Summary
ゼブラフィッシュ成体の腎臓は腎臓の再生や病気の研究のための優れたシステムです。このような研究の重要な側面は、ネフロンの構造と機能の評価である。このプロトコルは、ネフロンの尿細管組成を評価し、腎再吸収を評価するために実施することができるいくつかの方法論を記載している。
Abstract
ゼブラフィッシュのモデルは、腎臓の開発、再生や病気を研究するための関連システムとして浮上している。どちらの胚および成体ゼブラフィッシュ腎臓を強く哺乳類を含む他の脊椎動物と保存されているネフロンとして知られている機能ユニットで構成されている。ゼブラフィッシュの研究は最近、成人のネフロンが被害を被るから2独特の現象が蒸散ことを実証した：最初に、破壊された尿細管上皮細胞に置き換えられ、既存のネフロン内の強固な再生があります。第二、全く新しいネフロンはneonephrogenesisとして知られているプロセスにおける腎前駆細胞から産生される。これとは対照的に、ヒトおよび他の哺乳動物は、ネフロンの上皮再生のための限られた能力を持っているようだ。現在までに、これらの腎臓再生現象の原因となるメカニズムはよくわかっていないままである。大人のゼブラフィッシュ腎臓はネフロン上皮再生とneonephrogenesis両方を受けるので、それらは優れた実験的なパラを提供これらのイベントを研究するdigm。さらに、腎臓の再生を制御する細胞および分子メカニズムを描写するために使用することができるゼブラフィッシュモデルで利用可能な遺伝的および薬理学的ツールの広い範囲が存在する。このような研究の一つの重要な側面は、ネフロンの構造と機能の評価である。このプロトコルは、大人のゼブラフィッシュの腎臓における腎組成やテストネフロンの機能を評価するために使用することができます標識技術のセットについて説明します。したがって、これらの方法には、これらに限定されないが、成体ゼブラフィッシュの腎臓損傷パラダイム、腎毒性暴露方式や、ニトロレダクターゼ媒介細胞アブレーション法などの標的細胞死の遺伝的方法の将来の表現型の特徴付けに広く適用可能である。さらに、これらの方法は、成人の腎臓形成に遺伝的摂動を研究するために使用することができ、また、慢性疾患のモデリングの際に腎状態を評価するために適用することができる。
Introduction
腎臓は、体内の生理機能の多くを満たす複雑な器官である。腎臓の最も重要な機能は、代謝老廃排泄され、このタスクは密接流体恒常性の維持と絡み合っている。付随的に、血圧、電解質レベル、および酸塩基平衡を調節しながら腎臓は、血液を濾過し、尿を形成することにより、これらのジョブを実行する。ネフロンと呼ばれる高度に専門化上皮尿細管は、腎臓1,2の基本的な機能単位として機能する。大人の脊椎動物では、ネフロンは、一般的にこのように多くの細管がかなり小さな器官にパックするためにできるように、集中排水システムを取り巻くしっかりとコイル状の配置で構成されています。例えば、それぞれの人間の腎臓は100万人以上のネフロン3を含むことができます。マウスのような他の哺乳動物は、腎臓4あたり8から10000ネフロンのオーダーで保有する。腎臓の複雑度は、これらの哺乳動物および他のヴェールの間で異なる総ネフロン数と腎臓内でのそれらの建築レイアウトの変動によるebrates。脊椎動物種は開発中に最大3つの連続した腎臓構造を形成し、ネフロン養老や配置に関して複雑さを増す各フォームが表示されます。前腎、中腎、および後腎。保持される最後の腎構造は、成人の腎臓臓器通常、中腎または後腎2として機能する。各腎臓の形態は、しかしながら、ネフロン系組成物2を有する。
ネフロンは腎臓の主力であり、代謝物分泌および再吸収と一緒に血液濾過を担当しています。ネフロンは、上皮細胞で構成される単純な管状構造であり、分化した上皮の離散、専門性の高いドメインは、特定のタスクを実行する分節組織を持っている。ネフロンを通してろ液の流れのために、典型的には、3つの主要な部分はcomprisことがある電子各ユニット：（1）腎小体、近位、中間、および遠位セグメントを有する、（2）尿細管、および（3）集合管1。近位尿細管は、有機溶質、最も顕著なグルコースおよびアミノ酸1の再吸収を担当しています。中間細管（またはヘンレのループ）塩と水の調節1の主要部位である。最後に、塩および他のイオンの微調整は、遠位尿細管および集合管で発生し、高度内分泌系1によって調節される。そこから、ろ液は、最終的には廃棄物1としての体を出て、尿管、膀胱を通って移動する。
腎機能の喪失は、正常なネフロンの活動を妨げる原因の多数に由来することができます。これらの原因は腎臓の発生、ネフロン5の奇形を引き起こすなど、先天性欠損、または損傷の異なるタイプからの原因（遺伝的およびenvironme両方に起因する時に発生する可能性がありますNTAL起源）。後天性の傷害は、大きく、急性腎臓損傷（AKI）または慢性腎障害（CKD）に分類される。 AKIは、多くの場合、虚血または毒素曝露6,7起因する腎機能の突然の喪失を伴う。哺乳類では、ネフロン上皮修復は、このような怪我8後に可能となり、多くの人が、AKI後の腎機能の完全な回復を示す。 70％の入射範囲6,7 -しかし、AKIも広い30全体に報告されており、高い罹患率と死亡率に関連付けられています。 CKDは、対照的に、典型的には、線維症8,9に関連付けられた、延長された損傷の年に起因する腎機能の進行性の喪失と関連している。どちらか一方が他方10-12に個人を素因となることができますように。また、相互作用は、AKIとCKDの間に存在する。例えば、AKIに苦しんでいる人たちは、CKDや死13の影響を受けやすくなります。腎臓病の発生率は、米国および全世界の両方、epideに達しているマイクプロポーションとは高齢者人口は、腎臓14,15のための再生医療介入を識別するためのニーズがあると、このように拡張するように上昇すると予測される。
AKI患者が回復できるという知識にもかかわらず、それは長い間、腎臓が先天的回生の力のない臓器であると考えられてきた。この伝統的なビューには、劇的に近年16年に改定されました。 AKI後のマウスとラットで腎障害を調査する研究はネフロン細管上皮細胞が増殖し、機能的ネフロン17-20を再構築することができることを示している。哺乳類はネフロンを再生成するには、この適応能力を有しているが、腎線維症とCKD 21につながるトリガすることができます注目すべき制限及び不適応応答があります。例えば、最近の研究では、マウスネフロンにおける繰り返さ上皮細胞の切除が減少再生に関連していたことが実証され、腎線維化を示唆しているネフロンは場海EA限られた回生しきい値22。大人の哺乳類の腎臓は、紛失または破損したものを置き換えるために新しいネフロンを構成するので、それらの破壊が恒久的なネフロン赤字8,9につながるという証拠はない。興味深いことに、いくつかの脊椎動物はネフロン上皮を再生することにより、また、新しいネフロン、neonephrogenesisまたはネフロン新生23と呼ばれるプロセスを生成することによって、AKIに反応しません。 Neonephrogenesisは毒素曝露または部分切除後に魚に発生し、損傷モデルは、歴史的に金魚24,25、ティラピア26、スケート27、メダカ28、およびより最近では、ゼブラフィッシュ29,30が含まれている。これらのうち、ゼブラフィッシュは、腎再生のための責任を細胞および分子経路を発見するために実行可能な遺伝子研究のモデルを提供する。
このビデオの記事では、成人のゼブラフィッシュではネフロンセグメントにラベルを付ける方法を示します。ネフロン解剖学、分子的特徴に関する知識、そして機能的特徴は、ゼブラフィッシュを用いて、将来の成功腎研究のために不可欠です。大人のゼブラフィッシュの腎臓は中腎構造であり、大人の哺乳類、鳥類、爬虫類31で見つかった後腎構造よりネフロン数と組織の観点から本質的にあまり複雑である。しかし、ゼブラフィッシュネフロンセグメント組織は、哺乳類に類似しており、最初の遺伝子発現研究31-35に基づいて胎児腎臓で文書化されました。ゼブラフィッシュ胚ネフロンは、近位尿細管（PCT）、近位尿細管ストレート（PST）、（DE）遠位早く、および遠位後期（DL）31-35（ 図1）を含むリニア細管セグメントを含む。ゼブラフィッシュ成体のネフロンは、同様の管状のセグメント30,31,36,37（ 図1）を有する。 PCTは、機能表現型によって識別できます。PCTにおける上皮細胞は（サイズは10〜70 kDa）の蛍光標識されたデキストラン化合物を組み込む予定に存在胚および成体ゼブラフィッシュの腎臓の両方で使用されてきた循環は、これらの近位尿細管細胞38-41（ 図1）によるエンドサイトーシス取り込みを評価した。ゼブラフィッシュと哺乳類の間ネフロンセグメントにおける1つの違いは、ゼブラフィッシュが中間尿細管、ヘンレまたは30-37のループを欠いているということです。哺乳類におけるこのセグメントの機能は、水を節約するために、ゼブラフィッシュは、その尿を濃縮するための緊急性のない淡水種であるので、ゼブラフィッシュは、このセグメント32,33を欠いていることは驚くべきことではない。このように、全体的なネフロン組成物は、主にゼブラフィッシュと哺乳類の腎臓32,33の間で保存されている。これらの類似性は、発生腎形成32-35,42時の腎発現遺伝子の機能を調査することにより、することができ、人間の条件のかなりのリストに追加して、非常に多くの腎疾患43,44をモデル化するための有効な研究ツールであることがゼブラフィッシュを有効にしている使用して調査ゼブラフィッシュ45,46。
