Analyse détaillée de la dynamique de transcription à partir d'échantillons de cerveau après l'expérience comportementale

Abstract

L'encodage d'expériences dans le cerveau et la consolidation de la mémoire à long terme dépend de la transcription des gènes. Identifier la fonction de gènes spécifiques dans l'expérience de codage est l'un des principaux objectifs de la neuroscience moléculaire. En outre, l'association fonctionnelle des gènes définis avec des comportements spécifiques a des implications pour la compréhension de la base de troubles neuropsychiatriques. L'induction de la transcription des programmes de solides a été observée dans le cerveau des souris après diverses manipulations du comportement. Bien que certains éléments génétiques sont utilisées de manière récurrente suivant différentes manipulations et de comportement dans différents noyaux du cerveau, les programmes de transcription sont globalement unique pour les stimuli induisant la structure et dans laquelle elles sont étudiées ^1,2.

Dans cette publication, un protocole est décrit solide et complet pour le profilage de la transcription à partir de noyaux de cerveau de souris en réponse à la manipulation du comportement. Laprotocole est mise en évidence dans le cadre de l'analyse de la dynamique de l'expression des gènes dans le noyau accumbens suivant l'expérience de la cocaïne aiguë. Suite à une défini dans l'expérience in vivo, le tissu neural cible est disséqué; suivi par la purification de l'ARN, la transcription inverse et l'utilisation de matrices microfluidiques pour analyse qPCR complet de plusieurs gènes cibles. Ce protocole est axé sur une analyse complète (adressage 50-500 gènes) de limiter les quantités de matière première, tels que des échantillons de cerveau petites ou même des cellules individuelles.

Le protocole est le plus avantageux pour l'analyse en parallèle de plusieurs échantillons (par exemple, les cellules individuelles, l'analyse dynamique suivante pharmaceutique, virale ou perturbations comportementales). Toutefois, le protocole pourrait également servir pour l'assurance de la caractérisation et de la qualité des échantillons avant les études du génome entier par des puces ou RNAseq, ainsi que la validation des données obtenues à partir des études du génome entier.

Introduction

Organisation dynamique du cerveau permet la flexibilité cognitive et comportementale. Les expériences sont codées par des modifications de la structure et de la force des connexions entre les neurones dans le cerveau ^3. Cette «plasticité expérience dépendant" est le résultat de l'induction des modes spécifiques de l'expression du gène qui fournit les protéines nécessaires à la modification de la structure et de la force synaptique ^4. L'identification des réseaux de régulation génétique médiation de la formation de la mémoire à long terme est un élément central de la neuroscience moléculaire, avec l'espoir que l'identification des éléments dominants de programmes de transcription donnera un aperçu des principes fondamentaux qui régissent la formation de la mémoire, ainsi que des objectifs pour traitement des maladies neurodégénératives et des troubles neuropsychiatriques. Programmes de transcription se déroulent dans les vagues temporellement définis, chacun des gènes qui codent des caractères différents, qui sont importants pour différents étapes dans la mise en œuvre des résultats de l'événement de signalisation ^1,2. Il est donc important d'aborder la dynamique de la transcription sur un délai temporel détaillée, afin d'identifier la liste complète des gènes induits, et pour mieux comprendre leur fonction de potentiel selon la dynamique de leur induction.

La toxicomanie est une forme robuste de plasticité dépendant de l'expérience causée par les effets à long terme de l'abus des drogues sur les circuits neuronaux dans le cerveau ^5,6. , L'exposition aiguë initiale aux médicaments peut conduire à l'apparition de la toxicomanie et de la transition vers l'utilisation chronique. Les informations contextuelles est un élément crucial dans le développement de la toxicomanie. Signaux environnementaux associés au médicament sont affectés une grande importance dans l'esprit des toxicomanes. Les informations contextuelles rappelant un toxicomane de l'expérience passée de drogues peut induire une rechute de l'état de manque, même après de longues périodes d'abstinence de l'exposition au médicament ^7,8.D'où le grand défi clinique dans la dépendance - la propension des toxicomanes à la rechute, même longtemps après que les symptômes de sevrage ont disparu ^9.

La sensibilisation comportementale à la cocaïne est un modèle simple de l'expérience de la cocaïne utiles dans l'étude des mécanismes de la toxicomanie. Dans ce modèle largement étudié pour la sensibilisation de longue durée induite par l'exposition chronique aux drogues d'abus, les rongeurs sont d'abord habitués à des injections de solution saline (de intrapéritonéale; IP) dans un nouvel environnement (une chambre ouverte sur le terrain où leur activité locomotrice est surveillée) ; ensuite, ils reçoivent des injections quotidiennes de cocaïne dans les chambres en plein champ, tandis que leur activité est contrôlée ¹⁰ (figure 1). Ce paradigme comportemental se traduit généralement par une sensibilisation robuste de comportement locomoteur (8-12 fois supérieure à l'activité de base) ^11, qui est maintenue pendant une période de plusieurs mois après l'arrêt des injections de cocaïne, ce qui montre la formation d'un perversasive trace mnésique de l'expérience de la drogue.

Les circuits neuronaux de la récompense, naturellement impliqué dans le renforcement des comportements essentiels pour le succès d'une espèce (par exemple, l'alimentation, le sexe), est exploitée par l'abus des drogues à renforcer les comportements de drogue associé ^12,13. Les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels l'expérience de l'abus des drogues est renforcée semblent être similaires aux mécanismes sous-jacents de la formation des souvenirs déclaratifs ou sémantiques dans d'autres structures cérébrales ^14. Par conséquent, la robustesse du modèle de sensibilisation comportementale en fait un système modèle attractif pour étudier les mécanismes d'expérience dépendant de plasticité.

