Summary
Bu tür tek hücre düzeyinde sitokin üretimi tespit etmek ve T hücre yanıtlarının hem nicel hem de nitel karakterizasyonu sağlanmıştır interferon gamma (IFN-γ) ELISpot, gibi fonksiyonel deneylerde sahip yeni kuşak varicella zoster karşı hücre aracılı bağışıklık tepkilerini ölçmek için kullanılabilir virüsü (VZV).
Abstract
Varisella zoster virüsü (VZV) göbek kordon kanı nakli (UCBT) aşağıdaki morbidite ve mortalitenin önemli bir nedenidir. Bu nedenle, antiherpetic profilaksi VZV enfeksiyonu ile ilişkili komplikasyonların önlenmesi için pediatrik UCBT alıcıya sistematik idare, ancak optimal süresini tanımlar hiçbir güçlü, kanıta dayalı görüş birliği yoktur. T hücrelerinin aracılık ettiği bağışıklık UCBT profilaksi muhafaza edilmelidir veya kesilmelidir olup olmadığını olarak endikasyonlar sağlayabilir aşağıdaki VZV spesifik T hücresi tepkilerinin değerlendirilmesi sulandırma, VZV enfeksiyonu kontrolünden sorumlu olduğu için. Bu amaçla, bir VZV belirli bir interferon gamma (IFN-γ) enzim-bağlı immünospot (ELISpot) deneyi ışınlanmış Canlı zayıflatılmış VZV aşısı ile in vitro uyarılmasına karşılık olarak T lenfositler tarafından IFN-γ üretimi karakterize etmek için geliştirilmiştir. Bu tahlil VZV özel c hızlı, tekrarlanabilir ve hassas ölçüm sağlarell klinik ortamda VZV spesifik bağışıklığın sulandırma izlenmesi ve VZV antijenlerine karşı bağışıklık tepkisini değerlendirmek için uygun bir bağışıklık aracılı.
Introduction
İlk olarak 1989 yılında gerçekleştirilen UCBT giderek çocuklarda 1, çeşitli neoplastik ve neoplastik olmayan kan hastalıklarının tedavinin bir parçası olarak kullanılmaktadır. VZV iki farklı hastalıklar, suçiçeği (primer enfeksiyon sonrası) ve herpes zoster (reaktivasyonu) neden sitopatik insan alfaherpesvirüs olduğunu. Birincil enfeksiyonu takiben, VZV dorsal kök gangliyon duyu sinirlerinin içinde korunaklı konağın ömrü boyunca devam. UCBT izleyen en çok tehdit eden bulaşıcı komplikasyonlarından biridir VZV 2-4 ile ilişkilidir. Klinik merkezinde, VZV profilaksi yokluğunda, 3 yılda VZV hastalık VZV hastalığının kümülatif insidans postUCBT 46% 2 idi. Bu hastalarda, de novo enfeksiyonu ya VZV reaktivasyonu çoğu, merkezi sinir sistemi, akciğer ve karaciğer 5-7 için iç organ yayılması ile ilişkilidir. Bir sonuç, asiklovir, valasiklovir veya famsiklovire profilaksi yaygın UB ile yönetilmektedir gibiBT alıcıları 8,9. Bununla birlikte, bu tedavi stratejisi dikkate VZV spesifik T lenfositleri ya da VZV spesifik T hücre yanıtlarının sulandırma kinetikleri koruyucu potansiyelini almaz. Uzun vadeli antiherpetic profilaksi genişleyen kullanımı ile ilgili potansiyel sorunları a) hastanın tedavi alması içerir; b) antiviral ilaç direnci 10,11 geliştirilmesi; c) VZV spesifik bağışıklık sulandırma 12,13 bozukluğu. Fonksiyonel VZV spesifik T lenfositlerinin tespiti nakil sonrası dönemde VZV karşı hücre aracılı bağışıklık karşılıklarının izlenmesi, VZV enfeksiyondan uzun süreli koruma varlığı ve geliştirilmiş bir klinik sonuç ile ilişkilidir 4,14,15 için antiviral, daha rasyonel kullanımı neden olabilir VZV'nin yararlanacak hastaların ayırt hekimlerini sağlayarak tedavi bağışıklık sistemi VZV replikasyonu 4,13 kontrol edebilen olanlardan profilaksi.
IFN-γ ELISpot deney sistemleri yaygın olarak deneysel ve klinik koşulların çeşitli izleme hücre aracılı bağışıklık tepkileri için kullanılır. Noktalar reaksiyonun yerinde görünür ve istikrarlı bir çökelti oluşacak şekilde, bir kromojenik substratın yarılması aşağıdaki oluşturulur. Her bir nokta ve böylece tek bir sitokin üreten hücrenin ayak izini temsil eder. IFN-γ ELISpot ortak kökenli bir antijen ile in vitro uyarılmaya yanıt olarak IFN-γ üretilmesi için, tek tek hücrelerin ex vivo yeteneğini ölçer değil, ama aynı zamanda, belirli bir hücre popülasyonu 16,17 hücreleri yanıt frekansının bir tahmin sağlar. Yüksek hassasiyet ek olarak, IFN-γ ELISpot antiviral tedavinin başlatılması veya bırakma rehberlik hedefleyen kişiye klinik protokollerin bağlamında muhtemel kullanımı hale gerçekleştirmek için basittir. Bu işlem aşağıda ayrıntılı olarak describes özellikle VZV antijenleri ile elde edilen in vitro uyarımı takiben periferal kan mononükleer hücreleri tarafından IFN-γ üretimini tespit etmek ve ölçmek için tasarlanmış bir ELISPOT deneyi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu araştırma protokolü çalışmanın yapıldığı CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, Kanada, Kurumsal Etik Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanmıştır. Aydınlatılmış onam aranan ve tüm katılımcıların, ebeveynleri ya da yasal velileriyle elde edilmiştir. Bütün prosedürler gün 1 ve 2 üzerinde gerçekleştirilir (bir laminar akış başlığı altında Kalkış) steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir. Insan kanı işleme için standart güvenlik prosedürleri kesinlikle uyulmalıdır.