今日では、成人のゼブラフィッシュの腎臓は、その遺伝的取り扱いやすさと、この種における遺伝子機能及びシグナル伝達経路を調べるために利用可能な技術リソースの拡大を口蓋に腎再生の比較研究のための魅力的なモデルです。いくつかの研究は、AKI 29,30,37後の再生のメカニズムを調査するためにゼブラフィッシュ中腎を使用している。大人のゼブラフィッシュの腎臓を使って継続的なAKIの研究のためには、ネフロンの機能を調査するために、異なるネフロン領域や方法を標識する絶妙なメソッドを持つことが不可欠である。成人腎臓分析のためのいくつかの方法が胚腎臓プロトコルから適応されている。大人のゼブラフィッシュにおける蛍光標識されたデキストランの腹腔内注射は、ゼブラフィッシュ胚38-41（ 図1）のように、エンドサイトーシス30を介して中腎ネフロンにおけるPCT上皮にラベルを付けます。この方法は、visualizするために使用されている近位尿細管が復元生理的機能の一つ評価30（ 図1）を可能AKI、次の彼らの再吸収財産を取り戻すメール。ネフロンの近位尿細管のもう一つの特徴は、このセグメントの上皮細胞は、内因性アルカリホスファターゼ活性の高いレベルを示す刷子縁37を有することである。このように、近位上皮はELF-（酵素標識蛍光）として知られている蛍光ベースの技術-97 47を使用して、大人のゼブラフィッシュの腎臓で視覚的に定位させることができる。
ここでは、近位尿細管の機能評価を取得し、この細管セグメントのサイズと輪郭をマッピングするように、成人のゼブラフィッシュの腎臓中の蛍光デキストラン取り込みアッセイを30,48の実行方法について説明します。次に、蛍光標識アルカリホスファターゼで大人のネフロンの近位尿細管領域を標識するためのテクニックを説明します。第三に、私たちはそのrhod初めて示して哺乳類の腎臓49集合管の一般的なマーカーとして使用されてきたアミンタグ付きレクチンドリコスbiflorus凝集素（DBA）は、成人のゼブラフィッシュの腎臓の遠位尿細管をマーク。 DBAは、アルカリホスファターゼ染色に相互に排他的であるように、これらのラベルは、広く大人のゼブラフィッシュネフロンのパン - 遠位ストレッチに対する汎近位を区別する方法を提供します。ホールマウントクライオスタット組織切片の両方でこれらの蛍光染色剤の実装を通じて、私たちは一意にネフロンセグメントを識別し、溶質輸送体遺伝子の発現ドメインとこれらのラベルを関連付ける。したがって、このプロトコルはまた、当社の胚WISHプロトコル50に基づいて、in situハイブリダイゼーション （WISH）分析における成体組織全体のマウントのための修正された組織処理手順のガイドが含まれています。これらの手順は、O、形態学的および機能的属性を文書化するためにさまざまな組み合わせ（ 図2）において使用することができるfは大人のゼブラフィッシュの腎臓ネフロン。したがって、これらのプロトコルは、再生の研究、他の腎疾患モデルの表現型の特徴に適用することができ、さらには成人腎臓の形成を研究するために使用される。
Protocol
このプロトコルで説明ゼブラフィッシュを使用するための手順は、ノートルダム大学の施設内動物管理使用委員会によって承認された。注：ゼブラフィッシュにおける腎臓および腎の解剖学へのガイド（ 図1）が設けられている。このプロトコルで説明される方法の概要は、同じ腎臓サンプルに対して行うことができるか、複数の標識手順説明するためのフローチャート（ 図2）として提供される。成人の腎臓研究のためのWISHの準備についてパート7の場合は、ここで提供される手順は、腎臓の臓器の正常WISH解析のためのテクニカルガイドを提供するために、最近発表された50のように、ゼブラフィッシュ胚の処理を変更する方法を示している。
観光デキストラン1.アダルトゼブラフィッシュ腹腔内注射
- 濃度で蒸留水にデキストラン粉末を溶解することにより、所望の蛍光標識デキストランストック（複数可）を準備する50ミリグラム/ mlの、その後暗所に-20ºCで微小遠心管中でアリコートを保存する。注：さまざまな蛍光標識されたデキストランは、市販されている。望まれている他のラベルの組み合わせに基づいて使用するためのデキストランを選択し、適切な蛍光フィルターが利用される顕微鏡で使用可能であることを確認します。リジン固定可能なデキストランは、生体サンプル中のいずれかの、標識段差のない蛍光、安楽死させ検体からの未固定組織サンプル、及び固定した標本を示している。
- ステップ1.3〜1.5を実行している間、暗所で氷上に希望デキストランストックとストアを解凍する。処理中に光から保護するためにアルミホイルでマイクロチューブを包みます。
- 2分 - 約1に対して0.02％トリカインまたは0.001％2 - フェノキシエタノールのいずれかを含む皿に魚を置くことによって、時代の5-7ヶ月の間に大人のゼブラフィッシュを麻酔。注：若い魚はSMAを持つことができるので、この年齢層の大人のゼブラフィッシュを使用することが好ましい古い魚からllの解剖するのが困難である腎臓および腎臓サンプルを分析することができない瘢痕組織の塊を含むことができる。適切に麻酔をかけた場合、成人のゼブラフィッシュを静かに魚の尾びれに触れスプーンや鈍いプローブを用いてテストすることができ、刺激を触れないように反応を示すことはありません。
- プラスチックスプーンを使用して、ソリューションをデカントし、慎重に濡れたスポンジ型、腹側を上に動物を置き、皿から魚を持ち上げます。
- 31 G 1.0 ccのインスリン注射器を使用して、腹腔内空間に解凍されたデキストランのストック溶液20μlを注入する。オリエント挿入は腹部の腹側正中に浅い角度で発生するように、針。臓器を刺さないようにするには、魚の体壁を持ち上げ、デキストラン溶液48を注入するためにスペースを作るようにそれを調達少し後、針を挿入します。注：2または2：1（デキストラン：投あるいは、デキストラン在庫が1の割合で、例えば 、希釈することができるサンプル中のバックグラウンド蛍光を減少させるために、）水を耕し。
- ゆっくりと麻酔からの回復を可能にするためにタンクに魚を戻す。注：近位尿細管セグメント別のデキストランの取り込みは、8内で発生 - 12時間と、少なくとも3日まで、注射後（dpi）のために検出することができます。 3 dpiでの分析は、腎間質集団における低いバックグラウンド蛍光との強い尿細管信号を提供する。追加のラベリングが不要な場合、単独のデキストランの取り込みの全体のマウント検査のためにパート2に進んでください。コンビナトリアル標識のため、DBAの二重または三重のラベリングを行うために、アルカリホスファターゼおよび/または第5部で二重ラベルにパート4その後、デキストランの取り込みの全体のマウント検査のために組織を準備するパート3に進みます。組織切片を用いた研究では、クライオスタットを用いて、腎臓の細かい部分を作る方法と、プライマリおよびセカンダリantib各種ラベル、および/または免疫組織化学でこれらを染色する方法に関する手順については、第6部に進むodies。
近位尿細管の蛍光デキストランの標識を可視化するために2。解剖し、未固定動物のサンプルからアダルトゼブラフィッシュ腎臓のフラットマウントの準備
- 5分 - 4 0.2％トリカインpH7.0で皿にそれを置くことによって、デキストランを注入した大人のゼブラフィッシュを安楽死させる。注：魚はえらが運動を中止しており、心臓が36を破って停止しているかどうかを慎重に監視することで、先に進む前に安楽死されていることを確認します。
- プラスチックスプーンを使用して、トリカイン溶液から魚を持ち上げ、ソリューションをデカントし、組織や紙タオルの上に動物を配置します。
- 鰓蓋の後ろにカットをすると頭を除去するために解剖ハサミを使用してください。
- すぐに尾鰭のベースに頭から長い腹切開を行うことで、解剖ハサミで魚の体を開く。
- 細かい鉗子のペアを使用して、魚の内臓を取り除きます。
- 動物の背側の壁に付着している腎臓の臓器の可視化を可能にするように、本体壁を開いたピンに超微細解剖針を使用してください。
- 背壁から腎臓を切り離す細かい鉗子を使用してください。
- 穏やかに1×PBSを含む5 mlのガラスバイアルに腎臓を配置し、3で3回洗浄 - 5分毎に新鮮な1×PBSを5ml。注：成人の腎臓サンプルを処理するためのガラスバイアルを使用すると、組織の可視化を容易にし、約3大量の（組織量に対して）での洗浄を可能にする - を5ml。あるいは、12ウェル細胞培養皿を用いることができる。プラスチック製マイクロ遠心チューブを用いることができるが、標準サイズのチューブ（1.5ml）を洗浄制限した。
- 1×PBS、1〜2滴で清浄なガラススライド上にホールピペットと場所で腎臓を削除します。
- わからない組織がカールしていないか、他の方法で覆されていること、スライドに腎臓を平らに細かい鉗子を使用して、自体に。注：または、タングステン線ツールは、腎臓の平らな位置決めを容易にする結合組織中の小さな切開を作製するために使用することができる。
