Immunology and Infection

臍帯血移植後の水痘帯状疱疹ウイルス特異的細胞性免疫を評価するために、IFN-γELISPOTアッセイの開発

Published: July 9, 2014 doi: 10.3791/51643

Insaf Salem Fourati¹, Anne-Julie Grenier¹, Élyse Jolette¹, Natacha Merindol¹, Philippe Ovetchkine^2,3, Hugo Soudeyns^1,3

¹Unité d'Immunopathologie Virale, Centre de Recherche du CHU Sainte-Justine, Department of Microbiology, Infectiology & Immunology, Faculty of Medicine, Université de Montréal, ²Infectious Diseases Service, CHU Sainte-Justine, Faculty of Medicine, Université de Montréal, ³Department of Paediatrics, Université de Montréal

Summary

単一細胞レベルでのサイトカイン産生を検出し、T細胞応答の両方の定量的および定性的特徴づけを提供するようなγインターフェロン（IFN-γ）のELISpotのような機能アッセイの新規世代水痘帯状疱疹に対して向けられた細胞性免疫応答を評価するために使用することができるウイルス（VZV）。

Abstract

水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）は、臍帯血移植（UCBT）以下の罹患率および死亡率の重要な原因である。このため、抗ヘルペス予防は、VZV感染に伴う合併症を防ぐために、小児UCBT受信者に体系的に投与されたが、その最適な期間を定義強い、エビデンスに基づくコンセンサスが存在していません。 T細胞媒介性免疫は、UCBTの予防を維持すべきかまたは中止することができるかどうかの指示を提供することができ、以下のVZV特異的T細胞応答の再構成を評価し、VZV感染の制御に関与するからである。そのためには、VZV特定γインターフェロン（IFN-γ）酵素結合免疫（エリスポット）アッセイは、照射された弱毒生VZVワクチンを用いたin vitro刺激に応答してTリンパ球によるIFN-γ産生を特徴づけるために開発されました。このアッセイは、VZV固有のCの、迅速な再現性かつ高感度な測定を提供エル臨床現場でのVZV特異的免疫の再構成を監視し、VZV抗原に対する免疫応答性を評価するのに適した免疫を媒介した。

Introduction

1989年に初めて行われ、UCBTは、ますます子供¹における種々の新生物および非腫瘍性血液疾患の治療の一部として使用される。 VZVは（再活性化後）2異なる疾患、（一次感染後）水痘や帯状疱疹を引き起こす細胞変性人間アルファヘルペスウイルスである。一次感染後、VZVは後根神経節の感覚神経内守らホストの寿命を通じて持続します。 UCBT次の最も脅かす感染性合併症の一つは、VZV ^2-4に関連している。当社の臨床センターでは、VZV予防がない場合には、VZV病のVZV疾患の累積発生率は3年でpostUCBTは46％であった^。これらの患者において、 デノボでの感染又はVZVの再活性化は、多くの場合、中枢神経系、肺及び肝臓^5-7に内臓の普及に関連している。その結果、アシクロビル、バラシクロビル、またはファムシクロビル予防は、一般的にUBに投与されているCTの受信者^8,9。しかしながら、この治療戦略が考慮VZV特異的Tリンパ球またはVZV特異的T細胞応答の再構成の速度論の保護電位をとらない。長期的な抗ヘルペス予防の拡大使用に伴う潜在的な問題）は、患者過剰治療が含まれ; b）は、抗ウイルス薬剤耐性^10,11の開発、およびC）VZV特異的免疫再構築^12,13の減損。機能のVZV特異的なTリンパ球の検出は、VZV感染と臨床転帰の改善^4,14,15からの長期的な保護の存在と相関するので、移植後の期間の間に、VZVに対して向け細胞性免疫応答を監視するウイルスのより合理的な使用をもたらすかもしれませんVZVの恩恵を受ける患者を区別するために医師を可能にすることによる治療は、免疫システムのVZV複製^4,13を制御することができるものと予防。

