Summary
Новые поколения функциональных анализов, таких как гамма-интерферона (IFN-γ) ELISpot, которые обнаруживают продукцию цитокинов на уровне одной клетки и обеспечить как количественную и качественную характеристику Т-клеточные ответы могут быть использованы для оценки клеточно-опосредованные иммунные реакции, направленные против ветряной оспы вирус (VZV).
Abstract
Вирус ветряной оспы (ВВО) является одной из основных причин заболеваемости и смертности следующей пупочной трансплантации пуповинной крови (UCBT). По этой причине, противогерпетической профилактика администрируется систематически педиатрических получателей UCBT для предотвращения осложнений, связанных с VZV инфекции, но нет сильного и основанных на доказательствах мнение, что определяет его оптимальную продолжительность. Поскольку T клеточный иммунитет отвечает за контроль VZV-инфекции, оценка VZV воссоздание конкретных ответов Т-клеток следующее UCBT может обеспечить индикацию относительно того, профилактика должна быть сохранена или может быть прекращено. С этой целью VZV специфический гамма-интерферон (IFN-γ) фермент-связанный ImmunoSpot (ELISpot) был разработан анализ для характеристики производства IFN-γ Т-лимфоцитами в ответ на стимуляцию в пробирке с облучаемой живой аттенуированной вакцины VZV. Этот препарат обеспечивает быстрое, воспроизводимое и чувствительное измерение VZV конкретного слокоть иммунитет подходящий для мониторинга воссоздание VZV специфического иммунитета в клинических условиях и оценки иммунологическую реактивность к ВВЗ антигенов.
Introduction
Сначала выполненный в 1989 году, UCBT все шире используется как часть лечении различных опухолевых и неопухолевых заболеваний крови у детей 1. ВВО является цитопатический человеком alphaherpesvirus который вызывает два различных заболеваний, ветряной оспой (после первичного инфицирования) и опоясывающий лишай (после реактивации). После первичной инфекции, ВВО сохраняется в течение всей жизни хозяина защищенном пределах чувствительных нервов ганглиях задних корешков. Одним из наиболее опасных инфекционных осложнений после UCBT связан с VZV 2-4. В нашем клиническом центре, в отсутствии VZV профилактики, кумулятивное падение заболевания VZV болезни VZV на 3 года postUCBT составила 46% 2. У этих больных, заново инфекция или реактивация ВВЗ часто ассоциируется с висцеральной распространения в центральной нервной системе, легких и печени 5-7. В результате, ацикловир, валацикловир или фамцикловир профилактика обычно управляются с UBПолучатели CT 8,9. Однако, эта стратегия лечение не принимать во внимание защитный потенциал VZV специфических Т-лимфоциты или кинетики воссоздания VZV конкретных ответов Т-клеток. Потенциальные проблемы, связанные с расширением использования долгосрочных противогерпетических профилактики включают) избыточного лечения пациентов; б) развитие устойчивость к противовирусным препаратам 10,11; и в) нарушение VZV специфического иммунного восстановления 12,13. Поскольку обнаружение функциональных VZV специфических Т-лимфоцитов коррелирует с наличием долгосрочного защиты от VZV-инфекции и улучшению клинического исхода 4,14,15, мониторинг клеточно-опосредованный иммунный ответ, направленные против VZV в течение периода после трансплантации может привести к более рациональному использованию противовирусных лечение, позволяя практикующих врачей, чтобы отличить пациентов, которые больше всего выигрывают от ВВЗ профилактика от тех, чья иммунная система способна контролировать VZV репликации 4,13.
ИФН-γ ELISpot анализ широко используется для мониторинга клеточных опосредованных иммунных реакций в различных экспериментальных систем и клинических условиях. Пятна образуются после расщепления хромогенного субстрата, создавая видимый осадок и стабильной в месте реакции. Каждый человек место, таким образом, представляет собой след отдельного цитокинов производящих клетки. IFN-γ ELISpot не только измеряет способность отдельных клеток экс виво для получения IFN-γ в ответ на стимуляцию в пробирке с антигеном, но она также обеспечивает оценку частоты реагирует клетки в данной популяции клеток 16,17. В дополнение к своей высокой чувствительности, IFN-γ ELISpot проста для выполнения, что делает возможным его использование в контексте персональной клинических протоколов, направленных на руководящих инициирование или прекращение противовирусного лечения. Процедура подробно описаны ниже описания тогоэс анализ ELISpot, которая специально предназначена для обнаружения и измерения производство IFN-γ на мононуклеарных клеток периферической крови после стимуляции в пробирке с ВВО, полученных антигенов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол исследования был одобрен Советом по Институциональная Этика рассмотрению CHU Sainte-Justine, Монреаль, Квебек, Канада, где проводилось исследование. Информированное согласие было запрошено и получено от всех участников исследования, их родителей или законных опекунов. Все процедуры выполняются в дни 1 и 2 должны выполняться в стерильных условиях (т.е. при ламинарном боксе). Стандартные процедуры безопасности при работе человеческой крови должны строго соблюдаться.
1. Покрытие пластин
- Проницаемыми поливинилидендифторид (ПВДФ) мембраны в нижней части 96-луночных MultiScreen IP белый ELISPOT пластин путем добавления в каждую лунку по 20 мкл 35%-ного этанола в течение 1 мин. Мембраны должны стать слегка прозрачным.