- 18×18ミリメートルのガラスカバースリップの各コーナーに粘土の小片を置き、ゆっくりと腎臓の上にカバースリップを設定します。注：配置中にわずかに角度をカバーガラスを溶液50中の気泡をトラップ最小限に抑えるため。粘土のディボットは、直径（ 図2A）は約2ミリメートルである。代替的に、真空グリースのディボットは、粘土の代わりに置換することができる。必要に応じて、カバーガラスとガラススライドの間の空間を充填する1×PBSの追加のドロップを追加します。
- 適切なフィルタを備えた実体顕微鏡または化合顕微鏡視野内にガラススライドを配置することによって、腎臓を観察および/または画像。注：このスライド準備の巨視的外観については、図2（a）を参照してください。
3 FIXAる、解剖、透過化と成人ゼブラフィッシュ腎臓の色素沈着の除去
- 4％パラホルムアルデヒド（PFA）の新鮮な固定液を調製/ 1×PBS / 0.1％DMSOまたは4％PFA / 1×PBSを凍結した一定分量を解凍し、0.1％のDMSOを加える。注意：PFAは毒性があり、手袋、白衣を含め、適切な個人用保護具を身に着けている間、PFAのソリューションを化学フードで処理する必要があります。原液を作るとき加えて、PFA粉末は、注意して取り扱わなければならない。
- 動物全体を水没するのに十分な固定液で解剖トレイを記入してください。
- （ステップ2.2から2.6を参照）安楽死させると固定液内の選択されたゼブラフィッシュをマウントします。注：選択された魚は、未処理のゼブラフィッシュの腎臓標本、または以前に腹腔内注射デキストラン（その1）を受けたゼブラフィッシュから単離された腎臓ことができます。
- 4 Oにて- （16時間12）、サンプル、O / Nを修正
- 次の日、気に細かい鉗子を使用完全に背側体壁から腎臓をデタッチし、ホールピペットを用いてガラスバイアルに臓器を置く。注：または、12ウェルまたは24ウェル培養皿を用いることができる。プラスチック製マイクロ遠心チューブを用いることができるが、標準サイズのチューブ（1.5ml）を洗浄制限した。
- 5分ごとに0.05％Tweenで1×PBSの3〜5ミリリットルを切開し、腎臓を3回洗浄する。
- 0.05％Tweenで1×PBSを削除し、30分間（1X PBS中）を5％ショ糖溶液3mlで腎臓をすすぐ。
- 4 Oにて- （16時間12）（1×PBS中）を30％ショ糖溶液3mlと店舗でO / Nと交換注：スクロース溶液は、彼らが組織を貫通するように、その後の試薬の特異的標識を可能にする、細胞膜を透過性。
- 翌日、30％スクロース溶液を除去し、各5分間、0.05％Tweenで1X PBS 5mlで腎臓を2回洗浄する。
- 3 0.05％Tweenで1×PBSを交換してください -漂白液5mlを、腎臓の臓器に存在するメラノサイトの色素沈着を除去します。
- ローテーター上でガラスバイアルを置き、色素沈着が消えるように慎重に監視します。注：脱色は、ショ糖処理した後に実行したとき、一般的に約20分かかりますが、時折限り60分として取ることができます。漂白液が長すぎるために腎臓に残されている場合は、臓器の崩壊が発生する可能性があります。それは組織の完全性をチェックするために、サンプルごとに10〜15分を監視することをお勧めします。
- 0.05％Tweenで1X PBS 5mlの - 色素沈着は、腎臓から除去されたとき、3回洗浄する。
- 室温で1時間、4％PFA溶液を3〜5ミリリットル0.05％Tweenで1×PBSを交換してください。
- 4％PFA溶液を除去し、3で腎臓を3回洗浄する - 5分ごとに0.05％Tweenで1×PBSを5ml。注：固定が完了すると、腎臓はまた、ガラススライド上に取り付けられ、デキストラン取り込みサンセリフメラノサイトpigmについて評価することができる手順2.8から2.12を実行して、entation、。
- 2時間ブロックにRTで腎臓をインキュベート、その後、ブロッキング溶液を5ml - 0.05％Tweenで1×PBSを削除し、3と交換します。
- ブロッキングが完了すると、選択された染色プロトコルに直接進む。注：腎臓は、現在の異なる試薬で標識研究を実施するために、1つまたは複数の他の手順によって処理することができる。唯一のアルカリホスファターゼとの近位尿細管のホールマウント標識のために、あるいは、セクション4および5は、ホールマウントデュアル検出のための線形連続して行うことができ、第5章に行くだけ遠位尿細管のホールマウント標識のためにセクション4に進んでください。
4。アルカリホスファターゼの検出と大人の腎近位尿細管セグメントのラベリング
- ブロックを削除し、3で腎臓を3回洗浄する - 5分ごとに0.05％Tweenで1×PBSを5ml、次いで3 0.05％Tweenで1×PBSを置き換える - 5mlの1×PBSの。腎臓は、少なくとも10分間浸してみましょう。注：組織は、前処理工程のためにガラスバイアル中に保持されている場合、この時間の間、12ウェルまたは24ウェル培養皿に腎臓を転送する。
- サンプルをカバーするために（材料の表に位置検出用キットを参照してください）十分な作業アルカリホスファターゼ基質溶液で1×PBSを交換し、その後、室温で30分間、回転体上のサンプルを置く。光から保護したサンプルを保管してください。
- アルカリホスファターゼ洗浄緩衝液中で腎臓を洗浄することにより反応を停止する。
- 15分 - 10以上の洗浄用緩衝液を3回交換した腎臓を洗い流す。注：このステップの後、第5部に直接進む、5.1（したがって、一時的に省略してステップ4.5から4.6）をステップDBAによる標識はまた、所望される場合。オプションの手順：ヨウ化プロピジウム溶液中に腎臓を浸し、臓器の細胞核を標識して可視化する。 CONCENTRAで粉末を溶解することにより、ヨウ化プロピジウム在庫を準備します蒸留水で1 mg / mlの（1.5ミリモル）のる。 2X SSC中で500 nMの株式を希釈し、30分間この溶液に腎臓をインキュベートする。 1X PBSですすぎ、4.5に進みます。
- （ステップ2.9から2.12参照）の洗浄緩衝液を取り出し、標識キットに含まホスファターゼ封入剤で清浄なガラススライド上に腎臓をマウントします。注：封入剤は、ステップ2.9から1×PBSに取って代わった。
- ヘキスト/ DAPIフィルターセットを実体顕微鏡または化合顕微鏡を用いて、アルカリホスファターゼ染色腎臓を可視化。注：オプションの手順：テトラメチルローダミン（TRITC）またはテキサスレッドフィルターを使用してヨウ化プロピジウムを可視化。
5。ローダミンDBAと大人の腎遠位尿細管セグメントの境界設定
- 1×PBSで100：DBA（2 mg / ml）を1に希釈して200μlのワーキングDBA溶液を調製する。
- 200μlのDBA溶液で0.05％Tween溶液で1×PBSを交換してください。
- のための回転装置上に置き室温で1時間。
- DBA溶液を除去し、3で腎臓を3回洗う - 5分間ずつ1×PBSを5ml。注：オプションの手順を：ラベルとDBAラベルとともに器官における細胞核を可視化、（ローダミンDBA染色がTRITCまたはテキサスレッドフィルターで検出することが可能）ヘキスト/ DAPIフィルターを用いて検出するDAPI溶液中に腎臓を浸すする。 5 mg / mlの（14.3ミリモル）の濃度で粉末を溶解することにより、DAPIストックを準備します。 2X SSC中で300 nMの株式を希釈し、20分間この溶液中に腎臓をインキュベートする。 1X PBSですすぎ、5.5に進みます。第4処理を行った場合には、DAPIおよびアルカリホスファターゼの両方ヘキスト/ DAPIフィルターを用いて検出されることに留意してください。
- （ステップ2.9から2.12を参照）1×PBSを取り外し、清浄なガラススライド上に腎臓をマウントします。
- 蛍光実体顕微鏡または複合顕微鏡で設定され、標準的なTRITCまたはテキサスレッドフィルターを使用して腎臓のDBA染色した遠位セグメントを視覚化。注：オプションのTEP：ヘキスト/ DAPIフィルターを使用して、DAPIを視覚化。
大人のゼブラフィッシュの腎臓組織の6埋め込み、凍結切片化および染色（バイタル染料および免疫組織化学の標識）
- 安楽死させる、その後、分析のために魚を選択し、修正し、説明したように（ステップ3.2から3.8）透過性。注：1：エタノール：ホルムアルデヒド/ 0.1％DMSOデキストラン、アルカリホスファターゼ、およびDBA視覚化のためのセクションを生成するために凍結切片の手順については、4％パラホルムアルデヒド/ 1×PBS / 0.1％DMSOの代わりに9成魚を修正しました。しかし、ホルムアルデヒドベースの凝視は、いくつかの免疫組織化学手順のための互換性があることを心に留めておく。メラノサイトは表面的であり、腎臓器官の「内側」を含むネフロン細胞の可視化に影響を与えないので、さらに、成人の腎臓の漂白は、凍結切片分析には必要ありません。
- 次の日、30％ショ糖溶液を除去し、1と交換してください：1組織凍結培地：30％sucrosをRTで4時間の電子。
- 1液と、少なくとも1時間、-80°Cの時cryomoldsさで、場所を凍結し、100％の組織で腎臓サンプルを埋め込 む：1を削除してください。
- 横方向に約12μmの厚さの、全体の成人の腎臓を経て、連続切片を切った。
- 接着剤を顕微鏡スライド上に凍結した凍結切片をマウントし、50 Oで1時間空気乾燥させ