IFN-γELISpotアッセイが広く、実験系および種々の臨床症状のモニタリング細胞媒介性免疫応答のために使用される。スポットは、反応部位に表示され、安定した沈殿物を生成し、発色基質の切断後に生成される。個々のスポットは、それによって個々のサイトカイン産生細胞のフットプリントを表しています。 IFN-γELISpotは、同族抗原とin vitroでの刺激に応答してIFN-γを産生する個々の細胞をex vivoでの能力を測定するだけでなく、所与の細胞集団^16,17における細胞応答の頻度の推定値を提供する。その高い感度に加えて、IFN-γELISPOTは、抗ウイルス治療の開始や停止を誘導することを目的とし、個人の臨床プロトコルの文脈で可能なのを利用して、実行するのは簡単である。 describ下に詳述した手順エス具体VZV由来抗原によるインビトロ刺激後の末梢血単核細胞によるIFN-γの産生を検出し、測定するように設計されELISpotアッセイ。

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Protocol

この研究計画は、研究を行ったCHUサントジュスティーヌ、モントリオール、ケベック、カナダの機関倫理審査委員会によって承認された。インフォームドコンセントを求め、すべての研究参加者、両親または法的保護者から得られた。すべての手順は、1日目に行い、2（層流フードの下で、すなわち ）、無菌条件下で行わなければならない。ヒトの血液を処理するための標準的な安全手順を厳守しなければならない。

1。プレートコーティング

各ウェルに1分間、35％エタノールを20μl添加することにより、96ウェルマルチスクリーンIP白色のELISpotプレートの底部にポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜を透過。膜はやや半透明になる必要があります。
MULを用いて、直ちに1×リン酸緩衝生理食塩水（137mMのNaCl、2.7mMのKCl、10mMのNa ₂ HPO _4、2mMのKH ₂ PO _4、pH7.4のPBS）200μlでウェルを3回洗浄するピペットまたは同様のデバイスをtichannel。このステップは、エタノール残基は細胞生存率および捕捉抗体の結合に影響を与えることができることが指定されて重要である。 ELISPOTプレートは壊れやすく、取り扱いに注意する必要があります。自動プレート洗浄機の使用はお勧めしません。
コート10μg/ mlの終濃度になるように1×PBSで希釈した精製マウス抗ヒトIFN-γ捕捉抗体を10μlでウェル。定期的なプラスチック製のラップでプレートをカバーし、4℃で一晩インキュベート

2。プレートをブロッキング

井戸を空に、乾いたそれらをタップし、1X PBS200μlでプレートを5回洗浄する。
完全RPMI 1640培地200μlでウェルを満たし、（閉塞工程）、37℃で2時間、プレートをインキュベート。
プレートを1X PBS200μlで5回洗浄し、細胞がメッキされる準備が整うまで、フル1X PBSでのウェルを保つ。

