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Immunology and Infection

गर्भनाल रक्त प्रत्यारोपण के बाद एक IFN-γ का आकलन करने के लिए ELISpot परख छोटी चेचक दाद वायरस विशेष सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा का विकास

Published: July 9, 2014 doi: 10.3791/51643

Summary

ऐसे एकल कोशिका के स्तर पर cytokine उत्पादन का पता लगाने और टी सेल प्रतिक्रिया की दोनों मात्रात्मक और गुणात्मक लक्षण वर्णन प्रदान जो गामा इंटरफेरॉन (IFN-γ) ELISpot, के रूप में कार्यात्मक assays के उपन्यास पीढ़ियों छोटी चेचक दाद के खिलाफ निर्देशित सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है वायरस (VZV).

Abstract

छोटी चेचक दाद वायरस (VZV) गर्भनाल रक्त प्रत्यारोपण (UCBT) निम्नलिखित रुग्णता और मृत्यु दर का एक महत्वपूर्ण कारण है. इस कारण से, antiherpetic प्रोफिलैक्सिस VZV संक्रमण के साथ जुड़े जटिलताओं को रोकने के लिए बाल चिकित्सा UCBT प्राप्तकर्ताओं को व्यवस्थित ढंग से प्रशासित, लेकिन इसके इष्टतम अवधि को परिभाषित करता है कि कोई मजबूत साक्ष्य आधारित आम सहमति नहीं है. टी सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा UCBT प्रोफिलैक्सिस बनाए रखा जाना चाहिए या बंद किया जा सकता है के रूप में संकेत प्रदान कर सके निम्नलिखित VZV विशेष टी सेल प्रतिक्रिया के पुनर्गठन का आकलन करने, VZV संक्रमण के नियंत्रण के लिए जिम्मेदार है. इस प्रयोजन के लिए एक VZV विशिष्ट गामा इंटरफेरॉन (IFN-γ) एंजाइम से जुड़ी immunospot (ELISpot) परख विकिरणित रहते तनु VZV वैक्सीन के साथ इन विट्रो उत्तेजना के जवाब में टी lymphocytes द्वारा IFN-γ उत्पादन चिह्नित करने के लिए विकसित किया गया था. यह परख VZV विशिष्ट सी की एक तेजी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और संवेदनशील माप प्रदान करता हैपक्ष एक नैदानिक ​​सेटिंग में VZV विशिष्ट उन्मुक्ति के पुनर्गठन की निगरानी और VZV एंटीजन को प्रतिरक्षा जवाबदेही का आकलन करने के लिए उपयुक्त उन्मुक्ति मध्यस्थता.

Introduction

पहली बार 1989 में प्रदर्शन किया, UCBT तेजी बच्चे 1 में विभिन्न neoplastic और nonneoplastic रक्त विकारों के इलाज के भाग के रूप में प्रयोग किया जाता है. VZV दो विभिन्न रोगों, छोटी चेचक (प्राथमिक संक्रमण के बाद) और दाद दाद (पुनर्सक्रियन के बाद) का कारण बनता है, जो एक कोशिकाविकृति संबंधी मानव alphaherpesvirus है. प्राथमिक संक्रमण के बाद, VZV पृष्ठीय रूट ganglia का संवेदी तंत्रिकाओं के भीतर आश्रय मेजबान के जीवन भर बनी रहती है. UCBT निम्नलिखित सबसे धमकी संक्रामक जटिलताओं का एक VZV 2-4 के साथ जुड़ा हुआ है. हमारे नैदानिक ​​केन्द्र में, VZV प्रोफिलैक्सिस के अभाव में, 3 साल में VZV रोग VZV रोग का संचयी घटना postUCBT 46% 2 था. इन रोगियों में, डी नोवो साथ संक्रमण या VZV के पुनर्सक्रियन अक्सर केंद्रीय तंत्रिका तंत्र, फेफड़ों और जिगर 5-7 करने के लिए आंत का प्रसार के साथ जुड़ा हुआ है. परिणामस्वरूप, acyclovir, valacyclovir या फैम्सिक्लोविर प्रोफिलैक्सिस सामान्यतः यूबी को administrated है के रूप मेंसीटी प्राप्तकर्ताओं 8,9. हालांकि, इस इलाज की रणनीति को ध्यान में VZV विशेष टी लिम्फोसाइट या VZV विशेष टी सेल प्रतिक्रिया के पुनर्गठन के कैनेटीक्स की रक्षात्मक क्षमता नहीं ले करता है. लंबी अवधि के antiherpetic प्रोफिलैक्सिस के विस्तार के उपयोग के साथ जुड़े संभावित समस्याओं क) रोगी overtreatment शामिल हैं; ख) एंटीवायरल दवा प्रतिरोध 10,11 के विकास; और ग) VZV विशिष्ट प्रतिरक्षा पुनर्गठन 12,13 की परेशानी होती है. कार्यात्मक VZV विशेष टी लिम्फोसाइट का पता लगाने posttransplant अवधि के दौरान VZV के खिलाफ निर्देशित सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की निगरानी, ​​VZV संक्रमण से लंबी अवधि के संरक्षण की उपस्थिति और बेहतर नैदानिक ​​परिणाम 4,14,15 के साथ संबद्ध क्योंकि एंटीवायरल की एक अधिक तर्कसंगत उपयोग में परिणाम हो सकता है VZV से लाभ होगा, जो रोगियों को अलग करने के लिए चिकित्सा चिकित्सकों को सक्षम करने से उपचार जिनकी प्रतिरक्षा प्रणाली VZV प्रतिकृति 4,13 नियंत्रित करने में सक्षम है उन से प्रोफिलैक्सिस.