- Storeは使用するまで-80°Cの時にスライドする。
- 凍結切片を標識しても準備ができたら、顕微鏡は45分間50°Cの時より暖かいスライド上-80°Cのと場所からスライドし削除します。
- 液体ブロッカーペンを使用して、凍結切片の周りに円を描き、スライド上で15分間乾燥させて50℃。で暖かい
- 暖かいスライドからスライドを外し、室温で湿度室にフラットに配置します。
- 20分間スライドの囲まれた部分に0.05％Tweenで1X PBSを添加することにより凍結切片を再水和する。注：約200から300を＆＃956; lは、スライド上の各囲まれた部分をカバーするために必要とされる。
- 新鮮な1X PBSで0.05％Tween溶液で1×PBSを交換し、10分間インキュベートする。
- 1×PBSを削除し、2時間ブロッキング溶液中で凍結切片をインキュベートする。注：ブロッキング溶液10ミリリットルのために、0.05％のTween、2ミリリットルのウシ胎児血清および150μlのDMSOで8ミリリットル1×PBSを兼ね備えています。ブロッキング工程の後に免疫組織化学を実行するために、4°Cの新鮮なブロックO / Nで希釈した所望の一次抗体とのスライドをインキュベートし、0.05％Tweenで1×PBSを用いて一回洗浄中に希釈した二次抗体溶液をRTで2時間インキュベート1×PBS、0.05％Tweenで、0.05％Tweenで1×PBSを用いて一度洗い、メディアをマウントしたスライド上にカバースリップをマウントします。必要な抗体希釈は変化し、試験は、最適な希釈液を選択するために実行する必要があります。抗原回復はまた、免疫標識を容易にすることができ、及びブロッキングの前に行われる。スライドを50°Cので解凍した直後（ステップ6.8）に予熱した10 mMクエン酸ナトリウム緩衝液中で40分間95°Cの-100°Cの間の凍結切片をインキュベートする。 0.05％Tweenで1×PBSで2回洗った後、30分間、スライドを冷却し、6.11に進みます。
- ブロッキング溶液を除去し、5分間ずつ1X PBSで凍結切片を3回洗浄する。
- DBA染色液で1×PBSを交換し、1時間インキュベートする。注：100μlの染色溶液を作るために1×PBSの99μlの1μlのDBAに希釈する。
- DBA染色溶液を除去し、5分間ずつ1X PBSで凍結切片を3回洗浄する。
- アルカリホスファターゼラベルを適用し、10分間凍結切片上で培養する。
- 10分間ずつ洗浄緩衝液で3回洗浄する一連の凍結切片からアルカリホスファターゼを洗ってください。注：洗浄緩衝液100mlの解決策については、1×PBS 95mlの中に、0.5MのEDTAを5mlとレバミゾール120mgのを兼ね備えています。核を標識するには、ディでヨウ化プロピジウムまたはDAPIでセクションをインキュベートlutionsは、以前に室温で30分間（それぞれ4.4、5.4、手順）を記録。選択されている他の蛍光染色剤の組み合わせと互換性の核染色を選択します。
- 凍結切片からすべての液体を取り出し、顕微鏡スライド上に封入剤を2滴を配置します。
- 慎重に顕微鏡スライド上にマイクロカバーガラスを配置します。凍結切片は、適切な絞り込みを持つイメージに準備が整いました。
大人のゼブラフィッシュの腎臓サンプルのため7。WISH処理
- 希望ゼブラフィッシュ検体（複数可）を選択し、安楽死させる、説明したように（ステップ3.1から3.5）の腎臓を修正し、解剖。注：これは、腎臓を透過するように、0.1％DMSOで4％パラホルムアルデヒド（PFA）/ 1X PBSの固定液を使用することが不可欠である。その後の処理工程中に容易な可視化のためのガラス瓶に腎臓を置きます。
- 固定液を取り出し、1×PBST 5mlで二回腎臓を洗う。
- 1×PBSを削除し、二回ウィスコンシン腎臓を洗う100％メタノール番目、次に透過化するために、少なくとも20分間、-20°Cの時に腎臓をインキュベートする。注：解剖腎臓は無期限に保存することができる-20 oを
- 1X PBSTで5〜50％のメタノール/ 1X PBST、30％メタノール/ 1X PBST mlの、二回 - 3で5分間の洗浄のシリーズを実行することによって、腎臓を再水和。
- （ステップ3.10から3.14まで）を記載のように色素沈着を除去するために腎臓を漂白。
- その後、O / Nに20分間、4％PFA / 1X PBST中1X PBSTおよびポストフィックスで二回すすぎ、20分間、0.1％DMSOで10μg/ mlのプロテイナーゼK / 1X PBSTで腎臓を治療。注意：必ず、新たに解凍プロテイナーゼKストックの50μlの（10 mg / ml）を、1×PBST 50mlの、およびDMSOを50μlを組み合わせることにより、試料分解の直前に作業溶液プロテイナーゼKを準備します。
- リボプローブ合成、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、抗ジゴキシゲニン/抗フルオレセイン抗体インキュベーションとDETECための手順に従って、シングルまたはダブルウィッシュための腎臓を処理ンは、最近49について説明した。注：全体は、腎臓汚れの撮像が染色反応を行う数日以内に行われるべきマウント。ネフロンの汚れは、特に赤の基質標識、非常に迅速に退色する傾向がある。ネフロンの写真撮影のために、平らな立体または化合顕微鏡を用いて、腎2.12にステップ2.10で、上記のように、サンプル、およびイメージをマウントします。微分干渉コントラストフィルタは、より良好な試料分析を容易にするために、ネフロンの細胞の輪郭を視覚化するために使用することができる。
Representative Results
各プロトコルは、野生型ゼブラフィッシュで行った。文書の正常構造組成と健康な成人のゼブラフィッシュの腎臓内のネフロンの特性を得られたデータの例。大人のゼブラフィッシュは、背側体壁（ 図1A）上に配置されている中腎、または第二の腎臓の形を持っています。成人の腎臓は、比較的平坦であり、これらの地域（ 図1A）に点在する表面的なメラニン細胞で、いわゆる頭、胴、尾部領域を含む。腎組織は、接続して、中央の集合管（ 図1A）に排出ネフロンの分枝状の配列が含まれています。各ネフロンは、一端に血液フィルタ（または腎小体）で、その長さに沿って偏光された細管一連のセグメントが続き、最後に（ 図1A）に排泄される溶液を収集ダクトで終端されている。各大人のネフロン細管は、近位および遠位segmenが含まれています細胞のTSは、胚性ネフロン31-35（ 図1B）によって示されるセグメントのパターンで保存されている特定の溶質輸送体30,31,36,37の発現、によって区切ら。例えば、 キュビリン転写物は、近位尿細管39（PCT及びPST）とclcnk転写産物をマーク遠位尿細管32（DEおよびDL）（ 図1B）をマーク。更に、PCTセグメントはslc20a1aの発現によって区別される、PSTはslc13a1の発現によって区別され、DEはslc12a1の発現によって区別されており、DLはslc12a3 32の発現によって区別される （ 図1B）。胚のものと比較して、大人のネフロン細管との違いは、遠位セグメントがEMBR線形、これらの領域の非分岐解剖学とは区別され、成人で広範囲に畳み込み（DE、DL）およびDLセグメントに分岐を示すことであるヨーヨー30,31,36,37（ 図1A）。成人30および胚38-41ネフロンの尿細管の両方に、PCT上皮は、そのエンドサイトーシスの性質に区別することができ、蛍光デキストランコンジュゲート（ 図1B）を取り込む能力に基づいて再吸収機能のために視覚化し、評価することができる。以降の図で示すように遠位尿細管（DEとDL、または汎遠位領域）は、DBAによってラベル付けされている間また、成人の近位尿細管（PCTとPST、または汎近位領域）は、アルカリホスファターゼにより標識されている（ 図1B）。デキストラン取り込み、アルカリホスファターゼ、DBA、免疫組織化学またはWISHを使用してラベル成体ゼブラフィッシュネフロンセグメントに本明細書で使用される方法は、ホールマウントまたは腎組織（ 図2）の組織学的切片を、さまざまな組み合わせで実施することができる。ネフロン組成物が評価されることになっているときに（大きな柔軟性と多様性を可能にする図2）。
成人の腎臓は粘土（またはその代わりに、真空グリース）のディボットに、分析用のガラススライド上に平らに装着することができる組織（ 図3A）を介してカバースリップを一時停止するために使用される。代表的な腎臓の長さが約5〜7ミリメートルであるように、ステレオまたは化合顕微鏡（ 図3A）上に画像化に資するサイズを有する。循環赤血球は赤の色相（ 図3B）を有するので、明視野照明下で、黒い色素沈着とメラノサイトの表面的な集団は、腎臓組織に関連して視覚化することができ、大動脈などの血管系を見ることができる。デキストラン-FITCの腹腔内注射の後、中腎全体に配置PCTドメインは、まだ3日後に標識し、蛍光顕微鏡（ 図3C）上でFITCフィルターを用いて画像化した。メラノサイトは、部分的に個人の尿細管（ ふぃぎゅの可視化を曖昧にしながら3C '）再、メラノサイトはネフロン番号または細管の直径と長さの評価の定量化を防ぐことはできません。デキストランフルオロルビーの腹腔内注射に続いて、固定された試料の漂白は、メラニン色素沈着を排除し、及びPCTセグメントは、単独で、明視野照明（ 図3D）で観察した。腹部体腔から脂質滴は、時には畳み込み、コイル（ 図3D '）を示す全体腎臓器官調製物（ 図3A）.Individual PCTセグメントに関連して見ることができるだけでなく、比較的線形ストレッチ（ 図3D」）によって特徴付けることができる。