- Немедленно промыть лунки три раза 200 мкл 1х забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS; 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na 2 HPO 4, 2 мМ KH 2 PO 4, рН 7,4) с использованием MULtichannel пипетки или подобное устройство. Этот шаг имеет решающее значение, учитывая, что этанол остатки могут повлиять на жизнеспособность клеток и связывание захвата антитела. ELISpot плиты хрупки и следует обращаться осторожно: использование автоматизированной пластины шайбой не рекомендуется.
- Покрытия лунок с 10 мкл очищенного мышиного антитела против человеческого захвата IFN-γ антитела, разведенного в 1х PBS до конечной концентрации 10 мкг / мл. Обложка пластин с регулярной полиэтиленовой пленкой и инкубировать в течение ночи при 4 ° С.
2. Блокировка плиты
- Слейте скважин, нажав им высохнуть, и мыть пластины 5 раз с 200 мкл 1x PBS.
- Заполните лунки 200 мкл полной среды RPMI 1640 и инкубируют пластинки в течение 2 часов при 37 ° С (блокирование шаг).
- Вымойте планшеты 5x 200 мкл 1x PBS и держать скважин полон 1x PBS, пока клетки готовы быть покрыты.
3. Сотовый Покрытие и стимулирование
- Подготовьте рeripheral мононуклеарные клетки крови (РВМС) из проб венозной крови человека центрифугированием на Ficoll-Paque градиентов использованием стандартных методик. Кроме того, с использованием стандартных методов, оттаивать аликвоты РВМС замороженных в жидком азоте. После того, как последние центрифугирования, ресуспендирования клеток в конечной концентрации 2 х 10 6 клеток / мл и инкубировать в течение ночи при 37 ° С в 5% CO 2 атмосфере в водяной рубашке инкубатора.
- Удалить РВМС из инкубатора и ресуспендируют их в конечном объеме 5 мл полной среды RPMI 1640.
- Выдержите РВМС в присутствии 10 мкл генной инженерии эндонуклеазы из Serratia marcescens в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Удаление 50 мкл аликвоты РВМС и смешать с 50 мкл трипанового синего красителя. Граф клеток и оценить% жизнеспособность помощью гемоцитометра и микроскопическое исследование (метод исключения красителя). Различные автоматизированные методы подсчета и оценки жизнеспособности клеток всегда может клетоктак быть использованы. РВМС должно быть> 95% жизнеспособны. Отменить образец когда жизнеспособность ниже, чем 95%.
- Центрифуга РВМС при 700 х г в течение 5 мин, отбросить супернатант и ресуспендируют клеток в AIM-V среде, дополненной 2% (об / об) инактивированной сыворотки крови человека (его) в конечной концентрации 2 × 10 6 клеток / мл. Хранить при температуре 37 ° С до стимуляции смеси не будут добавлены к пластине.
- Добавить в лунки, одну каплю за один раз, 100 мкл соответствующей стимуляции смеси. Три стимуляции смеси следует использовать, как описано ниже:
- Использование AIM-V среде, дополненной 2% (об / об) инактивированной сыворотки крови человека (IHS) в качестве отрицательного контроля.
- Использование анти-CD3 моноклональные антитела (клон ОКТ3), разведенного в AIM-V среде, дополненной 2% (об / об) IHS в конечной концентрации 0,5 мкг / мл в качестве положительного контроля).
- Используйте VZV антиген, в форме либо γ-облучении (10000 Гр; 30 мин время экспозиции) живая ослабленная VZV вакцины (1350 бляшкообразующих единиц [PFU] / мл) DiluTed 1:200 в AIM-V среде, дополненной 2% (об / об) IHS) или 1 мкг эквимолярной смеси 67 пептидов (15 аминокислотных остатков), синтезированного на основе последовательности VZV немедленно раннего (IE63) фосфопротеин . Контроль облучения эффективность путем мониторинга отсутствие видимых признаков цитопатических эффектов после 4 дней в РВМС культур.
- Подготовьте все лунки в двух экземплярах.
- Добавить в лунках, по одной капле за раз 100 мкл клеток, полученных на шаге 5,4 в соответствующие лунки. Две скважины должны быть оставлены без клеток (отрицательный контроль). Выдержите в течение 20 часов при температуре 37 ° С в 5% CO 2 атмосфере в водяной рубашке инкубатора. Не трясите, двигаться, или стек пластин на верхней части друг с другом во время инкубации.
4. Спот Разработка и обнаружения
- Отменить клетки и промывают пластины 10 раз с 1x PBS с добавлением 0,05% (объем / объем) Твин 20 (PBST). Твин 20 помогает отделить клетки, которые, прилипшие к PVDF меняmbrane следующие инкубации в течение ночи.
- Использование многоканальную пипетку, добавьте 100 мкл 0,5 мг / мл биотин сопряженных анти-IFN-γ моноклональное антитело (клон 4S.B3) разводили в 1 × PBS, содержащим 0,5% (вес / объем) бычьим сывороточным альбумином (BSA). Инкубируют планшеты в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Промыть лунки 6x с PBST и добавить каждую лунку по 100 мкл стрептавидин conjugatd щелочной фосфатазой разбавленного 1:1000 в 1 × PBS, содержащим 0,5% (вес / объем) БСА. Крышка пластины и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Вымойте планшеты 3x ЗФРТ и 3x с 1x PBS. Добавьте 100 мкл 5-бром-4-хлор-3-индолил фосфат (BCIP) / нитро синий тетразол хлорид (NBT) раствора субстрата и инкубировать 5 мин при комнатной температуре.