IFN-γ ELISpot परख व्यापक रूप से प्रायोगिक प्रणाली और नैदानिक ​​स्थितियों की एक किस्म में निगरानी सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए प्रयोग किया जाता है. स्पॉट प्रतिक्रिया के स्थल पर एक दृश्य और स्थिर वेग पैदा करने, एक वर्णजनीय सब्सट्रेट की दरार निम्नलिखित उत्पन्न कर रहे हैं. प्रत्येक व्यक्ति मौके जिससे एक व्यक्ति साइटोकाइन उत्पादक सेल के पदचिह्न का प्रतिनिधित्व करता है. IFN-γ ELISpot आत्मीय प्रतिजन के साथ इन विट्रो उत्तेजना के जवाब में IFN-γ निर्माण करने के लिए व्यक्ति की कोशिकाओं पूर्व vivo की क्षमता का आकलन न केवल, लेकिन यह भी एक दिया सेल आबादी 16,17 में कोशिकाओं जवाब की आवृत्ति के एक अनुमान प्रदान करता है. इसकी उच्च संवेदनशीलता के अलावा, IFN-γ ELISpot एंटीवायरल उपचार की दीक्षा या समाप्ति का मार्गदर्शन करने के उद्देश्य से व्यक्तिगत नैदानिक ​​प्रोटोकॉल के संदर्भ में संभव इसके इस्तेमाल कर रही है, प्रदर्शन करने के लिए सरल है. प्रक्रिया describ नीचे विस्तृततों विशेष रूप से VZV व्युत्पन्न एंटीजन के साथ इन विट्रो उत्तेजना के बाद परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं द्वारा IFN-γ के उत्पादन का पता लगाने और मापने के लिए डिज़ाइन किया गया है कि एक ELISpot परख.

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Protocol

इस शोध प्रोटोकॉल अध्ययन आयोजित किया गया जहां चू सैंटे जस्टिन, मॉन्ट्रियल, क्यूबेक, कनाडा, के संस्थागत आचार समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था. सूचित सहमति की मांग की और सभी अध्ययन प्रतिभागियों, उनके माता - पिता या कानूनी अभिभावक से प्राप्त हुई थी. सभी प्रक्रियाओं दिन 1 पर प्रदर्शन किया और 2 (एक लामिना का प्रवाह हुड के नीचे यानी) बाँझ शर्तों के तहत बाहर किया जाना चाहिए. मानव रक्त से निपटने के लिए मानक सुरक्षा प्रक्रियाओं का कड़ाई से मनाया जाना चाहिए.

1. प्लेट्स कोटिंग

  1. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 1 मिनट के लिए 35% इथेनॉल के 20 μl जोड़कर 96 multiscreen आईपी सफेद ELISpot प्लेटों के तल पर polyvinylidene difluoride (PVDF) झिल्ली permeabilize. झिल्ली थोड़ा पारदर्शी बन जाना चाहिए.
  2. एक एमयूएल उपयोग कर, तुरंत 1x फॉस्फेट बफर खारा के 200 μl (137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 10 मिमी ना 2 4 HPO, 2 मिमी के.एच. 2 पीओ 4, 7.4 पीएच पीबीएस) के साथ कुओं 3 बार धोनेपिपेट या इसी तरह के उपकरण tichannel. यह कदम इथेनॉल अवशेषों सेल व्यवहार्यता को प्रभावित और कब्जा एंटीबॉडी के बंधन सकता है कि दिए गए महत्वपूर्ण है. ELISpot प्लेटें कमजोर कर रहे हैं और ध्यान से संभाला जाना चाहिए: एक स्वचालित प्लेट वॉशर के उपयोग की सिफारिश नहीं है.
  3. कोट 10 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता 1x पीबीएस में पतला शुद्ध माउस विरोधी मानव IFN-γ कब्जा एंटीबॉडी के 10 μl के साथ कुओं. नियमित रूप से प्लास्टिक की चादर के साथ प्लेटें कवर और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते

2. प्लेट्स ब्लॉकिंग

  1. उन्हें सूखी दोहन, कुओं खाली है, और 1x पीबीएस के 200 μl के साथ प्लेटें 5 बार धोने.
  2. पूरा RPMI 1640 मध्यम के 200 μl के साथ कुओं भरें और (कदम अवरुद्ध) 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए प्लेटें सेते हैं.
  3. प्लेटों 1x पीबीएस के 200 μl के साथ 5x और कोशिकाओं चढ़ाया होने के लिए तैयार हैं जब तक पूरा 1x पीबीएस के कुओं रखने धो लें.