異なるデキストランコンジュゲートは、近位尿細管のラベリングに全体的な明瞭さの異なるレベルを提供した。具体的には、デキストラン-FITCまたはデキストランフルオロルビーは、最小限のバックグラウンド（ 図3C-D」）とネフロンラベルを鮮明につながった。どちらのデキストランカスケードブルーレイeおよびルシファーイエローコンジュゲートは、成人の腎臓（ 図4A、4B）で近位尿細管取り込みを示した。デキストランルシファーの黄色にさらされた腎臓は、PCTセグメントのラベルが、中に全体で非特異的な蛍光染色が存在して、顕著なバックグラウンドシグナルを示していた間に興味深いことに、デキストランカスケードブルーにさらさ腎臓は、いくつかの背景（ 図4A、4A '）で比較的特異のPCT蛍光を示した腎間質、またはネフロン（ 図4B、4B '）との間のスペース。最後に、デキストランフルオロルビーを使用すると、最小または異なる倍率（ 図4C、4C '）の範囲で見ても背景なしで、優れた近位尿細管のラベルを提供した。全ての場合において、デキストランコンジュゲートの取り込みの特徴的な管状のパターンはslc20a1a、確立されたPCT特異的マーカー30-32（ 図4D）をコードする転写物のWISH発現と相関する。 Nephr'（、3D "標識デキストラン共役アッセイ図3D）の間に観察されたように、slc20a1aアンチセンスリボプローブで染色されたPCTセグメント上でS字PCTコイルだけでなく、あまり急激にコイル状のPCTセグメント（ 図4D）'を表示。
このような近位尿細管アルカリホスファターゼ活性（ 図5A、5B、5C）の検出などの他の腎臓製剤は、同様にメラニン細胞の色素沈着の除去後に行った。これは、任意の障害物なしで近位尿細管ネフロンイメージングと解析を可能にした。ネフロンにおける内因性アルカリホスファターゼ反応性は、近位尿細管1,47の一つの大きな特徴である。 39 キュビリン遺伝子（ 図5D、5D '）の汎近位WISH発現パターンと比較して、アルカリホスファターゼ染色は、近位ネフロン領域に対して高度に特異的である。アルカリホスファターゼ反応はモミで最も強かったまた、PCTで最も高い相対的転写レベルを持っていたキュビリン発現のパターン（ 図5D、5D '）と類似のPCT（ 図5B）に対応し、近位尿細管の目のセクション。 PCTは、そのわずかに広い直径、転写因子mafba（ 図5E、5E '）の特異的発現、および溶質輸送体遺伝子slc20a1a（ 図4D、4Dの特異的発現」）によって区別した。アルカリホスファターゼ反応性はまた、溶質輸送体遺伝子slc13a1（ 図5F、5F '）のセグメントに固有の転写発現との比較に基づいて、PSTファイルのセグメント（ 図5B）に対応し、より薄い直径の近位尿細管のストレッチをラベル。 PCTマーカーslc20a1aとPSTマーカーslc13a1のWISH発現ドメインは、（ 図5G相互に排他的であるキュビリンの発現ドメインを再現することを示した。 図5G '、5G」、5G "' ）。
さらに、近位尿細管の同一性を有するアルカリホスファターゼ反応の関係を確認するために、全体のアルカリホスファターゼ染色の同時標識を取り付ける（ 図6A-C）の前に3日間デキストランフルオロルビーの腹腔内注射を受けたゼブラフィッシュの腎臓で実施した。デキストランフルオロルビーは、PCT（ 図6D-Iの例）に対応する近位尿細管ドメインのちょうど広い径部におけるアルカリホスファターゼとの重複を示した。デキストラン陽性ドメインは突然、PCTとPSTが満たされ、近位尿細管の直径は間引かサイト、 すなわち、（白い矢印で停止図6のヘッド）のみアルカリホスファターゼ反応は、その後のPSTセグメント図6D-Iで（例）において観察された。アルカリホスファターゼ反応からのバックグラウンド蛍光は、またぼんやり図6A、6D内の任意の腎臓関連チューブ（アスタリスクの最も広い直径で区別され、成人の腎臓29,30 -ductsで見られる平行な主捕集ダクトトラックのペアを概説6E、6G、6H）。次に、アルカリホスファターゼおよびデキストランの取り込みとネフロンの尿細管の同時標識は、凍結切片分析で観察された（ 図6Jは、尿細管周囲の白いドットで概説）。対応する細管細胞質ゾル空間はデキストランフルオロルビー反応性（ 図6J）を示しながら、断面では、アルカリホスファターゼ反応性は、刷子縁超微細構造と一致して尿細管上皮の頂端表面に太いバンドで認められた。注目すべきは、staineその他：D細管は、PSTセグメント（ノートなどの識別につながる、アルカリホスファターゼ（ 図6J、黄色の点で概説周囲の細管）のためのPCTセグメントとしてそれらの同定につながる、アルカリホスファターゼおよびデキストラン陽性のダブル、または単独で陽性のいずれかであった現在の細管）を図6J（両方シミ、データは示されていない）に対して陰性であった。さらに、アルカリ性フォスファターゼ染色（ 図6K）が正常核ラベル、ヨウ化プロピジウム（ 図6L）、容易に細胞計数（ 図6Mオーバーレイ）と合わせた。
大人のゼブラフィッシュネフロンの遠位尿細管はローダミン結合DBA（ 図7）で標識した。全体野生型ゼブラフィッシュ（ 図7A-C）からの腎臓で実施したDBAおよびアルカリホスファターゼとの二重標識をマウントします。 DBAおよびアルカリホスファターゼ反応性（ネフロンの尿細管で重複を示さなかった
次に、さらにデキストラン-FITCの取り込み、アルカリホスファターゼ、およびDBAのパターンを比較するために、トリプル標識は3日後にアルカリホスファターゼおよびDBAのための凍結切片と染色に続いて腎臓の分離に続いて、腹腔内にデキストラン-FITCで大人のゼブラフィッシュを注入することによって調べた（ 図8A〜Eに提供された例）。アルカリホスファターゼおよびデキストラン表記PCTセグメント（白点線）、tubulのための二重陽性であった細管：尿細管は、ラベルの組み合わせの3つのカテゴリが示されたアルカリホスファターゼのための肯定的なESは、単独で、PSTセグメント（黄点線）に示され、遠位尿細管がちょうどDBAによって標識した（赤い点線図8A-Eアウトライン）。さらに、DBAのみ正細管は、分岐点（ 図8E）を示した。 WISH分析によって、遠位のこの独特の分岐パターンは、DBA陽性尿細管、遠位尿細管セグメント（ 図8F-I）に特異的な溶質輸送体転写物の遺伝子発現パターンと相関する。全体遠位尿細管（DEとDL）をマークしclcnkをコードする転写物は腎臓で、直径が豊富な薄いようで、含まれている分岐点（黒矢印図8F、8F '）。比較すると、それぞれDEのマーカーおよびDLあるslc12a1またはslc12a3の発現を示した細管セグメントは、clcnk発現と比較して、全体的な腎臓サンプルにおいてより少ない豊富であった（ 図8を比較する Gおよび8F、8H）。さらに、これまでに、（ 図8G、8G '）分岐した場合には、8H slc12a3を表明細管領域は頻繁に特性風車のようなアレンジメント（ 図8H、8Hで分岐された一方で、「slc12a1を表明細管セグメントは、めったになかった」、8H」'黒矢印）。最後に、PCTマーカーslc20a1aおよび遠位マーカーclcnkダブルウィッシュはこれらの汚れ（ 図8I）を重複していないことを示した。注目すべきことに、PCTセグメントを発現性slc20a1aのストレッチは、PSTは、これらの領域（ 図8I）の間に位置しているので、予想された細管を、発現性clcnkに添付されていませんでした。総合すると、特定の遺伝子転写物のためのデキストランの取り込み、アルカリホスファターゼ反応性、DBA、およびWISHで尿細管を標識アッセイは、遠位セグメントに対して近位の見識を可能にします。
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大人のゼブラフィッシュの腎臓における図1ネフロン解剖。（A）の成人ゼブラフィッシュの腎臓と（B）の成人および胚ゼブラフィッシュネフロンが示すセグメントの分子特性の比較チャートの模式図。（A）（左上）、成人の腎臓背側体壁上にある平らな器官である。腹側の視点から見た場合（右上）、腎臓、頭部、体幹および尾領域からなる、独特の湾曲した形態を有しており、また、関連するメラノサイトの表面人口を持っています。拡大（左下）は、各単一ネフロンが近位尿細管、遠位尿細管、ダクトが続き、一方の端部に血液フィルタ（腎小体）を有するいる大人のゼブラフィッシュの腎臓における典型的なネフロンツリーの概略図を示す。着色回路図（BOttom右）は、胚ネフロン（B）のものと、セグメントの特性を比較するための1成人のネフロンツリーの線形図を示している。ゼブラフィッシュ胚ネフロンは、下記のそれぞれの遺伝子発現ドメインとの近位尿細管（PCT）、近位尿細管ストレート（PST）、（DE）遠位早く、および遠位後期（DL）を含む尿細管セグメントを含む。胚に比べて顕著な違いは、いくつかのネフロンが分岐DLセグメントを通じて団結することができるということであるが、成人のゼブラフィッシュにおけるネフロンは、同じような分節組成および溶質輸送体をコードする遺伝子の発現ドメインに基づいて、類似の分子の署名を持っています。 こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。