1.. Tabaklar Kaplama
- Her bir kuyu için, 1 dakika boyunca% 35 etanol içinde 20 ul eklenmesi ile 96 oyuklu MultiScreen IP beyaz ELISpot plakaların altındaki (PVDF) membran geçirgenliği. Zarlar hafifçe saydam olmalıdır.
- Bir mul kullanan; hemen 1 x fosfat tamponlu tuzlu su içinde 200 ul (137 mM NaCl, 2.7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7.4 PBS) ile 3 kere yıkayın gözenekleripipet veya benzeri bir cihaz tichannel. Bu adım, etanol tortuları, hücre yaşayabilirliğini etkilemedi ve yakalama antikoru bağlanmasını olabilir verilen önemlidir. ELISpot plakalar kırılgan ve dikkatle ele alınmalıdır: Bir otomatik plaka yıkayıcı kullanılması tavsiye edilmez.
- Coat 10 ug / ml 'lik bir son konsantrasyona PBS içinde 1x seyreltilmiş saflaştırılmış fare anti-insan IFN-γ yakalama antikoru 10 ul ile gözler. Düzenli plastik wrap ile tabak örtün ve 4 ° C'de bir gece inkübe
2.. Plates Engelleme
- Onları kuru dokunarak, kuyular boşaltın ve 1x PBS 200 ul plakaları 5 kez yıkayın.
- Tam RPMI 1640 ortamı içinde 200 ul ile doldurun ve kuyu (adım engelleme) 37 ° C'de 2 saat süreyle inkübe edin.
- Plakalar 1x PBS 200 ul 5x'e ve hücreler kaplama için hazır olana kadar tam 1x PBS kuyuları tutmak yıkayın.
3.. Hücre Kaplama ve Uyarım
- P hazırlayınstandart prosedürler kullanılarak Ficoll-Paque üzerinde gradyan santrifüj ile insan venöz kan örneklerinden eripheral kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC). Alternatif olarak, standart yöntemler kullanılarak, sıvı azot altında dondurulmuş PBMC'nin alikotları eritin. Son santrifüjleme, tekrar süspansiyon ml 2 x 10 6 hücre / bir son konsantrasyonda hücre ve bir su ceketi, bir kuluçka makinesi içinde% 5 CO2 atmosferi altında 37 ° C'de gece boyunca inkübe sonra.
- Inkübatörden PBMC çıkarın ve tam RPMI 1640 ortamı içinde, 5 ml lik bir nihai hacim içinde bunları tekrar süspansiyon.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca Serratia marcescens'in gelen genetik olarak endonükleaz 10 ul varlığında PBMC'nin inkübe edin.
- PBMC, 50 ul bir kısım çıkarın ve tripan mavi boya, 50 ul ile karıştırın. Hücrelerin sayısı ve bir hemositometre ve mikroskopik inceleme (boya dışlama yöntemi) kullanılarak% canlılığı tahmin. Hücre sayımı ve hücre viyabilite kutu al değerlendirilmesi için çeşitli otomatik yöntemlerböylece kullanılabilir. PBMC>% 95 uygun olmalıdır. Canlılığı% 95 daha düşük olduğu zaman örnek atın.
- 5 dakika ıskarta yüzer ve 2 x 10 6 hücre / ml 'lik bir nihai konsantrasyonda% 2 (v / v) ile etkisiz hale getirilmiş insan serumu (HIS) ile desteklenmiş AIM-V ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri için 700 x g'de santrifüjleyin PBMC. Uyarım karışımları plakaya ilave kadar 37 ° C'de tutun.
- , Oyuklara her seferinde bir damla, uygun uyarım karışımından 100 ul ekleyin. Aşağıda tarif edildiği gibi üç uyarım karışımları da kullanılabilir olmalıdır:
- Kullanım AIM-V ortamı,% 2 (v / v) inaktive edilmiş insan serumu (IHS), negatif kontrol ile takviye edilmiştir.
- 0.5 ug / ml, pozitif kontrol olarak) bir son konsantrasyon elde etmek üzere% 2 (v / v) ile takviye edilmiş IHS AIM-V ortamı içinde seyreltilmiş anti-CD3 monoklonal antikoru (klon OKT3) kullanın.
- Γ-ışınlanmış ya biçiminde, VZV antijenleri için (10,000 Gy, 30 dakika maruz kalma süresi) zayıflatılmış aşı, VZV (1350 plak oluşturan birim [PFU] / ml) canlı dilüsyonuAIM-V ortamı içinde 1:200 ted% 2 (v / v) IHS) ya da hemen erken VZV'nin dizisi (IE63) fosfoprotein göre sentezlenen 67 peptidler (15 amino asit kalıntıları) eşmolar bir karışımı ile takviye edilmiş 1 ug . PBMC kültürlerinde 4 gün sonra sitopatik etkilerin gözle görülür yokluğunu izleyerek ışınlama etkinliğini kontrol edin.
- Iki kopya halinde her kuyu hazırlayın.
- , Oyuklara her seferinde bir damla, uygun oyuklara aşama 5.4 'de hazırlanan hücre 100 ul ekleyin. Iki kuyu hücre (negatif kontrol) olmadan bırakılmalıdır. Bir su ceketi, bir kuluçka makinesi içinde% 5 CO2 atmosferi altında 37 ° C'de 20 saat boyunca inkübe edin. , Sallamak, taşımak veya inkübasyon sırasında birbiri üstüne tabak koymayın.
4. Nokta Gelişim ve Algılama
- Atın hücreleri ve 1 x PBS ile yıkayın plakaları 10x% 0.05 (v / v) Tween 20 (PBST) ile takviye edilmiştir. Tween 20 PVDF bana yapışmış hücreleri ayırmak olurgece boyunca inkübasyonu takiben mbrane.
- Bir çok kanallı pipet kullanarak, 0.5 mg, 100 ul ekle / ml biyotin konjuge edilmiş anti-IFN-γ monoklonal antikor (w / v) inek serum albümini (BSA) ihtiva eden% 0.5 1x PBS içerisinde seyreltilmiş (4S.B3 klon). Oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edin.
