Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Analys av Nephron sammansättning och funktion i vuxen Zebrafish Kidney

doi: 10.3791/51644 Published: August 9, 2014

Summary

Den zebrafisk vuxna njuren är ett utmärkt system för njur förnyelse och sjukdomsstudier. En viktig aspekt av denna forskning är bedömningen av nefronet struktur och funktion. Detta protokoll beskriver flera metoder som kan genomföras för att bedöma nephron tubuli sammansättning och för att utvärdera njur reabsorption.

Abstract

Den zebrafisk modellen har vuxit fram som ett relevant system för att studera njurutveckling, förnyelse och sjukdom. Både de embryonala och vuxna zebrafisk njurar består av funktionella enheter som kallas nefroner, som är mycket konserverade med andra ryggradsdjur, inklusive däggdjur. Forskning inom zebrafisk har nyligen visat att två distinkta fenomen genomsyra efter vuxna nefroner medföra skador: först, det är robust förnyelse inom befintliga nefroner som ersätter de förstörda tubuli epitelceller; andra är helt nya nefroner framställts av njur stamceller i en process som kallas neonephrogenesis. Däremot människor och andra däggdjur verkar ha en begränsad förmåga till nefronet epiteliala förnyelse. Hittills har de mekanismer som ansvarar för dessa njurregenere fenomen förblir dåligt kända. Eftersom vuxna zebrafisk njure genomgår både nefronet epiteliala förnyelse och neonephrogenesis, de ger en enastående experimentellt paraparadigmet för att studera dessa händelser. Vidare finns det ett brett utbud av genetiska och farmakologiska verktyg som finns i zebrafisk modell som kan användas för att avgränsa de cellulära och molekylära mekanismer som reglerar njur förnyelse. En viktig aspekt av denna forskning är utvärderingen av nefronet struktur och funktion. Detta protokoll beskriver en uppsättning av märkningstekniker som kan användas för att mäta njur sammansättning och prov nefronet funktionalitet i den vuxna zebrafisk njure. Således är dessa metoder är allmänt gäller för den framtida fenotypisk karaktärisering av vuxna zebrafisk njurskada paradigm, som inkluderar, men är inte begränsade till, nephrotoxicant exponerings regimer eller genetiska metoder för riktade celldöd såsom nitroreduktas medierad cell ablation teknik. Vidare kan dessa metoder användas för att studera genetiska störningar i vuxennjurbildningen och kan också användas för att bedöma njurstatus vid kronisk sjukdom modellering.

Introduction

Njuren är ett komplext organ som uppfyller en mängd olika fysiologiska funktioner i kroppen. Den främsta funktionen av njuren är metaboliskt avfall utsöndring, och denna uppgift är tätt sammanflätad med underhåll av vätska homeostas. Njuren utför dessa jobb genom att filtrera blodet och bildar urin, medan samtidigt reglera blodtrycket, elektrolytnivåer och syra-bas balansen. Mycket specialiserade epitelceller tubuli kallas nefroner fungera som den grundläggande funktionell enhet i njuren 1,2. Hos vuxna ryggradsdjur är nephrons vanligtvis organiserade i en tätt lindad arrangemang kring ett centraliserat avloppssystem, vilket möjliggör många tubuli att packa in i ganska liten orgel. Till exempel kan varje mänsklig njure innehålla över en miljon nefroner 3. Andra däggdjur som musen har i storleksordningen 8-10.000 nephrons per njure 4. Graden av njur komplexitet skiljer mellan dessa däggdjur och andra vertebrates på grund av variationer i totalt nefronet nummer och deras arkitektoniska utformning i njuren. Ryggradsdjur bildar så många som tre på varandra följande njurstrukturer under utveckling, och var och en för visas ökande komplexiteten när det gäller nefronet kapitalförsäkring och arrangemang: de pronephros, mesonephros och metanefros. Den sista njur struktur som ska behållas fungerar som den vuxna njurorgan vanligtvis ett mesonephros eller metanefros 2. Varje njure formen har emellertid en nefronet baserad komposition 2.

Nefronet är arbetshästen i njuren och ansvarar för blodfiltrering tillsammans med metabolit sekretion och reabsorption. Nephrons är enkla rörformiga strukturer som består av epitelceller och har en segmentell organisation, där diskreta, mycket specialiserade områden av differentierade epitel utföra specifika uppgifter. I storleksordningen filtratflödet genom nefronet, det finns typiskt tre huvuddelar som comprise varje enhet: (1) njurblodkropp, (2) en tubuli med proximal, mellanliggande och distala segment och (3) en samlingskanal 1. Den proximala tubulus är ansvariga för resorptionen av organiska lösta ämnen, notably glukos och aminosyror 1. Mellan tubuli (eller Henles slynga) är en viktig plats för salt och vattenreglering 1. Slutligen finjustering av salt och andra joner förekommer i distala tubuli och samla kanal och är starkt reglerad av det endokrina systemet 1. Därifrån färdas filtratet genom urinledaren och urinblåsan, i sista hand ut ur kroppen som en avfallsprodukt 1.

Förlusten av njurfunktion kan bero på en mängd orsaker som hindrar normal nefronet aktivitet. Dessa orsaker kan förekomma under njurutveckling, t.ex. medfödda defekter som leder till missbildning av nefroner 5, eller orsaker från olika typer av skador (till följd av både genetiska och environmental ursprung). Förvärvade skador är i stort sett kategoriseras som akut njurskada (AKI) eller kronisk njurskada (CKD). AKI innebär en plötslig förlust av njurfunktion, ofta till följd av ischemi eller toxinexponering 6,7. Hos däggdjur är nephron epitel reparation möjligt efter sådana skador åtta, och många människor uppvisar fullständigt återupprättande av njurfunktionen efter AKI. Dock är AKI också förknippad med hög morbiditet och mortalitet som har rapporterats på bred 30-70% förekomst Område 6,7. CKD däremot förknippas med progressiv förlust av njurfunktion som är resultatet av år av långvarig skada, vanligtvis förknippas med fibros 8,9. Vidare föreligger ett samspel mellan AKI och CKD, som endera kan predisponera en person till den andra 10-12. Till exempel de som har drabbats av AKI är mer mottagliga för CKD och med död 13. Incidensen av njursjukdom, både i USA och i hela världen, har nått epidemic proportioner och spås stiga som den åldrade befolkningen expanderar-därför finns det ett växande behov av att identifiera regenerativ medicin interventioner för njuren 14,15.

Trots kunskapen om att AKI patienter kan återhämta sig, har det länge varit tänkt att njuren är ett organ utan medfödda regenerativ befogenheter. Denna traditionella uppfattning har dramatiskt reviderats under de senaste åren 16. Studier som undersöker njurskador hos möss och råttor efter AKI har visat att nefronet tubuli epitelceller kan föröka sig och bygga funktionella nephrons 17-20. Även däggdjur besitter denna adaptiva förmåga att regenerera nefroner, det finns anmärkningsvärda begränsningar och maladaptiv reaktioner kan utlösas som leder till renal fibros och CKD 21. Till exempel visade en färsk undersökning att upprepade epitelceller ablation i murina nefroner var associerad med minskad förnyelse och njur fibros-tyder nephrons HAVea begränsad regeneretröskel 22. Det finns inga belägg för att den vuxna däggdjurs njuren bildar nya nephrons att ersätta förlorade eller skadade sådana, alltså deras undergång leder till en permanent 8,9 nefronet underskott. Intressant nog har vissa ryggradsdjur svarar på AKI genom att regenerera nephron epitel och även producera nya nefroner, avses en process för att så neonephrogenesis eller nephron neogenesis 23. Neonephrogenesis förekommer i fisk efter toxinexponering eller partiell resektion, och skademodeller har historiskt inkluderat guldfisk 24,25, tilapia 26, skridsko 27 medaka 28, och på senare tid, zebrafisk 29,30. Av dessa zebrafisk ger en livskraftig genetisk forskning modell för att upptäcka de cellulära och molekylära vägar som ansvarar för njur förnyelse.