Le noyau accumbens (NAC) est un intégrateur central du circuit de récompense du cerveau, et a été largement associée au développement de la dépendance à ^5,6. La formation de la dépendance dépend de la transcription de nouvelles protéines dans le noyau accumbens et robusteproduction de programmes de transcription clairement structurés est observée dans le NAc suivante expérience de la cocaïne ^15-19. L'réponse transcriptionnelle aiguë à l'exposition de la cocaïne est susceptible de fonctionner à plusieurs niveaux afin de s'adapter à la relance de forte induction et d'orienter la production de nouvelles protéines qui sont responsables des changements structurels et électrophysiologiques induites par l'exposition au médicament ^6,19-22.

Afin de promouvoir l'étude des mécanismes moléculaires de la plasticité dépendant de l'expérience dans le cerveau, un protocole est décrit pour l'analyse globale de la dynamique de transcription dans des échantillons de tissu cérébral qui suit manipulation comportementale. Le protocole est illustré dans le cadre de l'expérience du comportement étudié dans le laboratoire Citri - la sensibilisation comportementale à la cocaïne, en utilisant les tableaux dynamiques microfluidiques pour analyse transcriptionnelle. Le protocole décrit n'est évidemment pas limitée à l'étude de til noyau accumbens, dans le cadre de la sensibilisation comportementale, mais pourrait être appliquée à un grand nombre de paradigmes comportementaux et les régions du cerveau. En fait, ce protocole peut être appliqué aux tissus de l'organisme à l'extérieur du cerveau, et une variété d'expériences ou des manipulations de l'organisme étudié.

Le protocole est grossièrement divisé en quatre étapes. Dans la première étape, l'animal est soumis au paradigme comportemental; dans la seconde étape, le tissu est microdissection; dans la troisième étape - l'ARNm est purifié, à une transcription inverse et de sonde, et dans l'étape finale, les données sont analysées.

Dans le cadre de l'étude de la dynamique de la transcription, la synchronisation précise et la définition de l'expérience sont probablement paramètres expérimentaux les plus importants à contrôler. Pour cette raison, le modèle de comportement de choix est celui de la sensibilisation comportementale à la cocaïne, un système qui permet un niveau élevé de contrôle de l'expérimentateur sur les paramètres de l'expéCE. Paradigmes comportementaux supplémentaires qui permettent une synchronisation précise et traitent les différents modèles de plasticité dépendant de l'expérience ou de la formation de la mémoire sont disponibles. Ces modèles comprennent conditionnement de la peur ^23, l'enrichissement environnemental aigu ^24,25, roman objet exploration ²⁶ et expérience visuelle suivante élevage sombre ^27. Pourtant, la sensibilisation comportementale à la cocaïne est une manipulation du comportement solide et cohérent, la création d'une trace de mémoire hautement invasive qui dure depuis des mois suivants expérience de cocaïne ^28.

Le cerveau est sectionné, suivie par microdissection manuel de noyau accumbens. Il a été notre expérience que la microdissection manuel de tranches de cerveau préparés rapidement fournit la méthode la plus fiable et rapide de l'extraction du tissu concerné au paradigme comportemental, et avec l'expérience, les limites du tissu devenu évident et facilement reconnaissables. Sinon, fines tranches pourraient être prépared, suivie par laser capture microdissection. Bien que ce procédé permet de fortement délimitation de la région d'intérêt définie, il est lent (risquant ainsi la perte d'ARNm labile), fastidieux et nécessite un équipement coûteux dédié (un microscope équipé d'une installation laser de capture). Le protocole défini dans ce document peut également être adapté à l'analyse de la transcription de cellules isolées, par aspiration manuelle du cytoplasme des cellules identifiées visuellement à l'aide de pipettes de patch ^29. Il est important de noter que le protocole décrit fournit une moyenne de la population, alors qu'il est très probable que dans la plupart des cas, seule une sous-population de cellules dans le tissu sont effectivement impliqués dans la réponse à l'expérience. Il est intéressant de profil transcription d'une manière sélective au sein de populations de cellules spécifiques répondant à l'expérience, mais la discussion de ces approches est au-delà de la portée actuelle.

Pour la purification de l'ARNm, la transcription inverse et qPCR interrogation, le tissuest perturbé par passage à travers de fines aiguilles, suivie par l'utilisation de kits disponibles dans le commerce (pour plus d'informations, voir le tableau 8). Le choix est informé par l'expérience de ces méthodes, qui assurent l'extraction fiable de l'ARN de haute qualité et des résultats solides à partir d'applications en aval.

Alors que le protocole est décrit par qPCR à haut débit en utilisant des tableaux dynamiques, les échantillons peuvent être sondés pour l'expression de gènes en utilisant la PCR point final, à faible débit qPCR, puces géniques d'expression ou le séquençage de profondeur. La préférence pour la PCR quantitative à haut débit en utilisant des tableaux dynamiques est due au fait que l'ARNm obtenu à partir de noyaux cérébraux suivant paradigmes comportementaux est souvent de quantités limitantes. Les tableaux dynamiques fournissent une plate-forme qui permet l'analyse globale efficace de la transcription à partir d'un grand nombre d'échantillons parallèles en une seule expérience. Après l'acquisition initiale du système microfluidique (généralement une unité centrale institutionnelrchase), les expériences sont relativement peu coûteux à exécuter. Suite à cette analyse, outre l'interrogation des échantillons peut être effectuée en utilisant des plates-formes plus coûteuses pour rechercher de nouveaux relevés de notes (biopuces ou RNAseq) avec les tableaux dynamiques fournir une référence complète pour l'assurance de la qualité. Enfin, l'analyse des données, les approches classiques sont utilisés. Pointeurs spécifiques concernant les problèmes qui pourraient survenir seront discutés dans le texte du protocole.

Ce protocole est le plus approprié pour les enquêteurs s'intéressent à une enquête approfondie de leur système d'intérêt, l'étude de plusieurs conditions et répétitions. Le protocole est également le plus approprié pour les enquêteurs qui ont déjà acquises dans (à travers des expériences de puces à ADN ou RNAseq) sur un sous-ensemble de 50-500 gènes d'intérêt, qu'ils sont intéressés à interroger à plusieurs reprises.

Protocol

NOTE: Le protocole suit les directives de protection des animaux de l'Université hébraïque de Jérusalem.