- Oyuklar PBST ile 6x yıkayın ve her bir (ağırlık / hacim),% 0.5 BSA ihtiva eden PBS içinde 1 x 1:1,000 seyreltilmiş alkalin fosfataz ile streptavidin conjugatd 100 ul ilave edin. Kapak plakaları ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir.
- Plakalar, PBST ile 3 kez yıkanır ve 1 x PBS ile 3 kez. Bir 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat (BCIP) / nitro blue tetrazolyum klorid (NBT) alt-tabaka çözeltisi 100 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir.
- Distile akan su altında plakaları yıkayın. ELISpot levhasının alt bölümü çıkarın ve damıtılmış su ile, zarın her iki tarafında yıkayın. Hava plakaları kurutunuz.
- Kuyuları incelemek ve bir stereoskopik d kullanarak noktalar numaralandırmakissection mikroskop veya otomatik bir nokta sayacını kullanarak plakaları tarayın. Aynı gün incelenebilir edemez ışıktan uzakta plakaları tutun.
- Karşılık gelen bir çift kaynaklar içerisinde sayılmıştır lekelerin sayısı ortalama ve test kaynaklar içerisinde sayılmıştır lekelerin sayısı, negatif kontrol kaynaklar içerisinde sayılmıştır lekelerin sayısı (hücre yok), çıkarın.
- 10 6 PBMC başına nokta oluşturucu birimlerinin sayısı (SFU) halinde IFN-γ üretimini ifade eder.
- SFU sayısı, negatif kontrol üzerinde> 50, 10 başına 6 PBMC ve 2 standart sapma (SD) ise, bu test numune pozitif düşünün (hücreler + AIM-V ortamı,% 2 (v / v), HIS ile takviye edilmiştir).
- Noktalar sayılacak kadar çoktur olduğunda kuyunun başına 400 SFU bir değer kullanın.
- Test ELISpot veriler normal Kolmogorov-Smirnov testi kullanılarak dağıtılan olsun veya olmasın. Veriler normal dağıldığı zaman, Student t tes kullanılarak istatistiksel karşılaştırmalar yapmakt (2 grup) ya da ANOVA ve Bonferroni post-testi (çoklu karşılaştırmalar). Veriler normal dağılım değilseniz, Mann-Whitney U testi (2 grup) ya da Kruskal-Wallis testi ve Dunn post-test (çoklu karşılaştırmalar) kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda ayrıntıları verilen IFN-γ ELISpot protokol büyüklüğünü ve VZV 4 karşı hücre aracılı bağışıklık tepkilerinin kalitesini ölçmek için geliştirilen ve laboratuarımızda optimize edilmiştir. VZV antijenin çeşitli kaynaklardan stimülasyon aşaması için kullanılabilir. Bunlar aşağıdakileri içerir: a) VZV den ticari olarak temin edilebilen inaktive edilmiş deterjan özleri Vero hücreleri 18, enfekte olmuş; IE63 15 ve 19 dahil olmak üzere belirli orf4 VZV kodlanmış proteinlerin, sentetik peptidler, üst üste binen b) havuzları; c) zayıflatılmış varisella zoster aşısı 20 yaşamak; ve d) VZV'nin UV etkisiz hale getirilmiş terkiplerin kesintiye VZV süpernatanından antijenleri MRC hücreleri 14 etkilemiştir. Hücre kültürü antijen kaynağı ve hazırlanmasında tekdüzelik sağlamak için ve bir klinik ortamda nozokomiyal transmissio canlı vahşi tipli VZV suşlarının kültürü ve manipülasyon sınırlamak amacıyla VZV türetilmiş üzerinde bizim durumda, canlı zayıflatılmış aşının VZV seyreltileri tercih edildin ciddi bir endişe 10 olduğunu. Buna ek olarak, γ ışınlama için teslim edilebildiği γ radyasyon dozları ile karşılaştırmalı hassas UV inaktivasyonu 21 tercih edilmiş ve UV farklı olarak, γ-ışınları etkin bir VZV havi kapatılmış şişeler nüfuz için. Viral stokların ışınlanması test VZV antijeni (Şekil 1) her dilüsyonlarda sağlıklı donörden alınan PBMC örneklerinde VZV spesifik IFN-γ üreten hücrelerin frekansı sürekli yüksek tahminleri yol açtı. Bu muhtemelen, hücre kültüründe, canlı zayıflatılmış VZV tarafından uyarılan sitopatik etkilerin azaltılması sonucudur.
Seyreltme VZV antijen 10 6 PBMC başına SFU sayısı açısından maksimal okumalarını elde belirlemek için, IFN-γ ELISpot canlı zayıflatılmış aşının VZV ışınlanmış γ iki kat seyreltileri kullanılarak gerçekleştirilen ve PBMC örnekleri yaş bağışıklığı çocuk bir gruptan elde edilmiştir 9 ay ve 12 ye arasındakisuçiçeği ve / veya pozitif bir VZV için seroloji (n = 50) bir belgelenmiş öyküsü ars. . Çalışma konuları Haziran 2007 ve Eylül 2009 tarihleri arasında Enfeksiyon Hastalıkları Kliniği ve CHU Sainte-Justine Özel İmmünoloji Kliniği, alındı istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar 1:200, 1 kullanılarak elde edilmiştir IFN-γ üreten hücrelerin ortanca frekanslar arasında gözlenmiştir: VZV antijen (p <0.0001, Kruskal-Wallis testi) (Şekil 2) 400 ve 1:800 dilüsyonları. Bu eşitsizlikler 1:200 seyreltme arasındaki farka göre muhasebeleştirilmiştir (medyan = 10 6 PBMC'den başına 115.0 sfu; çeyrekler arası aralık [DAG] = 75.0 - 10 6 PBMC'den başına 232.5 SFU) ve 1:800 seyreltme (ortanca = 50.0 sfu 10 6 PBMC'ye başına; DAG = 20.0 - 10 6 PBMC'den başına 105.0 SFU) ve 1:400 seyreltme (medyan arasındaki = 92,5 10 6 PBMC'den başına sfu; DAG = 52.5 - 10 6 PBMC'den başına 177.5 SFU) ve 1:800 seyreltme (p <0.001 ve p (Şekil 2). Bu nedenle, γ en 1:200 seyreltme canlı-zayıflatılmış aşı VZV VZV belirli bir hücre aracılı bağışıklık tepkilerinin rutin ölçümlerinde kullanılmak üzere seçildi radyasyona tabi tutulmuştur.