I denna video artikeln visar vi hur man kan märka Nephron segment vuxna zebrafisk. Kunskap om nefronet anatomi, molekylära egenskaper,och funktionella egenskaper är väsentliga för framgångsrika framtida njur studier med zebrafisk. Den vuxna zebrafisk njuren är en mesonephros struktur och sin natur är mindre komplex när det gäller nefronet nummer och organisation än den metanefros struktur som finns i vuxna däggdjur, fåglar och reptiler 31. Dock är zebrafisk organisation nephron segment analogt med däggdjur, och dokumenterades först i embryonala njur baserad på genuttryck studier 31-35. Zebrafisk embryo nephrons innehåller linjära tubuli segment som inkluderar proximala tubuli (PCT), proximala tubuli raka (PST), distal tidigt (DE) och distal sent (DL) 31-35 (Figur 1). Zebrafisk vuxna nephrons besitter liknande rörformiga segmenten 30,31,36,37 (Figur 1). PCT kan också identifieras genom en funktionell fenotyp: epitelceller i PCT kommer att innehålla fluorescerande dextran föreningar (10-70 kDa i storlek) som finns icirkulation, som har använts i både embryonala och vuxna zebrafisk njure att bedöma endocytiska upptagningen av dessa proximala tubuliceller 38-41 (Figur 1). En skillnad i Nephron segment mellan zebrafisk och däggdjur är att zebrafisk saknar en mellan tubuli eller Henles slynga 30-37; eftersom detta segment fungerar hos däggdjur för att spara vatten, och zebrafisk är en sötvattensarter utan en brådskande att koncentrera sin urin, är det inte förvånande att zebrafisk saknar detta segment 32,33. Således är den totala nefronet sammansättningen i stort sett bevarad mellan zebrafisk och däggdjur njure 32,33. Dessa likheter har aktiverat zebrafisk sig vara ett effektivt sökverktyg för att undersöka funktioner njur-uttryckta gener under utvecklings nephrogenesis 32-35,42 och att modellera många njursjukdomar 43,44 och därmed lägga till den omfattande förteckning över mänskliga förhållanden som kan vara undersöktes med användning avzebrafisk 45,46.

Idag är den vuxna zebrafisk njuren en attraktiv modell för jämförande studier av njur förnyelse på grund av sin genetiska spårbarhet och växande gommen av tekniska resurser tillgängliga för att förhöra geners funktion och signalvägar i denna art. Flera studier har använt de zebrafisk mesonephros att undersöka mekanismerna för förnyelse efter AKI 29,30,37. För fortsatt AKI forskning med den vuxna zebrafisk njuren, är det viktigt att ha utsökta metoder för att märka olika Nephron regioner och metoder för att kartlägga nefronet funktionalitet. Flera metoder för vuxna njuranalys har anpassats efter embryonala njurprotokoll. Intraperitoneal injektion av fluorescensmärkt dextran i den vuxna zebrafisk etiketter PCT epitelet i mesonephros nefroner via endocytos 30, såsom i zebrafiskembryon 38-41 (Figur 1). Denna metod har använts för att visualize när proximala tubuli återfå sin reabsorbing egendom efter AKI, vilket möjliggör en bedömning av restaurerade fysiologisk funktion 30 (Figur 1). En annan funktion i nefronet proximala tubulus är att epitelcellerna i detta segment har en borste kant 37 som visar höga nivåer av endogen alkaliskt fosfatas-aktivitet. Sålunda kan den proximala epitel lokaliseras visuellt i den vuxna zebrafisk njure med användning av en fluorescens-baserad teknik som kallas ELF- (enzymmärkt Fluorescens) -97 47.

Här beskriver vi hur du utför fluorescerande dextran upptagsanalyser 30,48 i den vuxna zebrafisk njuren, för att erhålla en funktionell bedömning av den proximala tubuli och kart storleken och konturerna av denna tubuli segment. Därefter beskriver vi metoder för att märka de proximala tubuli regioner i vuxen nephron med den fluorescerande märkningen alkaliskt fosfatas. För det tredje visar vi för första gången som rhodamin-märkta lektinet Dolichos biflorus agglutinin (DBA), som har använts som en allmän markör för uppsamlingskanalerna i däggdjursnjur 49, markerar de distala tubuli i den vuxna zebrafisk njure. Som DBA är ömsesidigt uteslutande till alkaliskt fosfatas färgning, dessa etiketter ger ett sätt att i stort sett skilja pan-proximala kontra pan-distala delarna av den vuxna zebrafisk nefronet. Under hela genomförandet av dessa fluorescerande fläckar i både hela berget och kryostat histologiska snitt, vi korrelerar dessa etiketter med uttrycks domäner av löst ämne transportörgener som unikt identifierar varje nefronet segment. Därför är detta protokoll innehåller också en guide till de ändrade förfarandena vävnads bearbetning för vuxen vävnad hela montera in situ hybridisering (WISH) analys, baserade på vår embryo WISH protokoll 50. Dessa procedurer kan användas i olika kombinationer (figur 2) för att dokumentera morfologiska och funktionella attribut of vuxna zebrafisk njure nefroner. Sålunda kan dessa protokoll appliceras på regenereringsstudier, den fenotypiska karaktäriseringen av andra modeller med njursjukdom, och även användas för att studera bildningen av den vuxna njuren.

Protocol

Förfarandena för att arbeta med zebrafisk beskrivs i detta protokoll godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Notre Dame. Obs: En guide till njure och nefronet anatomi i zebrafisk tillhandahålls (Figur 1). En översikt över de metoder som beskrivs i detta protokoll tillhandahålls som ett flödesschema (figur 2) för att illustrera hur flera märkningsförfaranden kan utföras på samma njurprovet. För del 7 om WISH förberedelse för vuxennjurstudier, de steg som här visar hur man ändrar behandlingen av zebrafiskembryon, som nyligen publicerats 50, för att tillhandahålla en teknisk guide för framgångsrik WISH analys av njur orgel.