- Вымойте тарелки под проточной дистиллированной воды. Извлеките нижнюю секцию ELISpot пластины и промыть обе стороны мембраны с дистиллированной водой. Воздух сухой тарелки.
- Изучите скважин и перечислить пятна с помощью стереоскопического дissection микроскоп или сканировать тарелки с использованием автоматического пятно счетчик. Держите пластины от света, если они не могут быть рассмотрены в тот же день.
- Среднее значение на основании количества пятен, подсчитанных в соответствующих дублирующих лунках и вычесть количество пятен, подсчитанных в отрицательных контрольных лунок (без клеток) из числа подсчитанных пятен в тестовых скважин.
- Экспресс IFN-γ производства как количество спот-единиц (СФУ) на 10 6 РВМС.
- Рассмотрим, что тестовые образцы положительны, если количество SFU составляет> 50 10 6 РВМС и 2 стандартных отклонений (SD) выше отрицательного контроля (клетки + AIM-V среде, дополненной 2% (об / об) IHS).
- Используйте значение 400 ЮФУ на лунку, когда пятна слишком много, чтобы пересчитать.
- Проверьте, работают ли данные ELISpot нормально распределены или нет, используя тест Колмогорова-Смирнова. Когда данные распределены по нормальному закону, выполнять статистические сравнения с помощью т Tes Стьюдентат (2 группы) или ANOVA и пост-тест Бонферрони (множественные сравнения). Если данные не являются нормально распределенными, использовать тест Манна-Уитни U (2 группы) или тест Крускала-Уоллиса и пост-тест Данна (множественные сравнения).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
IFN-γ ELISpot протокол описано выше был разработан и оптимизирован в нашей лаборатории, чтобы измерить величину и качество клеток, опосредованных иммунных ответов, направленных против VZV 4. Различные источники VZV антигена может быть использован на стадии стимуляции. К ним относятся: а) в продаже моющие инактивированные выдержки из ВВЗ инфицированных клетках Веро 18; б) бассейны перекрывающихся синтетических пептидов от конкретных ВВО кодируемых белков, в том числе IE63 15 и ORF4 19; в) живая ослабленная ветряной оспы вакцину 20; и г) УФ-инактивированных препаратов антигенов VZV из супернатанта нарушается VZV инфицированных MRC ячеек 14. В нашем случае, разведения живого ослабленного вакцины VZV были предпочтительнее, чем культура клеток происходит VZV, чтобы застраховать единообразия в источника антигена и подготовки, а также ограничить культуру и манипуляции живыми штаммами VZV дикого типа в клинических условиях, где внутрибольничная transmissioн является серьезной проблемой 10. Кроме того, γ облучение было более предпочтительным, чем УФ-инактивации 21 из-за сравнительной точности, с которой дозы γ-излучения могут быть доставлены и потому что, в отличие от УФ, γ-лучи эффективно проникать запечатанные ампулы, содержащие VZV. Облучение вирусных запасов привело к последовательно более высокие оценки частоты VZV конкретных IFN-γ продуцирующих клеток в образцах РВМС, полученных от здорового донора на всех разведений тестируемого антигена VZV (рис. 1). Возможно, это результат смягчения цитопатических эффектов, вызванных живого ослабленного VZV в клеточной культуре.
Чтобы определить, какие разбавления ВВО антиген дали максимальные показания в плане количества ЮФУ на 10 6 РВМС, IFN-γ ELISpot проводили с использованием двух-кратные разведения γ облучении живых ослабленных вакцины VZV и образцы РВМС получены от группы иммунокомпетентных детей в возрасте от 9 месяцев до 12 уеARS, которые имели документированную историю ветряной оспы и / или положительной серологией на ВВЗ (N = 50). . Учебные предметы были зачислены в инфекционной клиники и специальный иммунологии клиники Чу Сент-Жюстин в период с июня 2007 по сентябрь 2009 Статистически значимые различия наблюдались между срединных частот IFN-γ продуцирующих клеток, которые были получены с помощью 1:200, 1: 400 и 1:800 разведения VZV антигена (р <0,0001, тест Крускала-Уоллиса) (рис. 2). Эти различия были приходится на разнице между 1:200 разбавления (медиана = 115,0 СФУ на 10 6 РВМС, интерквартильный диапазон [МКР] = 75.0 - 232.5 СФУ на 10 6 РВМС) и разбавление 1:800 (медиана = 50,0 СФУ на 10 6 РВМС; IQR = 20,0 - 105,0 SFU за 10 6 РВМС), а также между разведение 1:400 (медиана = 92,5 SFU за 10 6 РВМС; IQR = 52,5 - 177,5 SFU за 10 6 PBMC) и 1:800 разбавление (р <0,001 и р (рис. 2). По этой причине 1:200 разбавление γ облучают живой ослабленной вакцины VZV был выбран для использования в обычных измерений VZV конкретных клеточных иммунных ответов, опосредованных.