3. सेल चढ़ाना और उत्तेजना

  1. पी की तैयारीमानक प्रक्रियाओं का उपयोग Ficoll-Paque ढ़ाल पर centrifugation द्वारा मानव शिरापरक रक्त के नमूनों से eripheral रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMC). वैकल्पिक रूप से, मानक तरीकों का उपयोग कर, तरल नाइट्रोजन के तहत जमे हुए PBMC की aliquots पिघलना. पिछले centrifugation, resuspend मिलीलीटर 2 x 10 6 कोशिकाओं / के अंतिम एकाग्रता में कोशिकाओं और एक पानी जैकेट इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2 के वातावरण के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते बाद.
  2. इनक्यूबेटर से PBMC निकालें और पूरा RPMI 1640 मध्यम के 5 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में resuspend.
  3. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए Serratia marcescens से अनुवांशिक इंजीनियर endonuclease के 10 μl की उपस्थिति में PBMC सेते हैं.
  4. PBMC की एक 50 μl विभाज्य निकालें और trypan नीले रंग के 50 μl के साथ मिश्रण. कक्षों की गणना और एक रुधिरकोशिकामापी और सूक्ष्म परीक्षण (डाई अपवर्जन विधि) का उपयोग% व्यवहार्यता का अनुमान है. सेल गिनती और सेल व्यवहार्यता कर सकते अल के मूल्यांकन के लिए विभिन्न स्वचालित विधियोंइसलिए इस्तेमाल किया जा. PBMC> 95% व्यवहार्य होना चाहिए. व्यवहार्यता 95% से कम है जब नमूना त्यागें.
  5. 5 मिनट, सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और 2 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में 2% (v / v) निष्क्रिय मानव सीरम (अपने) के साथ पूरक एआईएम-V मध्यम में resuspend कोशिकाओं के लिए 700 XG पर अपकेंद्रित्र PBMC. उत्तेजना मिश्रण थाली में जुड़ जाते हैं, जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें.
  6. , वेल्स के लिए एक समय में एक बूंद, उचित उत्तेजना मिश्रण के 100 μl जोड़ें. नीचे वर्णित के रूप में तीन उत्तेजना मिश्रण इस्तेमाल किया जाना चाहिए:
    1. उपयोग ricochets-V मध्यम 2% (v / v) निष्क्रिय मानव सीरम (आईएचएस) के रूप में नकारात्मक नियंत्रण के साथ पूरक.
    2. 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल के रूप में सकारात्मक नियंत्रण) के अंतिम एकाग्रता के लिए 2% (v / v) आईएचएस के साथ पूरक एआईएम-V मध्यम में पतला विरोधी CD3 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (क्लोन OKT3) का प्रयोग करें.
    3. Γ विकिरणित या तो के रूप में, VZV प्रतिजन का प्रयोग (10,000 Gy, 30 मिनट जोखिम समय) तनु VZV वैक्सीन (1,350 पट्टिका गठन इकाइयों [pfu] / एमएल) रहते Diluएआईएम-V माध्यम में टेड 1:200 2% (v / v) आईएचएस) या तुरंत जल्दी VZV के अनुक्रम (IE63) phosphoprotein पर आधारित संश्लेषित 67 पेप्टाइड्स (15 अमीनो एसिड के अवशेष) की एक equimolar मिश्रण का 1 ग्राम के साथ पूरक . PBMC संस्कृतियों में 4 दिनों के बाद कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव के स्पष्ट संकेत के अभाव की निगरानी के द्वारा विकिरण प्रभावकारिता पर नियंत्रण रखो.
    4. दो प्रतियों में सभी कुओं को तैयार है.
  7. , वेल्स के लिए एक समय में एक बूंद, उचित वेल्स को कदम 5.4 में तैयार की कोशिकाओं के 100 μl जोड़ें. दो कुओं कोशिकाओं (नकारात्मक नियंत्रण) के बिना छोड़ दिया जाना चाहिए. एक पानी जैकेट इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2 के वातावरण के तहत 37 डिग्री सेल्सियस से कम 20 घंटे के लिए सेते हैं. , मिलाने ले जाते हैं, या ऊष्मायन के दौरान एक दूसरे के ऊपर प्लेटें ढेर मत करो.

4. स्पॉट विकास और जांच

  1. कोशिकाओं त्यागें और 1x पीबीएस के साथ प्लेटें 10x धोने 0.05% (v / v) के बीच 20 (PBST) के साथ पूरक. बीच 20 PVDF मुझे का पालन किया है कि कोशिकाओं को अलग करने में मदद करतारातोंरात ऊष्मायन के बाद mbrane.
  2. एक multichannel विंदुक का प्रयोग, 0.5 मिलीग्राम के 100 μl जोड़ने / एमएल बायोटिन संयुग्मित विरोधी IFN-γ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (w / v) गोजातीय सीरम albumin (BSA) 0.5% युक्त 1x पीबीएस में पतला (4S.B3 क्लोन). कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए प्लेटें सेते हैं.
  3. कुओं PBST के साथ 6x धो लें और प्रत्येक अच्छी तरह से (w / v) बीएसए 0.5% से युक्त 1x पीबीएस में 1:1,000 पतला alkaline फॉस्फेट के साथ streptavidin conjugatd के 100 μl जोड़ें. प्लेटें कवर और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
  4. प्लेटों PBST के साथ 3x धो लें और 1x पीबीएस के साथ 3x. 5 ब्रोमो-4-क्लोरो 3 indolyl फॉस्फेट (BCIP) / नाइट्रो नीले tetrazolium क्लोराइड (एनबीटी) सब्सट्रेट समाधान के 100 μl जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट सेते हैं.
  5. आसुत पानी चलाने के अंतर्गत प्लेटें धो लें. ELISpot प्लेट के नीचे अनुभाग निकालें और आसुत जल के साथ झिल्ली के दोनों ओर धो लो. एयर प्लेटें सूखी.
  6. कुओं की जांच करने और एक त्रिविम डी का उपयोग स्पॉट गिननाissection माइक्रोस्कोप या एक स्वचालित मौके काउंटर का उपयोग प्लेटों स्कैन. वे एक ही दिन में जांच नहीं की जा सकती, तो प्रकाश से दूर प्लेटें रखें.
    1. इसी डुप्लिकेट कुओं में गिना स्पॉट की संख्या औसत और परीक्षण कुओं में गिना स्पॉट की संख्या से नकारात्मक नियंत्रण कुओं में गिना स्पॉट की संख्या (कोई कोशिकाओं) घटाना.
    2. 10 6 PBMC प्रति स्थान के गठन इकाइयों की संख्या (SFU) के रूप में IFN-γ उत्पादन व्यक्त करें.
    3. SFU की संख्या नकारात्मक नियंत्रण ऊपर> 50 से 10 प्रति 6 PBMC और 2 मानक विचलन (एसडी) है कि अगर नमूने परीक्षण सकारात्मक विचार कर रहे हैं (कोशिकाओं + उद्देश्य वी मध्यम 2% (v / v) आईएचएस के साथ पूरक).
    4. स्पॉट गिना जा भी कई हैं, जब अच्छी तरह से प्रति 400 SFU का एक मूल्य का प्रयोग करें.
  7. टेस्ट ELISpot डेटा सामान्य रूप से Kolmogorov-स्मिर्नोव परीक्षण का उपयोग कर वितरित रहे हैं या नहीं. डेटा सामान्य रूप से वितरित कर रहे हैं, विद्यार्थी t tes का उपयोग सांख्यिकीय तुलना प्रदर्शनT (2 समूहों) या एनोवा और Bonferroni बाद परीक्षण (कई तुलना). डेटा सामान्य रूप से वितरित नहीं कर रहे हैं, मान व्हिटनी यू परीक्षण (2 समूहों) या Kruskal वालिस परीक्षण और डन के बाद परीक्षण (कई तुलना) का उपयोग करें.