1 Vuxen Zebrafish intraperitoneal injektion med Dextran besöksmål

  1. Bered önskad fluorescensmärkt dextran lager (n) genom att lösa dextran pulver i destillerat vatten vid en koncentration50 mg / ml och förvara alikvoter i mikrocentrifugrör vid -20 ° C i mörker. Anm: Olika fluorescerande dextraner är kommersiellt tillgängliga. Välj dextran för användning baserat på en kombination av andra etiketter som önskas, och se till att lämpliga fluorescerande filter finns med de mikroskop som kommer att utnyttjas. Lysin-fixable dextraner visar fluorescens utan ytterligare märkning steg i levande prover, unfixed vävnadsprov från euthanized exemplar, och fasta prover.
  2. Tina önskat dextran lager och lagra på is i mörker när de utför steg 1,3-1,5. Linda mikrocentrifugrör i aluminiumfolie för att skydda den mot ljus vid hantering.
  3. Bedöva en vuxen zebrafisk mellan 5-7 månader i ålder genom att placera fisken i en skål innehållande antingen 0,02% tricaine eller 0,001% 2-fenoxietanol under ca 1 - 2 min. Obs: Det är bättre att använda vuxna zebrafisk för denna åldersgrupp eftersom yngre fisk kan ha small njurar som är svåra att dissekera och njurprover från gamla fiskar kan innehålla massor av ärrvävnad som inte kan analyseras. När tillräckligt bedövad, kommer den vuxna zebrafisk inte uppvisar ett svar att röra stimulering, vilket kan testas med hjälp av en sked eller slö sond för att försiktigt röra vid stjärtfenan på fisken.
  4. Med hjälp av en plastsked, lyfta fisk från skålen, häll upp lösningen och försiktigt placera djuret på en våt svamp mögel, ventrala sidan uppåt.
  5. Med hjälp av en spruta 31 G 1,0 cc insulin, injicera 20 pl tinade dextran stamlösning i intraperitoneal utrymmet. Genom nålen, så att insättningen sker vid en grund vinkel vid den ventrala mittlinjen på buken. För att undvika att punktera organ, in nålen sedan lätt ta upp det för att lyfta kroppen väggen av fisk och skapa ett utrymme för att injicera dextranlösning 48. Anm: Alternativt kan dextran lager spädas, t.ex. i förhållandet 1: 2 eller 2: 1 (dextran: distilled vatten), för att reducera bakgrundsfluorescens i provet.
  6. Tillbaka försiktigt fisken på tanken att tillåta återhämtning från anestesi. Obs: Upptag av dextran genom proximala tubuli segment sker inom 8-12 timmar och kan detekteras i minst upp till 3 dagar efter injektion (dpi). Analys på 3 dpi ger stark tubuli signal med låg bakgrundsfluorescens i njur stromal populationer. Gå vidare till del 2 för hela berget undersökning av dextran upptag enbart om ytterligare märkning inte är önskvärt. För kombi märkning, vidare till del 3 för att förbereda vävnad för hela berget undersökning av dextran upptag, då del 4 för att dubbel etikett med alkaliskt fosfatas och / eller del 5 för att utföra DBA dubbel eller trippelmärkning. För forskning med histologiska snitt, vidare till del 6 för instruktioner om hur man gör fina delar av njuren med hjälp av en kryostat och hur att färga dessa med olika etiketter och / eller immunohistokemi med primär och sekundär AntibOdies.

2. Dissection och Flat Mount Beredning av vuxna zebrafisk njure från en Ofixerad Animal Prov att visualisera Fluorescerande Dextran Märkning av proximala tubuli

  1. Euthanize dextran-injicerade vuxna zebrafisk genom att placera den i en skål med 0,2% Tricaine pH 7,0 under 4 - 5 min. Observera: Se till att fisken har avlivats innan du fortsätter genom att övervaka noggrant om gälarna har upphört rörelse och hjärtat har slutat slå 36.
  2. Med hjälp av en plastsked, lyfta fisk från Tricaine lösningen, häll upp lösningen och placera djuret på en vävnad eller pappershandduk.
  3. Använd en vass par dissekering sax för att göra ett snitt bakom gäl gällocket och ta bort huvudet.
  4. Öppna omedelbart kroppen av fisken med dissektion sax genom att göra en lång ventrala snitt från huvudet till basen på stjärtfenan.
  5. Ta bort de inre organen i fisken med hjälp av ett par fina pincett.
  6. Använd superfina dissektion nålar till stift öppna kroppen väggarna för att tillåta visualisering av njuren organ, vilket är vidhäftande till den dorsala väggen av djuret.
  7. Använd fin pincett för att ta bort njuren från rygg väggen.
  8. Placera försiktigt njuren i en 5 ml injektionsflaska av glas som innehåller 1X PBS och tvätta 3 gånger med 3 - 5 ml färskt 1X PBS för 5 min vardera. Anmärkning: Användning av en glasflaska för hantering av vuxna njurprover underlättar visualisering av vävnaden och möjliggör tvättar med stora volymer (i förhållande till den vävnadsmassa) av ungefär 3-5 ml. Alternativt kan användas en 12-brunnars cellodlingsskål. Medan en plast mikrocentrifugrör skulle kunna användas, skulle de standardstora rör (1,5 ml) begränsa tvättning.
  9. Avlägsna njure med en överföringspipett och plats på en ren glasskiva med 1-2 droppar 1X PBS.
  10. Använd fin pincett för att platta njuren på bilden, vilket gör att ingen vävnad har böjt eller på annat vältepå själv. Anm: Alternativt kan en volframtråd verktyg användas för att göra små snitt i bindväv för att underlätta plan positionering av njuren.
  11. Placera små bitar av modellera i varje hörn av en 18 x 18 mm täckglas och långsamt ställa täckglas på njuren. Obs: Något vinkel täckglas under placering för att minimera droppa luftbubblor i lösningen 50. Modelleran divots är ca 2 mm i diameter (Figur 2A). Alternativt kan divots av vakuum fett sättas in i stället för modellera. Tillsätt en ytterligare droppe 1X PBS för att fylla utrymmet mellan täckglas och objektglas om nödvändigt.
  12. Observera och / eller bild njuren genom att placera glasskiva i synfältet på ett stereomikroskop eller sammansatt mikroskop med lämpligt filter. Anm: Se Figur 2A för makroskopisk utseende denna preparatet.

3. Fixation, Dissection, Permeabilization och borttagning av pigmentering av vuxna zebrafisk njure

  1. Bered en färsk fixativ lösning av 4% paraformaldehyd (PFA) / 1X PBS / 0,1% DMSO eller tina en frusen portion på 4% PFA / 1 X PBS och tillsätt 0,1% DMSO. Varning: PFA är giftigt och PFA lösningar ska hanteras vid en kemisk huva iklädd lämplig personlig skyddsutrustning, inklusive handskar och skyddsrock. Dessutom bör PFA pulver hanteras varsamt när du gör aktielösningen.
  2. Fyll en dissektion bricka med tillräckligt fixeringslösning för att dränka hela djuret.
  3. Euthanize och montera den valda zebrafisk i fixeringslösning (se steg från 2,2 till 2,6). Obs: Den valda fisk kan vara en obehandlad zebrafisk njurprovet, eller en njure isolerad från en zebrafisk som tidigare fått en intraperitoneal dextran injektion (del 1).
  4. Fäst prov O / N (12 - 16 h) vid 4 ° C.
  5. Följande dag, använd fin pincett till vårdhelt ta bort njuren från rygg kroppen väggen och placera orgeln i en glasflaska med hjälp av en överförings pipett. Anm: Alternativt kan en 12-brunn eller 24 brunnar odlingsskål användas. Medan en plast mikrocentrifugrör skulle kunna användas, skulle de standardstora rör (1,5 ml) begränsa tvättning.
  6. Tvätta dissekerade njuren 3 gånger med 3 - 5 ml 1X PBS med 0,05% Tween för 5 min vardera.
  7. Avlägsna 1X PBS med 0,05% Tween och skölj njuren med 3 ml av en 5% sackaroslösning (i 1X PBS) under 30 min.
  8. Ersätt med 3 ml 30% sackaroslösning (i 1X PBS) och lagra O / N (12 - 16 h) vid 4 ° C. Obs: sackaroslösningar permeabilisera cellmembran, därefter tillåta särskild märkning av reagens som de penetrerar vävnaden.
  9. Följande dag, ta bort sackaroslösning 30% och tvätta njuren två gånger med 5 ml 1X PBS med 0,05% Tween under 5 min vardera.
  10. Byt ut 1X PBS med 0,05% Tween med 3 -5 ml av blekningslösningen för att avlägsna melanocytstimulerande pigmente närvarande på njuren orgel.
  11. Placera glasflaska på en rotator och titta noga som pigmenteförsvinner. Obs: pigmentborttagning tar normalt cirka 20 minuter när de utförs efter sackaros behandling, men ibland kan ta upp till 60 min. Om blekningslösningen är kvar på njuren för länge, kan sönderdelningen av organet inträffa; Det rekommenderas att övervakning av provets varje 10-15 min att kontrollera vävnadsintegritet.
  12. När pigmente har avlägsnats från njuren, tvätta två gånger med 3-5 ml 1X PBS med 0,05% Tween.
  13. Byt ut 1X PBS med 0,05% Tween med 3 - 5 ml 4% PFA-lösning för 1 timme vid RT.
  14. Ta bort 4% PFA-lösning och tvätta njuren 3 gånger med 3 - 5 ml 1X PBS med 0,05% Tween i 5 minuter vardera. OBS: När fixering är klar njuren också kan monteras på ett objektglas och utvärderades för dextran upptags sans melanocyten pigmsentation, genom att utföra steg 2,8-2,12.
  15. Avlägsna 1X PBS med 0,05% Tween och ersätta med 3-5 ml blockeringslösning, sedan inkubera njuren vid RT i blocket för 2 tim.
  16. Vid blockering är klar, gå direkt till den valda färgningsprotokollet. Obs: Njuren kan nu bearbetas genom en eller flera andra förfaranden för att genomföra märkningsstudier med olika reagenser. För hela berget märkning av proximala tubuli med endast alkaliskt fosfatas, gå till Avsnitt 4 för hela berget märkning av endast den distala tubuli gå till 5 § Alternativt kan avsnitten 4 och 5 utföras i linjär följd för dual detektering i hela berget .

