Omfattande Analys av transkription Dynamics från Brain Prover Efter Behavioral Experience

Abstract

Kodningen av upplevelser i hjärnan och konsolideringen av varaktiga minnen beroende gentranskription. Identifiera funktionen av specifika gener i kodning erfarenhet är ett av de viktigaste målen för molekylär neurovetenskap. Dessutom den funktionella sammanslutning av definierade gener med specifika beteenden har konsekvenser för att förstå grunden för neuropsykiatriska störningar. Induktion av robusta transkriptionsprogram har observerats i hjärnan hos möss efter olika beteende manipulationer. Medan vissa genetiska element används återkommande efter olika beteende manipulationer och i olika hjärnkärnor, transkriptions program är totalt unika för inducerande stimuli och strukturen där de studerade ^1,2.

I denna publikation är ett protokoll beskrivs för robust och omfattande transkriptions profilering från hjärnkärnor hos möss som svar på beteende manipulation. Denprotokoll demonstreras i samband med analys av genuttryck dynamiken i nucleus accumbens efter akut kokainupplevelse. Efter en definierad in vivo erfarenhet, målet nervvävnad dissekeras; följt av RNA-rening, omvänd transkription och användning av mikroflödes matriser för omfattande qPCR analys av flera mål gener. Detta protokoll är inriktad omfattande analys (adresse 50-500 gener) att begränsa mängder utgångsmaterial, såsom små hjärnprover eller till enskilda celler.

Protokollet är mest fördelaktiga för parallell analys av flera prover (t.ex. enskilda celler, dynamisk analys efter läkemedels, virus eller beteendestörningar). Emellertid skulle protokollet också fungera för karakterisering och kvalitetssäkring av prover före hel-genomstudier av mikromatriser eller RNAseq, samt validering av uppgifter från hel-genomstudier.

Introduction

Hjärnans dynamisk organisation möjliggör kognitiv och beteende flexibilitet. Erfarenheter kodas genom ändringar i strukturen och styrka kopplingar mellan nervceller i hjärnan ^3. Denna "erfarenhet beroende plasticitet" är resultatet av induktion av specifika mönster av genuttryck som ger de nödvändiga proteinerna för modifiering av synaptiska struktur och styrka ^4. Identifieringen av genreglerande nätverk medierar bildandet av långvariga minnen är en central grundsats i molekylär neurovetenskap, med förväntningen att identifieringen av de dominerande inslagen i transkription program kommer att ge insikt i de grundläggande principer som reglerar minnesbildning, samt mål för behandling av neurodegenerativa och neuropsykiatriska störningar. Transkription program utvecklas i tidsmässigt definierade vågor, som var och en kodar gener av olika karaktär, som är viktiga för different etapper i genomförandet av resultatet av signalerings händelsen ^1,2. Därför är det viktigt att ta itu med transkription dynamiken på en detaljerad tidstidsskala, för att identifiera den full uppsättning av gener som induceras, och få insikt i deras potentiella funktion enligt dynamiken i deras induktion.

Drogberoende är en robust form av erfarenhet beroende plasticitet som orsakas av långvariga effekter av droger av missbruk på neurala kretsar i hjärnan ^5,6. Initial, akut exponering för läkemedel kan leda till utveckling av missbruk och övergången till kronisk användning. Kontextuell information som är av avgörande betydelse för utvecklingen av beroende. Narkotika tillhörande miljö ledtrådar delas stor betydelse i medvetandet hos missbrukare. Kontextuell information som påminner en missbrukare av tidigare drog erfarenhet kan framkalla återfall till drogbegär även efter långa perioder av avhållsamhet från läkemedelsexponering ^7,8.Därav den stora kliniska utmaningen i missbruk - benägenhet missbrukare till återfall även långt efter utsättningssymtom har avtagit ^9.

Behavioral sensibilisering för kokain är en enkel modell av kokain erfarenhet användbar i studiet av mekanismer för narkotikamissbruk. I denna vida studerad modell för långvarig allergi inducerad av kronisk exponering för droger av missbruk, är gnagare först vana vid saltinjektioner (ip, IP) i en ny miljö (ett öppet fält kammare där deras rörelseaktivitet övervakas) ; då får de dagliga injektioner av kokain i de öppna fältkammare medan deras aktivitet övervakas ¹⁰ (Figur 1). Denna beteende paradigm resulterar vanligtvis i en robust sensibilisering av rörelsebeteende (8-12 gånger över baslinjen aktivitet) ^11, som upprätthålls under en period av månader efter avslutad kokaininjektioner, visar bildandet av en pervasive minne spår av narkotika upplevelse.

Den neurala kretsar av belöning, naturligt involverad i att förstärka beteenden viktiga för att lyckas med en art (t.ex. utfodring, kön), utnyttjas av missbruksdroger att förstärka narkotikarelaterade beteenden ^12,13. De molekylära och cellulära mekanismer som upplevelsen av missbruksdroger förstärks tycks likna de mekanismer som ligger bakom bildandet av deklarativa eller semantiska minnen i andra hjärnstrukturer ^14. Därför robustheten i beteende sensibilisering modellen gör det till ett attraktivt modellsystem för att studera mekanismer erfarenhet beroende plasticitet.

Nucleus accumbens (NAC) är en central integrator av hjärnans belöningskretsarna, och har i stor utsträckning i samband med utveckling av missbruk ^5,6. Bildningen av missbruk beror på transkription av nya proteiner i nucleus accumbens, och robust iduktion av tydligt strukturerade transkriptionsprogram observeras i NAC efter kokainupplevelse ^15-19. Den akuta transkription svar på exponering kokain sannolikt fungera på flera nivåer för att anpassa sig till den starka induktions stimulans och för att styra produktionen av nya proteiner som ansvarar för de strukturella och elektrofysiologiska förändringar inducerade av exponering för läkemedlet ^6,19-22.

För att främja studier av molekylära mekanismer erfarenhet beroende plasticitet i hjärnan, är ett protokoll som beskrivits för omfattande analys av transkriptions dynamik i hjärnvävnadsprover efter beteende manipulation. Protokollet illustreras i samband med beteende erfarenhet studeras i Citri labb - beteendesensibilisering mot kokain, som utnyttjar mikrofluid dynamiska matriser för transkriptionell analys. Protokollet som beskrivs är naturligtvis inte begränsad till att studera tHan nucleus accumbens i samband med beteende sensibilisering, men kan tillämpas på ett stort antal beteende paradigm och hjärnan. I själva verket kan detta protokoll tillämpas på kroppsvävnader utanför hjärnan, och en mängd olika upplevelser eller manipulationer av organismen studerade.

Protokollet är grovt indelas i fyra steg. I det första steget, är djuret utsattes för beteendeparadigm; i det andra steget vävnaden är microdissected; i det tredje steget - mRNA renas, omvänd-transkriberades och sonderades, och i det sista steget av data analyseras.

I samband med att studera transkription dynamik, den exakta tidpunkten och definition av upplevelsen är förmodligen de viktigaste experimentella parametrar som styr. Av denna anledning är det av beteendesensibilisering mot kokain, ett system, som möjliggör hög nivå av försöksledaren kontroll över parametrarna i experien vår beteendemodell av valce. Ytterligare beteende paradigm som gör att exakta tidpunkten och behandlar olika modeller av erfarenhet beroende plasticitet eller minnesbildning finns. Dessa modeller inkluderar rädsla konditione ^23, akut miljöberikning ^24,25, nya objekt prospektering ²⁶ och visuell upplevelse efter mörka uppfödning ^27. Ändå beteende sensibilisering mot kokain är ett genomgående robust beteende manipulation, vilket skapar en mycket genomgripande minne spår som varar i månader efter kokain erfarenhet ^28.

Hjärnan är uppställd, följt av manuell microdissection av nucleus accumbens. Det har varit vår erfarenhet att manuell microdissection från snabbt beredda hjärnan skivor ger den mest pålitliga och snabb metod för att extrahera den vävnad som är relevant för beteendeparadigm, och med erfarenhet, gränserna för vävnaden blivit uppenbart och lätt igenkännbar. Alternativt kan fina skivor vara prepared, följt av laser-capture microdissection. Även om denna metod möjliggör skarp avgränsning av det intressanta området, är det lugnt (därmed riskera förlust av labila mRNA), tråkiga och kräver kostsamma dedikerade maskiner (ett mikroskop utrustat med en laser-capture setup). Protokollet definieras häri kan också anpassas till encelliga transkriptions analys genom manuell aspiration av cytoplasma visuellt identifierade celler genom att använda patch pipetter ^29. Det är viktigt att notera att det protokoll som beskrivs ger en befolknings genomsnittet, medan det är mycket troligt att det i de flesta fall endast en subpopulation av cellerna i vävnaden som faktiskt deltar i att svara på upplevelsen. Det är av intresse att profilera transkription på ett selektivt sätt inifrån specifika cellpopulationer som svarade på erfarenhet, men diskussioner om dessa metoder är utöver den nuvarande omfattningen.

För mRNA-rening, omvänd-transkription och qPCR fråge, vävnadenstörs genom att passera fina nålar, följt av användning av kommersiellt tillgängliga kit (för mer information, se tabell 8). Valet informeras av erfarenhet av dessa metoder, som säkerställer tillförlitlig utvinning av hög kvalitet RNA och robusta resultat från senare led.

Medan protokoll beskrivs för high-throughput qPCR utnyttjar dynamiska matriser, kan proverna undersökas för genuttryck med end-point PCR, låg genomströmning qPCR, genuttryck microarrays eller djup sekvensering. Den preferens för hög genomströmning qPCR utnyttjar dynamiska matriser beror på att mRNA som erhållits från hjärnkärnor efter beteende paradigm är ofta begränsande mängder. Dynamiska matriser ger en plattform som möjliggör effektiv övergripande analys av transkript från ett stort antal parallella prov i ett enda experiment. Efter den initiala förvärvet av mikroflödessystem (vanligen en institutionell purchase), experiment är relativt billiga att köra. Efter denna analys kan ytterligare fråge av proven utföras med dyrare plattformar för att söka efter nya transkript (av microarrays eller RNAseq) med de dynamiska matriser ger en omfattande referens för kvalitetssäkring. Slutligen, för dataanalys, är vanliga metoder utnyttjas. Särskilda tips om vilka frågor som kan uppstå kommer att diskuteras i texten av protokollet.

Detta protokoll är mest lämpliga för utredarna är intresserade av en grundlig utredning av sina system av intresse, som studerar flera villkor och replikat. Protokollet är också bäst för utredare som redan har finslipat i (genom microarray eller RNAseq experiment) på en delmängd av 50-500 gener av intresse, som de är intresserade av att fråga flera gånger.

Protocol

OBS: Protokollet följer riktlinjerna djur hand om Hebrew University i Jerusalem.

1 Beredning av ACSF lösning

1. Bered ACSF lösning som beskrivs i tabell 1. Gör ett L i DDH ₂ O (> 18 Mohm renhet), att föra osmolaritet till ~ 300 mOsm / L med lämplig tillsats av vatten eller NaCl.

2 Utrustning och Room Set Up

Utrustning för övervakning av kokain-inducerad rörelsebeteende består av beteendekammare (50 x 45 cm) trådbundna med en inre ljuskälla, fläkt och kamera (eller infraröda sensorer), och utrustad med en inre plexiglaslåda (30 x 30 cm) i som mössen får röra sig fritt medan deras förflyttning övervakas. Den beteendetester ska utföras mellan 1 h efter lampor på till 1 tim före belysningen, på en vanlig ljus / mörker-cykel. Djur bör utbildas konsekvent vid samma tidpunkt varje dag.

1. Rengör kamrarna efter varje prövning med desinfektionsmedel från mus anläggning och / eller ta bort lukt reagens, för att förhindra lukt kö partiskhet och för att säkerställa korrekt desinfektion.

VIKTIGT: När du hanterar mössen vara tyst, lugn och försiktig.

3 Animal Förberedelse

1. Hus 5 C57BL6 hanmöss (6-12 veckor gamla, ~ 25-35 g vikt) per bur, i ett rum med en 12 tim ljus / mörker-cykel och fri tillgång till mat och vatten, enligt standard och krav för lokala djur Vård kommittén vägledning och protokoll. Innan initiering av experimentet, väger mössen och logga data. Kokain senare administrerad i enlighet med vikten hos mössen.
2. Överför alla burar som innehåller mössen in i beteende rummet 30 minuter innan den första rättegången.
3. Habituate alla avmöss som används i försöket att försöksledaren hantering, injektioner och övervakning i beteendet setup. Detta uppnås genom tre på varandra följande dagliga intraperitoneala injektioner av 250 | al saltlösning såsom beskrivs nedan.
4. Administrera en intraperitoneal injektion av 250 pl saltlösning. Omedelbart efter injektionen, placera musen i ett beteende kammaren för att övervaka rörelseaktivitet i 15 min. Upprepa denna åtgärd för 3 dagar i följd, vid samma klockslag varje dag.
5. På den fjärde dagen, dela upp mössen i två grupper. Bered en stamlösning av kokain vid 2 mg / ml i saltlösning. Administrera en enda injektion av kokain-lösning (slutlig 20 mg / kg) till experimentgruppen enligt vikten av musen (t.ex. för en 25 g mus - injicera 250 pl, medan en 30 g mus erhåller 300 pl). Administrera saltlösning till kontrollgruppen. Omedelbart efter injektionen, placera musen i 20 minuter i ett beteende kammare för kontroll av rörelseaktivitet (typicbundsförvant, är de första 15 min övervakas).
6. Efter kokaininjektion, offra mössen vid olika tidpunkter (0, 1, 2, 4, 8 och 24 h efter injektion). Viktigt är att se till att referens möss (0 tidpunkt) inte kommer att få någon injektion på denna dag. På grund av dess betydelse, är det nödvändigt att inkludera replikat av referensgruppen.

4. Dissekering av nucleus accumbens

1. Bedöva möss med isofluran vid lämplig tidpunkt efter det att kokain / saltlösning injektion. Den isofluran måste direkt ventileras ut ur rummet. Därför bör det förfarande utföras i ett dragskåp.
2. Övervaka anestesidjupet genom att testa den bakre foten reflex. Nyp tass för att framkalla ett tillbakadragande svar av djuret. Ett djur som visar en reflex är inte en kirurgisk nivå av anestesi och inte i ett tillstånd att avliva.
3. Extraktion av hjärnan:
   1. Euthanize musen genom halshuggning.
   <li> Ta bort huden ovanför centrum av skallen och skär skallen med vass sax.
   2. Sätt saxen vid den punkt där ryggmärgen går in i hjärnan (foramen magnum) och gör två sido nedskärningar.
   3. Från samma punkt, göra en lång sagittal snitt längs sagittal sutur. När det anländer till luktbulben, klipp till vänster och till höger.
   4. Med en pincett, ta bort skallen försiktigt, gripa varje halva av skallen och dra ut åt sidan, se till att inte trycka på eller skada hjärnan.
   5. Ta hjärnan samtidigt bryta kranialnervema med en inverterad mikro sked spatel.
4. Placera hjärnan i en iskall ACSF lösning för 1-2 minuter för att kyla och härda.
5. Ta hjärnan från ACSF, suga överflödig vätska med en pappershandduk, skapa en koronalt snitt mellan lillhjärnan och resten av hjärnan och limma hjärnan, med den rostrala delen uppåt, på vibratome scenen.
6. Cutting NAC: Behåll ACSF lösningar till iskalla temperaturer i skivning kammare vibratome. Sektion vid 200 nm tills nucleus accumbens (NAC) är klart enligt den Paxinos och Franklin Mouse Brain Atlas (ca 1,8 mm främre till Bregma, uppmärksamma formen på corpus callosum, platsen och formen på främre commissure och ventriklarna, såväl som den övergripande morfologin av hjärnan avsnitt). Vid denna punkt, skapa två 400 pm sektioner som NAC kommer att dissekeras.
7. Enligt ett stereoskop, använd ett fint blad för att dissekera NAC område ut ur skivorna. Definitionen av NAC är enligt Paxinos och Franklin mus hjärnatlas, och kunde lämpligen dissekeras i lämpliga avsnitt av fyra snabba passager av bladet på vävnaden. (Figur 2).
8. Placera NAc sektionerna omedelbart i 900 pl Trizol lysisreagens i ett mikrocentrifugrör och förvara vid -80 ° C tills RNA-extrhandling.

5. RNA-extraktion och cDNA omvänd transkription

1. Tina rören innehållande nucleus accumbens sektioner i TRIzol lysisreagens vid rumstemperatur och homogenisera lysatet med en 1 ml spruta ansluten till 25 G nål tills vävnaden är fullständigt homogeniserad (åtminstone 15 till 20 gånger). De första rundorna är svåra och kräver skjuta vävnaden mot väggen av röret för att bryta den till små bitar som kan komma in i spetsen på nålen.
2. För att garantera homogenisering, pipettera lysatet i en QIAshredder minispinnkolonn och centrifugera vid 12.000 xg under 1 min.
3. Pipet lysatet till nya mikrocentrifugrör och extrahera RNA enligt tillverkarens anvisningar. Förvara RNA vid -80 ° C fram till användning.
4. Mät RNA-koncentrationen, analysera integritet och kvalitet med hjälp av en Bioanalyzer eller motsvarande utrustning. Använd 100-500 ng RNA för varje omgång av cDNA beredning med rAndom hexamer primers.

6. Primer Design och Primer Testing

1. Att välja bra primers: För optimal primerpar för qPCR av mRNA-transkript, följ dessa krav (Figur 3):
   1. Design primers innehåller inte längre än 17-28 baser. Undvik nukleotid upprepningar eftersom de främjar mispriming.
   2. Design primrar med smälttemperaturen _(Tm) mellan 56-68 ° C (optimalt 60-64 ° C). _Tm inom primerpar bör vara inom 1 ° C från varandra.
   3. Var medveten om att produktens storlek idealt bör vara mellan 80 och 150bp.
   4. Se till att åtminstone en av primrarna omfattar en exon-exon-föreningspunkten, eller amplicon innehåller en stor intron (intron överbryggande), för att undvika förstärkning av genomiska DNA-kontaminanter.
   5. Använd en tillförlitlig mjukvara baserad på primer3 (för exempel se tabell 2) i syfte att förbättra primer design.
2. Testa primers: För att säkerställa specificiteten och effektiviteten av primers, en kontroll qPCR reaktion bör utföras:
   1. Använd ett positivt prov (innehållande cDNA mall för alla relevanta primerpar) och titrera cDNA (t.ex. åtta trefaldiga utspädningar från en initial koncentration av ~ 10 ng) i dubbla parallella reaktioner. Inkludera en no-mall kontroll, som kontrollerar för förorening inom de lösningar som används för reaktionen.
   2. Beräkna primer effektivitet med hjälp av formeln: (10 ^{(- 1 / lutning)} -1) x 100, så att kurvan för den optimala lutningen är - 3.333 (dvs 10 ^{(- 1 / 3.333)} = 2) (Figur 4).
   3. Bestäm specificiteten hos förstärkning. Specifik amplifiering demonstreras genom ett enda framträdande topp gemensam för alla smältkurvor av de amplifierade produkterna, medan off-målamplifiering skulle framstå som en uppenbar avvikelse frOM den enda stor topp.

7. qPCR Analys

1. Pre-förstärkning:
   1. Omfattande qPCR analys bygger på parallella fråge begränsa mängder RNA med ett stort antal primerpar. Därför är avgörande steg för pre-förstärkning. I detta steg cDNA genomgår 14-18 cykler av pre-amplifiering med en blandning av alla de primers som kommer att utnyttjas för att fråga provet i framtiden (upp till 800 primerpar).
   2. Späd alla primers i TE (lågt EDTA) till 50 ^ M för Specifik Amplification (STA).
   3. Pool tillsammans en il alikvoter av alla de 50 ^ M primer sätter ingå i STA reaktion, upp till 800 analyser.
   4. Förbered förblandning och prover för STA som beskrivs i tabell 3. Tillåta misstag genom att förbereda mix för 110% av det antal prov som måste förstärkas.
   5. Alikvot 3,75 l STA förblandning för varje prov. Lägg 1,25 plav cDNA till varje.
   6. Vortex för att blanda de reaktioner och centrifugera i 10 sek.
   7. Placera STA reaktionerna i en värmecykeln och cykla som anges vid tabell 4.
2. Exonukleas I (ExoI) behandling:
   1. Späd Exo I enligt tabell 5.
   2. Tillsätt 2 l av utspätt ExoI (4 U / l) till varje 5 l STA reaktion, virvel, spinn ner (> 6000 xg) och placera i en termocykler vid 37 ° C under 30 minuter och därefter vid 80 ° C under 15 min.
   3. Späd de färdiga produkterna till en lämplig koncentration för testning. Använd TE buffert (lägg 43 l TE buffert till 7 l TSA prov).
   4. Förvara utspädda STA produkterna vid -20 ° C eller använd omedelbart.
3. Primer och prov setup för qPCR:
   1. Förbered prover såsom visas i tabell 6. Förbered blandning enligt chipet som valts för experimentet, och lägga till lämpliga prover.
   2. Agilätta urvalet Mix lösningar i minst 20 sekunder, och centrifugera (> 6000 xg) i minst 30 sekunder. Beredda reaktioner kan förvaras under kortare perioder vid 4 ° C fram till chipet är redo för lastning.
   3. Förbered analyserna som beskrivs i tabell 7.
   4. Skaka analys Mix i minst 20 sekunder och centrifugera (> 6000 xg) i minst 30 sekunder för att snurra ner alla komponenter.
      VIKTIGT: Vortex noggrant och centrifugera alla prov och analyslösningar före pipettering i chipet vikar. Underlåtenhet att göra detta kan resultera i en minskning av datakvalitet.
      OBS: Den slutliga koncentrationen av varje primer är 5 | iM i inloppet och 500 nM i den slutliga reaktionen.
4. Priming och Laddar Dynamic Array IFC (integrerad fluidic krets) chip. IFC chip har inlopp för prover och analyser, samt specificerade inlopp (ackumulatorer) för styrledning vätska (mineralolja) som används för att trycksätta mikroflödeskammare (Figure 4A).
   1. Injicera styrledning vätska in varje ackumulator på chipet.
   2. Ta bort och kasta den blå skyddsfilmen från botten av chipet.
   3. Placera marker i lämplig IFC regulator (controller MX för 48.48 Dynamic Array IFC eller IFC controller HX för 96.96 Dynamic Array IFC), kör sedan Prime (113x) manus till 48.48 Dynamic Array IFC eller Prime (136X) manus till 96.96 Dynamic Array IFC för att prime chipet.
   4. När skriptet är klar, ta bort den grundade chip från IFC controller.
   5. Pipettera 5 ìl av varje analys Mix och 5 l av varje prov Mix i sina vikar.
   6. Återgå chipet till IFC controller.
   7. Med hjälp av IFC controller mjukvara, kör Load Mix (113x) manus till 48.48 Dynamic Array IFC) eller Load Mix (136X) manus till 96.96 Dynamic Array IFC att ladda prover och analyser i chipet. När Load Mix skriptet är klar, ta bort belastningened chip från IFC controller.
   8. Fyll på marker på värmecykeln, skapa ett nytt chip körning (enligt tillverkarens anvisningar), inklusive smältkurvanalys. Med hjälp av värmecykeln programvara, se till att reaktionskamrarna korrekt detekterar och låt reaktionen att springa till färdigställande.

8. Data Analysis

1. Kvalitetssäkring: För att säkerställa uppgifternas kvalitet, kontrollera kvaliteten på de primers genom att ta upp utspädningskurvor (enligt ovan). Övervaka specificitet förstärkningen genom att visa smältkurvoma av amplikoner, toppar som bör optimalt tätt linje ^29.
2. Visualisering: För visualisering av stora mängder data som erhållits genom hög genomströmning qPCR, använda mjukvara genererade heatmaps, där uttryck är färgkodade efter intensitet. Dessutom visar de transkriptions dynamiken i enstaka gener som fodrade spridningsdiagram.
3. Publikation: I publiceringde genuttryck resultat, är det tillrådligt att följa MIQE riktlinjer för publicering av kvantitativ realtids-PCR-experiment, med uppgifter om minimiuppgifter som ska redovisas för en qPCR experiment för att säkerställa dess relevans, noggrannhet, korrekt tolkning, och reproducerbarhet.

Representative Results

Kvaliteten på de resultat som fås genom detta protokoll beror ytterst på ett antal parametrar. Ordentlig försöksplanering kommer att resultera i minimal störning för de experimentella möss, så att beprövad erfarenhet (i detta exempel att exponering för kokain) kommer att vara den mest dominerande erfarenheten i sin moderna historia, och därför kommer att resultera i en robust och specifik transkriptions program. Figur 1 beskriver experimentell plan för beteende sensibilisering mot kokain, definiera tidpunkter efter kokainupplevelse där nucleus accumbens dissekeras från möss och analyserades. Nästa viktiga punkt är att definiera de exakta gränserna för excision av rätt vävnad för analys. Figur 2 beskriver gränserna för nucleus accumbens i koronala och sagittala sektioner. Företrädesvis dissektion bör utföras så att en tunn marginal på NAc vävnad utesluts från regionen taken för profilering. Detta säkerställer konsekvent profilering endast för NAC, minska variationen och risken för artefakter som uppstår införandet av omgivande vävnad.

När amplifiering begränsande mängder RNA, såsom i dissekering av små hjärnkärnor, många amplifieringscykler är nödvändiga för korrekt detektering av signalen. Därför är en avgörande punkt i någon kvantitativ PCR experiment, förstärks ytterligare när man arbetar med små mängder utgångsmaterial, är karakterisering av primers som används för förstärkning. Figur 3 beskriver viktiga funktioner att definiera optimala primers, och figur 4 visar förstärkningskurvorna för primers riktade mot c-Fos och FosB, vilket visar att dessa primerpar förstärka sina mål utskrift med ~ 100% effektivitet i varje cykel. Efter validering primer och etablering av den rätta experimentella paradigm för att möjliggöra tydlig bedömning av transkription från målgrupp tissue, kan utföras omfattande analys på Fluidigm Biomark plattformen, vilket möjliggör upp till 9216 parallella qPCR reaktioner (i 96.96-format, Figur 5). Denna hög genomströmning plattform möjliggör parallell analys av flera experimentella repetitioner, använder samma försöksbetingelser på ett enda chip. Data för fyrdubbla experimentella upprepningar, som behandlar transkription induktion av c-Fos och FosB efter akut kokain erfarenhet, demonstreras i Figur 6.

Figur 1 Experimentell paradigm för dynamisk transkriptionsanalys efter kokainupplevelse. (A) Försöksprotokoll - möss vana vid hantering och injektion i 3 dagar, under övervakning rörelseaktivitet med videospårning i ett ljuddämpande beteende kammaren. Mössär sedan föremål för kokain erfarenhet; en enda exponering = akut kokain erfarenhet; 5 på varandra följande injektioner benämns kronisk exponering. En enda injektion efter ≥16 dagars avhållsamhet från kokain benämns kokain utmaning. Transkriptions dynamik behandlas vid olika experimentella tidpunkter efter kokain erfarenhet (1, 2, 4, 8, 24 tim). (B) Rita av musens spår inom beteendet kammaren efter 3 dagar av saltlösning injektion eller 3 dagar av saltlösning + en enstaka exponering akut kokain. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 Placering av nucleus accumbens i mushjärna. Tjocka vita linjer markera platsen för nedskärningar definierar b oundaries av NAC (A) Coronal sektion;. (B) sagittalsnitt. (Bilder anpassas från Allen Brain Atlas Reference Atlas Bilder:. http: //atlas.brain- map.org/atlas?atlas=1&plate=100960352 ; http: //atlas.brain- map.org/atlas?atlas=2&plate = 100.883.869 ). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Planering qPCR primers. Riktlinjer för planering qPCR primers, med definitioner av specificitet, stabilitet och kompatibilitet. 2fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4 Bedömning av primer effektivitet. (A) Resultat av förstärkningskurvor för Fos och FosB använder Fluidigm IFC matriser. En standardkurva genererades genom att använda sju seriella 3-faldiga spädningar av totalt RNA extraherat från mus-NAc och sonderades för expression av Fos och FosB. (B) Effektiviteten av primerparet för Fos och FosB utvärderades genom plottning cykeln tröskelvärde ( Ct) vid varje spädning mot logaritmen för faldig spädning av provet. Effektiviteten av primrarna beräknas från lutningen av standardkurvan, såsom definieras i texten. De förstärkningskurvor och punkter på utspädningskurvan är färgmatchade.51642 / 51642fig4highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5 Omfattande qPCR profilering tillämpa Fluidigm plattformen. (A) 96.96 Dynamisk Array IFC för Real-Time Kvantitativ PCR. De primers laddas i inloppen placerade på höger sida, och proverna laddas i inloppen placerade i den vänstra sidan av chipet. Denna siffra har ändrats med tillstånd från Fluidigm Real Time PCR-analys User Guide. (B) Heat karta av qPCR resultat, representerande Ct-värden för varje brunn på chipet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6 Exempel på resultat från uttrycks dynamik efter en exponering akut kokain. Kokain-inducerad expression av c-fos-och FosB visas som en funktion av tiden. Medelvärden av fyrdubbla experimentella upprepningar, utförda enligt protokollet definieras här, visas tillsammans med felstaplar porträtterar standardfel av medelvärdet.

Reagens	MW	mM	g / L
NaCl (Sigma-Aldrich, 71.376)	58,44	119	6,95
NaHCOs 3 (Sigma-Aldrich, S6014)	84,01	26	2,18
Glukos (Sigma-Aldrich, G8270)	180,16	10	1,8
KCl (Sigma-Aldrich, P9541) d>	74.55	2,5	0,186
NaH 2 PO 4 (Sigma-Aldrich, S9638)	137,99	1	0,138
MgSO 4 ⋅7H 2 O (Sigma-Aldrich, M1880)	246,5	4	0,99
CaCl 2 (Sigma-Aldrich, C3011)	147	4	0,59

Tabell 1. ACSF lösning.

Mjukvara namn	Tillämpning	web plats
Roche Probefinder	primrar konstruktion	http://qpcr.probefinder.com/organism.jsp
NCBI-primer-blast	primrar konstruktion	http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

ve_content "> Tabell 2 Software lista.

Reagens	Volym / Reaktion (pl)	Volym i 48 Reaktioner + 10% översatsning (il)	Volym för 96 Reaktioner + 10% översatsning (il)
2X TaqMan Förstärkarnivå Master Mix (Applied Biosystems)	2,5	132	264
500 nM (10X) poolade primerblandningen	1	52,8	105,6
Vatten	0,25	13,2	26,4
cDNA	1,25
Total volym	5

Tabell 3. STA reaktionslösningen.

Tillstånd	Håll	10-14 Cykler	Håll
Temperatur	95 ° C	95 ° C	60 ° C	4 ° C
Tid	10 minuter	15 sek	4 min	∞

Tabell 4 Termiska cykel förutsättningar för för-förstärkning.

komponent	Per 5 mikroliter prov (| il)	48 Prover med satsning (pl)	96 Prover med satsning (pl)
Vatten	1,4	84	168
Exonukleas-reaktionsbuffert	0,2	12	24
Exonukleas I vid 20 enheter / pl	0,4	24	48 </ Td>
Total volym	2,0	120	240

Tabell 5 ExoI reaktionslösningen.

</ Tr>

SAMPLE MIX	Komponent Volym per Inlet (pl)	Volym per intag satsning (pl)	Volym för 48.48 Dynamic Array IFC (l) (120 prov)	Volym för 96.96 Dynamic Array IFC (l) (120 prov)
2X SsoFast EvaGreen Supermix med Low ROX (Bio-Rad, PN 172- 5211)	2,5	3	180	360
20X DNA Binding Dye Sample Laddar reagens (Fluidigm, PN 100- 3738) grönt lock	0,25	0,3	18	36
STA och ExoI behandlat prov	2,25	2,7
Totalt	5	6

Tabell 6 Prov Pre-Mix-lösning.

Tabell 7. Assay Mix lösning.

Komponent	Volym per Inlet (pl)	Volym per intag satsning (pl)	Volym för 48.48 Dynamic Array IFC (pl)	Volym för 96.96 Dynamic Array IFC (pl)
2X Assay laddas Reagens	2,5	3	180	360
1X DNA Suspension Buffer (TE låg EDTA)	2	2,4	144	288
50 pm varje blandad körning framåt och bakåt Primers	0,5	0,6
Total volym	5	6

Namn på reagens / Material	Företag	Katalog nr
Virusol	Oriek Medicin	J29D
Isofluran, USP 100%	MINRAD INC	NDC 60307-110-25
RNeasy plus Universal Mini Kit	QIAGENE	73.404
QIAshredder	QIAGENE	79.654
Hög kapacitet cDNA omvänd transkription kit	Invitrogene	AB-4368814
TE-buffert	Invitrogene	1355656

Tabell 8 Förteckning över kemikalier / reagenser.

Namn på utrustning	Företag	Katalog nr
Beteende Chamber (MDF, 50 x 45 cm)	Själv monterad
Inre Perspex låda (30 x 30 cm)	Själv monterad
Kamera och videokamera	Campden Inst	CMD-80051
Media Recorder programvara	Noldus	NDS-NMR3-00M
Iris sax	FST	FST-14.062-09
Vibratome	Campden Inst.	7000SMZ-2
Bioanalyzer	Agilent Technologies	Den Agilent 2100 Bioanalyzer
Termocykler	Bio-Rad	1852048
Inverterade microspun spatel	Bochem Instrument GmbH	3213
Biomark HD Reader	Fluidigm	BMHD-BMKHD
Dynamisk array Chip för 96.96 genuttryck	Fluidigm	BMK-M-96,96

Tabell 9 Utrustning lista.

Discussion

Framgångsrik karakterisering av genuttryck från hjärnvävnad efter beteende paradigm beror på: 1) Noggrann hantering av möss under beteende paradigm; 2) Snabb och exakt dissektion av vävnad av intresse; 3) RNA-safe åtgärder för att säkerställa integriteten av RNA; och 4) Noggrann planering av primers och experimentell layout samt precision och känsla för detaljer som förberedelse för qPCR analys.

Syftet med det förfarande som beskrivs är att karaktärisera dynamiken i transkription händelser som framkallas av en beteende upplevelse; Därför är nödvändig för noggrann uppmärksamhet för att se till att den beteende paradigm upplevs av musen representerar verkligen den erfarenhet avsett forskaren. Till exempel, även i en sådan enkel paradigm som beteende sensibilisering mot kokain, upplevelsen av musen kan påverkas av många felkällor: den tidigare erfarenhet av musen i hemmet-buren innan exexperimentera; metoden för överföring till testrummet; på ljus, ljud och lukt exponeringen i testrummet; erfarenheten av att hantera av försöksledaren, smärta / obehag av IP-injektion; exponering för ett nytt experiment, och erfarenheten efter den specificerade beteende fram till punkten för dödshjälp. Varje en av dessa upplevelser kan i isolering, främja induktion av transkriptionsprogram i olika hjärnregioner av musen. Därför måste man se till att den transkription programmet mäter önskad paradigm, och inte avspeglingar förknippas med paradigm. I fallet av kokain erfarenhet är detta lätt uppnås genom noggrann experimentering och uppmärksamhet på detaljer, såväl som en enkel kontrollexperiment, där alla parametrarna bibehålls konstanta, men vehikel (saltlösning) injiceras till musen snarare än kokain. Enligt vår erfarenhet, koksalt injektion inducerar en transkriptionsprogram mycket begränsad skala i jämförelse medexponering kokain, vilket visar att paradigm möjliggör undersökning av de fenomen av intresse överväldigande.

Yttersta försiktighet bör vidtas för att begränsa utbudet av upplevelser av musen medan den fortfarande är aktiv, vilket kräver lugn och försiktig hantering av mössen. Däremot efter anestesi, är snabb och exakt arbete nödvändigt på grund av risken för snabba förändringar i representationen av RNA (om tidsskalan för minuter) och den inneboende labilitet av RNA, som kan brytas ned snabbt när cellerna störs, potentiellt störa transkriptionsprofilen induceras av erfarenhet. Därför är det viktigt att ta bort hjärnan från skallen snabbt till en kyld miljö (inom 1-2 minuter) och snabbt dissekera NAC i iskalla förhållanden. När hjärnan har kylts, är potentialen för transkriptions förändringar eller RNA degradering minskat avsevärt, men bara när de relevanta delarna placeras i TRIzol reagens och frysta, jags integritet vävnaden och representationen av transkriptionsprofilen garanteras.

I detta sammanhang är det värt att nämna att transkription dynamik omedelbar tidigt genuttryck uppstår på en snabb tidsskala, ofta en topp före den 1 timme efter stimulering. Inom ramen för den experimentella paradigm beskrivits är förhör av transkriptions dynamik begränsad till omfattningen av timmar för att minska variationen mellan proverna. För tider kortare än 1 timme, kan små variationer i timing medföra stora variationer i omfattningen av transkription förändringar som observerats. Därför 1 hr tidpunkt har valts för analys, eftersom denna tidpunkt är experimentellt lättare att utföra med precision, och är mindre känslig för variationen på nivån för ett par minuter skillnad i experimentet.

Traditionellt har en vävnads micropunch använts av många laboratorier för dissektion av vävnadsprover. Detfinns flera skäl att föredra manuell microdissection av vävnaden. Stansen är normalt tillverkad av rostfritt stål och är inte transparent. Därför positionera stansen på ett exakt och konsekvent plats kan vara knepigt. Vidare har stansen inte tillåta någon korrigering som ska göras om det fanns ett fel i den ursprungliga placeringen. Slutligen utvinning av vävnad inifrån stansen kan ibland visa sig vara svårt, och det finns potential för att förlora vävnad eller förädling mellan proverna. Microdissection av vävnaden med användning av en fin skalpell möjliggör försöks mer exakt kontroll och ger säkerhet beträffande renheten av proverna.