3。細胞播種と刺激

Pを準備する標準的な手順を用いて、フィコール·パック勾配での遠心分離によりヒト静脈血サンプルからeripheral血単核細胞（PBMC）。あるいは、標準的な方法を用いて、液体窒素下で凍結PBMCのアリコートを解凍。最後の遠心分離、再懸濁mlの2×10 ⁶細胞/の最終濃度で細胞およびウォータジャケットインキュベーター中5％CO ₂雰囲気下37℃で一晩インキュベートした後。
インキュベーターからのPBMCを削除し、完全RPMI 1640培地5mlの最終容量で再懸濁します。
室温で5分間セラチアから遺伝子工学的にエンドヌクレアーゼを10μlの存在下でPBMCをインキュベートする。
PBMCの50μlアリコートを取り出して、トリパンブルー色素を50μlと混合。細胞を計数し、血球計数器および顕微鏡検査（色素排除法）を用いて％生存率を推定する。細胞計数および細胞生存缶らの評価のための様々な自動化された方法そのように使用すること。 PBMCを> 95％生存である必要があります。生存率が95％未満であるときにサンプリング捨てる。
5分間700×gで遠心分離PBMC、上清を捨て、2％を補充したAIM-V培地中で再懸濁細胞（v / v）の2×10 ⁶細胞/ mlの最終濃度で（HIS）ヒト血清を不活性化。刺激の混合物をプレートに添加されるまで、37℃で保管してください。
、ウェルに一度に1滴、適切な刺激混合物100μlを加える。後述するように3つの刺激の混合物が使用されるべきである。
1. 使用AIM-V培地は、2％（v / v）の不活性化ヒト血清（IHS）のような陰性対照を補充した。
2. 0.5μg/ mlの陽性対照として）の最終濃度2％（v / v）のIHSを補充したAIM-V培地中に希釈した抗CD3モノクローナル抗体（クローンOKT3）を使用する。
3. γ線照射のいずれかの形態で、VZV抗原を使用（10,000 Gyを、30分間の曝露時間）は弱毒化VZVワクチン（1,350プラーク形成単位[PFU] / ml）を生きDILUAIM-Vの2％（v / v）のIHSを添加した培地）またはVZV直ちに初期（IE63）リンタンパク質の配列に基づいて合成された67ペプチド（15アミノ酸残基）の等モル混合物を1μgでテッド1:200 。 PBMC培養中の4日後に細胞変性効果の明らかな兆候がないことを監視することで、照射の有効性を制御します。
4. 重複してすべてのウェルを準備します。
、ウェルに一度に1滴、適切なウェルにステップ5.4で調製した細胞を100μlを加える。 2つの井戸は、細胞（ネガティブコントロール）を使用せずにしておきます。ウォータージャケットインキュベーター中で5％CO ₂雰囲気下、37℃で20時間インキュベートする。、振って移動、またはインキュベーション中互いの上にプレートを積み重ねないでください。

4。スポットの開発と検出

セルを廃棄し、1×PBSでプレートを10倍を洗い、0.05％（V / V）のTween 20（PBST）を加えたもの。トゥイーン20をPVDF私に付着した細胞を剥離役立ちます一晩インキュベーション後のmbrane。
マルチチャンネルピペットを用いて、0.5％（w / v）ウシ血清アルブミン（BSA）を含有する1×PBSで希釈した0.5 mg / mlのビオチンコンジュゲート抗IFN-γモノクローナル抗体（4S.B3クローン）100μlを添加する。室温で2時間、プレートをインキュベート。
ウェルをPBSTで6倍および0.5％（w / v）のBSAを含む1×PBS中で1:1,000に希釈したアルカリホスファターゼで各ウェルにストレプトアビジンconjugatd100μlのを追加洗う。プレートを覆い、室温で1時間インキュベートする。
プレートをPBSTで3回洗浄し、1×PBSで3回。 5 - ブロモ-4 - クロロ-3 - インドリルリン酸（BCIP）/ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（NBT）基質溶液100μlを添加し、室温で5分間インキュベートする。
蒸留流水でプレートを洗ってください。 ELISPOTプレートの下部を外し、蒸留水で膜の両側を洗う。空気はプレートを乾燥させます。
井戸を調べ、立体Dを使用してスポットを列挙issection顕微鏡や自動化されたスポットカウンターを使用して、プレートをスキャンします。彼らは同じ日に検査することができない場合、離れて光からプレートを保管してください。
1. 二連のウェルに対応する計数スポットの数を平均化し、試験ウェルで計数したスポット数から負のコントロールとなるウェル（細胞なし）で計数したスポットの数を差し引く。
2. 10 ⁶ PBMCあたりのスポット形成単位数（SFU）として、IFN-γ産生を発現する。
3. SFUの数は、陰性対照以上> 50〜10あたり⁶ PBMCおよび2標準偏差（SD）である場合、そのテストサンプルが陽性で考慮する（細胞+ AIM-V培地は、2％（v / v）のIHSを補充した）。
4. スポットがカウントされるには余りにも多数であるとき、ウェルあたり400 SFUの値を使用します。
エリスポットデータが正常にコルモゴロフ - スミルノフ検定を使用して分散されているか否かをテストする。データが正規分布している場合、スチューデントのt TESを用いて統計的比較を行うT（2グループ）またはANOVAとボンフェローニポストテスト（多重比較）。データが正規分布していない場合には、マン-ホイットニーU検定 （2群）またはクラスカル·ワリス検定およびダンの事後検定（多重比較）を使用する。