4 Märkning av Adult Kidney proximala tubuli segment med alkaliskt fosfatas Detection

  1. Ta blocket och tvätta njuren 3 gånger med 3 - 5 ml 1X PBS med 0,05% Tween i 5 minuter vardera, och sedan ersätta 1X PBS med 0,05% Tween med 3 - 5 ml1X PBS. Låt njuren blöt i minst 10 min. OBS: Under denna tid, överföra njuren till en 12-brunn eller 24 brunnar odlingsskål om vävnaden har hållits i en glasflaska för tidigare processteg.
  2. Byt ut 1X PBS med tillräcklig bearbetning alkaliska fosfatassubstratlösningen (Se upptäckt kit som ligger i Table of Materials) för att täcka provet och placera provet på en rotator under 30 min vid rumstemperatur. Håll provet skyddas från ljus.
  3. Stoppa reaktionen genom att tvätta njuren i alkaliskt fosfatas-tvättbuffertlösning.
  4. Skölj njuren med 3 byten av tvättbuffertlösningen över 10 - 15 min. Anm: Efter det här steget, gå direkt till del 5, steg 5,1 (alltså tillfälligt utelämna steg från 4,5 till 4,6) Om märkningen med DBA är också önskvärt. Valfritt steg: Att märka och visualisera cellkärnor i orgeln, blöt njuren i propidiumjodid lösning. Förbered en propidiumjodid lager genom att lösa upp pulvret vid en koncenning av 1 mg / ml (1,5 mm) i destillerat vatten. Späd stam till 500 nM i 2X SSC och inkubera njuren i denna lösning under 30 min. Skölj med 1X PBS och gå vidare till steg 4,5.
  5. Ta tvättbuffertlösningen och montera njuren på en ren glasskiva i fosfatas monteringsmedium på märkningen satsen (se steg 2,9-2,12). Observera: monteringsmedium har ersatt 1X PBS från steg 2.9.
  6. Visualisera alkaliskt fosfatas färgas njuren med hjälp av ett stereomikroskop eller förening mikroskop med en Hoechst / DAPI filter set. Obs: Valfritt steg: Visualisera propidiumjodid med hjälp av en tetra-rodamin (TRITC) eller Texas rött filter.

5. avgränsa Adult Kidney Distal tubuli segment med Rhodamine DBA

  1. Förbered en 200 l arbets DBA lösning genom att späda DBA (2 mg / ml) 1: 100 i 1X PBS.
  2. Byt ut 1X PBS med 0,05% Tween-lösning med 200 l DBA-lösning.
  3. Placera på rotator för1 h vid RT.
  4. Avlägsna DBA lösningen och tvätta njuren 3 gånger med 3 - 5 ml 1X PBS för 5 min vardera. Obs: Valfritt steg: Att märka och visualisera cellkärnor i det organ tillsammans med DBA etiketten, blöt njuren i DAPI lösning för att upptäcka med ett Hoechst / DAPI filter (rhodamin DBA fläcken kan upptäckas med ett TRITC eller Texas rött filter). Förbered en DAPI lager genom att lösa pulvret i en koncentration av 5 mg / ml (14,3 mM). Späd stam till 300 nM i 2X SSC och inkubera njuren i denna lösning under 20 min. Skölj med 1X PBS och gå vidare till steg 5,5. Om Del 4 bearbetningen har utförts, kom ihåg att DAPI och alkaliskt fosfatas är båda detekteras med Hoechst / DAPI filter.
  5. Avlägsna 1X PBS och montera njuren på en ren glasskiva (se steg 2,9-2,12).
  6. Visualisera DBA-färgade distala segment av njuren med en vanlig TRITC eller Texas rött filter inställt på en fluorescerande stereomikroskop eller sammansatt mikroskop. Obs: Tillvals step: Visualisera DAPI använder ett Hoechst / DAPI filter.

6. Bädda, cryosectioning och färgning (Vital Färgämnen och immunohistokemi Labeling) Adult Zebrafish Kidney Tissue

  1. Välj fisk för analys och sedan avliva, korrigera och permeabilize som beskrivet (steg från 3,2 till 3,8). Notera: Fixa vuxen fisk i 9: 1 etanol: formaldehyd / 0,1% DMSO i stället för 4% paraformaldehyd / 1X PBS / 0,1% DMSO för kryosektion förfarandet att producera avsnitt för dextran, alkaliskt fosfatas, och DBA visualisering. Men kom ihåg att paraformaldehydbaserade upptagningar kan vara kompatibla för vissa immunohistokemi förfaranden. Vidare behövs inte blekning av den vuxna njuren för kryosektion analys, eftersom melanocyterna är ytliga och inte påverkar visualisering av Nephron celler som utgör "inne" i njuren orgel.
  2. Följande dag, ta bort 30% sackaros lösning och ersätta med 1: 1 vävnad frysmedium: 30% Sucrose för 4 h vid RT.
  3. Avlägsna 1: en lösning och bädda njurprover i 100% vävnad frysmedium i cryomolds och rum vid -80 ° C under minst en timme.
  4. Skurna på tvären seriella sektioner, ca 12 um tjock, genom hela vuxen njuren.
  5. Montera frysta kryosnitt på adhesiva objektglas och låt lufttorka under en timme vid 50 ° C.
  6. Store glider vid -80 ° C fram till användning.
  7. När kryosnitt är redo att märkas, ta bort objektglas från -80 ° C och placera på bild varmare vid 50 ° C i 45 minuter.
  8. Med hjälp av en flytande blockerare penna, rita en cirkel runt kryosnitten och låt torka i 15 min på bilden varmare vid 50 ° C.
  9. Ta diabilder från bilden varmare och placera plant i en fuktkammare vid rumstemperatur.
  10. Rehydrera kryosnitten genom tillsats 1X PBS med 0,05% Tween till det inringade partiet av objektglasen under 20 min. Obs: Cirka 200-300 &# 956; l behövs för att täcka varje inringade delen på en bild.
  11. Ersätt 1X PBS med 0,05% Tween-lösning med färsk 1X PBS och inkubera under 10 min.
  12. Avlägsna 1X PBS och inkubera kryosnitt i en blockeringslösning för 2 tim. Notera: För en 10 ml blockeringslösning, kombinera 8 ml 1X PBS med 0,05% Tween, 2 ml fetalt kalvserum och 150 ^ DMSO. För att utföra immunohistokemi efter blockeringssteget, inkubera objektglaset med den önskade primära antikroppen utspädd i färskt blocket O / N vid 4 ° C, tvätta en gång med användning av 1 x PBS med 0,05% Tween, inkubera i 2 h vid RT med sekundär antikropplösning utspädd i 1X PBS med 0,05% Tween, tvätta en gång med hjälp av 1X PBS med 0,05% Tween, och montera ett täckglas på objektglaset med monteringsmedel. De nödvändiga spädantikropps varierar och försök bör utföras för att välja de optimala spädningar. Antigenåtervinning kan också underlätta immunomärkning och utförs före blockering. Omedelbart efter diabilder tinas vid 50 ° C(Steg 6,8) inkubera kryosnitten mellan 95 o C-100 ° C under 40 min i förvärmd 10 mM natriumcitratbuffert. Kyl glasen i 30 minuter, sedan tvätta två gånger i 1X PBS med 0,05% Tween, och fortsätt till steg 6.11.
  13. Avlägsna den blockerande lösningen och tvätta kryosnitt tre gånger med 1X PBS under 5 min vardera.
  14. Ersätt 1X PBS med DBA färgningslösning och inkubera under 1 timme. OBS: Späd 1 pl DBA i 99 pl 1X PBS för att göra en 100 ^ färglösningen.
  15. Avlägsna DBA färglösningen och tvätta kryosektioner 3 gånger med 1X PBS i 5 minuter vardera.
  16. Applicera alkaliskt fosfatas etikett och inkubera på kryosnitt i 10 min.
  17. Tvätta alkaliskt fosfatas off kryosnitten med en serie av tre tvättningar med tvättbuffert för 10 min vardera. Obs: För en 100 ml lösning av tvättbuffert, kombinera 5 ml 0,5 M EDTA och 120 mg levamisol i 95 ml 1X PBS. Att märka kärnor, inkubera sektionerna med propidiumjodid eller DAPI på diningar tidigare noterats (Steg 4.4, 5.4, respektive) i 30 minuter vid rumstemperatur. Välj en nukleär fläck förenligt med kombinationen av andra fluorescerande fläckar som har valts.
  18. Ta bort all vätska från kryosnitt och placera 2 droppar monteringsmedium på objektglas.
  19. Placera försiktigt mikrotäckglas på objektglas. Kryosektioner är nu redo att bilden med lämpligt filter (s).