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Representative Results

ऊपर विस्तृत IFN-γ ELISpot प्रोटोकॉल परिमाण और VZV 4 के खिलाफ निर्देशित सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की गुणवत्ता मापने के लिए विकसित किया है और हमारी प्रयोगशाला में अनुकूलित किया गया था. VZV प्रतिजन के विभिन्न स्रोतों उत्तेजना कदम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इनमें शामिल हैं: एक) VZV से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डिटर्जेंट निष्क्रिय अर्क वेरो कोशिकाओं 18 संक्रमित; IE63 15 और ORF4 19 सहित विशिष्ट VZV इनकोडिंग प्रोटीन, से सिंथेटिक पेप्टाइड्स ओवरलैपिंग के ख) पूल; ग) तनु छोटी चेचक दाद टीका 20 जीना; और डी) VZV की यूवी निष्क्रिय तैयारी बाधित VZV की सतह पर तैरनेवाला से एंटीजन एमआरसी 14 कोशिकाओं संक्रमित. सेल संस्कृति प्रतिजन स्रोत और तैयारी में एकरूपता का बीमा करने के लिए और एक नैदानिक ​​सेटिंग जहां nosocomial transmissio में रहते wildtype VZV उपभेदों की संस्कृति और जोड़ - तोड़ को सीमित करने के क्रम में VZV व्युत्पन्न भर में हमारे मामले में, लाइव तनु VZV वैक्सीन की dilutions पसंद किया गयाN एक गंभीर चिंता का विषय है 10 है. इसके अलावा, γ विकिरण की वजह से दिया जा सकता है जो γ विकिरण की खुराक के साथ तुलनात्मक परिशुद्धता की यूवी निष्क्रियता 21 से अधिक पसंद किया गया था और यूवी के विपरीत, γ किरणों कुशलता VZV युक्त सील शीशियों घुसना, क्योंकि. वायरल शेयरों की किरणन परीक्षण किया VZV प्रतिजन (चित्रा 1) के सभी dilutions पर एक स्वस्थ दाता से प्राप्त PBMC नमूनों में VZV विशिष्ट IFN-γ उत्पादन की कोशिकाओं की आवृत्ति के लगातार उच्च अनुमानों के नेतृत्व में. यह संभवतः सेल संस्कृति में रहते तनु VZV से प्रेरित कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव के शमन का परिणाम है.

कमजोर पड़ने VZV प्रतिजन 10 6 PBMC प्रति SFU की संख्या के मामले में अधिक से अधिक readouts सामने आए जो यह निर्धारित करने के लिए, IFN-γ ELISpot रहते तनु VZV टीका विकिरणित γ का दो गुना dilutions उपयोग करते हुए प्रदर्शन और PBMC नमूने वृद्ध असुरक्षित बच्चों के एक समूह से प्राप्त हुई थी 9 महीने और 12 तु के बीचछोटी चेचक और / या एक सकारात्मक VZV के लिए सीरम विज्ञान (एन = 50) के एक दस्तावेज के इतिहास था जो एआरएस. . अध्ययन विषयों जून 2007 और सितंबर 2009 के बीच संक्रामक रोगों क्लिनिक और चू सैंटे जस्टिन की विशेष इम्यूनोलॉजी क्लिनिक में भर्ती थे सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर 1:200, 1 का उपयोग कर प्राप्त किया गया है कि IFN-γ उत्पादन की कोशिकाओं के बीच का आवृत्तियों के बीच मनाया गया: VZV प्रतिजन (पी <0.0001, Kruskal वालिस परीक्षण) (चित्रा 2) के 400 और 1:800 dilutions. इन असमानताओं को 1:200 कमजोर पड़ने के बीच अंतर के लिए जिम्मेदार थे (मंझला = 10 6 PBMC प्रति 115.0 SFU, सीमा अन्तःचतुर्थक [IQR] = 75.0 - 10 6 PBMC प्रति 232,5 SFU) और 1:800 कमजोर पड़ने (मंझला = 50.0 SFU 10 6 PBMC प्रति; IQR = 20.0 - 10 6 PBMC प्रति 105.0 SFU), और 1:400 कमजोर पड़ने (मंझला के बीच = 92.5 10 6 PBMC प्रति SFU; IQR = 52.5 - 10 6 PBMC प्रति 177.5 SFU) और 1:800 कमजोर पड़ने (पी <0.001 और पी (चित्रा 2). इस कारण से, γ के 1:200 कमजोर पड़ने रहते तनु VZV टीका VZV विशेष सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की दिनचर्या माप में उपयोग के लिए चुना गया था विकिरणित.

IFN-γ उत्पादन सीडी 4 + और ​​/ या सीडी 8 + टी लिम्फोसाइट कैंपेन्स में रहता है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए, एक स्वस्थ दाता से प्राप्त PBMC नमूने विरोधी सीडी 4 या विरोधी सीडी 8 एंटीबॉडी युग्मित चुंबकीय मोतियों का उपयोग सीडी 4 + या सीडी 8 + कोशिकाओं की कमी का शिकार हुए निर्माता अनुदेश के अनुसार. पहले प्रकाशित रिपोर्टों 22,23 साथ सामंजस्य में, सीडी 4 + कोशिकाओं की कमी, VZV प्रतिजन के 1:100, 1:200 और 1:400 dilutions उपयोग कर प्राप्त किया गया है कि IFN-γ उत्पादन की कोशिकाओं की आवृत्तियों में एक हड़ताली कमी के परिणामस्वरूप सीडी 8 + कोशिकाओं की कमी इस तरह के एक कमी और सकारात्मक नियंत्रण नहीं हो पाई है, जबकिएस (विरोधी CD3 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ उत्तेजना) इसी (चित्रा 3) प्रभावित नहीं थे. इन परिणामों VZV एंटीजन साथ उत्तेजना के जवाब में IFN-γ उत्पादन कि कोशिकाओं के बहुमत सीडी 4 + टी कोशिकाओं का सुझाव है कि. वैकल्पिक रूप से, इन परिणामों PBMC पूल से (यानी monocytes, वृक्ष के समान कोशिकाओं) सीडी 4 + प्रतिजन कोशिकाओं की कमी से स्टेम सकता है, VZV की प्रस्तुति का स्तर कम करने के लिए अग्रणी सीडी 8 + टी lymphocytes प्रत्युत्तर के लिए एंटीजन. विकिरणित VZV का उपयोग सीडी 4 प्रभुत्व के प्रति प्रतिक्रिया की skewing में योगदान दिया है की संभावना नहीं है, के रूप में इसी तरह के परिणाम विभिन्न तकनीकों और प्रतिजन सूत्रों 14,21,22 का उपयोग अन्य समूहों द्वारा प्राप्त किया गया. प्रतिनिधि ELISpot कुओं की कम बढ़ाई माइक्रोग्राफ चित्रा 4 में प्रस्तुत किया है.