1 Préparation de la solution de l'ACSF

1. Préparer la solution de l'ACSF, comme décrit dans le tableau 1. Faire 1 L dans le trou DDH ₂ O (> 18 MQ pureté), ce qui porte l'osmolarité de ~ 300 mOsm / L avec plus appropriée d'eau ou de NaCl.

2 Équipement et aménagement de la salle

L'équipement pour la surveillance du comportement locomotrice induite par la cocaïne est constitué de chambres de comportement (50 x 45 cm) câblés avec une source de lumière interne, d'un ventilateur et d'une caméra (ou des capteurs infrarouges), et équipé d'une boîte en plexiglas intérieure (30 x 30 cm) en qui les souris sont autorisés à se déplacer librement tout en leur locomotion est surveillée. Le test comportemental doit être effectué entre 1 heure après le coucher à 1 heure avant les lumières, sur un cycle régulier lumière / obscurité. Les animaux doivent être formés régulièrement à la même heure chaque jour.

1. Nettoyer les chambres après chaque essai avec un désinfectant fournie par l'installation de la souris et / ou élimination des odeurs réactif, afin d'éviter un biais de repère olfactif et à assurer une désinfection adéquate.

IMPORTANT: Lorsque vous manipulez les souris se taire, calme et prudent.

3 Préparation des animaux

1. Maison 5 C57BL6 souris mâles (6-12 semaines; ~ 25-35 g de poids) par cage, dans une pièce avec une lumière 12 h cycle jour / nuit et l'accès libre à la nourriture et de l'eau, conformément aux normes et exigences de animale locale Entretien directives et protocoles du Comité. Avant de lancer l'expérience, peser les souris et enregistrer les données. La cocaïne est administrée par la suite en fonction du poids de la souris.
2. Transférer toutes les cages contenant des souris dans le comportement à manger 30 min avant de commencer le premier essai.
3. Habituer tout de lasouris utilisées dans l'expérience de la manipulation expérimentateur, les injections et la surveillance dans la configuration du comportement. Ceci est réalisé en trois injections intrapéritonéales quotidiennes consécutives de 250 ul de solution saline comme décrit ci-dessous.
4. Administrer une injection intrapéritonéale de 250 pi saline. Immédiatement après l'injection, de placer la souris dans une chambre de comportement pour contrôler l'activité locomotrice pendant 15 minutes. Répétez cette action pour 3 jours consécutifs, à la même heure chaque jour.
5. Le quatrième jour, les souris diviser en deux groupes. Préparer une solution stock de cocaïne à 2 mg / ml dans une solution saline. Administrer une injection unique de solution de cocaïne (finale de 20 mg / kg) au groupe expérimental en fonction du poids de la souris (par exemple, pour une souris de 25 g - injecter 250 ul, tandis que 30 g d'une souris recevra 300 pi). Administrer une solution saline pour le groupe de contrôle. Immédiatement après l'injection, de placer la souris pendant 20 minutes dans une chambre de comportement pour la surveillance de l'activité locomotrice (typicallié, les 15 premières minutes sont surveillés).
6. Après l'injection de cocaïne, de sacrifier les souris à des temps différents (0, 1, 2, 4, 8 et 24 h après l'injection). Surtout, assurez-vous que les souris de référence (0 point de temps) ne recevront aucune injection de ce jour. En raison de son importance, il est impératif d'inclure les répétitions du groupe de référence.

4. Dissection des noyau accumbens

1. Anesthésier les souris avec de l'isoflurane au moment approprié après l'injection de cocaïne / solution saline. L'isoflurane doit être évacué directement hors de la chambre. Par conséquent, le test doit être réalisé dans une hotte chimique.
2. Surveiller la profondeur d'anesthésie en testant le réflexe du pied arrière. Pincez la patte pour obtenir une réponse de retrait par l'animal. Un animal qui montre un réflexe n'est pas à un niveau chirurgical de l'anesthésie et pas dans un état d'euthanasier.
3. Extraction du cerveau:
   1. Euthanasier la souris par décapitation.
   <li> Retirer la peau au-dessus du centre du crâne et couper le crâne avec des ciseaux pointus.
   2. Insérez les ciseaux à l'endroit où la moelle épinière pénètre dans le cerveau (foramen magnum) et faire deux coupes latérales.
   3. Du même point, faire un long coupe sagittale le long de la suture sagittale. Après avoir atteint le bulbe olfactif, le clip vers la gauche et vers la droite.
   4. Avec une pince, retirer le crâne soigneusement, en saisissant chaque moitié du crâne fermement et en tirant sur le côté, en prenant soin de ne pas appuyer sur ou endommager le cerveau.
   5. Retirez le cerveau tout en coupant les nerfs crâniens en utilisant une cuillère micro spatule inversée.
4. Placez le cerveau dans une solution ACSF glacée pendant 1-2 min pour refroidir et durcir.
5. Retirer cerveau de l'ACSF, évacuer l'excès de liquide avec une serviette en papier, créer une coupe coronale entre le cervelet et le reste du cerveau et de la colle du cerveau, avec la partie rostrale vers le haut, sur la scène vibratome.
6. Couper le NAc: Maintenir des solutions ACSF à des températures glaciales dans la chambre de découpage du vibratome. Section à 200 um jusqu'à le noyau accumbens (NAC) est clairement identifié en fonction de la souris Brain Atlas Paxinos et Franklin (environ 1,8 mm de antérieure à Bregma; attention à la forme du corps calleux, l'emplacement et la forme de la commissure antérieure et les ventricules, ainsi que la morphologie générale de la section de cerveau). À ce stade, la création de deux sections 400 um, à partir de laquelle le NAc sera disséquée.
7. En vertu d'un stéréoscope, utiliser une fine lame de disséquer la zone NAc sur les tranches. La définition de la NAC est selon les atlas du cerveau de la souris Paxinos et Franklin, et pourrait facilement être disséqué dans les sections appropriées de quatre passes rapides de la lame sur le tissu. (Figure 2).
8. Placez sections NAc immédiatement dans 900 ul Trizol réactif de lyse dans un tube à centrifuger et conserver à -80 ° C jusqu'à ce que l'ARN extraction.