7 WISH Behandling för vuxna zebrafisk njurprover

  1. Välj önskade zebrafisk provet (s), avliva, fixa och dissekera njuren som beskrivits (steg från 3,1 till 3,5). OBS: Det är viktigt att använda en fixeringslösning med 4% paraformaldehyd (PFA) / 1X PBS med 0,1% DMSO att permeabilize njuren. Placera njuren i en glasflaska för enkel visualisering under efterföljande processteg.
  2. Ta bort fixativ och tvätta njuren två gånger med 5 ml 1X PBST.
  3. Avlägsna 1X PBS och tvätta njuren dubbelt with 100% metanol, sedan inkubera njuren vid -20 ° C i minst 20 minuter för att permeabilize. Obs: Dissekerade njurar kan lagras på obestämd tid -20 ° C.
  4. Rehydrera njuren genom att utföra en serie av 5 min tvättar med 3 - 5 ml 50% metanol / 1X PBST, 30% metanol / 1X PBST, och två gånger med 1X PBST.
  5. Bleach njuren för avlägsnande av pigmentering såsom beskrivits (steg 3,10-3,14).
  6. Behandla njuren med 10 | ig / ml proteinas K / 1X PBST med 0,1% DMSO under 20 min, sedan skölja två gånger med 1X PBST och post-fix i 4% PFA / 1X PBST under 20 min till O / N. Obs: förbereda alltid proteinas K arbetslösning omedelbart före prov matsmältningen genom att kombinera 50 pl nyligen tinade proteinas K lager (10 mg / ml), 50 ml 1X PBST och 50 pl DMSO.
  7. Process njuren för en eller två WISH följa stegen för riboprob syntes, förhybridisering, hybridisering, anti-digoxigenin / anti-fluoroscein antikropp inkubation och detekteringstion beskrivs som nyligen 49. Anmärkning: Hela mount avbildning av njur fläckar bör utföras inom flera dagars utföra färgreaktion. Nephron fläckar tenderar att blekna väldigt snabbt, speciellt röda substrat etiketter. För nefronet fotografering, platt montera njurprov som beskrivs ovan i steg från 2,10 till 2,12, och bild med ett stereo eller förening mikroskop. Differentialinterferenskontrastfilter kan användas för att bättre visualisera cellulära konturerna av nephrons att underlätta provanalys.

Representative Results

Var och en av de protokoll utfördes på vildtyp zebrafisk. Exempel på uppgifter som erhållits dokument normala strukturella sammansättning och egenskaper nephrons inom frisk vuxen zebrafisk njure. Den vuxna zebrafisk besitter en mesonephros eller andra njurform som ligger på rygg kroppen väggen (Figur 1A). Den vuxna njuren är relativt platt och innehåller en så kallad huvud, bål och svans region med ytliga melanocyter utspridda dessa regioner (Figur 1A). Den njurvävnad innehåller grenade kedjor av nephrons som ansluter och avrinning sker till centrala uppsamlingskanalerna (Figur 1A). Varje nefronet är polariserat utmed dess längd, med ett blodfilter (eller njurblodkropp) i ena änden, följt av en serie av tubuli segment, och slutligen avslutas vid en kanal som samlar den lösning som kommer att utsöndras (Figur 1A). Varje vuxen nefronet tubuli innehåller proximala och distala Segments av celler, avgränsade av uttrycket av specifika lösta transportörer 30,31,36,37, som är bevarad med segmentell mönster som uppvisas av embryonala nefroner 31-35 (Figur 1B). Exempelvis cubilin avskrifter markera proximala tubuli 39 (PCT och PST) och clcnk avskrifter markera distala tubuli 32 (DE och DL) (Figur 1B). Vidare är PCT-segmentet kännetecknas av uttryck av slc20a1a är PST särskiljas genom uttryck av slc13a1 är DE tecknas av uttryck av slc12a1 och DL kännetecknas av uttryck av slc12a3 32   (Figur 1B). Skillnader mellan vuxna Nephron tubuli jämfört med embryonala dessa är att distala segment visar vindlingar (DE, DL) och DL segment grenarna i stor utsträckning i den vuxna, som skiljer sig från det linjära, icke-grenade anatomi dessa regioner i EMBRyo 30,31,36,37 (Figur 1A). I båda vuxna 30 och embryonala 38-41 Nephron tubuli kan PCT epitel särskiljas på grund av dess endocytic egenskaper och kan visualiseras och utvärderas för reabsorptive funktion bygger på förmågan att upptag fluorescerande dextran-konjugat (figur 1B). Dessutom, som skett i de efterföljande figurerna, den vuxna proximala tubuli (PCT och PST, eller pan-proximala region) är märkt med alkaliskt fosfatas, medan den distala tubuli (DE och DL, eller pan-distala region) är märkt av DBA (Figur 1B). De metoder som används häri till etikett vuxna zebrafisk Nephron segment använder dextran upptag, alkaliskt fosfatas, DBA, immunohistokemi eller WISH kan utföras i olika kombinationer, i hela berget eller med histologiska sektioner av njurvävnad (Figur 2). Detta möjliggör stor flexibilitet och variation när nefronet sammansättning ska bedömas (Figur 2).