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Representative Results

上記に詳述IFN-γエリスポットプロトコルは大きさおよびVZV ⁴に対して向け細胞媒介性免疫応答の質を測定するために開発され、我々の研究室で最適化した。 VZV抗原の多様なソースは、刺激工程のために使用することができる。これらは、a）VZVから市販されている洗剤の不活化抽出物は、Vero細胞を^18感染 ; IE63 ¹⁵とORF4 ¹⁹を含む特定のVZVコードされたタンパク質から合成ペプチドの重複B）のプール; C）の弱毒水痘帯状疱疹ワクチン^20を生きる;及びd）破砕VZVの清からのVZV抗原のUV不活性化された製剤には、MRC細胞^14を感染させた。抗原ソースと準備の均一性を確保するために院内transmissio臨床現場で生きた野生型VZV株の文化や操作を制限するために、VZVの派生我々の場合では、弱毒生VZVワクチンの希釈液を、細胞培養よりも優先されたnは深刻な懸念¹⁰です。また、γ照射が原因γ放射線の線量が配信することができ、紫外線とは異なり、γ線を効率的に密封されたVZVはバイアルを含む浸透し、ためているとの比較精度が紫外線不活化²¹よりも好まれた。ウイルスストックの照射はテストVZV抗原（ 図1）のすべての希釈で健康なドナーから得たPBMCサンプル中のVZV特異的IFN-γ産生細胞の頻度の一貫して高い推計につながった。これはおそらく、細胞培養で弱毒生VZVによって誘導される細胞変性効果の緩和の結果である。

10 ⁶ PBMCあたりのSFUの数の面で最大限の読み出しが得られている希釈VZV抗原を判断するには、IFN-γELISPOTは、γの2倍希釈液を用いて実施した高齢者の免疫担当子どもたちのグループから得られた弱毒生VZVワクチンおよびPBMCサンプルを照射し9月と12あなたがたの間で水痘および/または正VZVのための血清学的検査（N = 50）の文書化された歴史を持っていたARS。研究対象は、2007年6月および2009年9月の間で感染症CHUサントジュスティーヌのクリニックや特殊免疫学クリニックで登録された統計的に有意な差は1:200、1を使用して得られた、IFN-γ産生細胞の中央値は周波数の間で観察された。： VZV抗原の400と1:800希釈液（P <0.0001、クラスカル·ウォリス検定）（ 図2）。これらの格差は、1:200希釈の違いによって説明された（中央値= 10 ⁶ PBMCあたり115.0 SFU、四分位範囲[IQR] = 75.0 - 10 ⁶ PBMCあたり232.5 SFU）と1:800希釈（中央値= 50.0 SFU 10 ⁶ PBMCあたり、IQRは= 20.0 - 10 ⁶ PBMCあたり105.0 SFU）、および1:400希釈（中央値の間= 92.5 10 ⁶ PBMCあたりのSFU; IQR = 52.5で- 10 ⁶ PBMCあたり177.5 SFU）と1:800希釈した（p <0.001およびp 図2）。このため、γの1:200希釈は弱毒VZVワクチンは、VZV特異的細胞性免疫応答の日常的測定において使用するために選択した照射した。

IFN-γ産生はCD4 ⁺および/ またはCD8 ⁺ Tリンパ球サブセット内に存在するかどうかを決定するために、健康なドナーから得たPBMC試料を、抗CD4または抗CD8抗体を結合した磁気ビーズを用いてCD4 ⁺またはCD8 ⁺細胞の枯渇を行った製造業者の指示に従って。以前に公表された報告^22,23との一致では、CD4 ⁺細胞の枯渇は、VZV抗原の1:100、1:200と1:400希釈液を用いて得た、IFN-γ産生細胞の頻度の著しい減少をもたらしたCD8 ⁺細胞の枯渇は、このような削減と陽性対照につながるしなかったS（抗CD3モノクローナル抗体による刺激）が、同様に（ 図3）影響を受けなかった。これらの結果は、VZV抗原による刺激に応答してIFN-γを産生する細胞の大部分はCD4 ⁺ T細胞であることを示唆している。あるいは、これらの結果は、CD8 ⁺ Tリンパ球をレスポンダするVZV抗原の提示レベルの低下につながる、PBMCプールからの細胞（ すなわち 、単球、樹状細胞）を提示CD4 ^+抗原の枯渇から生じる可能性がある。照射されたVZVを使用すると、CD4優位に向かって応答のスキューに寄与している可能性は低い、同様の結果が異なる技術および抗原の供給源^14,21,22を使用して、他のグループによって得られた。代表的なのELISpotウェルの低倍率の顕微鏡写真を図4に示す。