5. extraction d'ARN et d'ADNc de la transcription inverse

1. Décongeler les tubes contenant les sections de noyau accumbens Trizol réactif de lyse à la température ambiante et homogénéiser le lysat avec une seringue de 1 ml relié à l'aiguille 25 G jusqu'à ce que le tissu est complètement homogénéisé (au moins 15 à 20 fois). Les premiers tours sont difficiles et nécessitent de pousser le tissu contre la paroi du tube afin de le casser en petits morceaux qui pourraient entrer dans la pointe de l'aiguille.
2. Pour assurer une homogénéisation, pipeter le lysat dans une mini-colonne de centrifugation et QIAshredder à 12000 g pendant 1 min.
3. Déposer le lysat dans nouveau tube et extraire l'ARN selon les instructions du fabricant. Stocker l'ARN à -80 ° C jusqu'à utilisation.
4. Mesurer la concentration d'ARN, d'analyser l'intégrité et de la qualité en utilisant un Bioanalyzer ou équipement équivalent. Utilisez 100-500 ng d'ARN pour chaque tour de préparation d'ADNc avec rAndom amorces hexamères.

6. Primer Conception et Test Primer

1. Choisir de bons amorces: Pour une paire d'amorces optimales pour qPCR de transcrits d'ARNm, suivez ces exigences (figure 3):
   1. amorces de conception ne contenant pas plus de 17-28 bases. Évitez les répétitions de nucléotides, car ils favorisent mésamorçage.
   2. Conception des amorces avec la température de fusion (T _m) entre 56 à 68 ° C (de manière optimale de 60 à 64 ° C). La _Tm à l'intérieur de la paire d'amorces doit être à moins de 1 ° C les unes des autres.
   3. Soyez conscient que la taille du produit devrait idéalement se situer entre 80 et 150 points de base.
   4. Veiller à ce que au moins l'une des amorces couvre une jonction exon-exon, ou l'amplicon contient un grand intron (intron-recouvrement), pour éviter l'amplification des contaminants de l'ADN génomique.
   5. Utilisez un logiciel fiable basé sur Primer3 (pour des exemples, voir le tableau 2) afin d'améliorer la conception primaire.
2. Test de la prIMERS: Afin de garantir l'efficacité et la spécificité des amorces, une réaction qPCR de contrôle doivent être effectuées:
   1. Utilisation d'un échantillon positif (contenant de l'ADNc matrice pour toutes les paires d'amorces appropriées) et doser l'ADNc (par exemple, huit dilutions au tiers à partir d'une concentration initiale d'environ 10 ng) dans des réactions parallèles en double. Inclure un contrôle sans modèle, qui contrôle de la contamination dans les solutions utilisées pour la réaction.
   2. Calculer l'efficacité d'amorce en utilisant la formule: (10 ^{(- 1 / pente)} -1) x 100, de telle sorte que la courbe de la pente optimale est de - 3,333 (c.-à-10 ^{(- 1 / 3,333)} = 2) (Figure 4).
   3. Déterminer la spécificité de l'amplification. Une amplification spécifique est démontrée par un seul pic proéminent commun à toutes les courbes de fusion des produits amplifiés, tandis que l'amplification de la cible apparaît comme une déviation fr évidentom le seul grand pic.

7. analyse qPCR

1. Pré-amplification:
   1. Une analyse complète qPCR est basée sur l'interrogation parallèle de limiter les quantités d'ARN avec un grand nombre de paires d'amorces. Par conséquent, une étape de pré-amplification est essentielle. Dans cette étape, l'ADNc est soumis à des cycles de 14 à 18 de la pré-amplification avec un mélange de toutes les amorces qui seront utilisées pour l'interrogation de l'échantillon dans le futur (jusqu'à 800 paires d'amorces).
   2. Diluer toutes les amorces de TE (faible EDTA) à 50 uM pour une amplification spécifique cible (STA).
   3. Piscine ensemble des aliquotes de 1 pl de l'amorce tout 50 uM fixe pour être inclus dans la réaction STA, jusqu'à 800 tests.
   4. Préparer pré-mélange et échantillons pour STA comme décrit dans le tableau 3. Permettre erreur en préparant mélange pour 110% du nombre d'échantillons qui doivent être amplifiés.
   5. Aliquoter 3,75 ul STA pré-mélange pour chaque échantillon. Ajouter 1,25 pide l'ADNc de chaque.
   6. Vortex à mélanger les réactions et centrifuger pendant 10 s.
   7. Placez les réactions STA dans un cycleur thermique et le cycle comme indiqué au Tableau 4.
2. Exonucléase I (Ex-i) le traitement:
   1. Diluer le Exo I comme indiqué dans le tableau 5.
   2. Ajouter 2 pi de Exoi dilué (4 UI / ul) à chaque réaction STA 5 pi, vortex, centrifuger (> 6000 xg) et placer dans un cycleur thermique à 37 ° C pendant 30 min et ensuite à 80 ° C pendant 15 min.
   3. Diluer le produit final à une concentration appropriée pour l'essai. L'utilisation du tampon TE (ajouter 43 ul de tampon TE à l'échantillon de TSA 7 pi).
   4. Stocker les produits STA dilué à -20 ° C ou utiliser immédiatement.
3. Primer et la configuration de l'échantillon pour qPCR:
   1. Préparer les échantillons comme indiqué dans le tableau 6. Préparer mélange en fonction de la puce choisie de l'expérience, et le cas échéant ajouter des échantillons.
   2. Agiliter les solutions de répartition de l'échantillon pour un minimum de 20 secondes, et centrifuger (> 6000 xg) pendant au moins 30 secondes. Préparations réactions peuvent être stockés pendant de courtes durées à 4 ° C jusqu'à ce que la puce est prêt pour le chargement.
   3. Préparer les essais comme décrit dans le tableau 7.
   4. Agiter le dosage Mix pour un minimum de 20 secondes et centrifuger (> 6000 xg) pendant au moins 30 secondes pour tourner vers le bas tous les composants.
      IMPORTANT: Vortex à fond et centrifugeuse toutes les solutions échantillonnage et d'analyse avant de pipetage dans les entrées de la puce. Ne pas le faire peut entraîner une diminution de la qualité des données.
      REMARQUE: La concentration finale de chaque amorce est de 5 uM à l'entrée et 500 nM dans la réaction finale.
4. Amorçage et charger la Dynamic Array IFC (circuit fluidique intégré) à puce. La puce de la SFI a des entrées pour des échantillons et des analyses, ainsi que les entrées spécifiées (piles) pour le fluide de la ligne de commande (huile minérale) utilisé pour pressuriser les chambres microfluidiques (Figure 4A).
   1. Injecter le fluide de la ligne de commande dans chaque accumulateur sur la puce.
   2. Retirez et jetez le film de protection bleu du fond de la puce.
   3. Placez le jeton dans le contrôleur IFC approprié (contrôleur MX pour le 48.48 dynamique IFC RAID ou le HX contrôleur de l'IFC pour l'dispositif dynamique 96.96 SFI), puis exécutez le script Premier (113x) pour le 48.48 dynamique IFC RAID ou le premier (136x) script pour le dispositif dynamique 96.96 IFC pour amorcer la puce.
   4. Lorsque le script est terminé, retirez la puce amorcée à partir du contrôleur de la SFI.
   5. 5 ul de chaque dosage Mix et 5 pi de chaque échantillon Mix dans leurs entrées.
   6. Retour à la puce du contrôleur de la SFI.
   7. Utilisation du logiciel de contrôleur de la SFI, exécutez la charge Mix (113x) script pour le 48.48 Dynamic Array IFC) ou Charger Mix (136x) script pour le dispositif dynamique 96.96 IFC pour charger les échantillons et les analyses dans la puce. Lorsque le script charge Mix est terminée, retirer la chargepuce ed du contrôleur de la SFI.
   8. Charger la puce sur le cycleur thermique, créer une nouvelle puce terme (selon les directives du fabricant), y compris l'analyse de la courbe de fusion. En utilisant le logiciel du thermocycleur, veiller à ce que les chambres de réaction sont identifiés correctement, et permettent à la réaction pour exécuter l'achèvement.