Den vuxna njuren kan monteras platt på ett objektglas för analys, med divots av modellera (eller alternativt, vakuum fett) används för upphängning av täck över vävnaden (figur 3A). Som den typiska njurlängden är ca 5-7 mm, den har en storlek som främjar avbildning på en stereo eller förening mikroskop (Figur 3A). Enligt bright belysning kan en ytlig population av melanocyter med svart pigmente visualiseras i association med njurvävnaden, och vaskulatur såsom aorta kan ses eftersom de cirkulerande erytrocyter har en röd nyans (figur 3B). Efter intraperitoneal injektion av dextran-FITC, var PCT domäner som finns i hela mesonephros fortfarande märkt 3 dagar senare, och avbildas med ett FITC-filter på ett fluorescensmikroskop (Figur 3C). Medan melanocyter delvis skymma visualisering av enskilda njurtubuli (Figure 3C), behöver melanocyterna inte hindra kvantifiering av nefronet nummer eller utvärdering av tubuli diameter och längd. Efter intraperitoneal injektion av dextran fluor-ruby, blekning av den fasta provet elimineras melanocyten pigmentering och PCT segmenten observerades med ljusa fält belysning ensam (figur 3D). Lipiddropparna från buken kroppshålan kan ibland ses i samband med hela preparat njurorgan (Figur 3A) .Individual PCT segmenten visar vindlingar, spolar (figur 3D ") men också kan kännetecknas av relativt linjära sträckor (Figur 3D").

Olika dextran konjugat förutsatt olika nivåer av generell tydlighet i proximala tubuli märkning. Framför allt ledde dextran-FITC eller dextran fluor-ruby till skarpa Nephron etiketter med minimal bakgrund (figur 3C-D "). Både dextran kaskad blue och Lucifer Yellow konjugaten uppvisade proximala tubuli upptag i vuxen njure (figur 4A, 4B). Intressant, njurar som utsätts för dextran kaskad blå uppvisade relativt specifik PCT fluorescens med lite bakgrund (figur 4A, 4A), medan njurarna utsätts för dextran lucifer gul hade märkt PCT segment men visade märkbar bakgrundssignal, med icke-specifik fluorescerande färgning närvarande under hela i njur stroma, eller utrymmet mellan nefroner (Figur 4B, 4B '). Slutligen har användningen av dextran-fluor rubin tillgänglig överlägsen proximala tubuli märkning, med minimal eller ingen bakgrund även när den betraktas på en rad olika förstoringar (figur 4C, 4C). I samtliga fall är det särskiljande rörformiga mönstret dextrankonjugatet upptag korrelerade med WISH uttryck av transkript som kodar slc20a1a, en etablerad PCT-specifik markör 30-32 (Figur 4D). Nephrpå PCT segment färgade med slc20a1a antisens riboprob visade S-formade PCT spolar samt mindre skarpt rullade PCT segment (Figur 4D), som observerats under märkta dextrankonjugatet analyser (Figur 3D ", 3D").

Andra njurpreparat, såsom detektering av den proximala tubuli alkaliskt fosfatas-aktivitet (Figur 5A, 5B, 5C) på liknande sätt utfördes efter avlägsnande av melanocytstimulerande pigmentering. Detta gjorde det möjligt för proximala tubuli nephron bildbehandling och analys utan några hinder. Endogen alkaliskt fosfatas reaktivitet i nefronet är en viktig kännetecken för proximala tubuli 1,47. Alkaliskt fosfatas-färgning är mycket specifikt för proximala Nephron regioner, jämfört med den pan-proximala WISH uttrycksmönstret för genen cubilin 39 (Figur 5D, 5D). Alkaliskt fosfatas reaktivitet var mest intensiv i granst avsnittet av proximala tubuli som motsvarar PCT (figur 5B), som liknar mönstret för cubilin uttryck (Figur 5D, 5D), som också hade högsta relativa transkriptnivåerna i PCT. PCT utmärkte sig genom sin något större diameter, särskilt uttryck för transkriptionsfaktorn mafba (Figur 5E, 5E), samt specifikt uttryck av det lösta ämnet transportörgenen slc20a1a (Figur 4D, 4D). Alkaliskt fosfatas reaktivitet märkt också en sträcka av proximala tubuli med en tunnare diameter som motsvarar den PST segmentet (Figur 5B) baserat på jämförelse med segmentspecifika transkript expression av det lösta ämnet transportörgenen slc13a1 (figur 5F, 5F). Önskan uttrycks domäner PCT markören slc20a1a och PST markör slc13a1 utesluter varandra (Figur 5G cubilin (svarta pilspetsar i. Figur 5G ", 5G", 5G "' ).

För att ytterligare bekräfta förhållandet av alkaliskt fosfatas reaktivitet med proximala tubuli identitet, hela montera samtidig märkning av alkaliskt fosfatas-färgning utfördes på njurar från zebrafisk som fick en intraperitoneal injektion av dextran fluor-rubin 3 dagar före (fig 6A-C). Dextran fluor-rubin visade överlappning med alkaliskt fosfatas i bara del den bredare diametern hos den proximala tubuli domän som motsvarar PCT (exemplen i Figur 6D-I). Dextran-positiva domän abrupt stoppas på den plats där diametern hos den proximala tubuli förtunnas, dvs där PCT och PST uppfyllda, (vit pilhuvuden i Figur 6) och endast alkaliskt fosfatas reaktivitet observerades i den efterföljande PST-segmentet (exempel i figur 6D-I). Bakgrund fluorescens från alkaliskt fosfatas reaktionen också svagt skisse paret av parallella huvudsamlingskanal spår hittades i den vuxna njuren 29,30 -ducts som utmärker sig genom att ha den bredaste diametern av någon njurassocierade rör (asterisker i fig 6A, 6D, 6E, 6G, 6H). Därefter samtidig märkning av Nephron tubuli med alkaliskt fosfatas och dextran upptag observerades i kryosektion analys (figur 6J, tubuli omkrets skiss med vita prickar). I tvärsnitt var alkaliskt fosfatas reaktiviteten noterats i ett tjockt band vid den apikala ytan av epitel, i linje med borstbräm ultra, medan motsvarande rörformiga cell cytosolic utrymme visade dextran fluor-ruby reaktivitet (Figur 6J). Notably stained tubuli var antingen dubbelt positivt för alkaliskt fosfatas och dextran, vilket leder till att de identifieras som PCT segment, eller var för sig positivt för alkaliskt fosfatas (Figur 6J, tubuli omkrets beskrivs i gula prickar), vilket leder till en identifikation som en PST-segmentet (notera: andra tubuli närvarande var negativa för båda fläckar, data visas ej) (Figur 6J). Vidare alkaliskt fosfatas färgning (Figur 6K) framgångsrikt kombinerat med en nukleär etikett, propidiumjodid (figur 6L), underlättar cellräkning (overlay i figur 6M).

Den distala tubuli av den vuxna zebrafisk nefronet märktes med rodamin-konjugerad DBA (Figur 7). Whole mount dubbelmärkning med DBA och alkaliskt fosfatas utfördes på njurar från vildtyp zebrafisk (fig 7A-C). DBA och alkaliskt fosfatas reaktivitet visade ingen överlappning i Nephron tubuli ( figur 7G, 7H, 7J), medan förgrening aldrig observerats i tubuli segment färgade med alkaliskt fosfatas. Renal kryosnitt uppsamlades från vildtyp zebrafisk som bär en transgen i vilken enpep promotorn driver EGFP (Tg: enpep: EGFP), såsom GFP etiketter både den proximala och distala Nephron tubuli 51 (figur 7i). Immunohistokemi utfördes för att detektera GFP, för att märka alla njurtubuli (gröna, Figur 7I), följt av fluorescensmärkning med alkaliskt fosfatas och DBA (turkos och rött, respektive, Figur 7I). Analys av tubuli sektioner visade att tubuli var antingen positivt för alkaliskt fosfatas eller DBA, men inte båda märkena (Figur 7I). Endast sällan tubmoduler visade reaktivitet med varken alkaliskt fosfatas eller DBA fläck, möjligen på grund av vinkeln på tubuli sektionen (vit pil, figur 7I). Vidare var DBA färgning framgångsrikt kombineras i hela montera njure färgning med kärnkrafts etiketten DAPI (Figur 7J), återigen betona den karakteristiska förgrenade karaktär de distala tubuli segment (vita pilspetsar, Figur 7J).