IFN-γ üretim CD4 + ve / veya CD8 + T lenfosit alt bulunur olup olmadığını belirlemek için, sağlıklı donörden alınan PBMC örnekleri, anti-CD4 veya anti-CD8 antikoru bağlanmış manyetik boncuklar kullanılarak, CD4 + ya da CD8 + hücrelerinin tükenmesi tabi tutulmuştur üreticinin talimatlarına göre. Daha önce yayınlanan raporlar 22,23 ile uyumlu olarak, CD4 + hücrelerinin tükenmesi, VZV antijenin 1:100, 1:200 ve 1:400 seyreltiler kullanılarak elde edildi IFN-γ üreten hücrelerin frekanslarda çarpıcı bir azalma ile sonuçlanmıştır CD8 + hücrelerinin tükenmesi gibi azaltılması ve pozitif kontrol yol değil ises (anti-CD3 monoklonal antikor ile stimülasyonu) benzer şekilde (Şekil 3) etkilenmemiştir. Bu sonuçlar, VZV antijenleri ile uyarılmaya yanıt olarak IFN-γ üreten hücrelerin çoğu CD4 + T hücreleri olduğunu göstermektedir. Alternatif olarak, bu sonuçlar, PBMC havuzundan (örneğin monositler, dendritik hücreler) CD4 + antijen sunan hücreler tükenmesi kaynaklanıyor olabilir, VZV sunum düşük düzeylerine yol açan CD8 + T lenfositlerinin müdahaleyi antijenleri. Işınlanmış VZV'nin kullanılması CD4 hakimiyeti karşı tepkisinin baskının eğri katkıda pek mümkün değildir, benzer sonuçlar farklı teknikler ve antijen kaynakları 14,21,22 kullanan diğer gruplar tarafından elde edilmiştir. Örnek ELISpot kuyu düşük büyütme mikrografı Şekil 4'te sunulmuştur.
| Sorun / konu | Olası nedenleri | Remedy / çözüm </ Td> |
| Yüksek background / Kötü tanımlanmış veya birleşen noktalar | Ölü hücrelerin yüksek sayılar. | Kültür set-up ve uyarılmadan önce hücre canlılığını değerlendirmek. |
| Yetersiz membran ön ıslatma adımlar. | 1 dakika sonra gri ön ıslatma zamanı ve bu membran dönüş saygı emin olun. % 35 etanol, kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır. | |
| Tabaklar kuluçka döneminde taşındı. | Kötü tanımlanmış salyangoz izi lekelerini önlemek için plakaları hareket etmeyin. | |
| Adımları yıkayın. | Elle yıkama plaka pullar daha verimlidir. | |
| Protein agrega oluşumu. | Arka plan ve yanlış pozitif noktaları azaltmak için hem yakalama ve algılama antikorları filtre. | |
| İkincil ve algılama antikoru konsantrasyonu. | Biotinli se ayarlayınarka planı azaltmak için İkinci basamak / algılama antikoru konsantrasyonu. | |
| Soğuk geliştirme reaktifleri. | Azgelişmişliğin-önlemek için alt tabaka oda sıcaklığına getirin. | |
| Hayır noktalar / Boş kuyular | Kötü noktalar tanımlanır. | Farklı kuyularda homojen bir sıcaklık var kuluçka döneminde tabak koymayın. |
| Uyarım substrat iyi hazırlanmış değil. | Kristal oluşumunu önlemek için, 15 dakika boyunca oda sıcaklığına kadar peptit karışımı kısım getirin. | |
| Hücre topaklanma. | Nokta oluşturan birimlerin küçümsenmesi önlemek için tek hücre süspansiyonu içine hücreleri tekrar. | |
| Hücreler, uygun uyarılmamıştır. | Bir pozitif kontrol olarak bir poliklonal aktivatörü kullanın. | |
| Tween-20 tarafından enzim reaksiyonunun engellenmesi. | OlduBCIP / NBT substrat çözeltisi ilave edilmeden önce PBS ile h plakalar. | |
| Yanlış antikor çiftleri. | Yakalama ve algılama antikorlar farklı antijenik epitoplarla tepki emin olun. |
Tablo 1. Ek sorun giderme.
Gibi IFN-γ üreten hücrelerin sıklığı canlı VZV inaktif aşı γ-radyasyon Şekil 1.. Etkisi kullanılarak belirlendi IFN-γ ELISpot. VZV spesifik IFN-γ ELISPOT bir kontrol gönüllüden PBMC Protokol metin altında tarif edildiği gibi gerçekleştirildi ve daha (10,000 Gy) ışınlanmış γ seri seyreltileri VZV antijen olarak zayıflatılmış canlı aşı. Veri yinelenen Dış ölçü ortalamasını temsilNTS ve hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil eder. PBMC: Periferik kan mononükleer hücreleri; SFU: birimleri oluşturan nokta; VZV: varicella zoster virüsü.
VZV'nin Şekil 2. Kantitasyonu özel hücre ile önceki enfeksiyon belgelenmiş kanıt olan çocuklarda immün yanıtları aracılı VZV. VZV spesifik PBMC'nin suçiçeği öyküsü olan kişilerde izole (n = 50) kullanılarak Protokol Metin altında açıklandığı gibi IFN-γ ELİSPOT yapıldı ve (10.000 Gy) ışınlanmış γ seri seyreltileri VZV antijen olarak zayıflatılmış bir canlı aşı. Yatay çizgiler kutular çeyrekler aralığı (DAG) temsil, medyan temsil ve bıyık değerlerin aralığını temsil eder. PBMC: Periferik kan mononükleer hücreleri; SFU: birimleri oluşturan nokta; VZV: varicella zoster virüsü .