समस्या / मुद्दे संभावित कारण उपाय / समाधान </ P>
उच्च पृष्ठभूमि / खराब परिभाषित या मिला हुआ स्पॉट मृत कोशिकाओं की उच्च संख्या. संस्कृति सेट अप और उत्तेजना से पहले सेल व्यवहार्यता का आकलन करें.
अपर्याप्त झिल्ली पूर्व गीला कदम. 1 मिनट के बाद ग्रे पूर्व गीला समय और है कि झिल्ली बारी का सम्मान करना सुनिश्चित करें. 35% इथेनॉल के उपयोग से पहले तुरंत तैयार किया जाना चाहिए.
प्लेट्स ऊष्मायन अवधि के दौरान चले गए. खराब परिभाषित घोंघा निशान स्पॉट से बचने के लिए प्लेटों कदम नहीं है.
कदम धो लें. मैनुअल धोने थाली वाशर से अधिक कुशल है.
प्रोटीन समुच्चय के गठन. पृष्ठभूमि और झूठी सकारात्मक धब्बे को कम करने के लिए दोनों को पकड़ने और पहचान एंटीबॉडी तक.
माध्यमिक और पहचान प्रतिरक्षी एकाग्रता. Biotinylated एसई समायोजितपृष्ठभूमि को कम करने के लिए condary / पहचान प्रतिरक्षी एकाग्रता.
शीत विकासशील अभिकर्मकों. अल्प विकास से बचने के लिए कमरे के तापमान को सब्सट्रेट लाओ.
कोई स्पॉट / खाली कुओं खराब स्पॉट परिभाषित किया. अलग कुओं में एक सजातीय तापमान है करने के लिए ऊष्मायन अवधि के दौरान प्लेटें ढेर मत करो.
उत्तेजना सब्सट्रेट अच्छी तरह से तैयार नहीं. क्रिस्टल के गठन से बचने के लिए 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान को पेप्टाइड मिश्रण विभाज्य लाओ.
सेल clumping. घटनास्थल के गठन इकाइयों के मूल्यवान समझना बचने के लिए एकल कक्ष निलंबन में कोशिकाओं Resuspend.
कोशिकाओं उचित प्रेरित नहीं. एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक पॉलीक्लोनल उत्प्रेरक का प्रयोग करें.
बीच 20 से एंजाइम की प्रतिक्रिया का निषेध. थाBCIP / एनबीटी सब्सट्रेट समाधान जोड़ने से पहले पीबीएस के साथ घंटे प्लेटें.
गलत एंटीबॉडी जोड़े. पर कब्जा है और पता लगाने के एंटीबॉडी अलग प्रतिजनी epitopes के साथ प्रतिक्रिया सुनिश्चित करें.

तालिका 1. अतिरिक्त समस्या निवारण.

चित्रा 1
के रूप में IFN-γ उत्पादन की कोशिकाओं की आवृत्ति पर रहते निष्क्रिय VZV वैक्सीन की γ विकिरण के चित्रा 1. प्रभाव का उपयोग कर निर्धारित IFN-γ ELISpot. VZV विशिष्ट IFN-γ ELISpot एक नियंत्रण स्वयंसेवक से PBMC का उपयोग प्रोटोकॉल पाठ के तहत वर्णित के रूप में प्रदर्शन किया गया था और (10,000 Gy) विकिरणित γ के धारावाहिक dilutions प्रतिजन के रूप में तनु VZV टीका रहते हैं. डेटा डुप्लिकेट measureme के मतलब का प्रतिनिधित्वएनटीएस और त्रुटि सलाखों के मतलब की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं. PBMC: परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं; SFU: इकाइयों के गठन हाजिर; VZV: छोटी चेचक दाद वायरस.

चित्रा 2
VZV की चित्रा 2. मात्रा विशेष सेल के साथ पिछले संक्रमण के दस्तावेज सबूत के साथ बच्चों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मध्यस्थता VZV. VZV विशिष्ट PBMC छोटी चेचक का एक इतिहास के साथ विषयों से पृथक (एन = 50) का उपयोग प्रोटोकॉल पाठ के तहत वर्णित के रूप में IFN-γ ELISpot प्रदर्शन किया गया था और (10,000 Gy) विकिरणित γ के धारावाहिक dilutions प्रतिजन के रूप में तनु VZV टीका रहते हैं. क्षैतिज लाइनों बक्से अन्तःचतुर्थक श्रेणी (IQR) का प्रतिनिधित्व करते हैं, मंझला प्रतिनिधित्व करते हैं, और मूंछ मानों की श्रेणी का प्रतिनिधित्व करते हैं. PBMC: परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं; SFU: इकाइयों के गठन हाजिर; VZV: छोटी चेचक दाद वायरस .

चित्रा 3
के तहत वर्णित के रूप में चित्रा 3. IFN-γ ELISpot. सीडी 4 + की कमी या सीडी 8 + कोशिकाओं और VZV विशिष्ट IFN-γ ELISpot का उपयोग कर के रूप में मापा IFN-γ उत्पादन की कोशिकाओं की आवृत्ति पर सीडी 4 + या सीडी 8 + कोशिकाओं की कमी का प्रभाव प्रदर्शन किया गया (10,000 Gy) विकिरणित एक नियंत्रण स्वयंसेवक और γ के धारावाहिक dilutions से PBMC का उपयोग प्रोटोकॉल पाठ प्रतिजन के रूप में तनु VZV टीका रहते हैं. डेटा डुप्लिकेट माप और त्रुटि सलाखों के मतलब मतलब की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं प्रतिनिधित्व करते हैं. PBMC: परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं; SFU: इकाइयों के गठन हाजिर; VZV: छोटी चेचक दाद वायरस.