Analyse 8. données

1. Assurance de la qualité: Afin d'assurer la qualité des données, vérifier la qualité des amorces en abordant les courbes de dilution (comme décrit ci-dessus). Surveiller la spécificité de l'amplification en regardant les courbes de fusion des amplicons, les pics de qui devraient être étroitement alignées de façon optimale ^29.
2. Visualisation: Pour la visualisation de grandes quantités de données obtenues par qPCR haut débit, utilisez le logiciel généré heatmaps, dans lequel l'expression est de couleur selon l'intensité. En outre, afficher la dynamique de la transcription de gènes uniques que les nuages ​​de points alignés.
3. Publication: Dans l'éditionles résultats de l'expression des gènes, il est conseillé de suivre les lignes directrices MiQE pour la publication des expériences quantitatives PCR en temps réel, en détaillant les informations minimales qui doivent être déclarés pour une expérience qPCR pour assurer sa pertinence, l'exactitude, l'interprétation correcte, et la reproductibilité.

Representative Results

La qualité des résultats obtenus par l'application de ce protocole dépend essentiellement un certain nombre de paramètres. Planification expérimentale appropriée entraînera une perturbation minimale pour les souris expérimentales, telles que l'expérience testée (dans cet exemple, que l'exposition à la cocaïne) sera l'expérience la plus dominante dans leur histoire récente, et donc se traduira par une transcription robuste et spécifique programme. figure 1 décrit le plan expérimental pour la sensibilisation comportementale à la cocaïne, de la définition des points de temps suivant l'expérience de la cocaïne au cours de laquelle le noyau accumbens est disséqué de souris et analysées. Le prochain point crucial est de définir les limites précises pour l'excision du tissu approprié pour l'analyse. Figure 2 décrit les limites des nucleus accumbens en coupes coronales et sagittales. De préférence, la dissection doit être réalisée de telle sorte qu'une marge de tissu mince NAc est exclue de la région takfr pour le profilage. Cela garantit que le profilage conforme de la NAc, la variabilité et la réduction de la possibilité d'artefacts résultant de l'inclusion du tissu environnant.

Lorsque l'amplification de quantités d'ARN de limitation, comme dans la dissection de petits noyaux du cerveau, de nombreux cycles d'amplification sont nécessaires pour une bonne détection du signal. Par conséquent, un point crucial dans une expérience de PCR quantitative, en outre amplifiés lorsqu'on travaille avec des petites quantités de matière de départ, est la caractérisation des amorces utilisées pour l'amplification. Figure 3 décrit les principales caractéristiques pour définir des amorces optimales, et la figure 4 montre les courbes d'amplification des amorces dirigées contre c-Fos et FosB, ce qui démontre que ces paires d'amorces amplifient leur transcription cible avec ~ 100% d'efficacité à chaque cycle. Après validation de l'amorce et l'établissement du paradigme expérimental adéquat pour permettre une évaluation claire de la transcription des tiss ciblesue, l'analyse complète peut être effectuée sur la plate-forme Fluidigm Biomark, permettant jusqu'à 9216 réactions parallèles (qPCR dans le format 96,96; Figure 5). Cette plate-forme à haut débit permet l'analyse en parallèle de multiples répétitions de laboratoire, en utilisant des conditions expérimentales identiques sur une seule puce. Les données pour les répétitions expérimentales quadruples, portant sur ​​l'induction de la transcription de c-Fos et FosB suivante expérience de cocaïne aiguë, sont mises en évidence dans la figure 6.