問題/課題	考えられる原因	救済策/解決策</ TD>
高いバックグラウンド/不十分な定義またはコンフルエントスポット	死んだ細胞の高い数値。	培養セットアップ及び刺激の前に細胞生存率を評価する。
	不適切な膜事前湿潤段階。	1分後に灰色に事前濡れ時間と、その膜のターンを尊重することを確認します。 35％エタノールを使用直前に調製する必要があります。
	プレートは、インキュベーション期間中に移動した。	不十分に定義されたカタツムリのトレイルスポットを避けるために、プレートを移動しないでください。
	手順を洗ってください。	手動洗浄は、プレート洗浄よりも効率的です。
	タンパク質凝集体の形成。	背景と偽陽性スポットを減らすために捕捉および検出抗体の両方をフィルタリングします。
	セカンダリおよび検出抗体濃度。	ビオチン化SEを調整バックグラウンドを低減するcondary /検出抗体濃度。
	冷たい現像試薬。	低開発を避けるために、室温に基板を持参してください。
ノースポット/ブランクウェル	定義が不十分スポット。	異なるウェルにおいて均一の温度にインキュベーション期間中、プレートを積み重ねないでください。
	刺激基板よく準備されていません。	結晶形成を回避するために15分間室温にペプチド混合物のアリコートをもたらす。
	細胞凝集。	スポット形成単位の過小評価を避けるために、単一細胞懸濁液中に細胞を再懸濁。
	細胞が適切に刺激されていない。	ポジティブコントロールとして、ポリクローナル活性化剤を使用してください。
	トゥイーン20による酵素反応の阻害。	たBCIP / NBT基質溶液を添加する前にPBSで時間プレート。
	間違った抗体のペア。	捕捉および検出抗体が異なる抗原エピトープと反応することを確認します。

表1。その他のトラブル。

図1。IFN-γ産生細胞の頻度でライブ不活化VZVワクチンのγ線照射の影響IFN-γELISPOTを使用して決定された議定書のテキストで説明されているよう。、VZV特異的IFN-γELISPOTは、制御志願者からのPBMCを用いて行ったし、（万線量）を照射γの連続希釈液を抗原として、弱毒化VZVワクチンを生きる。データが重複measuremeの平均を表す国税庁、エラーバーは平均の標準誤差を表す。 PBMC：末梢血単核細胞; SFU：スポット形成単位; VZV：水痘帯状疱疹ウイルス。

図2。プロトコルテキストで説明されているようVZV特異的な細胞の定量化は、VZVの以前の感染の証拠の書類の子供の免疫応答を媒介した。VZV特異的IFN-γELISPOTは、PBMCを用いて行ったが、水痘の歴史を持つ被験者から単離した（N = 50）と（10,000 Gyの）照射γの連続希釈液を抗原として、弱毒化VZVワクチンを生きる。水平線はボックスは四分位範囲（IQR）を表し、中央値を表し、ウィスカーは、値の範囲を表す。 PBMC：末梢血単核細胞; SFU：スポット形成単位; VZV：水痘帯状疱疹ウイルス。

下で説明するように図3 IFN-γエリスポット。CD4 ⁺の枯渇またはCD8 ⁺細胞およびVZV特異的IFN-γエリスポットを用いて測定したIFN-γ産生細胞の頻度に対するCD4 ⁺またはCD8 ⁺細胞の枯渇の影響を行った（万線量）を照射制御ボランティアとγの段階希釈からのPBMCを使用して、プロトコルのテキストは、抗原として、弱毒化VZVワクチンを生きる。データは、平均値の標準誤差を表す重複測定および誤差棒の平均を表す。 PBMC：末梢血単核細胞; SFU：スポット形成単位; VZV：水痘帯状疱疹ウイルス。