Nästa, för att ytterligare jämföra de mönster av dextran-FITC-upptag, alkaliskt fosfatas, och DBA ades trippelmärkning undersöktes genom intraperitoneal injicering av vuxna zebrafisk med dextran-FITC, följt av njure isolering 3 dagar senare, följt av cryosectioning och färgning för alkalisk fosfatas och DBA (exempel tillhandahålls i fig 8A-E). Njurtubuli visade tre kategorier av etikettkombinationer: tubuli som var dubbelt positivt för alkaliskt fosfatas och dextran betecknas PCT segment (vita streckade linjer), tubules positivt för alkalisk fosfatas enbart betecknas PST segment (gula streckade linjer), och distala tubuli märktes genom att bara DBA (röd streckad konturer Figur 8A-E). Vidare endast DBA positiv tubuli uppvisade förgreningspunkter (figur 8E). Genom WISH analys, detta särskiljande förgreningsmönstret för den distala, DBA positiva tubuli korrelerade med genexpressionsmönster av löst ämne transportörtranskript som är specifika för distala tubuli segment (Figur 8F-I). Transkript som kodar clcnk, som markerar hela distala tubuli (DE och DL) var tunna i diameter, riklig i njuren, och innehöll förgreningspunkter (svart pil Figur 8F, 8F "). I jämförelse, som tubuli segment visade uttryck av slc12a1 eller slc12a3, som är markörer för DE och DL respektive var mindre gott om i njurprover totalt jämfört med clcnk uttryck (jämför figur 8 G och 8F, 8H). Vidare var tubuli segment som uttryckte slc12a1 sällan, om någonsin, grenade (figur 8G, 8G '), medan tubuli regioner som uttryckte slc12a3 ades ofta förgrenad i karakteristiska lyckohjul liknande arrangemang (Figur 8H, 8H ", 8H", 8H "' , svarta pilspetsar). Slutligen dubbel önska PCT markören slc20a1a och den distala markören clcnk visade att dessa fläckar inte överlappande (figur 8I). Noterbart var de sträckor av slc20a1a -uttryckande PCT segment inte kopplad till clcnk -uttryckande tubuli, vilket förväntades eftersom PST ligger mellan dessa regioner (figur 8I). Sammantaget analyserna enligt märkning njurtubuli med dextran upptag, alkaliskt fosfatas reaktivitet, DBA och önska specifika gentranskript möjliggör urskiljning av proximala kontra distala segment.

t "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 1
Figur 1 Nephron anatomi i den vuxna zebrafisk njuren. Schematiska ritningar av (A) vuxna zebrafisk njure och (B) en jämförelse diagram av segment molekylära egenskaper som uppvisas av vuxna och embryonala zebrafisk nefroner. (A) (Överst till vänster) Den vuxna njuren är en platt orgel placerad på rygg kroppen väggen. (Överst till höger), Sett från en ventral perspektiv har njuren en distinkt böjd morfologi, som består av huvud, bål och svans regioner, och har även en yta befolkning associerade melanocyter. Utvidgningen (nederst till vänster) visar en schematisk bild av en typisk nefronet träd i den vuxna zebrafisk njure, i vilken varje enskild nefron besitter ett blodfilter (nedsatt blodkropp) på en ände, följt av en proximal tubulus, distal tubulus, och kanal. Färgade schema (boTTom höger) visar ett linjärt diagram av en vuxen nefronet träd för att jämföra egenskaperna etapper med de hos embryonala nefroner (B). De zebrafisk embryo nephrons innehåller tubuli segment som inkluderar proximala tubuli (PCT), proximala tubuli raka (PST), distal tidigt (DE) och distal sent (DL), med respektive genuttryck områden som anges nedan. Nephrons i den vuxna zebrafisk har en liknande segment sammansättning och analoga molekylär signatur baserad på uttrycket domäner av gener som kodar lösta transportörer, även om en märkbar skillnad jämfört med embryot är att flera nefroner kan förenas genom en förgrenad DL segment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 Figur 2 Flödesschema karta som visar förhållandet mellan de metoder som skildras i detta protokoll, som anger hur metoderna kan utföras enskilt eller i diverse kombinationer. Efter intraperitoneal injektion av märkt lysin-fixable dextran i den vuxna zebrafisk, kan njuren visualiseras i en Hela montera beredning, antingen ensamt eller i kombination med alkaliska fosfataser och / eller DBA fläckar. Alternativt kan den valda zebrafisk njure undersökas efter histologisk vävnadssnittning med en kryostat. Sektionerna kan färgas för att märka ett stort antal kombinationer av egenskaper, med hjälp av immunohistokemi, nukleär färgning, DBA färgning och / eller alkalisk fosfatas reaktivitet. Dessutom kan njursektioner visualiseras direkt med avseende på förekomst av lysin-fixerbar dextran upptag i PCT-segment. Slutligen kan utvalda njurar bearbetas för Spatiotemporal uttryck av genuttryck med hjälp WISH. Parentes nummer hänvisar till correspoENDE protokolldelar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3 vuxna zebrafisk njure platt montera framställning och spridning på visualisera konjugerat dextran upptag i PCT segmentet njur nefroner. (A) Bright bilden av en njure exemplar platt montera beredning, där organet har placerade platt på en glasskiva, med ett täckglas ovanpå den vävnad som vilar på fyra divots av modellera (shock rosa färg). Här njur beredningen avbildas tillsammans med en metrisk linjal för att ge en skalad jämförelse. Den typiska vuxna njuren är cirka 5-7 millimeter (mm) från huvud till svans. (B) Brightfield bild av en oblektnjure. Den svarta pigmente motsvarar den spridda befolkningen i melanocyter som påträffas tillsammans med njurarna, och stora kroppspulsådern löper längs mittlinjen av njuren. (C) Visualisering av Nephron PCT segment 3 dagar efter intraperitoneal injektion av 40 kDa dextran-fluorescein (FITC) , utan blekning av den vuxna njuren. PCT segment ses i hela njuren men är delvis skymd på grund av melanocyter. (C) Digital zoom av ett enda nefronet, med melanocyter (vit pil). (D) Bild av en vuxen njure 3 dagar efter intraperitoneal injektion av 10 kDa dextran fluor-ruby, fixering av njure, och blekning. Den melanocytstimulerande pigmente avlägsnades och PCT regioner visualiserades här baserat på deras endocytiska upptagningen av dextran enligt bright belysning. Lipiddroppar (pil) från buken kan ibland ses i association med njurvävnadsprover. (D ', D ") Representativa bilder skildrar små morfologiska variationer mellan PCT segment. Medan många Nephron PCT är tätt lindade (D '), andra nefroner innehåller PCT regioner som har minimal lande (D "). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
. Figur 4 vuxen njure nephron PCT tubuli segment märkning vildtyp zebrafisk injicerades intraperitonealt med en enda fluorescerande dextrankonjugatet; då deras njurar undersöktes 3 ​​dagar efter injektionen för PCT visualisering (A, A '). Dextran kaskad blå, 10 kDa (B, B') dextran lucifer gul, 10 kDa och (C, C ') dextran f luoro-ruby, 10 kDa alla företrädesvis märka PCT segmenten i njur nephrons. Både dextran kaskad blå och lucifer gul show vissa icke-specifik märkning av stromala cellpopulationer som ligger mellan nephrons, med mycket högre bakgrund observerats i lucifer gul behandlade njurar. Däremot dextran fluor-ruby visade dramatiskt reducerad bakgrund med intensiv PCT märkning. (D, D ') En vuxen njure färgas av önskan att upptäcka var transkript som kodar slc20a1a, en specifik markör av typen PCT transportörcell. Uttrycket domän slc20a1a matchar det karaktäristiska mönstret av dextran upptag observerats i njuren, med en fördelning av olika tätt lindade / öglor PCT-domäner samt mer avlånga PCT sträckor som visar en konsekvent bred diameter. Klicka här för att se en större version av denna figur.

