дифференциация щитовидной железы в культуре. Долей щитовидной железы культивировали в течение указанного времени. (А) Основные ткани целом монтажа иммуноокрашиванию с антителами против базолатеральную маркера Е-кадгерина, и предвершинное мембрана маркер Эзрин. После одного дня в области культуры, эпителиальные клетки паренхимы щитовидной железы, присутствующих небольших Эзрином-позитивных структур, которые соответствуют внутриклеточных везикул 7. Согласованные слияние везикул из соседних клеток образуют небольшой просвет в день 2; их прогрессивный рост, и организация окружающих клеток вокруг просвета будет очертить заранее фолликулярные структуры после 4 дней. Шкала бар, 20 мкм. (В) щитовидной лОБЕ иммуноокрашиванию с антителами против тромбоцитов и эндотелиальных клеток молекул адгезии (PECAM) и Эзрином. Фолликулы окружены эндотелиальных структур. Шкала бар, 50 мкм. (C) РНК экстрагировали из долей щитовидной железы, подвергают обратной транскрипции перед количественной ПЦР. Выражение щитовидной транскрипционного фактора Nkx2.1, и двух генов дифференцировки, тиреоглобулина и кальцитонин, был измерен с использованием специфических праймеров пары. Для расчета выражение относительной гена, метод ΔΔ Ct был использован, используя E-кадгерина в качестве опорного гена и последний момент времени культуры за 100%. Изображения, показанные на А и В являются одиночными конфокальные оптические разделы целом монтажа иммуноокрашиванию долей щитовидной железы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Эта статья описывает способ рассечения и культивирования эксплантов щитовидной железы (E12.5) или долей (E14.5) с целью изучения и лучше понять сложные события, приведшие к образованию щитовидной железы. Из-за двойного происхождения зачатков щитовидной железы (по средней линии закладки в и две боковые ultimobranchial органов), а их малый размер, фрагмент E12.5 ткани локализованной ростральнее к глоточной дуги артерий, и содержащей в трахею, но не пищевод является микродиссекции. Как показано, в течение четырех дней, эта система культуры добросовестно повторяет в развитии щитовидной естественных условиях, так как: (I) по средней линии зачаток мигрирует на двусторонней основе и расширяется, чтобы образовывать с UB, два лепестка щитовидной железы, соединенные узким перешейком (рис. 2а) , (II) предшественники щитовидной железы реорганизовать от массы клеток в фолликулах и в конечном счете поляризации (рис. 2В и 3А), (III) эндотелиальные клетки присутствуют вмикродиссекции ткани размножаются, мигрируют в долях щитовидной железы, и тесно общаться с эпителиальных клеток (рис. 3б), и (IV) тиреоциты и C-клетки дифференцируются качественно (рис. 3C), как они это делают в естественных условиях 7. Как рассечение физически прерывает в развитии внутриутробной и эксплантированных ткани должна адаптироваться к условиях культивирования, морфологические и дифференциация события слегка замедленным по сравнению с ситуацией в естественных условиях.

Критические шаги в протоколе

Важнейшим аспектом этого метода заключается в рассечение. Во-первых, важно, чтобы удалить боковые тканей, а также правый и левый лепестки вилочковой железы от E12.5 эксплантов, а их расширение в культуре мешают правильному развитию долях щитовидной железы. Во-вторых, быстрота также имеет важное значение, если один хочет сохранить эндотелияклетки живых. Если рассечение не выполняется в стерильной атмосфере, важно, чтобы вымыть несколько раз эксплантатов в стерильной культуральной среды. Наконец, при культивировании эксплантов на semiporous фильтров, важно использовать небольшой объем среды и поместить эксплантов по центру фильтра. Слишком много среда будет течь к периферии фильтра и создать мениска с фильтром стене. В этом случае эксплантов будет следовать среды и достигает мениска; ее развитие будет в среде, а не на воздух / раздела сред.

Возможные изменения и ограничения

Протокол, описанный здесь относится к E12.5 эксплантатах щитовидной железы и E13.5 и E14.5 изолированных долей щитовидной железы. Младшие и старшие стадии развития можно было бы проверить в зависимости от научной вопрос решать. Другие условия культивирования также могут быть проверены: щитовидной железы экспланты или доли может быть выращен в 3D matrigэль, или среда может быть дополнена Инсулин / трансферрин / селена, а не с 10% сыворотки.

Важным аспектом культуры ткани является концентрация кислорода. При выращивании на микроскопии пластиковых слайдов, концентрация кислорода трудно оценить, как это будет уменьшаться с высотой среды выше эксплантов. При выращивании на фильтрах, на границе раздела воздух / среднего, эксплантаты находятся в контакте с атмосферой, следовательно, с 21% кислорода. В этом последнем случае, можно попытаться воспроизвести "гипоксии" в маточно среде, используя ниже РО 2 концентрации внутри инкубатора.

Если тканевой сложность E12.5 эксплантов является преимуществом для правильного развития, она также является основным недостатком, поскольку эпителиальные клетки не являются доступными для вирусов или реагентов трансфекции. Манипуляция может быть выполнена с диффундирующих реагентов (ингибиторов, блокирующих антител, факторов роста, цитокинов, кондиционированной среды), держатьING в виду, что экзогенный соединение влияет на все типы клеток. Кроме того, сложность ткани и небольшой размер долей по отношению ко всему эксплантата ткани (см. рис 2А, правая панель), уменьшает чистоту экстрактов (РНК или белок), подготовленных.