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図4。代表のELISpot井戸。VZV特異的IFN-γELISPOTは、プロトコルのテキストで説明したように5つの制御ボランティアからのPBMCを用いて行われ、γの連続希釈液を照射した（10,000 Gyが）抗原としての弱毒化VZVワクチンを生きる。最初の行：陰性対照（2％（v / v）のIHSを補充したAIM-V培地）;第二行目：ポジティブコントロール（抗CD3モノクローナル抗体）; 3行目：VZV抗原。自動化されたスポットカウンターを用いて測定されるように、上部の角にある数字は、ウェルあたりのSFUを表しています。 PBMC：末梢血単核細胞; SFU：スポット形成単位; VZV：水痘帯状疱疹ウイルス; IHS：ヒト血清を不活性化。

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Discussion

修正およびトラブルシューティング：IFN-γエリスポットアッセイは、ヒト免疫不全ウイルス1型^{（HIV-1）24,25、C}型肝炎ウイルス^（HCV）26を含む微生物病原体の種々に対して向けられた細胞性免疫応答を調べるために使用されてきた^{、 27、}および結核菌 ^28,29は、ほんの数名に。ここでは、小児UCBT受信者の回復にVZV特異的免疫再構築の相関を定義する希望を持って、に対する細胞性免疫を測定するために、IFN-γELISPOTアッセイの開発について述べた。

このアッセイの主な特徴は4つある。第一に、それは時間がかかるT細胞の事前のインビトロ増殖を必要としない。第二に、アッセイ間のばらつきを最小限に抑えるために最適な、凍結保存されたPBMC試料を用いて行うことができる。さらに、凍結保存及び並列処理は、当longitudiするように適合されているサンプルはバッチで処理されることを必要と内部研究。第三に、PBMC、遺伝的霊菌からエンドヌクレアーゼを用いた操作された超純による治療の解凍中に遭遇する細胞凝集を防止することができる。処理する前に室温で一晩放置された血液サンプルを使用する場合にPBMCを解凍時の細胞凝集がより頻繁に発生する。霊菌から遺伝子操作されたエンドヌクレアーゼの組み込みは、使用されるヌクレアーゼ低レベルの日時SFUの点で細胞生存率、細胞表面マーカーの発現および同種抗原による刺激に対する応答に影響を及ぼさないことが知られ、露光の持続時間は²²短いです。第四に、γ照射弱毒化VZVワクチンは、PBMCを刺激するために使用した。これは、抗原用量および製剤の均一性を保証し、患者の安全と臨床設定でのライブVZVを操作するための必要性を克服するために、細胞培養由来のVZV好まし研究室の担当者は、主要な関心事である。まとめると、VZV-ELISpotアッセイで導入された修飾は、それがより良い臨床環境での使用に適合することを意図した。