Figure 1: Experimental paradigme pour l'analyse de la transcription dynamique suivant l'expérience de la cocaïne. (A) Protocole expérimental - les souris sont habituées à la manipulation et à l'injection de 3 jours, tout en surveillant l'activité locomotrice par suivi vidéo dans une chambre de conduite d'insonorisation. Sourissont alors soumis à l'expérience de la cocaïne; une seule exposition = expérience de la cocaïne aiguë; 5 injections consécutives sont appelés exposition chronique. Une seule injection suivante ≥16 jours d'abstinence de la cocaïne est appelé un défi de cocaïne. La dynamique de la transcription sont abordés à différents points dans le temps expérimentaux suivants expérience de la cocaïne (1, 2, 4, 8, 24 h). (B) Terrain de la piste de la souris dans la chambre de comportement suivant 3 jours de l'injection de solution saline ou trois jours de solution saline + un exposition à la cocaïne aiguë unique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2 Localisation des noyau accumbens du cerveau de la souris. Lignes blanches épaisses marquent l'emplacement des coupes définissant le b oundaries de la NAC (A) Coupe coronale;. (B) Coupe sagittale. (Photos adapté du cerveau Allen Atlas Atlas Référence Images:. http: //atlas.brain- map.org/atlas?atlas=1&plate=100960352 ; http: //atlas.brain- map.org/atlas?atlas=2&plate = 100 883 869 ). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. amorces planification qPCR. Lignes directrices pour la planification amorces qPCR, avec des définitions de la spécificité, de stabilité et de compatibilité. 2fig3highres.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4 Évaluation de l'efficacité primaire. (A) Résultats des courbes d'amplification de Fos et FosB utilisant des batteries Fluidigm SFI. Une courbe standard a été générée à l'aide de sept dilutions en série de trois fois de l'ARN total extrait à partir de souris NAc et sondées pour l'expression de Fos et FosB. (B) L'efficacité de la paire d'amorces pour Fos et FosB a été évaluée en traçant la valeur de seuil de cycle ( Ct) à chaque dilution en fonction du logarithme de la dilution de l'échantillon de pliage. L'efficacité des amorces sont calculées à partir de la pente de la courbe d'étalonnage, tel que défini dans le texte. Les courbes d'amplification et des points de la courbe de dilution sont de couleur assortie.51642 / 51642fig4highres.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5 qPCR complète profilage application de la plate-forme de Fluidigm. (A) dispositif dynamique 96.96 IFC pour Real-Time PCR quantitative. Les amorces sont chargées dans les orifices d'entrée situés sur le côté droit, et les échantillons sont chargés dans les orifices d'entrée situés sur le côté gauche de la puce. Ce chiffre a été modifié avec la permission de l'analyse PCR en temps réel Fluidigm Guide de l'utilisateur. Carte des résultats de qPCR (B) de chaleur, qui représente les valeurs de Ct pour chaque puits sur la puce. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6: Exemples de résultats de la dynamique d'expression suite à une exposition à la cocaïne aiguë. L'expression induite par la cocaïne de c-Fos et FosB sont affichées comme une fonction du temps. Les moyennes des répétitions expérimentales quadruples, effectuées selon le protocole défini ici, sont affichées avec des barres d'erreur dépeignant erreur standard de la moyenne.

Réactif	MW	mM	g / l
NaCl (Sigma-Aldrich, 71376)	58.44	119	6,95
NaHCO 3 (Sigma-Aldrich, S6014)	84.01	26	2.18
Glucose (Sigma-Aldrich, G8270)	180.16	10	1.8
KCl (Sigma-Aldrich, P9541) d>	74.55	2.5	0,186
NaH 2 PO 4 (Sigma-Aldrich, S9638)	137,99	1	0,138
MgSO 4 ⋅7H 2 O (Sigma-Aldrich, M1880)	246,5	4	0,99
CaCl 2 (Sigma-Aldrich, C3011)	147	4	0,59

Tableau 1 solution de l'ACSF.

Nom du logiciel	Application	emplacement Web
Roche Probefinder	conception des amorces	http://qpcr.probefinder.com/organism.jsp
NCBI amorce-explosion	conception des amorces	http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

ve_content »> Tableau 2 Liste des logiciels.

Réactif	Volume / réaction (pi)	Volume 48 Réactions + 10% excédentaires (ul)	Volume pour 96 Réactions + 10% excédentaires (ul)
2X TaqMan PreAmp Master Mix (Applied Biosystems)	2.5	132	264
500 nM (10X) mélange primaire commun	1	52,8	105,6
Eau	0,25	13.2	26,4
ADNc	1,25
Volume total	5

Tableau 3 de solution de réaction STA.

Condition	Tenir	10-14 Cycles	Tenir
Température	95 ° C	95 ° C	60 ° C	4 ° C
Temps	10 min	15 sec	4 min	∞

Tableau 4: les conditions de cycle thermique de pré-amplification.

composant	Par 5 pi échantillon (pl)	48 échantillons avec utilisation excédentaire (pl)	96 échantillons avec utilisation excédentaire (pl)
Eau	1.4	84	168
L'exonucléase I de tampon de réaction	0,2	12	24
Exonucléase I à 20 unités / ul	0,4	24	48 </ Td>
Volume total	2.0	120	240

Tableau 5 de la solution de réaction Ex-i.

</ Tr>

Mélanger l'échantillon	Volume des composants par Inlet (pl)	Volume par entrée avec utilisation excédentaire (pl)	Volume de 48,48 Dynamic Array IFC (pl) (120 échantillons)	Volume de dispositif dynamique 96.96 IFC (pl) (120 échantillons)
2X SsoFast EvaGreen Supermix avec Low ROX (Bio-Rad, PN 172- 5211)	2.5	3	180	360
20X liaison à l'ADN de l'échantillon réactif colorant de chargement (Fluidigm, PN 100 à 3738) bonnet vert	0,25	0,3	18	36
Échantillon STA et Exoi traité	2,25	2.7
Total	5	6

Solution de pré-Mix 6 Exemple de table.

Tableau 7 Composition de la solution Mix.