Чтобы определить, находится ли производство IFN-γ в CD4 + и / или CD8 + Т-лимфоцитов подмножеств, образцы РВМС, полученные от здорового донора были подвергнуты истощение CD4 + или CD8 + клеток с использованием анти-CD4 или анти-CD8 антител в сочетании магнитных шариков в соответствии с инструкцией завода-изготовителя. В соответствии с ранее опубликованными отчетами 22,23, истощение CD4 + клеток приводило к снижению ударной в частотах IFN-γ продуцирующих клеток, которые были получены с использованием 1:100, 1:200 и 1:400 разведений антигена VZV, в то время как истощение CD8 + клеток не приводит к такому сокращению и положительного контроляс (стимуляция с анти-CD3 моноклональных антител) не были затронуты аналогичным образом (рис. 3). Эти результаты показывают, что большинство клеток, которые продуцируют IFN-γ в ответ на стимуляцию VZV антигенов CD4 + Т-клетки. Кроме того, эти результаты может вытекать из истощения антиген-представляющих клеток CD4 + (т.е. моноциты, дендритные клетки) из пула РВМС, что приводит к снижению уровня представления антигенов VZV ответчик CD8 + Т-лимфоциты. Использование облученного ВВЗ вряд ли способствовали искажению ответа к CD4 доминирования, как аналогичные результаты были получены другими группами с использованием различных методов и источников антиген 14,21,22. Низкий увеличением микрофотография представительных ELISpot скважин представлена на рисунке 4.
| Проблема / вопрос | Возможные причины | Способы устранения / решение </ TD> |
| Высокая фон / Плохо определенные или сливающиеся пятна | Большое количество мертвых клеток. | Оценка жизнеспособности клеток до культуры настройки и стимуляции. |
| Недостаточное мембрана шаги предварительного увлажнения. | Убедитесь в том, уважать время предварительного смачивания и что мембраны поворот к серому через 1 мин. 35% этанол следует готовить непосредственно перед использованием. | |
| Плиты перемещены в течение инкубационного периода. | Не перемещайте пластины, чтобы избежать плохо определенные улитки след пятна. | |
| Вымойте шаги. | Ручная стирка более эффективна, чем пластины шайбами. | |
| Формирование белковых агрегатов. | Фильтр оба захвата и обнаружения антител для уменьшения фона и ложные положительные пятна. | |
| Среднее и определения концентрации антител. | Отрегулируйте биотинилированное себеконцентрация антител циальным / обнаружения для уменьшения фона. | |
| Холодные развивающиеся реагенты. | Привести подложку до комнатной температуры, чтобы избежать отсталости. | |
| Нет пятна / Пустые скважины | Нечетко выраженная пятна. | Не укладывать плиты в течение инкубационного периода, чтобы иметь однородную температуру в различных скважин. |
| Стимуляция субстрат не хорошо подготовлены. | Доведите смесь пептидов аликвоты до комнатной температуры в течение 15 мин, чтобы избежать образования кристаллов. | |
| Сотовый слипания. | Ресуспендируют клеток в одной клеточной суспензии, чтобы избежать недооценки спот-формирования единиц. | |
| Клетки не стимулируется соответствующим образом. | С помощью поликлонального активатора в качестве положительного контроля. | |
| Ингибирование ферментативной реакции путем Tween-20. | Былч пластины с PBS перед добавлением BCIP / NBT раствора субстрата. | |
| Неправильные пары антител. | Убедитесь, что захват и обнаружения антитела реагируют с различными антигенных эпитопов. |
Таблица 1. Дополнительная устранения неисправностей.
Рисунок 1. Влияние γ-облучения живой инактивированной вакцины VZV от частоты IFN-γ продуцирующих клеток, как определяется с помощью IFN-γ ELISpot. ВВО конкретных IFN-γ ELISPOT проводили, как описано в соответствии с Протоколом текста с помощью РВМС от волонтера управления и серийные разведения γ облученные (10000 Гр) живая ослабленная вакцина VZV в качестве антигена. Данные представляют собой среднее значение дубликатов MeasureMeНТС и планки погрешностей представляют стандартную ошибку среднего. РВМС: мононуклеарных клеток периферической крови; СФУ: спот образующих единиц; ВВО: вирус ветряной оспы.
Рисунок 2. Количественная оценка VZV конкретных клеточный иммунный ответ у детей при наличии доказательства перенесенной инфекции с ВВО. ВВО конкретных IFN-γ ELISPOT проводили, как описано в соответствии с Протоколом Текст, использующий РВМС изолированы от субъектов с историей ветряной оспы (п = 50) и серийные разведения γ облученные (10000 Гр) живая ослабленная вакцина VZV в качестве антигена. Горизонтальные линии представляют медиану, прямоугольники представляют интерквартильный диапазон (МКР), и усы представляют диапазон значений. РВМС: мононуклеарных клеток периферической крови; СФУ: спот образующих единиц; ВВО: ветряной вирус оспы .