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चित्रा 4. प्रतिनिधि ELISpot कुओं. VZV विशिष्ट IFN-γ (10,000 Gy) प्रतिजन के रूप में तनु VZV वैक्सीन रहते विकिरणित पाँच नियंत्रण स्वयंसेवकों और γ के धारावाहिक dilutions से PBMC का उपयोग प्रोटोकॉल पाठ के तहत वर्णित के रूप में ELISpot प्रदर्शन किया गया था. प्रथम पंक्ति: नकारात्मक नियंत्रण (ए आई एम वी मध्यम 2% (v / v) आईएचएस के साथ पूरक); दूसरी पंक्ति: सकारात्मक नियंत्रण (विरोधी CD3 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी); तीसरी पंक्ति: VZV प्रतिजन. एक स्वचालित मौके काउंटर का उपयोग कर के रूप में मापा ऊपरी कोने में संख्या अच्छी तरह से प्रति SFU का प्रतिनिधित्व करते हैं. PBMC: परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं; SFU: इकाइयों के गठन हाजिर; VZV: छोटी चेचक दाद वायरस; आईएचएस: मानव सीरम निष्क्रिय.

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Discussion

संशोधन और समस्या निवारण: IFN-γ ELISpot assays मानव इम्यूनो वायरस टाइप 1 (एचआईवी -1) 24,25, हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी) 26 सहित माइक्रोबियल रोगज़नक़ों, की एक किस्म के खिलाफ निर्देशित सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, 27, और माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग 28,29, बस कुछ ही नाम के लिए. यहाँ हम बाल चिकित्सा UCBT प्राप्तकर्ताओं उबरने में VZV विशिष्ट प्रतिरक्षा पुनर्गठन की संबद्ध परिभाषित करने की आशा के साथ, के खिलाफ सेलुलर प्रतिरक्षा को मापने के लिए एक IFN-γ ELISpot परख के विकास का वर्णन किया.

इस परख की मुख्य विशेषताओं चार गुना कर रहे हैं. सबसे पहले, यह समय लेने वाली है, जो टी कोशिकाओं की पूर्व में इन विट्रो विस्तार, की आवश्यकता नहीं है. दूसरा, यह interassay परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए जो सबसे अच्छा है cryopreserved PBMC नमूने, का उपयोग किया जा सकता है. इसके अलावा, cryopreservation और समानांतर प्रसंस्करण अच्छी तरह longitudi के लिए अनुकूलित कर रहे हैंनमूने बैचों में संसाधित किया जा आवश्यकता है कि जो एनएएल पढ़ाई,. तीसरा, PBMC, एक ultrapure Serratia marcescens से अनुवांशिक इंजीनियर endonuclease इस्तेमाल किया गया था के साथ इलाज के विगलन के दौरान सामना करना पड़ा सेल रोकने के लिए. प्रक्रिया से पहले कमरे के तापमान पर रातोंरात छोड़ दिया जाता है कि रक्त के नमूनों का उपयोग करते समय विगलन PBMC पर सेल clumping अधिक बार होता है. Serratia marcescens से अनुवांशिक इंजीनियर endonuclease का समावेश उपयोग किया जाता है nuclease के निम्न स्तर के बाद से SFU के मामले में सेल व्यवहार्यता, सेल सतह मार्करों की अभिव्यक्ति और आत्मीय प्रतिजन के साथ उत्तेजना के जवाब को प्रभावित करने के लिए नहीं जाना जाता है और जोखिम की अवधि 22 कम है. चौथा, γ विकिरणित लाइव तनु VZV टीका PBMC को प्रोत्साहित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. यह प्रतिजन खुराक और तैयारी में एकरूपता का बीमा करने के लिए और जहां मरीजों की सुरक्षा और एक नैदानिक ​​सेटिंग में रहते VZV जोड़ तोड़ के लिए की जरूरत पर काबू पाने के क्रम में सेल संस्कृति व्युत्पन्न VZV से अधिक पसंद किया गया थाप्रयोगशाला कर्मियों को एक प्रमुख चिंता का विषय है. साथ में ले ली, VZV-ELISpot परख में पेश किए गए संशोधनों कि यह बेहतर है एक नैदानिक ​​वातावरण में इस्तेमाल के लिए अनुकूलित बनाने के इरादे से की गई.