の方法は単独で、または各種の組み合わせで実施することができるかを示す、このプロトコルに示されている方法との関係を示す図2のフローチャートマップ。大人のゼブラフィッシュにラベルされたリジン固定可能なデキストランの腹腔内注射の後には、腎臓で可視化することができる全体単独で、またはアルカリホスファターゼおよび/またはDBA汚れと組み合わせて、準備をマウントします。あるいは、選択されたゼブラフィッシュ腎臓は組織学的組織は、クライオスタットで切片化した後に検査することができる。切片は、免疫組織化学、核染色、DBA染色、および/またはアルカリホスファターゼ反応を用いて、属性の多数の組み合わせを標識するために染色することができる。また、腎切片は、PCTセグメントにおけるリシン固定可能デキストランの取り込みの存在を直接可視化することができる。最後に、選択された腎臓はWISHを用いた遺伝子発現の時空間的発現のために処理することができる。括弧付きの数字はcorrespoを参照してください。プロトコルパーツnding。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：大人のゼブラフィッシュの腎臓はフラット腎臓ネフロンのPCTセグメントにおいて共役デキストランの取り込みを可視化するために準備して、アプリケーションをマウントします。臓器が粘土（ホットピンク色）の4ディボット上に載っている組織の上に置かカバーガラスで、ガラススライド上に平らに配置された準備をマウントフラット腎臓標本、（A）の明視野像。ここでは、腎製造は、スケーリングされた比較を提供するために、メトリック定規と一緒に画像化される。典型的な成人の腎臓は尾に頭から約5〜7ミリメートル（mm）である。（B）無漂白の明視野像腎臓。黒の色素沈着は、腎臓に関連して発見さメラノサイトの散乱人口に対応し、大動脈、腎臓の正中線に沿って走る。ネフロンのPCTセグメント（C）可視化40kDaのデキストラン-フルオレセイン（FITC）の腹腔内注射後の3日間、大人の腎臓の漂白せずに。 PCTセグメントは、腎臓全体に見られているが、一部には、メラノサイトに隠されている。（C '）の単一ネフロンのデジタルズーム、メラノサイト（白矢印）で。成人の腎臓の（D）のイメージの10kDaの腹腔内注射後の3日間デキストランフルオロルビー、腎臓、および漂白の固定。メラノサイトの色素沈着を除去し、PCT領域は明視野照明下でのデキストランの彼らのエンドサイトーシスの取り込みに基づいて、ここで可視化した。腹部の脂肪滴（矢印）は、時には、腎組織サンプルに関連して見ることができる。（D '、D "）Representative画像は、PCTセグメント間のわずかな形態学的変動を示す。多くのネフロンPCT類はしっかりと（D '）をコイル状されているが、他のネフロンは、（D "）を巻き、最小限必要がPCT領域を含む。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4大人の腎臓ネフロンのPCT細管セグメントラベリング野生型のゼブラフィッシュは腹腔内に単一の蛍光デキストラン結合体を注射した。その後彼らの腎臓が3日、PCTの可視化のための注射後に調べた。（A、A '）デキストランカスケードブルー、10kDaの（B、B'）デキストランルシファーイエロー、10 kDaおよび（C、C '）デキストランF luoro-ルビー、10kDaのは、すべての優先的腎ネフロンにおけるPCTセグメントにラベルを付ける。デキストランカスケード青とルシファーイエローショールシファーイエロー治療腎臓で観察されたはるかに高い背景に、ネフロンの間に位置する間質細胞集団の一部の非特異的標識の両方。対照的に、デキストランフルオロルビー激しいPCT標識と劇的に減少し、バックグラウンドを示した。（D、D '）slc20a1a、PCTトランスポーターの細胞型の特異的なマーカーをコードする転写物の位置を検出するWISHによって染色された成体腎臓。 slc20a1aの発現ドメインは、さまざまなしっかりとコイル状の分布と、腎臓で観察されたデキストランの取り込みの特徴的なパターンにマッチ/ PCTドメインだけでなく、一貫性のある広い直径を示している複数の細長いPCTストレッチをループし。 拡大版を表示するには、ここをクリックしてくださいこの図の。
WISHで評価他の近位尿細管のマーカーに比べて大人のゼブラフィッシュの腎臓におけるアルカリホスファターゼの染色、汎近位尿細管マーカー、図5。代表的な結果。 （AC）アルカリフォスファターゼ染色（ターコイズ）は、PCTとPSTの両方を強調し、ネフロンの近位尿細管を照らす。（DF '）列挙された遺伝子の単一WISH（紫染色の各）。（D、D'） キュビリンの発現パターン汎近位（PCT-PST）マーカーは、アルカリホスファターゼ（D、D '）と相関する。比較すると、mafbaためWISHは、PCT（E、E '）をマークし、slc13a1は 、PST（F、Fマーク'）。 （GG "'）slc20a1a <PCTマーカーのための二重WISHで/ em>の（赤）及びPSTマーカーslc13a1（紫色）は、これらのマーカーによって標識されたセグメントが重複しないよう、むしろ単一ネフロン密接（ '"G'-G）を調べているとき、それらの発現ドメインが隣接する位置を占めることを示している。黒矢印は、一般に、それぞれ、小規模から大規模まで細管径の変化と関連している、PCTとPSTセグメント間の接合部を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6。アルカリホスファターゼおよび成人腎臓ネフロンのPCTセグメントにおけるデキストランの取り込みショー重なり、およびアルカリホスファターゼ染色は、ヨウ化プロピジウムによる核同時標識と互換性があります。 （AI） 、*）、。（AC）結合画像および単一の腎臓のサドルの領域の別個の画像。（DF）は 、各腎臓の主要集合管のペアを照らす単独のアルカリホスファターゼは、PSTにラベルを付け、一方、および（GI）マージされた画像やサンプルネフロンの個別の画像の二組。（I）凍結切片分析は、アルカリホスファターゼおよびPCTセグメント（白い点で概説）デキストランフルオロルビーの同時標識を確認するセグメント（黄色の点で概説）。（KM）腎臓た（K）のアルカリホスファターゼ（ターコイズ）と（L）のヨウ化プロピジウム（紫）、（M）を可能にするで標識された、それぞれ。近位尿細管細胞とそれらの核の可視化を合併し、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図7アルカリホスファターゼおよびDBAは、それぞれ、成人のゼブラフィッシュの腎臓ネフロンに存在する汎近位及び汎遠位領域をマークし、相互に排他的なセグメントラベルです。 （AH）、アルカリホスファターゼおよびローダミンDBAで染色したゼブラフィッシュ腎臓のホールマウント標本。アルカリホスファターゼ（ターコイズ）およびDBA（赤）は、腎臓の重なりを示していない。アルカリ性ホスファのバックグラウンドレベルTASEそれらの広い直径に独特である各腎臓における主要な集合管（アスタリスク、*）のペアを照らす。 DBAは正の細管の直径は薄く、分岐点（白矢印）の存在によってしばしば特徴付けられる。（AC）結合画像および単一の腎臓のサドルの領域の別個の画像。（DF）マージされた画像および個別の画像の一組例ネフロン。（G、H）追加の例、アルカリホスファターゼ陽性の尿細管と並んで分岐したのDBA細管で、画像を統合しました。（I）凍結切片の分析は、アルカリホスファターゼおよびDBAラベルの異なる細管のセクションことを確認し、唯一の珍しい細管はどちらもラベルを見せる（白矢印）、その細管のための部分の角度に起因する可能性が高い。この分析のために、野生型トランスジェニック魚のTg：enpep：eGFPのは 、使用され、この腎臓における尿細管のすべてがGFPを検出するための一次抗体で免疫標識した（J）を 。 、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