Altında tarif edildiği gibi Şekil 3,. IFN-γ ELISpot. CD4 + tükenmesi ya da CD8 + hücreleri ve VZV spesifik IFN-γ ELISPOT kullanılarak ölçülen IFN-γ üreten hücrelerin sıklığına CD4 + ya da CD8 + hücrelerinin tükenmesi etkisi gerçekleştirilmiştir (10.000 Gy) ışınlanmış bir kontrol gönüllü ve γ seri seyreltmelerinden PBMC'yi kullanarak Protokol Metni antijen olarak zayıflatılmış VZV aşısı yaşıyor. Veriler kopya ölçümlerin ve hata çubukları, ortalama ortalamanın standart hatayı temsil etmektedir. PBMC: Periferik kan mononükleer hücreleri; SFU: birimleri oluşturan nokta; VZV: varicella zoster virüsü.
load/51643/51643fig4highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51643/51643fig4.jpg "/>
Şekil 4. Temsilcisi ELISpot kuyular. VZV spesifik IFN-γ (10.000 Gy) antijen olarak zayıflatılmış VZV aşısı canlı ışınlanmış beş kontrol gönüllüler ve γ seri seyreltmelerinden PBMC'yi kullanarak Protokol Metin altında açıklanan ELISpot yapıldı. İlk sıra: negatif kontrol (AIM-V ortamı,% 2 (v / v) ile takviye IHS); İkinci satır: pozitif kontrol (anti-CD3 monoklonal antikor); Üçüncü sıra: VZV antijen. Otomatik bir nokta sayacı ile ölçülmüş olarak, üst köşelerde sayılar oyuk başına SFU temsil eder. PBMC: Periferik kan mononükleer hücreleri; SFU: birimleri oluşturan nokta; VZV: varicella zoster virüsü; IHS: inaktive edilmiş insan serumu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Değişiklikler ve sorun giderme: IFN-γ ELISpot deneyleri, insan bağışıklık eksikliği virüsü tip 1 (HIV-1), 24,25, hepatit C virüsü (HCV), 26 dahil olmak üzere, mikrobiyal patojenler, çeşitli karşı hücre aracılı bağışıklık tepkilerini incelemek için kullanılmıştır, 27, ve Mycobacterium tuberculosis 28,29, sadece birkaç isim. Burada çocuk UCBT alıcıları kurtarma VZV spesifik immün rekonstitüsyon etkenleri tanımlayan ümidiyle, karşı olan hücresel bağışıklığın ölçülmesi için bir IFN-γ ELISpot deneyinin geliştirilmesi tarif.
Bu tahlilin anahtar özellikleri dört kat bulunmaktadır. İlk olarak, o zaman alıcı T hücrelerinin önce in vitro genişlemesi, gerektirmez. İkinci olarak, bu testler arası değişkenliği asgariye indirmek için en iyi dondurularak saklanmış PBMC örnekleri, kullanılarak yapılabilir. Buna ek olarak, dondurarak saklama ve paralel işlem de boyuna uzanan şekilde uyarlanmıştırNumuneler gruplar halinde işleme gerektirir nal çalışmalar. Üçüncü olarak, PBMC, bir ultra saf Serratia marcescens'in gelen genetik olarak endonükleaz kullanıldı ile tedavinin çözülme sırasında karşılaşılan hücre kümeleşmeyi önlemek için. Işlem daha önce gece boyunca oda sıcaklığında bırakılır kan örnekleri kullanarak eritme üzerine PBMC Hücre topaklanma daha sık ortaya çıkar. Serratia marcescens'in gelen genetik olarak endonükleaz birleşme kullanılan nükleaz düşük seviyelerde bu yana SFU açısından hücre canlılığı, hücre yüzeyi markerlerinin ifadesi ve aynı kökenli antijeni ile uyarılmaya tepki etkilediği bilinen değildir ve maruz kalma süresi 22 kısa olmasıdır. Dördüncü olarak, γ ışımaya canlı zayıflatılmış bir aşı VZV PBMC kullanıldı. Bu yüzden, antijen dozu ve hazırlanmasında tekdüzelik sağlamak için ve hastaların güvenlik ve klinik ortamda canlı VZV işlenmesi için ihtiyaç aşmak için hücre kültürü türetilmiş VZV tercih edilmiştirlaboratuvar personelinin önemli bir husustur. Birlikte ele alındığında, VZV-ELISpot tahlilinde tanıtıldı modifikasyonlar daha iyi bir klinik ortamda kullanılmak üzere adapte olmak için amaçlanmıştır.
Mevcut yöntem ile ilgili olarak teknik öneme Sınırlamalar: Basit hassas ve tekrarlanabilir yöntemler klinik takip süresi bağlamında mikrobiyal antijenlere karşı konakçı hücre aracılı bağışıklık tepkilerini ölçmek için gereklidir. IFN-γ ELISpot nispeten düşük teknolojili ekipman (santrifüjler, inkübatör, diseksiyon mikroskobu) kullanılarak venöz kan örnekleri üzerinde yapılabilir sağlam, tekrarlanabilir ve bilgilendirici bir testtir. Bununla birlikte, hali hazırda birden çok sitokin ve hücre yüzeyi markerlerinin eş zamanlı olarak tespit edilmesine izin verir vermez. Klasik bir CD4 + ve CD8 + sayımı antijen specifi için kullanılan geleneksel in vitro T hücresi çoğalma tahlilleri,c T hücresi yanıtları, emek yoğun duyarlılık eksikliği ve interassay değişkenlik 30,31 yüksek derecede muzdarip eğilimindedir. Öte yandan, sitotoksik T lenfosit tahlilleri (CTL) 51 Cr ve sınırlayıcı seyreltme analizi ile yüklü otolog hedefler lize göre mevcut olan bir antijene spesifik CD8 + T hücreleri, in vitro ölçmek için genleşme adımından zaman alıcı bağımlı olma eğilimindedir düşük habercisi 32,33 frekansları. Antijenik uyarımı (hücre içi sitokin boyama [ICS]) 34,35, aynı zamanda antijene özgü bağışıklık yanıtlarını karakterize etmek için kullanılabilir aşağıdaki sitokin salgılanmasını ölçmek sitometrisi göre tahlilleri akış. ICS sitokin üretimi ve tek hücre içinde fenotipik markerlerin hücre yüzeyi ekspresyonu aynı anda algılama izin verir. ICS duyarlılığı ELISPOT bu karşılaştırır, ama bu hücrelerin 36,37 daha fazla sayıda gerektirir. Floresan sınıf I veya sınıf II peptit-ma faydalanmak Yöntemlerimajör histo-uyumluluk kompleksi (pMHC) oligomerleri (pMHC tetramerleri) 38-40 hassas ve hücre yüzeyi markerlerinin ifadesi göre lenfosit alt setlerinin çok parametreli karakterizasyonu sağlar. Ancak, pMHC tetrameri boyama hantal olması ve belirli bir çalışma içine hasta kaydını sınırlayabilir hastaların insan lökosit antijen (HLA) tipi, önceden bilgi gerektirir. Bu tekniğin bir başka sınırlama pMHC tetramer boyama esas olarak, yüksek afiniteli, T hücre reseptörlerinin (TCR) 41 orta ifade eden T hücrelerinin algılanmasını sağlar olmasıdır. Öte yandan, pMHC tetramerleri ile boyanmış değildir düşük afiniteli TCRlerin eksprese CD8 + T hücreleri, hali hazırda IFN-γ ELISPOT 41 kullanılarak tespit edilebilir. Buna ek olarak, pMHC tetramerler ve böylece antijene spesifik hücre aracılı bağışıklık tepkilerinin fonksiyonel değerlendirme eğriltme, kronik viral enfeksiyonların 42,43 yaygın olan sözde tükenmiş CD8 + T lenfositlerinin bağlanabilir. FinaLly pMHC tetramer boyama ve ICS tipik bir klinik takip ortamda uygulamak için bu teknikler zordur yapma, yüksek eğitimli personel, nispeten pahalı reaktifler, sofistike araçlar ve özel olanaklar gerektirir.
Gelecek uygulamalar: Aynı anda IFN-γ ve IL-2 ve 44, çift-ve üçlü-renkli Fluorospot yöntemleri bu antijenin çok fonksiyonlu olması değerlendirilmesi spesifik T izin olarak 45, önemli ölçüde ilgi olan iki üretimini saptayabilen çift renkli ELISpot deneyleri etkili bir hücre aracılı bağışıklık tepkilerinin 46 arasında önemli bir özelliğidir lenfositler.
Protokol dahilinde kritik adımlar: Ek teknik sorunlar dikkatli bir önem verilmelidir. Pek çok değişken nokta kalitesini (yani büyüklüğü ve yoğunluğu) ve uyuşmuş etkileyebilir çünküer, protokole bağlılık duyarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek esastır. Spesifik monoklonal antikorların markaları (yakalama ve algılama), PVDF membran ile ELISpot plakaları ve kaplamadan önce membran tedavisi için% 35 etanol içinde sürekli kullanımı büyük önem taşımaktadır. Örneğin, etanol ile tedavilerin yapılması Deneyde ve spot kalite performansını etkileyebilir. Uninformative kuyu (yani> 300 lekeler) elde önlemek için, biz artık 5 10 x 2 den PBMC'yi kullanarak kuyu başına öneririz. Antijene spesifik T hücrelerinin düşük frekansları ile karşı karşıya, deney duyarlılık ortak kökenli bir antijen ile in vitro olarak prestimulating hücreleri tarafından geliştirilmiş ya da belirli bir zaman süresi için fitohemaglutinin (PHA) gibi poliklonal aktivatörleri (tipik olarak 3-7 gün) ile genişletmek olabilir 38 . Bununla birlikte, burada sunulan VZV ELISPOT deneyi için nihai optimize edilmiş prosedür vitro stimülasyonu ve / veya genişletme adımlarla içermez. Numarası ve Qualitnoktalar y 16-21 saatlik bir kuluçka aralığında benzerdi. Inkübasyon 21 saat ötesinde, noktalar kendi numaralandırma daha zor hale, genellikle daha yaygın ve bazen çakışan idi. Ayrıca, hücreler, kuluçka sırasında plakaları hareketli aynı şekilde saymak daha zor olan ve iyi tanımlanmamış iz salyangoz noktalar yol açabilir. Ek sorun işaretler Tablo 1 'de verilmiştir.
Otomatik bir nokta sayacı, duyarlılık ve spot boyutu yolluk kullanılırken pozitif kontrol (anti-CD3 monoklonal antikor) ve bir negatif kontrol (AIM-V ortamı,% 2 (v / v) ile takviye edilmiş IHS) kullanılarak ayarlanır. Spot numaralandırma sırasında dikkate almak önemli özellikleri boyutu ve şekli (Şekil 4) vardır. Eski bir göz ardı edilmelidir plan noktalar T hücre kaynaklı sitokin noktalar ayırt etmenizi sağlar. Nokta sayısı, verilen bir PB mevcut VZV spesifik T hücrelerinin frekansının bir tahmin sağlarMC örnek, nokta boyutu her hücreleri tarafından üretilen ne kadar IFN-γ yansıtır iken.