मौजूदा तरीकों के संबंध में तकनीक महत्व की सीमाएं:, सीधा संवेदनशील और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने के तरीकों नैदानिक ​​फॉलोअप के संदर्भ में माइक्रोबियल प्रतिजनों के खिलाफ निर्देशित मेजबान सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को मापने के लिए आवश्यक हैं. IFN-γ ELISpot अपेक्षाकृत कम तकनीकी उपकरणों (centrifuges, इन्क्यूबेटरों, विच्छेदन माइक्रोस्कोप) का उपयोग शिरापरक रक्त के नमूने पर प्रदर्शन किया जा सकता है कि एक मजबूत, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और जानकारीपूर्ण परख है. हालांकि, यह आसानी से कई साइटोकिन्स और कोशिका की सतह मार्कर के साथ पता लगाने की अनुमति नहीं देता. प्रतिष्ठित सीडी 4 + और ​​सीडी 8 + की गणना प्रतिजन specifi के लिए इस्तेमाल किया गया है जो पारंपरिक इन विट्रो टी सेल प्रसार assays,सी टी सेल प्रतिक्रिया, श्रम गहन संवेदनशीलता की कमी है और interassay परिवर्तनशीलता 30,31 के एक उच्च स्तर से पीड़ित हैं. दूसरी ओर, साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइट assays (सीटीएल) 51 करोड़ और सीमित कमजोर पड़ने विश्लेषण के साथ भरी हुई ऑटोलॉगस लक्ष्य की सेल पर आधारित एक पर मौजूद हैं कि विशिष्ट प्रतिजन सीडी 8 + टी कोशिकाओं यों के लिए इन विट्रो विस्तार चरणों में काफ़ी समय पर निर्भर करते हैं कम अग्रदूत 32,33 आवृत्तियों. प्रतिजनी उत्तेजना (intracellular साइटोकाइन धुंधला [आईसीएस]) 34,35 भी प्रतिजन विशेष प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है निम्नलिखित cytokine स्राव कि उपाय cytometry आधारित assays प्रवाह. आईसीएस cytokine उत्पादन और एकल कक्षों में प्ररूपी मार्करों की कोशिका की सतह अभिव्यक्ति के साथ पता लगाने के लिए परमिट. आईसीएस की संवेदनशीलता ELISpot की है कि तुलना, लेकिन यह कोशिकाओं 36,37 की बड़ी संख्या की आवश्यकता है. फ्लोरोसेंट वर्ग मैं या द्वितीय श्रेणी पेप्टाइड मा का उपयोग कर उस तरीकेjor उतक अनुरूपता जटिल (pMHC) oligomers (pMHC tetramers) 38-40 सटीक रहे हैं और कोशिका की सतह मार्करों की अभिव्यक्ति पर आधारित लिम्फोसाइट कैंपेन्स के multiparametric लक्षण वर्णन सक्षम. हालांकि, pMHC टेट्रामर धुंधला बोझिल हो सकता है और किसी दिए गए अध्ययन में रोगी नामांकन सीमित कर सकते हैं जो मरीजों के मानव ल्युकोसैट प्रतिजन (एचएलए) लिखें के पूर्व ज्ञान की आवश्यकता है. इस तकनीक का एक और सीमा pMHC टेट्रामर धुंधला हो जाना मुख्य रूप से उच्च आत्मीयता टी सेल रिसेप्टर्स (TCR) 41 मध्यम व्यक्त टी कोशिकाओं का पता लगाने की अनुमति देता है. दूसरी ओर, pMHC tetramers से दाग नहीं कर रहे हैं कि कम आत्मीयता TCRs व्यक्त सीडी 8 + टी कोशिकाओं को आसानी से IFN-γ ELISpot 41 का उपयोग कर पाया जा सकता है. इसके अलावा, pMHC tetramers जिससे प्रतिजन विशेष सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के कार्यात्मक मूल्यांकन skewing, क्रोनिक वायरल संक्रमण 42,43 में प्रचलित हैं कि तथाकथित थक सीडी 8 + टी lymphocytes के लिए बाध्य कर सकते हैं. फिनाlly, pMHC टेट्रामर धुंधला और आईसीएस आम तौर पर एक नैदानिक ​​अनुवर्ती कार्रवाई की स्थापना में लागू करने के लिए इन तकनीकों को बेहद मुश्किल बना रही है, उच्च प्रशिक्षित कर्मियों, अपेक्षाकृत महंगा अभिकर्मकों, परिष्कृत उपकरणों, और समर्पित सुविधाओं की आवश्यकता होती है.

भविष्य अनुप्रयोगों: एक साथ IFN-γ और आईएल -2 के 44 और दोहरे और तिहरे रंग fluorospot तरीकों वे प्रतिजन के polyfunctionality के आकलन के विशेष टी की अनुमति के रूप में 45, महत्वपूर्ण रुचि उत्पन्न की है, दोनों के उत्पादन का पता लगाने में सक्षम दोहरी रंग ELISpot assays कुशल सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 46 की एक महत्वपूर्ण विशेषता है जो लिम्फोसाइटों,.

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम: अतिरिक्त तकनीकी मुद्दों पर सावधानी से ध्यान दिया जाना चाहिए. कई चर मौके गुणवत्ता (यानी आकार और घनत्व) और सुन्न प्रभावित हो सकती है क्योंकिएर, प्रोटोकॉल के पालन के प्रति संवेदनशील और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के मार्क्स (कब्जा और पहचान), PVDF झिल्ली के साथ ELISpot प्लेटें, और पूर्व कोटिंग के लिए झिल्ली के इलाज के लिए 35% इथेनॉल के लगातार उपयोग उच्च महत्व का है. उदाहरण के लिए, इथेनॉल के साथ overtreatment परख और मौके गुणवत्ता के प्रदर्शन को प्रभावित कर सकते हैं. Uninformative वेल्स (यानी> 300 स्पॉट) प्राप्त करने से रोकने के लिए, हम अधिक से अधिक 5 10 एक्स 2 से PBMC का उपयोग कर प्रति अच्छी तरह से सलाह देते हैं. प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं की कम आवृत्तियों के साथ सामना किया, परख संवेदनशीलता आत्मीय प्रतिजन के साथ इन विट्रो में prestimulating कोशिकाओं से बढ़ाकर या ऐसे समय का एक निर्धारित अवधि के लिए phytohemagglutinin (पीएचए) के रूप में पॉलीक्लोनल activators (आमतौर पर 3-7 दिन) के साथ उन्हें विस्तार किया जा सकता है 38 . हालांकि, इस के साथ साथ प्रस्तुत VZV ELISpot परख के लिए अंतिम अनुकूलित प्रक्रिया विट्रो prestimulation और / या विस्तार चरणों में शामिल नहीं है. संख्या और गुणवत्तास्पॉट के y 16-21 घंटे की एक ऊष्मायन सीमा पर इसी तरह के थे. ऊष्मायन के 21 घंटे से परे, स्पॉट उनके गणन और अधिक कठिन बना, अक्सर अधिक फैलाना और कभी कभी छा गए थे. इसके अलावा, कोशिकाओं incubating रहे हैं, जबकि प्लेटें आगे बढ़ इसी तरह गणना करने के लिए और अधिक मुश्किल हो जाता है कि खराब परिभाषित घोंघा निशान स्पॉट करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. अतिरिक्त समस्या निवारण cues 1 टेबल में प्रदान की जाती हैं.