Composant	Volume par entrée (pl)	Volume par entrée avec utilisation excédentaire (pl)	Volume de 48,48 Dynamic Array IFC (pl)	Volume de dispositif dynamique 96.96 IFC (pl)
Chargement Réactif 2X Assay	2.5	3	180	360
1X ADN Suspension Buffer (TE faible EDTA)	2	2.4	144	288
50 uM chaque mixte amorces sens et antisens	0,5	0,6
Volume total	5	6

Nom du réactif / Matériel	Entreprise	Numéro de catalogue
Virusol	Oriek médicale	J29D
Isoflurane, USP 100%	MINRAD INC	NDC 60307-110-25
RNeasy, plus universelle Mini Kit	Qiagene	73404
QIAshredder	Qiagene	79654
High Capacity kit ADNc transcription inverse	Invitrogene	AB-4368814
Tampon TE	Invitrogene	1355656

Tableau 8 Liste des produits chimiques / réactifs.

Nom de l'Equipement	Entreprise	Numéro de catalogue
Comportement Chambre (MDF, 50 x 45 cm)	Auto assemblés
Boîte de plexiglas intérieure (30 x 30 cm)	Auto assemblés
Appareil photo et enregistreur vidéo	Campden Inst	CMD-80051
Recorder logiciel Media	Noldus	NDS-NMR3-00M
Iris Ciseaux	FST	FST-14062-09
Vibratome	Campden Inst.	7000SMZ-2
Bioanalyzer	Agilent Technologies	Le bioanalyseur Agilent 2100
Cycleur thermique	Bio-Rad	1852048
Spatule de microspun inversés	Bochem Instrument GmbH	3213
Biomark HD Reader	Fluidigm	BMHD-BMKHD
Chip tableau dynamique de l'expression du gène 96,96	Fluidigm	BMK-M-96.96

Tableau 9 Liste des équipements.

Discussion

Caractérisation succès de l'expression des gènes du tissu cérébral qui suit paradigmes comportementaux dépend: 1) Une manipulation soigneuse des souris pendant le paradigme comportemental; 2) dissection rapide et précise des tissus d'intérêt; 3) les mesures d'ARN de sécurité pour assurer l'intégrité de l'ARN; et 4) la planification minutieuse des amorces et dispositif expérimental ainsi que la précision et l'attention au détail dans la préparation de l'analyse qPCR.

Le but de la procédure décrite est de caractériser la dynamique des événements de transcription induits par une expérience de comportement; Par conséquent, une attention particulière est nécessaire afin de garantir que le modèle de comportement connu de la souris de l'expérience représente en effet prévu par le chercheur. Par exemple, même dans un tel paradigme simple que la sensibilisation comportementale à la cocaïne, l'expérience de la souris pourrait être influencée par de nombreux facteurs de confusion: l'expérience préalable de la souris dans la maison-cage avant l'expérience; la méthode de transfert à la salle expérimentale; l'exposition à la lumière, le son et l'odeur dans la salle expérimentale; l'expérience de la manipulation par l'expérimentateur; la douleur / l'inconfort causé par l'injection IP; exposition à une nouvelle expérience, et l'expérience acquise suite au comportement spécifié jusqu'au point de l'euthanasie. Chacun de ces expériences peut, dans l'isolement, favoriser l'induction de la transcription des programmes dans les différentes régions du cerveau de la souris. Par conséquent, des précautions doivent être prises pour s'assurer que le programme transcriptionnel mesure le paradigme souhaité, et non epiphenomena associé au paradigme. Dans le cas de l'expérience de la cocaïne, ceci est facilement réalisé par une expérimentation soigneuse et une attention aux détails, ainsi que d'une expérience de contrôle simple, dans lequel tous les paramètres sont maintenus constants, mais véhicule (solution saline) est injecté à la souris plutôt que de la cocaïne. Dans notre expérience, l'injection saline induit un programme de transcription d'échelle très limitée par rapport àexposition à la cocaïne, ce qui démontre que le paradigme permet massivement enquête sur les phénomènes d'intérêt.

Le plus grand soin doit être pris pour limiter la gamme des expériences de la souris alors qu'il est encore actif, ce qui nécessite la manipulation calme et attentive des souris. En revanche, après une anesthésie, un travail rapide et précis est essentiel en raison de la possibilité de changements rapides dans la représentation de l'ARN (sur l'échelle de temps de minutes) et la labilité intrinsèque de l'ARN, qui pourrait être dégradée rapidement une fois que les cellules sont rompues, ce qui pourrait perturber le profil transcriptionnel induite par l'expérience. Il est donc important de retirer le cerveau du crâne rapidement à un environnement froid (dans 1-2 min) et rapidement disséquer le NAc dans des conditions glaciales. Une fois que le cerveau a été refroidi, le potentiel pour des changements de la transcription ou de la dégradation de l'ARN est réduite de manière significative, mais seulement lorsque les sections correspondantes sont placées dans le réactif Trizol et de gelée, is l'intégrité du tissu et la représentation du profil de transcription assurée.

Dans ce contexte, il est intéressant de mentionner que la dynamique de la transcription de l'expression précoce immédiate gène se produit sur une échelle de temps rapide, souvent un pic avant 1 h après la stimulation. Dans le cadre du paradigme expérimental décrit, l'interrogation de la dynamique de la transcription est limitée à l'échelle d'heures afin de réduire la variabilité entre les échantillons. Pour des durées plus courtes que 1 heure, de petites variations dans le temps peut entraîner une grande variation dans la grandeur des changements observés de la transcription. Par conséquent, le point de temps de 1 heure a été choisi pour l'analyse, étant donné que ce point de temps est expérimentalement plus facile à réaliser avec précision, et il est moins sensible à une variation au niveau d'une différence de quelques minutes dans l'expérience.

Traditionnellement, un micropunch de tissu a été utilisé par de nombreux laboratoires pour la dissection des échantillons de tissus. Làun certain nombre de raisons de préférer microdissection manuel du tissu. Le poinçon est normalement réalisé en acier inoxydable et n'est pas transparent. Par conséquent le positionnement du poinçon dans un endroit précis et cohérent peut être délicat. En outre, le poinçon ne permet aucune correction à apporter s'il y avait une erreur dans le positionnement initial. Enfin, l'extraction du tissu à l'intérieur du poinçon peut parfois s'avérer difficile, et il est possible que la perte de tissu ou de report entre les échantillons. Microdissection du tissu à l'aide d'un scalpel fin permet à l'expérimentateur un contrôle plus précis et assure la sécurité en ce qui concerne la pureté des échantillons.