Рисунок 3. Влияние истощения CD4 + или CD8 + клеток от частоты IFN-γ продуцирующих клеток, как измерено с помощью IFN-γ ELISpot. Истощение CD4 + или CD8 + клеток и VZV конкретный IFN-γ ELISPOT проводили, как описано в разделе Протокол Текст, использующий РВМС от волонтера управления и серийных разведений γ облученного (10000 Гр) живая ослабленная вакцина VZV в качестве антигена. Данные представляют среднее двух измерений и ошибками представляют стандартную ошибку среднего. РВМС: мононуклеарных клеток периферической крови; СФУ: спот образующих единиц; ВВО: вирус ветряной оспы.
load/51643/51643fig4highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51643/51643fig4.jpg "/>
Рисунок 4. Представитель ELISPOT скважины. VZV конкретных IFN-γ ELISpot проводили, как описано в разделе Протокол Текст использованием РВМС от пяти контрольных добровольцев и серийных разведений γ облученных (10000 Гр) живой аттенуированной вакцины VZV в качестве антигена. Первый ряд: отрицательный контроль (AIM-V среде, дополненной 2% (об / об) IHS); Второй ряд: положительные контроли (анти-CD3 моноклональных антител); Третий ряд: ВВО антиген. Числа в верхних углах представляют SFU на лунку как измерено с использованием автоматического счетчика пятна. РВМС: мононуклеарных клеток периферической крови; СФУ: спот образующих единиц; ВВО: вирус ветряной оспы; IHS: инактивируется человеческой сыворотки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изменения и устранение неисправностей: ИФН-γ ELISPOT анализы были использованы для изучения клеточно-опосредованные иммунные реакции, направленные против различных патогенных микроорганизмов, в том числе вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) 24,25, вирус гепатита С (HCV) 26, 27 и микобактерии туберкулеза 28,29, просто назвать несколько. Здесь мы описали разработку IFN-γ ELISpot анализа для измерения клеточный иммунитет против, с надеждой на определении корреляты VZV специфического иммунного восстановления в восстановлении педиатрического получателей UCBT.
Основные характеристики данного анализа являются четыре раза. Во-первых, она не требует предварительного расширение в пробирке Т-клеток, которое отнимает много времени. Во-вторых, он может быть выполнена с использованием криоконсервированных образцов РВМС, что на все, чтобы минимизировать межпробная изменчивость. Кроме того, криоконсервация и параллельная обработка хорошо приспособлены к продольнойNAL исследования, которые требуют, что образцы обрабатываются в партиях. В-третьих, для предотвращения слипания клеток столкнулись во время таяния РВМС, обработкой сверхчистых генной инженерии эндонуклеазы из Serratia marcescens был использован. Сотовый слипания при оттаивании РВМС происходит более часто при использовании образцов крови, которые остались в течение ночи при комнатной температуре перед обработкой. Включение генной инженерии эндонуклеазы из Serratia marcescens как известно, не влияет на жизнеспособность клеток, экспрессию маркеров клеточной поверхности и ответ на стимуляцию антигеном с точки зрения SFU начиная с низким уровнем нуклеазы используются и продолжительность воздействия не хватает 22. В-четвертых, γ облучении живых ослабленных вакцин ВВО был использован, чтобы стимулировать РВМС. Было предпочтительнее для культивирования клеток, полученных ВВЗ, чтобы застраховать единообразия в дозе антигена и подготовки и преодоления необходимость манипулирования живой VZV в клинических условиях, где безопасность пациентов иПерсонал лаборатории является серьезной проблемой. Взятые вместе, эти изменения, которые были введены в анализе ВВО-ELISpot были предназначены, чтобы сделать его лучше адаптированы для использования в клинических условиях.
Ограничения техники значимости в отношении существующих методов: прямой, чувствительные и воспроизводимые методы требуются для измерения клетки-хозяина, опосредованных иммунных ответов, направленных против микробных антигенов в контексте клинической последующем наблюдении. ИФН-γ ELISpot является надежным, воспроизводимым и информативным анализ, который может быть выполнен на венозных проб крови с использованием относительно низкой технологическим оборудованием (центрифуги, инкубаторы, рассечение микроскоп). Тем не менее, это не всегда допускают одновременное обнаружение нескольких цитокинов и маркеров клеточной поверхности. Традиционные пробирке T пролиферации клеток анализы в, которые классически используемые для перечисления CD4 + и CD8 + антиген спецификациис Т-клеточные ответы, являются трудоемкими, недостаточно чувствительны и склонны страдать от высокой степенью межпробная изменчивости 30,31. С другой стороны, цитотоксических Т-лимфоцитов анализы (CTL) на основе лизиса аутологичных целей, нагруженных 51 Cr и предельного анализа разбавления, как правило, зависят от длительных стадий расширения в пробирке для количественного антиген-специфических CD8 + Т-клеток, которые присутствуют в низкий предшественником частоты 32,33. Проточная цитометрия основе анализов, которые измеряют секрецию цитокинов следующее антигенной стимуляции (внутриклеточного окрашивания цитокинов [ICS]) 34,35 также может быть использован для характеристики антиген-специфические иммунные реакции. ICS позволяет одновременное обнаружение продукции цитокинов и экспрессии на клеточной поверхности фенотипических маркеров в одиночных клеток. Чувствительность ICS сравнивает, что и ELISpot, но это требует большего числа клеток 36,37. Методы, которые используют флуоресцентного класса I или класса II пептид-маДжор комплекс гистосовместимости (ПКИКЖ) олигомеры (ПКИКЖ тетрамеры) 38-40 точны и позволяют многопараметрическая характеристику субпопуляций лимфоцитов, основанный на экспрессии поверхностных маркеров клеточной. Тем не менее, окрашивание тетрамера ПКИКЖ требуется предварительное знание человеческого лейкоцитарного антигена пациентов (HLA) типа, который может быть громоздкими и ограничить набор пациентов в данном исследовании. Другим ограничением этой методики является то, что окрашивание тетрамером ПКИКЖ первую очередь позволяет обнаружить Т-клеток, выражающих средне высоким сродством Т-клеточных рецепторов (TCR) 41. С другой стороны, CD8 + Т-клетки, экспрессирующие низкие ТКО сродства, которые не окрашивают ПКИКЖ тетрамеров можно легко обнаружить с помощью IFN-γ ELISPOT 41. Кроме того, ПКИКЖ тетрамерами может связываться с так называемых истощенных CD8 + Т-лимфоцитов, которые распространены в хронических вирусных инфекций 42,43, тем самым искажая функциональную оценку антиген-специфическая клеточный иммунные ответы. FinaLLY, ПКИКЖ тетрамером окрашивание и ICS обычно требуют высококвалифицированного персонала, сравнительно дорогие реагенты, сложные инструменты и специальные средства, что делает эти методы чрезвычайно трудно реализовать в клиническое наблюдение обстановке.
Будущие приложения: двухцветный ELISpot анализы, способные одновременно обнаруживать производство как IFN-γ и IL-2 44 и двух-и трех-цветных методов fluorospot 45 породили значительный интерес, так как они позволяют оценка полифункциональности антигенспецифического Т лимфоцитов, что является важной особенностью эффективным клеточных иммунных ответов, опосредованных 46.
Критические шаги в протоколе: Дополнительные технические вопросы должны быть внимательно рассмотрены. Потому что многие переменные могут повлиять пятна качества (то есть размер и плотность) и онемелиэ-э, соблюдение протокола имеет важное значение для достижения чувствительные и воспроизводимые результаты. Последовательное использование конкретных марок моноклональных антител (захвата и обнаружения), ELISpot пластин с ПВДФ-мембраны, и 35% этанола для мембранной обработки перед покрытием имеет большое значение. Например, избыточности лечения этанолом может влиять на производительность и качество анализа пятна. Для предотвращения получения неинформативные скважин (т.е.> 300 пятна), мы рекомендуем использовать не более 2 х 10 5 РВМС на лунку. При столкновении с низких частотах антиген-специфических Т-клеток, анализ чувствительности может быть повышена путем prestimulating клеток в пробирке с антигеном или расширить их поликлональных активаторов, таких как фитогемагглютинином (ФГА) в течение определенного периода времени (обычно 3-7 дней) 38 . Однако окончательное оптимизирован порядок ВВО ELISpot анализа представленных здесь не включает в пробирке prestimulation и / или шагов расширения. Количество и Qualitу пятен были похожи по инкубационного диапазоне 16-21 час. За 21 часа инкубации пятна были часто более размытыми, а иногда перекрываются, что делает их перечисление сложнее. Кроме того, перемещение пластины в то время как клетки инкубации может привести к плохо определенных улитки след пятен, которые также более трудно рассчитывать. Дополнительные сигналы неисправностей приведены в таблице 1.
При использовании автоматизированных пятна счетчика, чувствительность и размер пятна стробирования устанавливаются с использованием положительного контроля (анти-CD3 моноклональные антитела) и отрицательный контроль (AIM-V среде, дополненной 2% (об / об) IHS). Важными характеристиками, чтобы рассмотреть во время точечной перечисления являются размер и форма (рис. 4). Бывший позволяет различать Т-клеток, полученных цитокинов пятна от фоновых пятен, которые должны игнорироваться. Пятно число обеспечивает оценку частоты VZV специфических Т-клеток, присутствующих в данном PBMC образца, в то время как размер пятна отражает, сколько IFN-γ производится каждый отдельных клеток.
Насколько нам известно, это единственный IFN-γ метод ELISpot, что делает использование γ облученного живые ослабленные вакцины VZV в качестве антигена 4. Панели перекрывающихся синтетических пептидов (15-меры) также были использованы в качестве антигена, в том числе смеси пептидов, основанных на аминокислотной последовательности фосфопротеина VZV IE63. IE63 является высокую иммуногенность 47 и, кажется, решающее значение для вирусной инфекционной и установления задержки 48. IE63 конкретные Т-клетки были обнаружены в здоровых ВВЗ серопозитивных доноров 15, что свидетельствует, что IE63 является важным объектом клеточный иммунитет, направленный против ВВЗ. Однако реактивные клетки были обнаружены в значительной степени CD4 + Т-клетки 15.
ВВО IFN-γ ELISpot анализ ранее был использован на огруппа ур оценить ВВЗ конкретных Т-клеточные ответы у 28 детей, перенесших UCBT для лечения опухолевых или наследственное нарушение крови 4. Результаты, которые были получены в ходе этого исследования показали, что оба CD4 + и CD8 + Т-клеток подмножества были причастны производства IFN-γ и что воссоздания наивных CD8 + Т-клеток отсеке привело к более надежной VZV специфический клеточный иммунный ответ у сроки производства IFN-γ. Важно отметить, что эти результаты также показали, что обнаружение более чем 150 SFU на 10 6 РВМС согласуется с Т-клеток, опосредованной защиты от VZV-инфекции или реактивации 4. Однако это пороговое значение для VZV специфического клеточного иммунитета в контексте UCBT и последующего восстановления иммунитета или отсутствие таковых должны быть проверены в больших перспективных исследований многоцентровыми.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить участников исследования и их родителей. Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Режан Lapointe (CHUM Notre-Dame, Монреаль, Канада) для доступа к его ELISpot читателя, д-р Любо Александрова для статистического анализа, и Денис Blais, Сандра Кэрон, Сильвия Валуа и Мартин Caty для экспертно-техническое помощь. При поддержке грантов от ле Fonds d'операции налить ле PROJETS по исследованиям Clinique др. d'Evalution DES технологий (ЧУ Sainte-Justine) для HS и ПО, по-ла Fondation Centre де cancérologie Charles-Бруно, а к лейкемии и лимфомы общества Канада. МФС была поддержана стипендии от ла Fondation CHU Sainte-Justine и ле Fonds де-ла-Recherche Квебека-Здоровье (FRQS). AJG был удостоен стипендии от кафедры микробиологии, инфектологии и иммунологии, Университета Монреаля (Gabriel-Маркиз стипендий), FRQS, и канадские институты здравоохранения Rсследования (CIHR). Н.М. поддержали ла Fondation CHU Sainte-Justine, Коула Foundation, и FRQS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leucocep tube | VWR | 89048-936/89048-932 | 12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood. |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Protect from light. |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70746-3 | Keep at -20 °C. |
| MultiScreenHTS-IP Filter Plate | Millipore | MSIPS4W10 | Sterile with pore size of 0.45 µm. |
| Mouse anti-human IFN-γ capture antibody | BD Biosciences | 551221 | NIB42 clone. |
| Pepmix VZV IE63 | JPT Peptide Technologies | PM-VZV-IE63 | Dissolve contents of one vial in 40 μl of DMSO. Use within 6 months. |
| Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody | BD Biosciences | 554550 | 4SB3 clone. |
| Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase | Bio-Rad Life Science | 170-3554 | Dilute for use on the same day. |
| BCIP/NBT | Bio-Rad Life Science | 170-6432 | Protect from light. |
References
- Ballen, K. K., et al. Umbilical cord blood transplantation: the first 25 years and beyond. Blood. 122 (4), 491-498 (2013).
- Vandenbosch, K., et al. Varicella-zoster virus disease is more frequent after cord blood than after bone marrow transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (8), 867-871 (2008).
- Barker, J. N., et al. Serious infections after unrelated donor transplantation in 136 children: impact of stem cell source. Biol. Blood Marrow Transplant. 11 (5), 362-370 (2005).
- Merindol, N., et al. Reconstitution of protective immune responses against cytomegalovirus and varicella zoster virus does not require disease development in pediatric recipients of umbilical cord blood transplantation. J. Immunol. 189 (10), 5016-5028 (2012).
- Feldman, S., et al. Varicella in children with cancer: Seventy-seven cases. Pediatrics. 56 (3), 388-397 (1975).
- Arvin, A. M. Varicella-Zoster virus: pathogenesis, immunity, and clinical management in hematopoietic cell transplant recipients. Biol. Blood Marrow Transplant. 6 (3), 219-230 (2000).
- Wiegering, V., et al. Varicella-zoster virus infections in immunocompromised patients - a single centre 6-years analysis. BMC Pediatr. 11, 31 (2011).
- Boeckh, M., et al. Long-term acyclovir for prevention of varicella zoster virus disease after allogeneic hematopoietic cell transplantation--a randomized double-blind placebo-controlled study. Blood. 107 (5), 1800-1805 (2006).
- Boeckh, M. Prevention of VZV infection in immunosuppressed patients using antiviral agents. Herpes. 13 (3), 60-65 (2006).
- Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: a global perspective. Biol. Blood Marrow Transplant. 15 (10), 1143-1238 (2009).
- Ljungman, P., et al. Long-term acyclovir prophylaxis in bone marrow transplant recipients and lymphocyte proliferation responses to herpes virus antigens in vitro. Bone Marrow Transplant. 1 (2), 185-192 (1986).
- Selby, P. J., et al. The prophylactic role of intravenous and long-term oral acyclovir after allogeneic bone marrow transplantation. Br. J. Cancer. 59 (3), 434-438 (1989).
- Distler, E., et al. Recovery of varicella-zoster virus-specific T cell immunity after T cell-depleted allogeneic transplantation requires symptomatic virus reactivation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (12), 1417-1424 (2008).
- Levin, M. J., et al. Decline in varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity with increasing age and boosting with a high-dose VZV vaccine. J. Infect. Dis. 188 (9), 1336-1344 (2003).
- Jones, L., et al. Phenotypic analysis of human CD4+ T cells specific for immediate-early 63 protein of varicella-zoster virus. Eur. J. Immunol. 37 (12), 3393-3403 (2007).
- Czerkinsky, C., et al. Reverse ELISPOT assay for clonal analysis of cytokine production. I. Enumeration of gamma-interferon-secreting cells. J. Immunol. Methods. 110 (1), 29-36 (1988).
- Hutchings, P. R., et al. The detection and enumeration of cytokine-secreting cells in mice and man and the clinical application of these assays. J. Immunol. Methods. 120 (1), 1-8 (1989).
- De Castro, N., et al. Varicella-zoster virus-specific cell-mediated immune responses in HIV-infected adults. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 27 (10), 1089-1097 (2011).
- Jones, L., et al. Persistent high frequencies of varicella-zoster virus ORF4 protein-specific CD4+ T cells after primary infection. J. Virol. 80 (19), 9772-9778 (2006).
- Malavige, G. N., et al. Viral load, clinical disease severity and cellular immune responses in primary varicella zoster virus infection in Sri Lanka. PLoS One. 3 (11), (2008).
- Sadaoka, K., et al. Measurement of varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity: comparison between VZV skin test and interferon-gamma enzyme-linked immunospot assay. J. Infect. Dis. 198 (9), 1327-1333 (2008).
- Smith, J. G., et al. Development and validation of a gamma interferon ELISPOT assay for quantitation of cellular immune responses to varicella-zoster virus. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8 (5), 871-879 (2001).
- Ouwendijk, W. J., et al. T-cell immunity to human alphaherpesviruses. Curr. Opin. Virol. 3 (4), 452-460 (2013).
- Rowland-Jones, S. L., et al. Cytotoxic T cell responses to multiple conserved HIV epitopes in HIV-resistant prostitutes in Nairobi. J. Clin. Invest. 102 (9), 1758-1765 (1998).
- Alter, G., et al. Human immunodeficiency virus (HIV)-specific effector CD8 T cell activity in patients with primary HIV infection. J. Infect. Dis. 185 (6), 755-765 (2002).
- Lechner, F., et al. Analysis of successful immune responses in persons infected with hepatitis C virus. J. Exp. Med. 191 (9), 1499-1512 (2000).
- Fournillier, A., et al. A heterologous prime/boost vaccination strategy enhances the immunogenicity of therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J. Infect. Dis. 208 (6), 1008-1019 (2013).
- Adetifa, I. M., et al. Interferon-γ ELISPOT as a biomarker of treatment efficacy in latent tuberculosis infection: a clinical trial. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187 (4), 439-445 (2013).
- Lalvani, A., Pareek, M. A 100 year update on diagnosis of tuberculosis infection. Br. Med. Bull. 93, 69-84 (2010).
- Berger, R., et al. A dose-response study of a live attenuated varicella-zoster virus (Oka strain) vaccine administered to adults 55 years of age and older. J. Infect. Dis. 178 Suppl. 1, (1998).
- Trannoy, E., et al. Vaccination of immunocompetent elderly subjects with a live attenuated Oka strain of varicella zoster virus: a randomized, controlled, dose-response trial. Vaccine. 18 (16), 1700-1706 (2000).
- Brunner, K. T., et al. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
- Moretta, A., et al. Quantitative assessment of the pool size and subset distribution of cytolytic T lymphocytes within human resting or alloactivated peripheral blood T cell populations. J. Exp. Med. 158 (2), 571-585 (1983).
- Jung, T., et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 159 (1-2), 197-207 (1993).
- Maecker, H. T., et al. Standardization of cytokine flow cytometry assays. BMC Immunol. 6, 13 (2005).
- Nomura, L., et al. Standardization and optimization of multiparameter intracellular cytokine staining. Cytometry A. 73 (11), 984-991 (2008).
- Letsch, A., Scheibenbogen, C. Quantification and characterization of specific T-cells by antigen-specific cytokine production using ELISPOT assay or intracellular cytokine staining. Methods. 31 (2), 143-149 (2003).
- Merindol, N., et al. Umbilical cord blood T cells respond against the Melan-A/MART-1 tumor antigen and exhibit reduced alloreactivity as compared with adult blood-derived T cells. J. Immunol. 185 (2), 856-866 (2010).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Scriba, T. J., et al. Ultrasensitive detection and phenotyping of CD4+ T cells with optimized HLA class II tetramer staining. J. Immunol. 175 (10), 6334-6343 (2005).
- Stone, J. D., et al. Interaction of streptavidin-based peptide-MHC oligomers (tetramers) with cell-surface TCRs. J. Immunol. 187 (12), 6281-6290 (2011).
- Pantaleo, G., et al. Evidence for rapid disappearance of initially expanded HIV-specific CD8+ T cell clones during primary HIV infection. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94 (18), 9848-9853 (1997).
- Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. Immunol. 12 (6), 492-499 (2011).
- Boulet, S., et al. A dual color ELISPOT method for the simultaneous detection of IL-2 and IFN-gamma HIV-specific immune responses. J. Immunol. Methods. 320 (1-2), 18-29 (2007).
- Ahlborg, N., Axelsson, B. Dual- and triple-color fluorospot. Methods Mol. Biol. 792, 77-85 (2012).
- Precopio, M. L., et al. Immunization with vaccinia virus induces polyfunctional and phenotypically distinctive CD8(+) T cell responses. J. Exp. Med. 204 (6), 405-1416 (2007).
- Sadzot-Delvaux, C., et al. Recognition of the latency-associated immediate early protein IE63 of varicella-zoster virus by human memory T lymphocytes. J. Immunol. 159 (6), 2802-2806 (1997).
- Malavige, G. N., et al. IE63-specific T-cell responses associate with control of subclinical varicella zoster virus reactivation in individuals with malignancies. Br. J. Cancer. 102 (4), 727-730 (2010).