Bildiğimiz kadarıyla, bu antijen 4 olarak VZV aşısı zayıflatılmış canlı ışınlanmış γ kullanan sadece IFN-γ ELISpot yöntemdir. Üst üste binen sentetik peptidlere (15-mer) panelleri de VZV IE63 fosfoprotein amino asit sekansına dayanan peptitlerin bir karışımı da dahil olmak üzere antijen olarak kullanılmıştır. IE63 47 yüksek derecede bağışıklık ve viral enfeksiyon ve gecikme 48 kurulması için çok önemli olduğu görülmektedir. IE63 spesifik T hücreleri, VZV IE63 karşı hücre aracılı bağışıklık önemli bir hedefi olduğunu göstermektedir sağlıklı vericilerden VZV seropozitif 15 tespit edilmiştir. Bununla birlikte, reaktif hücreler esas CD4 + T hücreleri, 15 olduğu tespit edildi.
VZV, IFN-γ ELISpot tahlil daha önce o tarafından kullanılmıştırneoplastik ya da kalıtsal kan hastalıkları tedavi etmek için 4 UCBT yapılan 28 çocuklarda VZV spesifik T hücresi tepkilerini değerlendirmek ur grubudur. Bu çalışma sırasında elde edilen sonuçlar daha güçlü bir VZV belirli bir hücre aracılı bağışıklık tepkilerinin de neden CD4 + ve CD8 + T hücre alt hem de IFN-γ üretimi ve doğal CD8 + T hücre bölmesine bu sulandırma karıştığı yönünde önerilen IFN-γ üretimi açısından. Daha da önemlisi, bu sonuçlar aynı zamanda 10 6 PBMC başına en fazla 150 SFU tespiti VZV enfeksiyonu veya yeniden 4'e karşı T hücre aracılı koruma ile tutarlı olduğunu göstermiştir. Ancak, VZV UCBT bağlamında spesifik hücre aracılı bağışıklık ve ardından gelen bağışıklık sulandırma veya eksikliği için bu eşik değer bunların büyük prospektif çok merkezli çalışmalarda valide gerekecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar Çalışma katılımcıları ve velilerine teşekkür ederiz. Biz de onun ELISpot okuyucu, istatistiksel analiz için Dr Lubo Alexandrov'da erişim için Dr Rejean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montreal, Kanada) teşekkür etmek istiyorum, ve Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois ve teknik uzman için Martine Caty olur yardım. Le Fonds d'operasyon la Fondation Merkezi de cancérologie Charles-Bruneau tarafından, HS ve PO les projets de recherche clinique et d'Evalution des teknolojileri (CHU Sainte-Justine) dökün, ve Lösemi ve Lenfoma Derneği tarafından hibe tarafından desteklenmektedir Kanada. ISF la Fondation CHU Sainte-Justine ve le Fonds de la recherche du Québec-Sante (FRQS) burs tarafından desteklenmiştir. AJG Mikrobiyoloji, Infectiology ve İmmünoloji, Université de Montréal (Cebrail-Marquis Burslu), FRQS Bölümü burs alıcı oldu, ve Sağlık Kanada Enstitüler RPiyasaları Araştırması (CIHR). NM la Fondation CHU Sainte-Justine, Cole Vakfı ve FRQS tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leucocep tube | VWR | 89048-936/89048-932 | 12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood. |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Protect from light. |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70746-3 | Keep at -20 °C. |
| MultiScreenHTS-IP Filter Plate | Millipore | MSIPS4W10 | Sterile with pore size of 0.45 µm. |
| Mouse anti-human IFN-γ capture antibody | BD Biosciences | 551221 | NIB42 clone. |
| Pepmix VZV IE63 | JPT Peptide Technologies | PM-VZV-IE63 | Dissolve contents of one vial in 40 μl of DMSO. Use within 6 months. |
| Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody | BD Biosciences | 554550 | 4SB3 clone. |
| Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase | Bio-Rad Life Science | 170-3554 | Dilute for use on the same day. |
| BCIP/NBT | Bio-Rad Life Science | 170-6432 | Protect from light. |
References
- Ballen, K. K., et al. Umbilical cord blood transplantation: the first 25 years and beyond. Blood. 122 (4), 491-498 (2013).
- Vandenbosch, K., et al. Varicella-zoster virus disease is more frequent after cord blood than after bone marrow transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (8), 867-871 (2008).
- Barker, J. N., et al. Serious infections after unrelated donor transplantation in 136 children: impact of stem cell source. Biol. Blood Marrow Transplant. 11 (5), 362-370 (2005).
- Merindol, N., et al. Reconstitution of protective immune responses against cytomegalovirus and varicella zoster virus does not require disease development in pediatric recipients of umbilical cord blood transplantation. J. Immunol. 189 (10), 5016-5028 (2012).
- Feldman, S., et al. Varicella in children with cancer: Seventy-seven cases. Pediatrics. 56 (3), 388-397 (1975).
- Arvin, A. M. Varicella-Zoster virus: pathogenesis, immunity, and clinical management in hematopoietic cell transplant recipients. Biol. Blood Marrow Transplant. 6 (3), 219-230 (2000).
- Wiegering, V., et al. Varicella-zoster virus infections in immunocompromised patients - a single centre 6-years analysis. BMC Pediatr. 11, 31 (2011).
- Boeckh, M., et al. Long-term acyclovir for prevention of varicella zoster virus disease after allogeneic hematopoietic cell transplantation--a randomized double-blind placebo-controlled study. Blood. 107 (5), 1800-1805 (2006).
- Boeckh, M. Prevention of VZV infection in immunosuppressed patients using antiviral agents. Herpes. 13 (3), 60-65 (2006).
- Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: a global perspective. Biol. Blood Marrow Transplant. 15 (10), 1143-1238 (2009).
- Ljungman, P., et al. Long-term acyclovir prophylaxis in bone marrow transplant recipients and lymphocyte proliferation responses to herpes virus antigens in vitro. Bone Marrow Transplant. 1 (2), 185-192 (1986).
- Selby, P. J., et al. The prophylactic role of intravenous and long-term oral acyclovir after allogeneic bone marrow transplantation. Br. J. Cancer. 59 (3), 434-438 (1989).
- Distler, E., et al. Recovery of varicella-zoster virus-specific T cell immunity after T cell-depleted allogeneic transplantation requires symptomatic virus reactivation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (12), 1417-1424 (2008).
- Levin, M. J., et al. Decline in varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity with increasing age and boosting with a high-dose VZV vaccine. J. Infect. Dis. 188 (9), 1336-1344 (2003).
- Jones, L., et al. Phenotypic analysis of human CD4+ T cells specific for immediate-early 63 protein of varicella-zoster virus. Eur. J. Immunol. 37 (12), 3393-3403 (2007).
- Czerkinsky, C., et al. Reverse ELISPOT assay for clonal analysis of cytokine production. I. Enumeration of gamma-interferon-secreting cells. J. Immunol. Methods. 110 (1), 29-36 (1988).
- Hutchings, P. R., et al. The detection and enumeration of cytokine-secreting cells in mice and man and the clinical application of these assays. J. Immunol. Methods. 120 (1), 1-8 (1989).
- De Castro, N., et al. Varicella-zoster virus-specific cell-mediated immune responses in HIV-infected adults. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 27 (10), 1089-1097 (2011).
- Jones, L., et al. Persistent high frequencies of varicella-zoster virus ORF4 protein-specific CD4+ T cells after primary infection. J. Virol. 80 (19), 9772-9778 (2006).
- Malavige, G. N., et al. Viral load, clinical disease severity and cellular immune responses in primary varicella zoster virus infection in Sri Lanka. PLoS One. 3 (11), (2008).
- Sadaoka, K., et al. Measurement of varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity: comparison between VZV skin test and interferon-gamma enzyme-linked immunospot assay. J. Infect. Dis. 198 (9), 1327-1333 (2008).
- Smith, J. G., et al. Development and validation of a gamma interferon ELISPOT assay for quantitation of cellular immune responses to varicella-zoster virus. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8 (5), 871-879 (2001).
- Ouwendijk, W. J., et al. T-cell immunity to human alphaherpesviruses. Curr. Opin. Virol. 3 (4), 452-460 (2013).
- Rowland-Jones, S. L., et al. Cytotoxic T cell responses to multiple conserved HIV epitopes in HIV-resistant prostitutes in Nairobi. J. Clin. Invest. 102 (9), 1758-1765 (1998).
- Alter, G., et al. Human immunodeficiency virus (HIV)-specific effector CD8 T cell activity in patients with primary HIV infection. J. Infect. Dis. 185 (6), 755-765 (2002).
- Lechner, F., et al. Analysis of successful immune responses in persons infected with hepatitis C virus. J. Exp. Med. 191 (9), 1499-1512 (2000).
- Fournillier, A., et al. A heterologous prime/boost vaccination strategy enhances the immunogenicity of therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J. Infect. Dis. 208 (6), 1008-1019 (2013).
- Adetifa, I. M., et al. Interferon-γ ELISPOT as a biomarker of treatment efficacy in latent tuberculosis infection: a clinical trial. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187 (4), 439-445 (2013).
- Lalvani, A., Pareek, M. A 100 year update on diagnosis of tuberculosis infection. Br. Med. Bull. 93, 69-84 (2010).
- Berger, R., et al. A dose-response study of a live attenuated varicella-zoster virus (Oka strain) vaccine administered to adults 55 years of age and older. J. Infect. Dis. 178 Suppl. 1, (1998).
- Trannoy, E., et al. Vaccination of immunocompetent elderly subjects with a live attenuated Oka strain of varicella zoster virus: a randomized, controlled, dose-response trial. Vaccine. 18 (16), 1700-1706 (2000).
- Brunner, K. T., et al. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
- Moretta, A., et al. Quantitative assessment of the pool size and subset distribution of cytolytic T lymphocytes within human resting or alloactivated peripheral blood T cell populations. J. Exp. Med. 158 (2), 571-585 (1983).
- Jung, T., et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 159 (1-2), 197-207 (1993).
- Maecker, H. T., et al. Standardization of cytokine flow cytometry assays. BMC Immunol. 6, 13 (2005).
- Nomura, L., et al. Standardization and optimization of multiparameter intracellular cytokine staining. Cytometry A. 73 (11), 984-991 (2008).
- Letsch, A., Scheibenbogen, C. Quantification and characterization of specific T-cells by antigen-specific cytokine production using ELISPOT assay or intracellular cytokine staining. Methods. 31 (2), 143-149 (2003).
- Merindol, N., et al. Umbilical cord blood T cells respond against the Melan-A/MART-1 tumor antigen and exhibit reduced alloreactivity as compared with adult blood-derived T cells. J. Immunol. 185 (2), 856-866 (2010).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Scriba, T. J., et al. Ultrasensitive detection and phenotyping of CD4+ T cells with optimized HLA class II tetramer staining. J. Immunol. 175 (10), 6334-6343 (2005).
- Stone, J. D., et al. Interaction of streptavidin-based peptide-MHC oligomers (tetramers) with cell-surface TCRs. J. Immunol. 187 (12), 6281-6290 (2011).
- Pantaleo, G., et al. Evidence for rapid disappearance of initially expanded HIV-specific CD8+ T cell clones during primary HIV infection. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94 (18), 9848-9853 (1997).
- Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. Immunol. 12 (6), 492-499 (2011).
- Boulet, S., et al. A dual color ELISPOT method for the simultaneous detection of IL-2 and IFN-gamma HIV-specific immune responses. J. Immunol. Methods. 320 (1-2), 18-29 (2007).
- Ahlborg, N., Axelsson, B. Dual- and triple-color fluorospot. Methods Mol. Biol. 792, 77-85 (2012).
- Precopio, M. L., et al. Immunization with vaccinia virus induces polyfunctional and phenotypically distinctive CD8(+) T cell responses. J. Exp. Med. 204 (6), 405-1416 (2007).
- Sadzot-Delvaux, C., et al. Recognition of the latency-associated immediate early protein IE63 of varicella-zoster virus by human memory T lymphocytes. J. Immunol. 159 (6), 2802-2806 (1997).
- Malavige, G. N., et al. IE63-specific T-cell responses associate with control of subclinical varicella zoster virus reactivation in individuals with malignancies. Br. J. Cancer. 102 (4), 727-730 (2010).