Хотя большинство из данных, представленных в данной работе были получены из 4-5 дней культивированный эксплантов, можно сохранить орган в культуре в течение более длительного времени, до 10 дней на пластике, с непрерывным развитием фолликулов (см. рисунке 2б на 7-й день). Если дольше культуры должны быть выполнены, следует убедиться, что все типы клеток, в том числе эндотелиальных клеток, выжить в эксплантов.

Значение техники в отношении существующих методов или других альтернативных методов

По сравнению с культурой чистых популяций тироцитов в 2D блюд или 3D матрице дляс, этот орган системы культура представляет преимущество сохранения природных и физиологически состав микродиссекции фрагментов. В самом деле, в дополнение к тироцитов и С-клеток предшественников, эксплантаты содержать мезенхимальных и эндотелиальные клетки, а также внеклеточный матрикс. Как уже продемонстрировали с слюнных желез, почек, легких или поджелудочной железы, культур органов красиво мимической естественных условиях развития в. Более того, она предоставляет возможность быстро анализировать и манипулировать (прибыль или убыток-из-функции) дикого типа и нокаут органы.

Будущие приложения или направления после освоения этой техники

В данной работе показано, что клеточные и молекулярные аспекты развития щитовидной железы может быть проанализирована с помощью микроскопа или RT-КПЦР; в гибридизация или вестерн-блоттинга также может быть выполнена. Эта система культура поддается получить и с потерей функции эксперименты через добавлением специфического ингибиторас, блокирующие антитела, факторы роста, цитокины, или даже клетки в культуральной среде 7. Однако все типы клеток, присутствующих в ткани не затрагиваются. Было бы интересно развивать вирусов на основе камерного типа специфическую направленность.

Использование флуоресцентного репортерного деформации, с флуоресцентным микроскопом рассекает, облегчает микродиссекции кусок ткани (фиг. 1F, вставка), но и, как сообщалось другими использованием мембранного-меченый флуоресцентный белок 16, позволяет выполнять в режиме реального времени визуализация развивающегося органа в 3D 15,16, или следовать конкретный популяции клеток в культуре. Разработка новых штаммов люминесцентные репортер будет необходимо тщательно визуализировать морфогенетические события.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile proxylab 80826
Collagen Type I, rat tail Millipore 08-115
Fibronectin from human plasma Invitrogen # 33010-018
M199 Invitrogen 31150-022
HBSS Invitrogen 14025-100
Tungsten wire Goodfellow LS237450
culture plate insert (12 mm diameter) Millipore PICM01250
GlycoBlue Invitrogen AM9516
E-cadherin BD Biosciences 610182 1/1,000
Ezrin Thermo Scientific MS-661-P1 1/400
PECAM BD Biosciences 550274 1/100
Hoechst Sigma B2261

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Colin, I. M., Denef, J. -F., Lengelé, B., Many, M. -C., Gérard, A. -C. Recent insights into the cell biology of thyroid angiofollicular units. Endocr. Rev. 34 (2), 209-238 (2013).
  2. Fagman, H., Andersson, L., Nilsson, M. The developing mouse thyroid embryonic vessel contacts and parenchymal growth pattern during specification budding, migration, and lobulation. Dev. Dyn. 235 (2), 444-455 (2006).
  3. Fagman, H., Nilsson, M. Morphogenesis of the thyroid gland. Mol. Cell. Endocrinol. 323 (1), 35-54 (2010).
  4. Fagman, H., Nilsson, M. Morphogenetics of early thyroid development. J. Mol. Endocrinol. 46 (1), (2011).
  5. De Felice, M., Di Lauro, R. Thyroid development and its disorders genetics and molecular mechanisms. Endocr. Rev. 25 (5), 722-746 (2004).
  6. De Felice, M., Di Lauro, R. Intrinsic and extrinsic factors in thyroid gland development: an update. Endocrinology. 152 (8), 2948-2956 (2011).
  7. Hick, A. -C., et al. Reciprocal epithelial paracrine interactions during thyroid development govern follicular organization and C-cells differentiation. Dev. Biol. 381 (1), 227-240 (2013).
  8. Toda, S., Koike, N., Sugihara, H. Cellular integration of thyrocytes and thyroid folliculogenesis: a perspective for thyroid tissue regeneration and engineering. Endocr. J. 48, 407-425 (2001).
  9. Toda, S., et al. Culture models for studying thyroid biology and disorders. ISRN Endocrinol. , (2011).
  10. Eggo, M. C., Quiney, V. M., Campbell, S. Local factors regulating growth and function of human thyroid cells in vitro and in vivo. 213, 47-58 (2003).
  11. Antonica, F., et al. Generation of functional thyroid from embryonic stem cells. Nature. 491, 66-71 (2012).
  12. van Eyll, J. M., Pierreux, C. E., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. Shh-dependent differentiation of intestinal tissue from embryonic pancreas by activin A. J. Cell Sci. 117, 2077-2086 (2004).
  13. Hick, A. -C., et al. Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1. BMC Dev. Biol. 9. , (2009).
  14. Pierreux, C. E., et al. Epithelial:Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas. Dev. Biol. 347, 216-227 (2010).
  15. Puri, S., Hebrok, M. Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging. Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).
  16. Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex-vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. , (2012).
  17. Watanabe, T., Costantini, F. Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis in vitro. Dev. Biol. 271, 98-108 (2004).

Tags

Клеточная биология выпуск 88 развитие клеточная биология щитовидной железы органов культуры эпителиальных морфогенез иммуноокрашивание изображений РНК
<em&gt; Экс естественных</em&gt; Культура Система по изучению развития щитовидной железы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Delmarcelle, A. S., Villacorte, M.,… More

Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development. J. Vis. Exp. (88), e51641, doi:10.3791/51641 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter