Summary
Nye generationer af funktionelle assays, såsom gamma-interferon (IFN-γ) ELISpot, som opdager cytokinproduktion på enkelt celle niveau og giver både kvantitativ og kvalitativ karakterisering af T-cellereaktioner kan anvendes til at vurdere cellemedierede immunreaktioner rettet mod varicella zoster virus (VZV).
Abstract
Varicella zoster virus (VZV) er en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed efter navlestrengsblod transplantation (UCBT). Af denne grund er antiherpetic profylakse administreres systematisk til pædiatriske UCBT modtagerne til at forebygge komplikationer forbundet med VZV infektion, men der er ingen stærk, evidensbaseret konsensus, der definerer sin optimale varighed. Fordi T-celle medieret immunitet er ansvarlig for kontrollen af VZV infektion, vurderer rekonstituering af VZV-specifikke T-celle responser efter UCBT kunne give oplysninger om, hvorvidt profylakse bør opretholdes eller kan ophøre. Til dette formål blev en VZV specifikt gamma interferon (IFN-γ) enzym-linked immunospot (ELISpot) assay udviklet til at karakterisere IFN-γ-produktion af T-lymfocytter som respons på in vitro-stimulering med bestrålede levende svækket VZV-vaccine. Denne analyse giver en hurtig, reproducerbar og følsom måling af VZV specifik cell medieret immunitet er egnet til overvågning af rekonstituering af VZV specifik immunitet i en klinisk indstilling og vurdere immunforsvar til VZV-antigener.
Introduction
Uropført i 1989 UCBT stigende grad anvendes som en del af behandlingen af forskellige neoplastiske og nonneoplastic blodsygdomme i børn 1. VZV er en cytopatisk humant alphaherpesvirus som forårsager to forskellige sygdomme, skoldkopper (efter primær infektion) og herpes zoster (efter reaktivering). Efter primær infektion, VZV fortsætter gennem hele livet af værten i læ inden sensoriske nerver af dorsalrodsganglier. En af de mest truende infektiøse komplikationer efter UCBT er forbundet med VZV 2-4. I vores kliniske center i mangel af VZV profylakse den kumulative incidens af VZV sygdom VZV sygdom efter 3 år postUCBT var 46% 2. Hos disse patienter er de novo infektion med eller reaktivering af VZV ofte forbundet med visceral formidling til det centrale nervesystem, lunger og lever 5-7. Som et resultat, acyclovir, valacyclovir eller famciclovir profylakse almindeligvis administreres til UBCT modtagere 8,9. Men denne behandlingsstrategi ikke hensyn til den beskyttende potentiale af VZV-specifikke T-lymfocytter eller kinetikken af rekonstituering af VZV-specifikke T-celle-responser. Potentielle problemer i forbindelse med den stigende anvendelse af langsigtede antiherpetic profylakse omfatter a) patient overbehandling; b) udvikling af antiviral resistens 10,11; og c) forringelse af VZV specifik immun rekonstituering 12,13. Fordi påvisning af funktionelle VZV-specifikke T-lymfocytter korrelerer med tilstedeværelsen af langsigtet beskyttelse fra VZV infektion og forbedret klinisk resultat 4,14,15, overvågning cellemedieret immunrespons rettet mod VZV under transplantationen periode kan resultere i en mere rationel anvendelse af antiviral behandling ved at give læger til at skelne patienter, der vil have gavn af VZV profylakse fra dem, hvis immunsystem er i stand til at styre VZV replikation 4,13.
IFN-γ ELISpot analysen er almindeligt anvendt til overvågning celle-medierede immunreaktioner i en række forskellige eksperimentelle systemer og kliniske tilstande. Steder genereres efter spaltning af et kromogent substrat, der genererer et synligt og stabilt bundfald på stedet af reaktionen. Hver enkelt plet derved repræsenterer fodaftryk af en individuel cytokin-producerende celle. IFN-γ-ELISpot ikke kun måler evnen af de enkelte celler ex vivo til at producere IFN-γ som respons på in vitro-stimulering med dertil hørende antigen, men det giver også et estimat af frekvensen af reagerer celler i en given cellepopulation 16,17. Ud over sin høje følsomhed, IFN-γ-ELISpot er ligetil at udføre, hvilket gør dets anvendelse mulig i forbindelse med personlige kliniske protokoller formål at vejlede påbegyndelse eller ophør af antiviral behandling. Proceduren beskrevet nedenfor describes et ELISpot-assay, der er specielt designet til at detektere og måle produktionen af IFN-γ af perifert blod mononukleære celler efter in vitro stimulering med VZV afledte antigener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne forskning protokol blev godkendt af Institutional Ethics Review Board of CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, Canada, hvor undersøgelsen blev gennemført. Informeret samtykke blev søgt og fået fra alle undersøgelsens deltagere, deres forældre eller værger. Alle procedurer udføres på dag 1 og 2 skal udføres under sterile forhold (dvs. under en laminar flow hætte). Standard sikkerhedsprocedurer for håndtering af humant blod, bør overholdes nøje.
1.. Coating platter
- Permeabilisere polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner i bunden af 96-brønds MultiScreen IP hvid ELISpot plader ved tilsætning til hver brønd 20 pi af 35% ethanol i 1 min. Membraner bør blive lidt gennemskinnelige.
- Umiddelbart vaskes brøndene 3 gange med 200 pi 1x phosphatpufret saltvand (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2PO 4, pH 7,4) ved hjælp af en multichannel pipette eller lignende enhed. Dette trin er kritisk, da ethanol rester kan påvirke cellernes levedygtighed og binding af capture-antistof. ELISpot pladerne er skrøbelige og skal håndteres forsigtigt: brugen af en automatiseret pladevasker anbefales ikke.
- Overtrække brøndene med 10 pi af renset muse-anti-humant IFN-γ opfangningsantistof fortyndet i 1x PBS til en slutkoncentration på 10 ug / ml. Dæk pladerne med regelmæssig plastfolie og inkuberes natten over ved 4 ° C.
2.. Blokering Plader
- Tøm brøndene, trykke dem tørre, og vaske pladerne 5 gange med 200 pi 1x PBS.
- Fyld brøndene med 200 ul komplet RPMI 1640-medium og inkuberes pladerne i 2 timer ved 37 ° C (blokeringstrin).
- Pladerne skylles 5x med 200 pi 1x PBS og holde brøndene fyldt med 1x PBS, indtil cellerne er klar til at blive belagt.
3.. Celleudpladning og Stimulation
- Forbered peripheral mononukleære blodceller (PBMC) fra venøse blodprøver menneske ved centrifugering på Ficoll-Paque gradienter anvendelse af standardprocedurer. Alternativt ved anvendelse af standardmetoder, optø portioner af PBMC frosset under flydende nitrogen. Efter sidste centrifugering, resuspender cellerne i en slutkoncentration på 2 x 10 6 celler / ml og inkuberes natten over ved 37 ° C under en 5% CO2-atmosfære i en vandkappe inkubator.
- Fjern PBMC fra inkubatoren og resuspender dem i et endeligt volumen på 5 ml komplet RPMI 1640-medium.
- Inkuber PBMC i nærværelse af 10 pi gensplejset endonuklease fra Serratia marcescens i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern en 50 ul aliquot af PBMC og blandes med 50 ul af trypanblåt farvestof. Tæl celler og estimere% levedygtighed ved hjælp af et hæmocytometer og mikroskopisk undersøgelse (farveeksklusionstestning metoden). Forskellige automatiserede metoder til celletælling og vurdering af cellernes levedygtighed dåse alså anvendes. PBMC skal være> 95% levedygtige. Kassér prøve når levedygtighed er lavere end 95%.
- Centrifuge PBMC ved 700 xg i 5 minutter, kasseres supernatanten og resuspender cellerne i AIM-V-medium suppleret med 2% (v / v) inaktiveret human serum (HIS) i en endelig koncentration på 2 x 10 6 celler / ml. Opbevar ved 37 ° C, indtil stimulation blandinger tilsat til pladen.
- Tilføj til brøndene, én dråbe ad gangen, 100 pi af den passende stimulation blanding. Tre stimulation blandinger bør anvendes som beskrevet nedenfor:
- Brug AIM-V-medium suppleret med 2% (v / v) inaktiveret human serum (IHS) som negativ kontrol.
- Brug anti-CD3-monoklonalt antistof (klon OKT3) fortyndet i AIM-V-medium suppleret med 2% (v / v) IHS til en slutkoncentration på 0,5 ug / ml som positiv kontrol).
- Brug VZV-antigen, i form af enten γ-bestrålede (10.000 Gy; 30 min eksponeringstid) levende svækket VZV-vaccine (1350 plakdannende enheder [PFU] / ml) fortyndingted 1:200 i AIM-V-medium suppleret med 2% (v / v) IHS) eller 1 ug af en ækvimolær blanding af 67 peptider (15 aminosyrerester) syntetiseret baseret på sekvensen af VZV umiddelbart tidligt (IE63) phosphoprotein . Styre bestråling effekt ved at overvåge fravær af synlige tegn på cytopatiske virkninger efter 4 dage i PBMC kulturer.
- Forberede alle brønde i to eksemplarer.
- Tilføj til brøndene, én dråbe ad gangen, 100 ul celler fremstillet i trin 5.4 til de relevante brønde. To brønde bør overlades uden celler (negativ kontrol). Der inkuberes i 20 timer ved 37 ° C under en 5% CO2-atmosfære i en vandkappe inkubator. Må ikke rystes, flytte eller stak plader oven på hinanden under inkubation.
4.. Spot Udvikling og Detection
- Kassér cellerne og vaskes pladerne 10x med 1x PBS suppleret med 0,05% (v / v) Tween 20 (PBST). Tween 20 hjælper løsne celler, der har tilsluttet sig PVDF migmbrane efter inkubering natten over.
- Hjælp af en multikanalpipette, tilsættes 100 pi 0,5 mg / ml biotin-konjugeret anti-IFN-γ-monoklonalt antistof (4S.B3 klon) fortyndet i 1x PBS indeholdende 0,5% (w / v) bovint serumalbumin (BSA). Pladerne inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur.
- Brøndene vaskes 6x med PBST, og der tilsættes hver brønd 100 pi streptavidin conjugatd med alkalisk phosphatase fortyndet 1:1.000 i 1x PBS indeholdende 0,5% (w / v) BSA. Dække pladerne og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
- Pladerne skylles 3x med PBST og 3x med 1x PBS. Tilsæt 100 pi af en 5-brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (BCIP) / nitro blue tetrazolium-chlorid (NBT)-substrat-opløsning, og der inkuberes 5 minutter ved stuetemperatur.
- Pladerne skylles under rindende destilleret vand. Fjern den nederste del af ELISpot pladen og vaske begge sider af membranen med destilleret vand. Lufttørre pladerne.
- Undersøg brøndene og opregne de pletter ved hjælp af et stereoskopisk dissection mikroskop eller scanne pladerne ved hjælp af en automatiseret stedet counter. Hold pladerne væk fra lys, hvis de ikke kan blive undersøgt på samme dag.
- Gennemsnittet af antallet af pletter tælles i tilsvarende dobbelte brønde og trække antallet af pletter tælles i den negative kontrol brøndene (ingen celler) fra antallet af pletter tælles i testbrøndene.
- Udtrykke IFN-γ produktion som antallet af pletdannende enheder (SFU) pr 10 6 PBMC.
- Overvej, at prøverne er positive, hvis antallet af SFU er> 50 per 10 6 PBMC og 2 standardafvigelser (SD) over den negative kontrol (celler + AIM-V-medium suppleret med 2% (v / v) IHS).
- Brug en værdi på 400 SFU per godt, når pletter er for talrige til at blive talt.
- Test om ELISpot data er normalfordelte eller ikke bruger Kolmogorov-Smirnov test. Når data er normalfordelte, udføre statistiske sammenligninger hjælp Students t TESt (2 grupper) eller ANOVA og Bonferroni post-test (multiple sammenligninger). Hvis data ikke er normalt fordelt, skal du bruge Mann-Whitney U-test (2 grupper) eller Kruskal-Wallis test og Dunns post-test (multiple sammenligninger).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
IFN-γ-ELISpot-protokollen beskrevet ovenfor blev udviklet og optimeret i vores laboratorium til måling af størrelsen og kvaliteten af cellemedierede immunreaktioner rettet mod VZV 4. Forskellige kilder til VZV-antigen kan anvendes til stimulering trin. Disse omfatter: a) kommercielt tilgængelig vaskemiddel inaktiverede uddrag fra VZV inficerede Vero-celler 18; b) puljer af overlappende syntetiske peptider fra bestemte VZV kodede proteiner, herunder IE63 15 og ORF4 19; c) levende svækket varicella zoster-vaccine 20; og d) UV-inaktiverede præparater af VZV-antigener fra supernatanten fra forstyrret VZV inficerede MRC celler 14. I vores tilfælde blev fortyndinger af levende svækket VZV vaccine foretrækkes frem cellekultur afledt VZV for at sikre ensartethed i antigen kilde og forberedelse og for at begrænse kultur og manipulation af levende vildtype VZV stammer i et klinisk miljø, hvor nosokomiel transmission er en alvorlig bekymring 10. Desuden blev γ bestråling foretrækkes frem UV inaktivering 21 på grund af den sammenlignende præcision, hvormed doser af γ-stråling kan leveres, og fordi, i modsætning til UV, γ-stråler effektivt trænge forseglede VZV indeholder hætteglas. Bestråling af virusstamopløsninger førte til konsekvent højere skøn over frekvensen af VZV specifikke IFN-γ-producerende celler i PBMC prøver fra en sund donor i alle fortyndinger af VZV-antigen testes (figur 1). Dette er muligvis et resultat af afbødning af cytopatiske effekt induceret af levende svækket VZV i cellekultur.
At afgøre, hvilken fortynding VZV-antigen gav maksimal udlæsninger i form af antallet af SFU pr 10 6 PBMC blev IFN-γ ELISpot udført ved hjælp af to-folds fortyndinger af γ bestrålet levende svækket VZV vaccine og PBMC prøver fra en gruppe af immunkompetente børn i alderen mellem 9 måneder og 12 Iars, der havde en dokumenteret historie af skoldkopper og / eller en positiv serologi for VZV (n = 50). . Undersøgelse forsøgspersoner blev indskrevet på Infektionsmedicinsk Clinic og Special Immunologi Clinic of CHU Sainte-Justine mellem juni 2007 og September 2009 blev observeret statistisk signifikante forskelle mellem median frekvenser af IFN-γ producerende celler, der blev opnået ved hjælp af 1:200, 1: 400 og 1:800 fortyndinger af VZV-antigen (p <0,0001, Kruskal-Wallis-test) (figur 2). Disse forskelle blev bogført ved forskellen mellem 1:200 fortynding (median = 115.0 SFU pr 10 6 PBMC; Kvartilafstand [IQR] = 75,0 til 232,5 SFU pr 10 6 PBMC) og 1:800 fortynding (median = 50,0 SFU per 10 6 PBMC, IQR = 20,0 til 105,0 SFU pr 10 6 PBMC) og mellem 1:400 fortynding (median = 92,5 SFU pr 10 6 PBMC, IQR = 52,5 til 177,5 SFU pr 10 6 PBMC) og 1:800 fortynding (p <0,001 og p (figur 2). Af denne grund, 1:200 fortynding af γ bestrålet levende svækket VZV-vaccine blev udvalgt til anvendelse i rutinemæssige målinger af VZV specifik cellemedierede immunresponser.
At afgøre, om IFN-γ produktion ligger i CD4 + og / eller CD8 + T-lymfocytundergrupper blev PBMC prøver fra en rask donor underkastes udtømning af CD4 + eller CD8 +-celler ved hjælp af anti-CD4 eller anti-CD8 antistof koblet magnetiske perler ifølge producentens anvisninger. Samstemmende med de tidligere publicerede rapporter 22,23, udtømning af CD4 +-celler resulterede i en markant reduktion i hyppigheden af IFN-γ-producerende celler, der blev opnået under anvendelse af 1:100, 1:200 og 1:400 fortyndinger af VZV-antigen, mens udtømning af CD8 +-celler ikke førte til en sådan reduktion og positiv kontrols (stimulering med anti-CD3 monoklonalt antistof) blev ikke påvirket i samme grad (figur 3). Disse resultater tyder på, at størstedelen af celler, der producerer IFN-γ som reaktion på stimulering med VZV antigener er CD4 + T-celler. Alternativt kunne disse resultater stammer fra nedbrydningen af CD4 +-antigenpræsenterende celler (dvs. monocytter, dendritiske celler) fra PBMC pulje, hvilket fører til reducerede niveauer af præsentation af VZV-antigener til Responder CD8 + T-lymfocytter. Brugen af bestrålet VZV er usandsynligt, at have bidraget til skævhed af responset mod CD4 dominans blev så opnået tilsvarende resultater ved andre grupper ved hjælp af forskellige teknikker og antigen-kilder 14,21,22. En lav forstørrelse mikrograf af repræsentative ELISpot brønde er vist i figur 4.
| Problem / spørgsmål | Mulige årsager | Remedy / løsning </ Td> |
| Høj baggrund / dårligt definerede eller sammenflydende pletter | Høje antal af døde celler. | Vurdere celleviabilitet før kultur opsætning og stimulering. |
| Utilstrækkelig membran pre-befugtnings trin. | Sørg for at overholde pre-befugtning tid, og at membranen tur til grå efter 1 min. 35% ethanol skal tilberedes umiddelbart før brug. | |
| Pladerne bevæges under inkubationsperioden. | Flyt ikke plader for at undgå dårligt definerede snegl trail pletter. | |
| Vask trin. | Manuel vask er mere effektiv end pladevaskere. | |
| Dannelse af protein-aggregater. | Filtrere både opsamling og detektion af antistoffer til at reducere baggrunden og falske positive pletter. | |
| Sekundær og afsløring koncentration antistof. | Juster biotinyleret sedær / detektionsantistof koncentration for at reducere baggrunden. | |
| Kolde udviklingslande reagenser. | Bring substrat til stuetemperatur for at undgå underudvikling. | |
| Ingen pletter / Blank brønde | Dårligt defineret pletter. | Undgå at stable plader i løbet af inkubationstiden for at have en ensartet temperatur i de forskellige brønde. |
| Stimulation substrat ikke godt forberedt. | Bring peptidblanding alikvot til stuetemperatur i 15 minutter for at undgå krystaldannelse. | |
| Cell sammenklumpning. | Resuspendér celler i encellede suspension for at undgå en undervurdering af pletdannende enheder. | |
| Cellerne ikke stimuleret korrekt. | Brug en polyklonal aktivator som en positiv kontrol. | |
| Inhibering af enzymreaktion med Tween-20. | Varh plader med PBS før tilsætning af BCIP / NBT substratopløsning. | |
| Forkerte antistof par. | Sørg for, at opsamling og detektion antistoffer reagerer med forskellige antigene epitoper. |
Tabel 1.. Yderligere fejlfinding.
Fig. 1. Effekt af γ-bestråling af levende inaktiveret VZV-vaccine på frekvensen af IFN-γ-producerende celler som bestemt ved anvendelse af IFN-γ-ELISpot. VZV IFN-γ-ELISpot blev udført som beskrevet i henhold til protokol tekst ved hjælp af PBMC fra en kontrol frivillig og seriefortyndinger af γ bestrålede (10.000 Gy) levende svækket VZV-vaccine som antigen. Dataene repræsenterer middelværdien af dobbeltbestemmelser overvåNTS og fejl repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien. PBMC: perifere blod mononukleære celler; SFU: pletdannende enheder; VZV: varicella zoster virus.
Figur 2.. Kvantificering af VZV specifik cellemedieret immunrespons hos børn med dokumentation for tidligere infektion med VZV. VZV specifik IFN-γ ELISpot blev udført som beskrevet i henhold til protokol tekst ved hjælp af PBMC isoleret fra patienter med en historie af varicella (n = 50) og serielle fortyndinger af γ bestrålede (10.000 Gy) levende svækket VZV-vaccine som antigen. Vandrette linjer repræsenterer medianen, kasser repræsenterer interkvartile område (IQR), og knurhår repræsenterer det interval af værdier. PBMC: perifere blod mononukleære celler; SFU: pletdannende enheder; VZV: varicella zoster virus .
Fig. 3. Effekt af udtømning af CD4 + eller CD8 +-celler på frekvensen af IFN-γ-producerende celler, som målt ved anvendelse af IFN-γ-ELISpot. Udtømning af CD4 + eller CD8 +-celler og VZV IFN-γ-ELISpot blev udført som beskrevet under Protokol tekst ved hjælp af PBMC fra en kontrol frivillig og serielle fortyndinger af γ bestrålet (10.000 Gy) levende svækket VZV vaccine som antigen. Dataene repræsenterer middelværdien af dobbeltbestemmelser målinger og fejl repræsenterer standardafvigelsen af middelværdien. PBMC: perifere blod mononukleære celler; SFU: pletdannende enheder; VZV: varicella zoster virus.
load/51643/51643fig4highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51643/51643fig4.jpg "/>
Figur 4.. Repræsentant ELISpot brønde. VZV IFN-γ-ELISpot blev udført som beskrevet i henhold til protokol tekst ved hjælp af PBMC fra fem kontrol frivillige og seriefortyndinger af γ bestrålede (10.000 Gy) levende svækket VZV-vaccine som antigen. Første række: negative kontroller (AIM-V-medium suppleret med 2% (v / v) IHS); anden række: positive kontroller (anti-CD3-monoklonalt antistof); tredje række: VZV antigen. Numre i de øverste hjørner repræsentere SFU per brønd som målt ved anvendelse af en automatiseret stedet counter. PBMC: perifere blod mononukleære celler; SFU: pletdannende enheder; VZV: varicella zoster-virus; IHS: inaktiveret humant serum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ændringer og fejlfinding: IFN-γ-ELISpot-assays er blevet anvendt til at undersøge cellemedierede immunreaktioner rettet mod en række af mikrobielle patogener, herunder human immundefekt virus type 1 (HIV-1) 24,25, hepatitis C-virus (HCV) 26, 27, og Mycobacterium tuberculosis 28,29, bare for at nævne et par stykker. Her beskrev vi udviklingen af en IFN-γ ELISpot assay til måling af cellulær immunitet mod, med håbet om at definere korrelater til VZV specifik immun rekonstituering med at inddrive pædiatriske UCBT modtagere.
Vigtige karakteristika ved denne analyse er fire gange. For det første er det ikke kræver forudgående in vitro ekspansion af T-celler, hvilket er tidskrævende. For det andet kan det udføres ved hjælp af kryopræserverede PBMC prøver, hvilket er bedst til at minimere inter-variabilitet. Desuden er kryopræservering og parallel behandling godt tilpasset til længderetningennale undersøgelser, som kræver, at prøver skal behandles i partier. For det tredje, for at forhindre celle sammenklumpning optræder under optøning af PBMC, behandling med et ultrarent gensplejset endonuclease fra Serratia marcescens blev anvendt. Cell sammenklumpning ved optøning PBMC forekommer hyppigere ved brug af blodprøver, der er tilbage natten over ved stuetemperatur før forarbejdning. Indarbejdelsen af gensplejsede endonuclease fra Serratia marcescens vides ikke at påvirke celle levedygtighed, udtryk for celleoverflademarkører og respons på stimulation med dertil hørende antigen i form af SFU siden lave niveauer af nuklease anvendes, og varigheden af eksponeringen er kort 22. Fjerde γ bestrålet levende svækket VZV-vaccine blev anvendt til at stimulere PBMC. Det blev foretrukket frem cellekultur afledt VZV for at sikre ensartethed i antigendosis og forberedelse og for at imødekomme behovet for at manipulere levende VZV i et klinisk miljø, hvor patienternes sikkerhed oglaboratorium personale er en stor bekymring. Tilsammen blev de ændringer, der blev indført i den VZV-ELISpot assay til formål at gøre det bedre tilpasset til brug i et klinisk miljø.
Begrænsninger af teknikken betydning med hensyn til eksisterende fremgangsmåder: Enkle, følsomme og reproducerbare metoder er nødvendige for at måle vært cellemedierede immunreaktioner rettet mod mikrobielle antigener i forbindelse med klinisk opfølgning. IFN-γ ELISpot er et robust, reproducerbar og informativ analyse, der kan udføres på venøse blodprøver ved hjælp af relativt lav tech udstyr (centrifuger, inkubatorer, dissektion mikroskop). Imidlertid er det ikke let tillader den samtidige detektering af multiple cytokiner og celleoverflademarkører. Traditionelle in vitro T-celleproliferationsassays, som har klassisk blevet anvendt til tælling af CD4 + og CD8 +-antigen specifiktc T-celle responser er arbejdskrævende, mangler følsomhed og har tendens til at lide under en høj grad af inter-variabilitet 30,31. På den anden side, cytotoksiske T-lymfocyt-assays (CTL) baseret på lysis af autologe mål fyldt med 51Cr og begrænsende fortynding analyse tendens til at afhænge af tidskrævende in vitro ekspansion skridt til at kvantificere antigenspecifikke CD8 + T-celler, der er til stede i en lav forløber frekvenser 32,33. Flowcytometri baserede assays, der måler cytokinsekretion efter antigen stimulation (intracellulær cytokin farvning [ICS]) 34,35 kan også anvendes til at karakterisere antigenspecifikke immunresponser. ICS tillader den samtidige detektion af cytokinproduktion og celleoverfladeekspression af fænotypiske markører i enkeltceller. Følsomheden af ICS sammenligner som i ELISpot, men det kræver et større antal celler 36,37. Metoder, der gør brug af fluorescerende klasse I eller klasse II-peptid-maJOR histokompatibilitetskompleks (pMHC) oligomerer (pMHC tetramere) 38-40 er præcise og muliggøre multiparametric karakterisering af lymfocytundergrupper baseret på ekspression af celleoverflademarkører. Men pMHC tetramerfarvning kræver forudgående kendskab til patienternes human leukocyt antigen (HLA)-type, som kan være besværlige og begrænse patientrekruttering i en given undersøgelse. En anden begrænsning ved denne teknik er, pMHC tetramerfarvning primært muliggør påvisning af T-celler, der udtrykker medium til høj affinitet T-cellereceptorer (TCR) 41. På den anden side kan CD8 + T-celler, der udtrykker lav affinitet TCR'er, der ikke farves af pMHC tetramerer let kan påvises ved hjælp af IFN-γ-ELISpot 41. Desuden kan pMHC tetramerer binde til såkaldte opbrugte CD8 +-T-lymfocytter, der er fremherskende i kroniske virusinfektioner 42,43, hvorved skævvridning af funktionel vurdering af antigenspecifik cellemedierede immunresponser. Finally, pMHC tetramerfarvning og ICS kræver typisk højt uddannet personale, forholdsvis dyre reagenser, avancerede instrumenter og dedikerede anlæg, hvilket gør disse teknikker notorisk vanskeligt at gennemføre i en klinisk opfølgning indstilling.
Fremtidige anvendelser: Dual farve ELISPOT-analyser i stand til samtidigt at detektere produktionen af både IFN-γ og IL-2 44 og dual-og triple-color fluorospot metoder 45 har genereret stor interesse, da de giver en vurdering af polyfunctionality af antigen-specifik T lymfocytter, som er et vigtigt element i en effektiv cellemedierede immunresponser 46.
Kritiske trin i protokollen: Yderligere tekniske spørgsmål skal overvejes nøje. Fordi mange variabler kan påvirke spot kvalitet (dvs. størrelse og tæthed) og følelsesløsis, er afgørende tilslutning til protokollen til at opnå følsomme og reproducerbare resultater. Konsekvent brug af bestemte mærker af monoklonale antistoffer (opsamling og detektion), ELISpot plader med PVDF-membraner, og 35% ethanol til membran behandling før belægningen er af stor betydning. For eksempel kan overbehandling med ethanol påvirke ydeevnen af assayet og spot kvalitet. For at forhindre at få uinformative brønde (dvs.> 300 spots), anbefaler vi at bruge ikke mere end 2 x 10 5 PBMC pr godt. Når man står med lave frekvenser af antigen-specifikke T-celler, kan målefølsomhed forbedres ved prestimulating celler in vitro med dertil hørende antigen eller udvide dem med polyklonale aktivatorer såsom phytohemagglutinin (PHA) for en bestemt periode (typisk 3-7 dage) 38 . Men den endelige optimerede procedure for VZV ELISpot assay præsenteret heri omfatter ikke in vitro-stimulering og / eller ekspansion trin. Antal og kvy af pletter var ens i løbet af en inkubation området 16-21 timer. Beyond 21 timers inkubation pletter var ofte mere diffus og til tider overlappede, hvilket gør deres tælling vanskeligere. Desuden kan flytte pladerne mens cellerne inkubere føre til dårligt definerede snail trail spots, der er også sværere at tælle. Yderligere signaler fejlfinding er tilvejebragt i tabel 1.
Ved anvendelse af en automatiseret stedet counter, følsomhed og punktstørrelse gating indstilles med positiv kontrol (anti-CD3-monoklonalt antistof) og en negativ kontrol (AIM-V-medium suppleret med 2% (v / v) IHS). De vigtige egenskaber til at overveje i løbet spot tælling er størrelse og form (figur 4). Førstnævnte tillader en at skelne mellem T-celle afledt cytokin pletter fra baggrunden pletter, der skal ignoreres. Spot nummer giver et estimat af frekvensen af VZV-specifikke T-celler til stede i en given PBMC prøve, mens spot størrelse afspejler, hvor meget IFN-γ er produceret af hver enkelte celler.
Til vores viden, er dette den eneste IFN-γ-ELISpot metode, der gør brug af γ bestrålet levende svækket VZV-vaccine som antigen 4. Paneler af overlappende syntetiske peptider (15-merer) er også blevet anvendt som antigen, herunder blanding af peptider baseret på aminosyresekvensen af VZV IE63 phosphoprotein. IE63 er meget immunogen 47 og synes at være afgørende for virusinfektivitet og etablering af latens 48. IE63 specifikke T-celler er blevet påvist hos raske VZV seropositive donorer 15, hvilket tyder på, at IE63 er et vigtigt mål for cellemedieret immunitet rettet mod VZV. Imidlertid var reaktive celler fundet at være stort set CD4 + T-celler 15.
VZV IFN-γ-ELISpot-assay blev tidligere anvendt med our gruppe til at vurdere de VZV specifikke T-celle responser i 28 børn, som gennemgik UCBT at behandle neoplastiske eller arvelige blodsygdomme 4. Resultater, der blev opnået i løbet af denne undersøgelse antydede, at både CD4 + og CD8 + T-celle-undergrupper blev impliceret i IFN-γ produktion, og at rekonstituering af naive CD8 +-T-celle-rum førte til mere robust VZV specifik cellemedierede immunresponser i form af IFN-γ-produktion. Vigtigere, at disse resultater viste også, at detektion af mere end 150 SFU pr 10 6 PBMC var i overensstemmelse med T-celle-medieret beskyttelse mod VZV infektion eller reaktivering 4. Men denne tærskelværdien for VZV specifik cellemedieret immunitet i forbindelse med UCBT og efterfølgende immun rekonstituering eller mangel på samme skal valideres i større prospektive multicenter studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at takke undersøgelsens deltagere og deres forældre. Vi vil også gerne takke Dr. Rejean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montreal, Canada) for at få adgang til hans ELISpot læser, Dr. Lubo Alexandrov til statistisk analyse, og Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois og Martine Caty for sagkyndig teknisk assistance. Støttet af tilskud fra le Fonds d'opération pour les projets de recherche Clinique et d'Evalution des teknologier (CHU Sainte-Justine) til HS og PO, ved la Fondation Centre de cancérologie Charles-Bruneau, og ved leukæmi og lymfom Society of Canada. ISF blev støttet af legater fra La Fondation CHU Sainte-Justine og le Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS). AJG var modtageren af stipendier fra Department of Microbiology, Infectiologist & Immunologi, Université de Montréal (Gabriel-Marquis Scholarship) FRQS, og den canadiske Institutes of Health Research (CIHR). NM blev støttet af la Fondation CHU Sainte-Justine, Cole Foundation, og FRQS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leucocep tube | VWR | 89048-936/89048-932 | 12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood. |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Protect from light. |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70746-3 | Keep at -20 °C. |
| MultiScreenHTS-IP Filter Plate | Millipore | MSIPS4W10 | Sterile with pore size of 0.45 µm. |
| Mouse anti-human IFN-γ capture antibody | BD Biosciences | 551221 | NIB42 clone. |
| Pepmix VZV IE63 | JPT Peptide Technologies | PM-VZV-IE63 | Dissolve contents of one vial in 40 μl of DMSO. Use within 6 months. |
| Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody | BD Biosciences | 554550 | 4SB3 clone. |
| Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase | Bio-Rad Life Science | 170-3554 | Dilute for use on the same day. |
| BCIP/NBT | Bio-Rad Life Science | 170-6432 | Protect from light. |
References
- Ballen, K. K., et al. Umbilical cord blood transplantation: the first 25 years and beyond. Blood. 122 (4), 491-498 (2013).
- Vandenbosch, K., et al. Varicella-zoster virus disease is more frequent after cord blood than after bone marrow transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (8), 867-871 (2008).
- Barker, J. N., et al. Serious infections after unrelated donor transplantation in 136 children: impact of stem cell source. Biol. Blood Marrow Transplant. 11 (5), 362-370 (2005).
- Merindol, N., et al. Reconstitution of protective immune responses against cytomegalovirus and varicella zoster virus does not require disease development in pediatric recipients of umbilical cord blood transplantation. J. Immunol. 189 (10), 5016-5028 (2012).
- Feldman, S., et al. Varicella in children with cancer: Seventy-seven cases. Pediatrics. 56 (3), 388-397 (1975).
- Arvin, A. M. Varicella-Zoster virus: pathogenesis, immunity, and clinical management in hematopoietic cell transplant recipients. Biol. Blood Marrow Transplant. 6 (3), 219-230 (2000).
- Wiegering, V., et al. Varicella-zoster virus infections in immunocompromised patients - a single centre 6-years analysis. BMC Pediatr. 11, 31 (2011).
- Boeckh, M., et al. Long-term acyclovir for prevention of varicella zoster virus disease after allogeneic hematopoietic cell transplantation--a randomized double-blind placebo-controlled study. Blood. 107 (5), 1800-1805 (2006).
- Boeckh, M. Prevention of VZV infection in immunosuppressed patients using antiviral agents. Herpes. 13 (3), 60-65 (2006).
- Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: a global perspective. Biol. Blood Marrow Transplant. 15 (10), 1143-1238 (2009).
- Ljungman, P., et al. Long-term acyclovir prophylaxis in bone marrow transplant recipients and lymphocyte proliferation responses to herpes virus antigens in vitro. Bone Marrow Transplant. 1 (2), 185-192 (1986).
- Selby, P. J., et al. The prophylactic role of intravenous and long-term oral acyclovir after allogeneic bone marrow transplantation. Br. J. Cancer. 59 (3), 434-438 (1989).
- Distler, E., et al. Recovery of varicella-zoster virus-specific T cell immunity after T cell-depleted allogeneic transplantation requires symptomatic virus reactivation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (12), 1417-1424 (2008).
- Levin, M. J., et al. Decline in varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity with increasing age and boosting with a high-dose VZV vaccine. J. Infect. Dis. 188 (9), 1336-1344 (2003).
- Jones, L., et al. Phenotypic analysis of human CD4+ T cells specific for immediate-early 63 protein of varicella-zoster virus. Eur. J. Immunol. 37 (12), 3393-3403 (2007).
- Czerkinsky, C., et al. Reverse ELISPOT assay for clonal analysis of cytokine production. I. Enumeration of gamma-interferon-secreting cells. J. Immunol. Methods. 110 (1), 29-36 (1988).
- Hutchings, P. R., et al. The detection and enumeration of cytokine-secreting cells in mice and man and the clinical application of these assays. J. Immunol. Methods. 120 (1), 1-8 (1989).
- De Castro, N., et al. Varicella-zoster virus-specific cell-mediated immune responses in HIV-infected adults. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 27 (10), 1089-1097 (2011).
- Jones, L., et al. Persistent high frequencies of varicella-zoster virus ORF4 protein-specific CD4+ T cells after primary infection. J. Virol. 80 (19), 9772-9778 (2006).
- Malavige, G. N., et al. Viral load, clinical disease severity and cellular immune responses in primary varicella zoster virus infection in Sri Lanka. PLoS One. 3 (11), (2008).
- Sadaoka, K., et al. Measurement of varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity: comparison between VZV skin test and interferon-gamma enzyme-linked immunospot assay. J. Infect. Dis. 198 (9), 1327-1333 (2008).
- Smith, J. G., et al. Development and validation of a gamma interferon ELISPOT assay for quantitation of cellular immune responses to varicella-zoster virus. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8 (5), 871-879 (2001).
- Ouwendijk, W. J., et al. T-cell immunity to human alphaherpesviruses. Curr. Opin. Virol. 3 (4), 452-460 (2013).
- Rowland-Jones, S. L., et al. Cytotoxic T cell responses to multiple conserved HIV epitopes in HIV-resistant prostitutes in Nairobi. J. Clin. Invest. 102 (9), 1758-1765 (1998).
- Alter, G., et al. Human immunodeficiency virus (HIV)-specific effector CD8 T cell activity in patients with primary HIV infection. J. Infect. Dis. 185 (6), 755-765 (2002).
- Lechner, F., et al. Analysis of successful immune responses in persons infected with hepatitis C virus. J. Exp. Med. 191 (9), 1499-1512 (2000).
- Fournillier, A., et al. A heterologous prime/boost vaccination strategy enhances the immunogenicity of therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J. Infect. Dis. 208 (6), 1008-1019 (2013).
- Adetifa, I. M., et al. Interferon-γ ELISPOT as a biomarker of treatment efficacy in latent tuberculosis infection: a clinical trial. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187 (4), 439-445 (2013).
- Lalvani, A., Pareek, M. A 100 year update on diagnosis of tuberculosis infection. Br. Med. Bull. 93, 69-84 (2010).
- Berger, R., et al. A dose-response study of a live attenuated varicella-zoster virus (Oka strain) vaccine administered to adults 55 years of age and older. J. Infect. Dis. 178 Suppl. 1, (1998).
- Trannoy, E., et al. Vaccination of immunocompetent elderly subjects with a live attenuated Oka strain of varicella zoster virus: a randomized, controlled, dose-response trial. Vaccine. 18 (16), 1700-1706 (2000).
- Brunner, K. T., et al. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
- Moretta, A., et al. Quantitative assessment of the pool size and subset distribution of cytolytic T lymphocytes within human resting or alloactivated peripheral blood T cell populations. J. Exp. Med. 158 (2), 571-585 (1983).
- Jung, T., et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 159 (1-2), 197-207 (1993).
- Maecker, H. T., et al. Standardization of cytokine flow cytometry assays. BMC Immunol. 6, 13 (2005).
- Nomura, L., et al. Standardization and optimization of multiparameter intracellular cytokine staining. Cytometry A. 73 (11), 984-991 (2008).
- Letsch, A., Scheibenbogen, C. Quantification and characterization of specific T-cells by antigen-specific cytokine production using ELISPOT assay or intracellular cytokine staining. Methods. 31 (2), 143-149 (2003).
- Merindol, N., et al. Umbilical cord blood T cells respond against the Melan-A/MART-1 tumor antigen and exhibit reduced alloreactivity as compared with adult blood-derived T cells. J. Immunol. 185 (2), 856-866 (2010).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Scriba, T. J., et al. Ultrasensitive detection and phenotyping of CD4+ T cells with optimized HLA class II tetramer staining. J. Immunol. 175 (10), 6334-6343 (2005).
- Stone, J. D., et al. Interaction of streptavidin-based peptide-MHC oligomers (tetramers) with cell-surface TCRs. J. Immunol. 187 (12), 6281-6290 (2011).
- Pantaleo, G., et al. Evidence for rapid disappearance of initially expanded HIV-specific CD8+ T cell clones during primary HIV infection. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94 (18), 9848-9853 (1997).
- Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. Immunol. 12 (6), 492-499 (2011).
- Boulet, S., et al. A dual color ELISPOT method for the simultaneous detection of IL-2 and IFN-gamma HIV-specific immune responses. J. Immunol. Methods. 320 (1-2), 18-29 (2007).
- Ahlborg, N., Axelsson, B. Dual- and triple-color fluorospot. Methods Mol. Biol. 792, 77-85 (2012).
- Precopio, M. L., et al. Immunization with vaccinia virus induces polyfunctional and phenotypically distinctive CD8(+) T cell responses. J. Exp. Med. 204 (6), 405-1416 (2007).
- Sadzot-Delvaux, C., et al. Recognition of the latency-associated immediate early protein IE63 of varicella-zoster virus by human memory T lymphocytes. J. Immunol. 159 (6), 2802-2806 (1997).
- Malavige, G. N., et al. IE63-specific T-cell responses associate with control of subclinical varicella zoster virus reactivation in individuals with malignancies. Br. J. Cancer. 102 (4), 727-730 (2010).