Under RNA-extraktion och fram till cDNA-syntes, måste arbetsmiljön, för att hållas fria från källor till RNas föroreningar, och arbetet bör utföras med RNas gratis verktyg, engångsartiklar och reagenser. I detta skede, den minsta förorening kan lätt korrupta surt förvärvade RNA-prov. Att hålla proven i-ce kallt är avgörande för att minimera neural aktivitet som kunde modifiera transkriptions avläsning, samt att minimera enzymatisk aktivitet som kan påverka prov integritet. Ytterligare farmakologiska hämmare tillsätts ibland för att minska neurala retbarhet, men ofta dessa är inte nödvändigt.

Efter omvänd transkription till cDNA, vänder betoningen att säkerställa giltigheten av resultaten från den omfattande profilering av transkript. Det första steget är att se till att lämpliga qPCR primers används, för vilka det är starkt rekommenderat att testa primer effektivitet och specificitet på utspädningskurvorna för en definierad källa till RNA. Optimal PCR-primers ger specifik och effektiv förstärkning av målet. Särskild förstärkning innebär att förstärkningen är endast av målsekvensen, uppenbart som en enda diskret topp i smältkurvanalys, medan effektiv förstärkning innebär att i varje cykel, är mängden målsekvensendupliceras, med en effektivitet som närmar 100%. På grund av den höga genomströmning karaktären hos de mikroflödes qPCR chips, dessa experiment kräver noggrann planering för att säkerställa införandet av ett stort antal positiva och negativa kontroller. Det är bättre att vara enhetliga kontroller i varje chip sikt möjliggör direkt jämförelse av resultaten från kontroll och experimentella förhållanden. Under installationen av experimentet, är det viktigt att inte korsa-förorena brunnar. Eftersom liten mängd primer på fel väl kan leda till förstärkning av den oönskade målet bör vara extra noga vid pipettering primers.

För de flesta vävnadsprover från hjärnan är det svårt att vara säker på att under dissektion endast vävnaden av intresse extraherades, med ingen förorening av irrelevanta områden i hjärnan, vilket kan förvirra analysen av resultaten. För detta ändamål är en viktig kontroll sondering för gener vars uttryck förväntas undantas frånvävnaden av intresse. Ett användbart verktyg för att identifiera rumsliga mönster av genuttryck är Allen Brain Atlas ( http://www.brain-map.org/ ).

Medan en ingående diskussion av dataanalys är utanför ramen för denna publikation, bör det noteras att noggranna experiment optioner noggrann analys. Det är viktigt att se till att ett antal relevanta referensgener ingår i varje omgång av qPCR. Dessa gener kommer att tjäna för normalisering för att se till att liknande mängder RNA som analyseras. Normalisering utförs först med referensgener i provet, och sedan till de referensmöss för experimentet ("time 0"), med tillämpning av "ΔΔCt metoden".

Protokollet beskrivs i detta manuskript är att studera transkription dynamik efter kokain erfarenhet nucleus accumbens av möss. Emellertid är det mycket lätt ADAPTEd för att studera någon annan erfarenhet av musen, så länge lämpliga kontroller genomförs, och tidpunkten för upplevelsen är väl definierad. Självklart kan detta protokoll också genomföras för att studera dynamiken i transkription i vävnader utanför nervsystemet också.

Det bör understrykas att omfattande transkriptionsprofilering med hjälp av mikroflödesbaserade qPCR är en kostnadseffektiv metod för profilering transkriptions händelser, men är beroende av tidigare kunskap om målgrupp gener av intresse. Dessa är normalt erhålls genom objektiva profileringsmetoder, såsom mikroarrayer och djup sekvensering. Därför, i arbetsflödet för ett stort projekt, kan omfattande qPCR profilering tillgodose merparten av uppgifterna, men företrädesvis bör följa en tidigare objektiv karakterisering av systemet.

Det är också värt att nämna att den process som beskrivs här för att erhålla vävnadsprover också skulle kunna genomföras till studiering en mängd andra cellulära händelser - proteomik och proteinmodifieringar, metabolomik, Lipidomics och epigenetiska märken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Virusol	Oriek Medical	J29D
Isoflurane, USP 100%	MINRAD INC	NDC 60307-110-25
RNeasy plus Universal Mini Kit	QIAGEN	73404
QIAshredder	QIAGEN	79654
High Capacity cDNA Reverse Transcription kit	Invitrogen	AB-4368814
TE Buffer	Invitrogen	1355656
Behavior Chamber (MDF; 50 x 45 cm)			Self assembled
Inner Perspex box (30 x 30 cm)			Self assembled
Camera and video recorder	Campden Inst.	CMD-80051
Media Recorder software	Noldus	NDS-NMR3-00M
Iris Scissors	FST	FST-14062-09
Vibratome	Campden Inst.	7000SMZ-2
Bioanalyzer	Agilent Technologies	The Agilent 2100 Bioanalyzer
Thermal cycler	Bio-Rad	1852048
Inverted microspoon spatula	Bochem Instrument GmbH	3213
Biomark HD Reader	Fluidigm	BMHD-BMKHD
Dynamic array Chip for 96.96 gene expression	Fluidigm	BMK-M-96.96