既存の方法に関する技術的意義の制限：分かりやすいが、高感度で再現性のある方法は、臨床フォローアップのコンテキスト内での微生物抗原に対する宿主細胞性免疫応答を測定するために必要とされる。 IFN-γELISpotは、比較的低いハイテク機器（遠心分離機、インキュベーター、解剖顕微鏡）を用いて静脈血試料に対して行うことができる、堅牢かつ再現性のある有益なアッセイである。しかしながら、容易に複数のサイトカインおよび細胞表面マーカーの同時検出を可能にしない。古典的CD4 ⁺およびCD8 ⁺の列挙抗原仕ために使用されてきた伝統的なインビトロ T細胞増殖アッセイ、C T細胞応答は、労働集約的で、感度を欠き、アッセイ間変動^30,31の高度に苦しむ傾向がある。一方^、51 Crで負荷した自己標的の溶解限界希釈分析に基づく細胞傷害性Tリンパ球アッセイ（CTL）はαで存在する抗原特異的CD8 ⁺ T細胞を定量するためのin vitro増殖工程を消費する時間に依存する傾向がある低前駆頻度^32,33。抗原刺激（細胞内サイトカイン染色[ICS]）は、以下のサイトカインの分泌を測定するフローサイトメトリーに基づくアッセイ^34,35を流れる抗原特異的免疫応答を特徴付けるためにも使用することができる。 ICSは、サイトカイン産生および単一細胞における表現型マーカーの細胞表面発現の同時検出を可能にする。 ICSの感度を、ELISPOTのそれに比較していますが、セル^36,37のより多くを必要とします。蛍光クラスIまたはクラスIIペプチド-MAを利用する方法JOR組織適合性複合体（pMHC複合）オリゴマー（のpMHC四量体^{）38-40は、}正確であり、細胞表面マーカーの発現に基づいて、リンパ球サブセットのマルチパラメトリック特徴付けを可能にする。しかし、のpMHC四量体染色は厄介で、指定された研究に患者登録を制限することができ、患者のヒト白血球抗原（HLA）のタイプの事前知識を必要とします。この技術の他の制限は、pMHC複合四量体染色は、主に高親和性T細胞受容体^（TCR）41に媒体を発現するT細胞の検出を可能にすることである。一方のpMHC四量体によって染色されない低親和性のTCRを発現するCD8 ⁺ T細胞は、容易にIFN-γエリスポット^41を用いて検出することができる。また、のpMHC四量体は、それによって、抗原特異的な細胞性免疫応答の機能評価をゆがめる、慢性ウイルス感染^42,43に普及している、いわゆる消耗したCD8 ⁺ Tリンパ球に特異的に結合することができます。 FINALLY、のpMHC四量体染色およびICSは通常、臨床フォローアップの設定で実現するために、これらの技術は悪名高く困難に高度に訓練された人材、比較的高価な試薬、洗練された楽器、専用の設備が必要になります。

将来のアプリケーション：彼らは、T抗原の多官能性の評価は、特定の許す限りデュアルカラーのELISpot同時に、IFN-γおよびIL-2 ⁴⁴の両方の生成を検出することが可能なアッセイおよびデュアルおよびトリプルカラーfluorospot法^45は、かなりの関心を集めている免疫応答^46を媒介効率的な細胞の重要な特徴であるリンパ球。

プロトコル内の重要なステップ：追加の技術的な問題は、慎重に検討を与えられなければならない。多くの変数はその場の質（ すなわち大きさや密度）と麻痺に影響を与える可能性があるため、ER、プロトコルへの準拠は、高感度で再現性のある結果を達成するために不可欠です。特異的モノクローナル抗体のブランド（捕捉および検出）、PVDF膜とのELISpotプレート、及びコーティングの前に膜処理し、35％エタノールを一貫して使用することは非常に重要である。例えば、エタノールと過剰治療は、アッセイスポット品質の性能に影響を与えることができる。情報価値のウェル（ すなわち > 300スポット）を取得しないようにするには、我々はこれ以上の⁵ 10×2以上のPBMCを使用してウェルあたりをお勧めします。抗原特異的T細胞の低周波数に直面したとき、アッセイ感度は、同族抗原とin vitroで prestimulating細胞によって強化された、またはそのような定義された期間のためのフィトヘマグルチニン（PHA）などのポリクローナル活性化剤（通常は3〜7日）でそれらを拡張することができます³⁸ 。しかし、ここに提示されたVZV ELISpotアッセイのための最終的な最適化された手順では、in vitro予備刺激および/ または拡張段階に含まれていません。数とクォリティスポットのyは16〜21時間のインキュベーション範囲にわたって類似していた。インキュベーションの21時間を超えて、スポットは、多くの場合、より拡散した、時には彼らの列挙がより困難に、重複した。さらに、細胞をインキュベートしている間にプレートを移動すると、同様にカウントするのがより困難である不明確なカタツムリのトレイルスポットにつながることができます。追加のトラブルシューティングの手がかりを表1に示す。