एक स्वचालित मौके काउंटर, संवेदनशीलता और स्थान आकार gating का उपयोग करते समय सकारात्मक नियंत्रण (विरोधी CD3 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी) और नकारात्मक नियंत्रण (ए आई एम वी मध्यम 2% (v / v) आईएचएस के साथ पूरक) का उपयोग कर सेट कर रहे हैं. मौके गणना के दौरान विचार करने के लिए महत्वपूर्ण विशेषताओं आकार और आकृति (चित्रा 4) हैं. पूर्व एक अनदेखा किया जाना चाहिए कि पृष्ठभूमि स्पॉट से टी सेल व्युत्पन्न साइटोकाइन स्पॉट भेद करने के लिए अनुमति देता है. स्पॉट नंबर एक दिया पंजाब में उपस्थित VZV विशेष टी कोशिकाओं की आवृत्ति के एक अनुमान प्रदानएम सी नमूना, स्थान आकार प्रत्येक व्यक्ति की कोशिकाओं द्वारा निर्मित है कितना IFN-γ को दर्शाता है.

हमारे ज्ञान करने के लिए, इस प्रतिजन के रूप में 4 VZV टीका तनु लाइव विकिरणित γ का उपयोग करता है कि केवल IFN-γ ELISpot विधि है. अतिव्यापी सिंथेटिक पेप्टाइड्स (15 mers) का पैनल भी VZV IE63 phosphoprotein के अमीनो एसिड अनुक्रम के आधार पर पेप्टाइड्स के मिश्रण सहित प्रतिजन, के रूप में इस्तेमाल किया गया है. IE63 47 अत्यधिक immunogenic है और वायरल संक्रामकता और विलंबता 48 की स्थापना के लिए महत्वपूर्ण हो गया लगता है. IE63 विशेष टी कोशिकाओं IE63 VZV के खिलाफ निर्देशित सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा का एक महत्वपूर्ण लक्ष्य है कि पता चलता है जो स्वस्थ VZV सेरोपॉज़िटिव दाताओं 15, में पाया गया है. हालांकि, प्रतिक्रियाशील कोशिकाओं बड़े पैमाने पर सीडी 4 + टी कोशिकाओं 15 होना पाया गया है.

VZV IFN-γ ELISpot परख पहले से ओ द्वारा इस्तेमाल किया गया थाneoplastic या विरासत में मिला रक्त विकारों 4 के इलाज के लिए UCBT लिया 28 बच्चों में VZV विशेष टी सेल प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए उर समूह. इस अध्ययन के दौरान प्राप्त किया गया है कि परिणाम और अधिक मजबूत VZV विशेष सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में नेतृत्व करने के लिए सीडी 4 + और ​​CD8 + टी सेल सबसेट दोनों IFN-γ उत्पादन और अनुभवहीन सीडी 8 + टी सेल डिब्बे की कि पुनर्गठन में फंसाया गया था कि सुझाव IFN-γ उत्पादन के मामले. महत्वपूर्ण बात है, इन परिणामों को भी 10 6 PBMC प्रति 150 से अधिक SFU का पता लगाने VZV संक्रमण या पुनर्सक्रियन 4 के खिलाफ टी सेल की मध्यस्थता संरक्षण के अनुरूप था कि पता चला है. हालांकि, VZV UCBT के संदर्भ में विशेष सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा और आगामी प्रतिरक्षा पुनर्गठन या कमी के लिए इस सीमा मूल्य उसके बड़े संभावित multicenter अध्ययन में मान्य होना होगा.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

लेखकों अध्ययन में प्रतिभागियों और उनके माता पिता को धन्यवाद देता हूँ. हम भी अपने ELISpot पाठक, सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए डॉ. Lubo Alexandrov के लिए उपयोग के लिए डॉ. Réjean Lapointe (दोस्त Notre-Dame, मॉन्ट्रियल, कनाडा) का शुक्रिया अदा करना, और डेनिस Blais, सैंड्रा Caron, Silvie Valois और तकनीकी विशेषज्ञ के लिए मार्टिन Caty होगा सहायता. Le Fonds डी 'आपरेशन ला Fondation केंद्र डे Cancerologie चार्ल्स-Bruneau द्वारा, एच एस और पीओ को लेस projets डी अति सूक्ष्म Clinique एट डी' évalution des टेक्नोलॉजीज (चू सैंटे जस्टिन) डालना, और की लेकिमिया और लिंफोमा सोसायटी द्वारा अनुदान से समर्थन कनाडा. ISF ला Fondation चू सैंटे जस्टिन और ले Fonds डी ला Recherche डु क्यूबेक-Sante (FRQS) से छात्रवृत्ति के द्वारा समर्थित किया गया. AJG माइक्रोबायोलॉजी, Infectiology और इम्यूनोलॉजी, Université de मॉन्ट्रियल (गेब्रियल-मार्क्विस छात्रवृत्ति), FRQS विभाग से छात्रवृत्ति के प्राप्तकर्ता था, और स्वास्थ्य संस्थान कनाडा आरesearch (CIHR). समुद्री मील दूर ला Fondation चू सैंटे जस्टिन, कोल फाउंडेशन, और FRQS द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leucocep tube VWR 89048-936/89048-932 12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood. 
Ficoll-Paque GE Healthcare 17-1440-02 Protect from light.
Benzonase nuclease Novagen 70746-3 Keep at -20 °C.
MultiScreenHTS-IP Filter Plate Millipore MSIPS4W10 Sterile with pore size of 0.45 µm. 
Mouse anti-human IFN-γ capture antibody BD Biosciences 551221 NIB42 clone. 
Pepmix VZV IE63  JPT Peptide Technologies PM-VZV-IE63 Dissolve contents of one vial in 40 μl of DMSO. Use within 6 months.
Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody BD Biosciences 554550 4SB3 clone.
Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase  Bio-Rad Life Science 170-3554 Dilute for use on the same day.
BCIP/NBT Bio-Rad Life Science 170-6432 Protect from light.

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गर्भनाल रक्त प्रत्यारोपण के बाद एक IFN-γ का आकलन करने के लिए ELISpot परख छोटी चेचक दाद वायरस विशेष सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा का विकास
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Salem Fourati, I., Grenier, A. J.,More

Salem Fourati, I., Grenier, A. J., Jolette, É., Merindol, N., Ovetchkine, P., Soudeyns, H. Development of an IFN-γ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation. J. Vis. Exp. (89), e51643, doi:10.3791/51643 (2014).

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