遠位セグメントWISH解析に比べて、デキストランの取り込み、アルカリホスファターゼ、およびDBAの成人腎臓凍結切片の図8。トリプルラベリング。 （AE）成人腎臓を腹腔内にデキストラン-FITC（緑）を注射し、そして腎臓は埋め込 み、凍結切片のために3日後に回収した。アルカリホスファターゼ反応性とDEXT陽性であったPCTセグメント：アルカリホスファターゼ（ターコイズ）およびDBA（赤）による染色は、尿細管の3つの集団を明らかにしたのみ（黄色の点で概説）アルカリホスファターゼ反応性について陽性であったのPSTセグメント、また特徴的な遠位分岐点を示した（赤い点で概説）DBAのみ陽性であった遠位尿細管セグメント、（白い点で概説）走った。（別の例の断面のAD）の画像と1例セクションの独立した画像を合併。（E）合成画像。シングル（FH '」による遠位尿細管の遺伝子発現パターンの（FI）比較）とダブル（I）WISH。 （FH '）列挙された遺伝子の単一WISH（紫染色のそれぞれ）。（F、F'）clcnkの発現パターン、汎遠位（DE-DL）マーカーは、分岐点を含んでいた薄い尿細管で検出された（黒矢印）。（G、G '）の比較では、slc12a1のための願いが検出されていない分岐点でDEをマークし、（H-H' "）<em>のslc12a3は、DL、腎臓の臓器（黒矢印）を通じて多数の分岐点によって特徴づけられるセグメントをマークします。PCTマーカーslc20a1a（赤）と汎遠位clcnk（パープル）のための（I）ダブルウィッシュ。これらのマーカーによって標識セグメントは重複しない、むしろそれらの発現ドメインは、個別のPCTのコイル（下右）、非隣接位置を、占める、遠位尿細管に当接しないで、後者は離散的な位置を占有し、特徴的な分岐点（黒い矢印を有し）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
ここでは、成体ゼブラフィッシュにおけるネフロンセグメントのコンポーネントの視覚化を可能にする方法を記載している。蛍光デキストラン複合体の注入は、これらの近位尿細管細胞30,38のエンドサイトーシスの性質により優遇されたPCTラベリングを可能にします。この方法は、異なる蛍光複合体の群れを得ることができるデキストランの存在に非常に柔軟に行うことができる。二次標識手順が必要とされないように加えて、リジン固定可能なデキストランの使用は、PCTセグメントを標識するための特に便利な方法です。これは、比較的簡単な信号検出を可能にし、多くの他の蛍光標識、免疫標識、およびトランスジェニックレポーター株の使用と互換性がある。アルカリホスファターゼ標識はまた、PCTにおいて強い反応性とPSTでわずかに弱い反応性、近位尿細管をマークします。最後に、DBA染色はCHを表示遠位尿細管セグメントのラベル付けを可能にしますaracteristicは形態を分岐した。非免疫由来の糖結合タンパク質である、さまざまなレクチン分子は、哺乳動物のネフロンセグメント47を区別するために広く使用されてきた。それはそれは、哺乳動物の腎臓47に集合管をマークするために利用されるようにゼブラフィッシュにおけるDBAは、遠位尿細管セグメントと相関していることは興味深い。
まとめると、これらの方法は、腎組成および機能を文書化するためにさまざまな組み合わせで利用することができる。これらの方法の全ては、全体の腎臓調製物において使用することができるので、それらは完全に多くの時間がかかり、面倒な方法、 例えば、凍結切片作業と免疫標識の使用に頼ることなく、臓器全体ネフロンの構造と機能を評価するためのツールを提供する。しかし、この方法の資料に記載の汚れは凍結切片で生存可能である。凍結切片の分析は、特定のpeptiを検出するための免疫組織化学のために適しています（ホールマウントと比較して）サンプルを生成DESは、もちろんかかわらずこの種の分析は、適切な一次抗体の利用可能性を必要とします。残念ながら、ゼブラフィッシュ、動物モデルでの作業中の一つの主要な制限は、抗体の貧しい可用性残る。したがってWISHは、遺伝子発現の解析のための最も広く使用されている、 すなわち、「ゴーに、「手続きのまま。紫や赤の沈殿物を生成するためにBCIP、NBT、および/またはINT基質反応を用いてWISHは、凍結切片上の蛍光染色と互換性がありません。一つの選択肢は、蛍光WISH検出、ゼブラフィッシュの胚のサンプル用に最適化されており、成人の腎臓での使用のために調整することができた手順の使用を呼び出すことであろう。このビデオ記事の方法の説明は、個別のセグメントは、eGFPのかmCherryをレポーターで標識されたトランスジェニックゼブラフィッシュ系統との組み合わせで蛍光WISHのような技術とのさらなる実験のために許可する必要があります。代わりに、これらの方法は、ここでクーロンを説明したその他の重要な染料、 例えば、他のレクチンと組み合わせて試験することがdは。したがって、ここに記載した方法の更なる適応と膨張が全体マウント腎臓調製および分析のための研究者のニーズに合うように呼び出すことができる。
このように、これらの方法は、進行中の再生の研究のためのゼブラフィッシュモデルと実装のための、また、遺伝病のモデル化において幅広い可能性を秘めている。腎臓の苦痛のための革新的な研究や治療の差し迫った必要性がある。何百万人もの人が、先天性の急性および/または慢性の原因から生じ、毎年腎臓病のいくつかのフォームに苦しんでいます。さらに、腎臓病の有病率は、これらの疾患のグローバルな公衆衛生上の問題14,15を作り、世界的に上昇し続ける。外部透析機械が自分の腎臓がこの役割を実行できない場合には、代謝廃棄物の患者の血液を取り除くのに役立つことにより、血液透析などの治療法が利用可能である。残念ながら継続的な治療が生存のために必要であるとして、この介入は、制限があります。また、患者は、最終的には、患者がキャンセル待ちに置かれると受け取るように年を取ることができる腎臓移植を必要とします。でも、腎臓移植を取得した後、多くの患者は、手順の結果として悪影響を受けると自分たちの生活の残りのためにこれらの効果を戦う必要があります。これらの困難は、腎疾患を予防またはおそらく組織再生8,16,52,53を強化するのに役立つどちら小説治療法の開発のための重大な必要性を実証している。生物医学研究室で人間の被験者の使用の明白な倫理的な限界を考えると、動物モデルは、ヒト疾患の病因の研究のため、新たな治療法のテストのために不可欠である。その解剖学的類似性および進化の近接の結果、マウスは、ヒト疾患45の最も広く使用されているモデルとなっている。しかし、この動物との一定の制限がはこちらより、あるインビボでの大規模遺伝子スクリーニングを完了することの実用性器官の発達を可視化するることができない。ゼブラフィッシュは、ヒト疾患45,46の臓器の開発とモデリングの研究のための関連性の高い有益なモデル生物である。ヒトの疾患に関しては、ゼブラフィッシュにおける機能ホモログは、ヒトの全遺伝子54,55のほぼ70％のために存在する。
最近の研究は、腎臓の研究31,37,56の多くの分野のためのゼブラフィッシュの有用性を強調している。 AKI後のゼブラフィッシュにおける再生及び修復の研究は、尿細管上皮再生とneonephrogenesisが発生し、30,37時間経過再生を通じて重複する2つのプロセスがあることを示唆している。ゲンタマイシンと呼ばれるアミノグリコシド系抗生物質の使用は、成人のゼブラフィッシュ29,30,37にAKIの成果を研究するためのそれを通して怪我パラダイムとして利用されている。ゲンタマイシン、近位tubulから損傷後約2週間にわたりエス再生成し、その間に新しいネフロンは、臓器29,30,37を通じて形成される。一般的には、上皮再生を制御するメカニズムは非常に議論の余地が残されている。修復プロセスの1提案されたメカニズムでは、内腔への死細胞の脱落に続いて、最初の急性損傷のイベントがあります。次に、新しい細胞が分化し、その後脱分化、増殖、および移行一連のイベント、負傷した基底膜を再増殖し、損傷部位に機能を回復さがある。あるいは、他の研究は、置換細胞はネフロンの尿細管内に存在する幹細胞/前駆細胞から生じることを示唆している。ゼブラフィッシュにおいてneonephrogenesisのプロセスに関しては、細胞凝集体は、ゲンタマイシン注射29,30によって次AKIが観察されている。これらの凝集体は後に既存の細管29,30に配管し、新しいネフロンに成熟する。ネフロン上皮再生とneonephrを結びつける共通のスレッドogenesisは、全くの謎因子である：現時点では、これらの回生偉業が利用可能な洞察があるよりも、発生する方法については、指数関数的に多くの質問があります。
現在までに、しかし、証拠のいくつかのエキサイティングなラインがゼブラフィッシュを用いた腎再生研究は確かに、直接、翻訳可能性56-58を有することができる人間のAKIに関連する比較洞察を提供できるという考えを支持している。化学スクリーニングは、最近、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤メチル-4-（フェニルチオ） -ブタノエート（m4PTB）56,57が同定されたゼブラフィッシュ胚における腎前駆細胞の増殖を増加させる小分子を同定する。ゲンタマイシン誘発のAKIとゼブラフィッシュの幼虫にこの化合物の投与は、幼虫の生存率が増加し、その尿細管増殖は56,58を向上したことを明らかにした。適度な虚血誘導AKIとマウスをm4PTBで処理した場合、その回復が連想で加速された尿細管細胞58の増殖の両方尿細管萎縮および細胞周期停止の減少にiation。これらの知見は、正常なゼブラフィッシュ腎臓の発生および/ またはAKI回生応答を担う経路は、哺乳類56で保存されることを示唆している。
このように、さらなる研究が関与しているシグナル伝達経路を特定し、それらの相互作用、ゼブラフィッシュは、腎臓フィールドに、この重要な目標を追求するために、1つの有望な手段を提供して理解することが回生すなわちのメカニズムを離れていじめるために必要とされている。このようなプロトコルに記載ネフロンセルのラベルなどのツールは、AKIモデルにおいて腎組成および機能性を評価するために利用することができるアッセイの1つのグループを表す。さらに、それらは、腎臓病のトランスジェニックモデルを特徴付けるために適用することができ、腎ダム後のネフロン構造の修復を促進することができる化学治療薬を同定する方法を提供することができる時代。
Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Acknowledgments
この作品は、以下の中からRAWに資金によってサポートされていました：国立衛生研究所は、K01 DK083512、DP2 OD008470、およびR01 DK100237を付与します。ダイムバジルオコナースターター学者グラント賞＃5-FY12-75 3月;科学と生物科学専攻のノートルダム大学の大学から資金を起動する。そしてギャラガー家族に代わってエリザベスとマイケル·ギャラガーからノートルダム大学の寛大な贈り物は、幹細胞研究促進するため。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定、または原稿の準備に何の役割がありませんでした。私たちは、ゼブラフィッシュのコロニーのケアと福祉での傑出した献身ために彼らのサポートのために生物科学科のスタッフに感謝し、ノートルダム寺院でのゼブラフィッシュ研究センター。最後に、この作品についての彼らのコメント、議論や洞察力のための私達の研究室のメンバーに感謝。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X PBS | Made by diluting 10 X PBS in distilled water. | ||
| 1X PBST | 0.1% Tween-20 detergent in 1 X PBS. | ||
| 1X PBS with 0.05 % Tween | 0.05% Tween-20 detergent in 1 X PBS. | ||
| Tween 20 | American Bioanalytical | AB02038 | |
| 4% PFA/1X PBS | Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20°C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. | ||
| Fine Forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
| Glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | White Frost |
| Glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
| Modeling clay | Hasbro | Playdoh | Other modeling clays can be substituted and work similarly |
| Slide holder | Thermo-Fisher | 12-587 | Optional: cardboard tray to store slides flat |
| Bleaching solution | Bleach mix formula (for a 20 ml solution): 1.6 ml of 10% Potassium hydroxide solution 0.6 ml of 30% Hydrogen peroxide solution 100 μl of 20% Tween Fill to 20 ml with distilled water |
||
| Potassium hydroxide | Sigma | 221473 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | H1009 | |
| Blocking solution | Blocking Solution (for a 10 ml solution): 8 ml of 1X PBS with 0.05% Tween 2 ml of fetal calf serum 150 μl of DMSO |
||
| Alkaline phosphatase activity detection | Invitrogen | E6601 | We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit. To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer's instructions. |
| Alkaline phosphatase wash solution | Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 ml solution): 5 ml of 0.5 M EDTA 120 mg of Levamisole 95 ml of 1X PBS |
||
| Dextran, fluorescein, 40,000 MW | Invitrogen | D1844 | Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C. |
| Dextran, cascade blue, 10,000 MW | Invitrogen | D1976 | Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C. |
| Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW | Invitrogen | D1825 | Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C. |
| Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW | Invitrogen | D1817 | Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C. |
| Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine | Vector laboratories | RL-10-32 | DBA Staining Solution (for a 100 μl solution): 1 μl of DBA 99 μl of 1X PBS |
| Propidium iodide | Invitrogen | E6601 | |
| DAPI | Invitrogen | P1304MP | |
| Vectashield hard set mounting medium | Vector laboratories | H-1400 | |
| Micro cover glass | VWR | 48393081 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | American Bioanalytical | 67-68-5 | |
| Sucrose | Sigma | S0289 | |
| EDTA, 0.5 M solution, pH 8.0 | American Bioanalytical | AB00502 | |
| Levamisole | Sigma | L-9756 | |
| Tissue freezing medium | Triangle Biomedical Sciences, Inc. | TFM-C | |
| Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10 x 10x 5 mm | Sakura Finetek | 4565 | |
| TruBond 380 adhesive microscope slides | Tru Scientific | 0380W | |
| Liquid blocker – super PAP pen | Electron Microscopy Sciences | 71312 | |
| Immuno stain moisture chamber | Evergreen Scientific | 240-9020-Z10 | |
| Cryostat | Therm | Microm™ HM 525 Cryostat | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC | Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection. |
| Compound microscope | Nikon | 96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red | Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection. |
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