自動化されたスポット·カウンタ、感度、スポットサイズゲーティングを使用する場合、陽性対照（抗CD3モノクローナル抗体）及びネガティブコントロール（AIM-V培地は、2％（v / v）のIHSを補充した）を用いて設定されている。スポット列挙中に考慮すべき重要な特徴は、大きさや形状（ 図4）である。前者は1を無視するか、バックグラウンドスポットからのT細胞由来のサイトカインのスポットを区別することができます。スポット数は、所与のPB中に存在するVZV特異的T細胞の頻度の推定値を提供するMCの試料スポットサイズは、個々の細胞によって産生されるどのくらいのIFN-γ反映する。

我々の知る限りでは、これは、抗原⁴として、VZVワクチンを弱毒生照射γを利用しているだけ、IFN-γELISPOT法である。重複する合成ペプチド（15量体）のパネルもVZV IE63リンタンパク質のアミノ酸配列に基づいたペプチドの混合物を含む抗原として使用されてきた。 IE63は⁴⁷高い免疫原性であり、ウイルスの感染性とレイテンシ⁴⁸の確立のために重要であると思われる。 IE63特異的T細胞は、IE63がVZVに対して向け細胞性免疫の重要な標的であることを示唆している健康なVZVの血清陽性ドナー¹⁵で検出されている。しかしながら、反応性細胞は、主にCD4 ⁺ T細胞¹⁵であることが見出された。

VZVのIFN-γELISpotアッセイは、以前にOで使用されていた新生物または継承された血液障害^を治療するために⁴ UCBTを受けた子供の28 VZV特異的T細胞応答を評価するためにウル基。この研究の過程で得られた結果は、よりロバストなVZV特異的細胞性免疫応答のにつながったCD4 ⁺およびCD8 ⁺ T細胞サブセットの両方が、IFN-γ産生およびナイーブCD8 ⁺ T細胞区画の再構成に関与することが示唆されたIFN-γ産生の観点から。重要なのは、これらの結果は、10 ⁶のPBMCあたりの150以上のSFUの検出は、VZV感染または再活性⁴に対するT細胞媒介保護と一致していたことを示した。しかし、VZV UCBTのコンテキストで特定の細胞性免疫およびその後の免疫再構築または不足のため、このしきい値は、その大きな前向き多施設共同研究で検証する必要があります。

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Disclosures

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

Acknowledgments

著者らは、研究参加者とその保護者に感謝したいと思います。また、統計分析のために、彼のELISPOTリーダー、博士Luboアレクサンドロフへのアクセスのために博士Réjeanラポイント（CHUMノートルダム、モントリオール、カナダ）を感謝したい、とデニス割い、サンドラ·キャロン、シルビーヴァロワや専門家の技術のためのマーティンキャティう援助。ルフォンドール操作LA財団センターデcancérologieチャールズ·ブリュノにより、HSとPOにレprojetsデRECHERCHEクリニークらD'評価に関する研究DES技術（CHUサントジュスティーヌ）を注ぐ、との白血病リンパ腫協会によるからの補助金によってサポートされているカナダ。 ISFは、ラ·財団CHUサントジュスティーヌ、ル·フォン·デ·ラ·RECHERCHEデュケベックサンテ（FRQS）からの奨学金によってサポートされていました。 AJGは微生物学、Infectiology＆免疫学教室、モントリオール大学（ガブリエル·マーキス奨学金）、FRQS、健康研究のカナダの協会からの奨学金を受賞したeSearchは（CIHR）。 NMは、ラ·財団CHUサントジュスティーヌ、コール財団、FRQSによってサポートされていました。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leucocep tube	VWR	89048-936/89048-932	12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood.
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-1440-02	Protect from light.
Benzonase nuclease	Novagen	70746-3	Keep at -20 °C.
MultiScreenHTS-IP Filter Plate	Millipore	MSIPS4W10	Sterile with pore size of 0.45 µm.
Mouse anti-human IFN-γ capture antibody	BD Biosciences	551221	NIB42 clone.
Pepmix VZV IE63	JPT Peptide Technologies	PM-VZV-IE63	Dissolve contents of one vial in 40 μl of DMSO. Use within 6 months.
Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody	BD Biosciences	554550	4SB3 clone.
Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase	Bio-Rad Life Science	170-3554	Dilute for use on the same day.
BCIP/NBT	Bio-Rad Life Science	170-6432	Protect from light.