Lors de l'extraction de l'ARN et jusqu'à la synthèse de l'ADNc, l'environnement de travail doit être exempt de sources de contaminants RNase, et le travail doit être effectué en utilisant la RNase gratuitement des outils, des consommables et des réactifs. A ce stade, la plus petite contamination pourrait facilement corrompu durement gagné des échantillons d'ARN. Garder les échantillons iCE froid est indispensable pour réduire au minimum l'activité neuronale qui pourraient modifier la lecture de la transcription, ainsi que de minimiser l'activité enzymatique qui pourrait affecter l'intégrité échantillon. Inhibiteurs pharmacologiques supplémentaires sont parfois ajoutés pour réduire l'excitabilité neuronale, mais souvent elles ne sont pas essentielles.

Après transcription inverse en ADNc, l'accent se tourne vers s'assurer de la validité des résultats obtenus à partir du profilage complet de transcriptions. La première étape consiste à faire en sorte que les amorces qPCR appropriées sont utilisées, pour lesquelles il est fortement recommandé de tester l'efficacité et la spécificité de l'amorce sur des courbes de dilution d'une source déterminée d'ARN. Les amorces de PCR optimales fournissent une amplification spécifique et efficace de la cible. Une amplification spécifique implique que l'amplification est seulement de la séquence cible, évident que d'un seul pic distinct dans l'analyse de courbe de fusion, tandis que l'amplification efficace implique que, dans chaque cycle, la quantité de la séquence cible estdupliqué, avec un rendement se rapprochant de 100%. En raison de la nature à haut débit des puces microfluidiques qPCR, ces expériences nécessitent une planification minutieuse pour assurer l'inclusion d'un nombre important de contrôles positifs et négatifs. Il est préférable d'inclure des contrôles cohérents dans chaque course de la puce, ce qui permet une comparaison directe des résultats de contrôle et des conditions expérimentales. Lors de l'installation de l'expérience, il est crucial de ne pas la contamination croisée des puits. Depuis toute petite quantité d'amorces dans la mauvaise et pourrait provoquer l'amplification de la cible non désirée, une attention particulière doit être prise lors du pipetage amorces.

Pour la plupart des échantillons de tissu provenant du cerveau, il est difficile d'être certain que, pendant que la dissection du tissu d'intérêt a été extrait, sans contamination de régions cérébrales pertinentes, ce qui pourrait les confondre et analyser les résultats. À cette fin, un contrôle important scrute les gènes dont l'expression est censé être exclus dele tissu d'intérêt. Un outil utile pour identifier les structures spatiales de l'expression des gènes est le cerveau Allen Atlas ( http://www.brain-map.org/ ).

Bien qu'une discussion approfondie de l'analyse des données est au-delà de la portée de cette publication, il convient de noter que les mandats d'une expérimentation rigoureuse, une analyse minutieuse. Il est important de veiller à ce qu'un certain nombre de gènes de référence pertinents sont inclus dans chaque tour de qPCR. Ces gènes se servir de normalisation afin d'assurer que des quantités similaires d'ARN est dosé. La normalisation est effectuée en premier lieu aux gènes de référence à l'intérieur de l'échantillon, et ensuite aux souris de référence pour l'expérience ("temps 0"), l'application de la "méthode ΔΔCt".

Le protocole décrit dans ce manuscrit vise à étudier la dynamique de la transcription qui suit l'expérience de la cocaïne dans le noyau accumbens de souris. Cependant, il est très facilement adapted pour l'étude de toute autre expérience de la souris, aussi longtemps que les contrôles appropriés sont mis en œuvre, et le moment de l'expérience est bien défini. De toute évidence, ce protocole pourrait également être mis en œuvre pour l'étude de la dynamique de la transcription dans les tissus en dehors du système nerveux ainsi.

Il convient de souligner que le profilage transcriptionnel complet qPCR utilisant microfluidique à base d'un procédé rentable de profilage événements transcriptionnels, mais dépend de la connaissance préalable des gènes cibles d'intérêt. Ceux-ci sont normalement obtenues par des méthodes de profilage sans parti pris, comme les puces et séquençage profond. Par conséquent, le flux de travail d'un grand projet, complète profilage qPCR pourrait fournir l'essentiel des données, mais de préférence devrait suivre une caractérisation objective préalable du système.

Il est également utile de préciser que le procédé décrit ici pour obtenir des échantillons de tissus peut également être mise en œuvre à l'étudement une variété d'autres événements cellulaires - protéomique et modifications des protéines, la métabolomique, lipidomique et marques épigénétiques.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Virusol	Oriek Medical	J29D
Isoflurane, USP 100%	MINRAD INC	NDC 60307-110-25
RNeasy plus Universal Mini Kit	QIAGEN	73404
QIAshredder	QIAGEN	79654
High Capacity cDNA Reverse Transcription kit	Invitrogen	AB-4368814
TE Buffer	Invitrogen	1355656
Behavior Chamber (MDF; 50 x 45 cm)			Self assembled
Inner Perspex box (30 x 30 cm)			Self assembled
Camera and video recorder	Campden Inst.	CMD-80051
Media Recorder software	Noldus	NDS-NMR3-00M
Iris Scissors	FST	FST-14062-09
Vibratome	Campden Inst.	7000SMZ-2
Bioanalyzer	Agilent Technologies	The Agilent 2100 Bioanalyzer
Thermal cycler	Bio-Rad	1852048
Inverted microspoon spatula	Bochem Instrument GmbH	3213
Biomark HD Reader	Fluidigm	BMHD-BMKHD
Dynamic array Chip for 96.96 gene expression	Fluidigm	BMK-M-96.96