ontent "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 5
Figur 5 Representativa resultat av färgning för alkalisk fosfatas, en pan-proximala tubuli markör, i den vuxna zebrafisk njuren jämfört med andra proximala tubuli markörer bedömts med WISH. (AC) alkaliskt fosfatas färgning (turkos) belyser nefronet proximala tubuli och visar på såväl PCT och PST. (DF) Single WISH för de listade generna (var i lila färgning). (D, D ') Uttrycket mönster cubilin , en pan-proximal (PCT-PST) markör, korrelerar med alkaliskt fosfatas (D, D '). I jämförelse, önska mafba markerar PCT (E, E) och slc13a1 markerar PST (F, F '). I (GG "') dubbel WISH för PCT markör slc20a1a </ Em> (röd) och PST markör slc13a1 (lila) visar att segmenten märkta av dessa markörer inte överlappar varandra, och snarare att deras uttrycksdomäner ockupera angränsande positioner när enstaka nefroner är nära undersöks (G'-G "). Svarta pilarna visar korsningen mellan PCT och PST segment, som normalt är förknippat med en förändring i tubuli diameter från stora till små, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6
Figur 6 Alkaliskt fosfatas och dextran upptag visar överlappning i PCT-segmentet av vuxna njur nephrons och alkaliskt fosfatas färgning är kompatibel med kärn samtidig märkning med propidiumjodid. (AI) (AC) sammanslagna bilden och separata bilder av sadeln region i en enda njure. (DF) och (GI) Två uppsättningar av sammanslagna bilder och separata bilder av exempel nefroner. (I) kryosektion analys bekräftar samtidig märkning av alkaliskt fosfatas och dextran fluor-ruby i PCT-segment (beskrivs i vita prickar), medan alkaliskt fosfatas ensam märker PST segment (beskrivs i gula prickar). (KM) En njur varmärkt med (K) alkaliskt fosfatas (turkos) och (L) propidiumjodid (lila) så att (M) sammanslagna visualisering av proximala tubuli celler och deras kärnor, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7
Figur 7 Alkaliskt fosfatas och DBA är ömsesidigt uteslutande segment etiketter som markerar den pan-proximala och pan-distala regioner, respektive, som finns i vuxna zebrafisk njure nefroner. (AH) Hela Mount preparat av zebrafisk njure färgas med alkaliskt fosfatas och rodamin-DBA. Alkaliskt fosfatas (turkos) och DBA (röd) inte visar överlappning i njuren. Bakgrundsnivåer av alkaliska fosfatase belysa par stora uppsamlingskanaler i varje njure (asterisker, *), vilket är utmärkande på grund av deras breda diameter. DBA positiva tubuli är tunnare i diameter och kännetecknas ofta av närvaron av förgreningspunkter (vita pilspetsar). (AC) sammanslagna bilden och separata bilder av sadeln region i en enda njure. (DF) En uppsättning av sammanslagna bilderna och separata bilder av exempel nefroner. (G, H) Ytterligare exempel, med grenade DBA tubuli tillsammans alkaliskt fosfatas positiva tubuli, sammanslagna bilder. (I) kryosektion analys bekräftar att alkaliskt fosfatas och DBA etikett distinkta tubuli sektioner och bara sällsynta tubuli visar varken etiketten (vit pil ), sannolikt på grund av vinkeln på sektionen för den tubuli. För denna analys vildtyp transgen fisk, Tg: enpep: eGFP, användes och alla njurtubuli i denna njure var immunolabeled med en primär antikropp för att upptäcka GFP (J). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8
Figur 8 Triple märkning av vuxna njur kryosnitt med dextran upptag, alkaliskt fosfatas och DBA jämfört med distalt segment WISH analys. (AE) Vuxna njurar injicerades intraperitonealt med dextran-FITC (grön), och njurarna samlas 3 dagar senare för inbäddning och cryosectioning. Färgning med alkaliskt fosfatas (turkos) och DBA (röd) avslöjade tre populationer av tubuli: PCT segment som var positiva för alkalisk fosfatas reaktivitet och DEXTsprang (beskrivs i vita prickar), PST segment som var positiva endast för alkaliskt fosfatas reaktivitet (beskrivs i gula prickar), och distala tubuli segment som var positiva för DBA endast (beskrivs i röda prickar) som också uppvisade karaktäristiska distala förgreningspunkter. ( AD) Sammanslagen bild och separata bilder av ett exempel avsnittet. (E) Sammanslagen bild av ett annat exempel avsnittet. (FI) Jämförelse av distala tubuli genuttryck mönster genom en enda (FH '") och dubbel (I) WISH. Den (FH) Single WISH för de listade generna (var och en i lila missfärgning). (F, F ') Uttrycket mönster clcnk, en pan-distal (DE-DL) markör, upptäcktes i tunna tubuli som innehöll förgreningspunkter (svart pil). (G, G ') Som jämförelse önska slc12a1 markerar DE utan förgreningspunkter upptäcks, och (HH' ") <em> slc12a3 markerar DL, ett segment som kännetecknas av många förgreningar i hela njuren orgel (svarta pilspetsar). (I) Dubbel WISH för PCT markör slc20a1a (röd) och den pan-distala clcnk (lila). Segmenten märkta av dessa markörer inte överlappar varandra, och ganska deras uttrycksdomäner ockupera icke-intilliggande positioner, där enskilda PCT spolar (nere till höger) inte ligger an mot distala tubuli, och den senare upptar diskreta platser och har hallmark förgreningspunkter (svart pil ). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Här har vi beskrivit metoder som möjliggör visualisering av komponenter nephron segment i den vuxna zebrafisk. Injektion av fluorescerande dextran konjugat möjliggör förmånliga PCT märkning grund de endocytiska egenskaperna hos dessa proximala tubuli celler 30,38. Denna metod kan utföras med stor flexibilitet på grund av förekomsten av dextraner som kan erhållas med en uppsjö av olika fluorescerande konjugat. Dessutom är användningen av lysin-fixerbar dextraner ett särskilt bekvämt sätt att märka PCT segment, som sekundära förfaranden för märkning inte krävs. Detta möjliggör relativt enkelt signaldetektering och är kompatibel med många andra fluorescerande markörer, immunomärkning och användning av transgena reporter linjer. Alkaliskt fosfatas märkning markerar också den proximala tubuli, med stark reaktivitet i PCT och något svagare reaktivitet i PST. Slutligen möjliggör märkning av distala tubuli segment, som visar en ch DBA färgningaracteristic grenad morfologi. Olika lektinmolekyler, som är sockerbindande proteiner av icke-immunt ursprung, har använts i stor utsträckning för att skilja däggdjur Nephron segment 47. Det är intressant att DBA i zebrafisk korrelerar med distala tubuli segment, eftersom det används för att markera samlingsrör i däggdjursnjurarna 47.

Tillsammans kan dessa metoder utnyttjas i olika kombinationer för att dokumentera njur sammansättning och funktion. Eftersom alla dessa metoder kan användas i hela njurpreparat ger de verktyg för att utvärdera nephron struktur och funktion genom hela orgeln utan att helt förlita sig på användningen av mer tidskrävande, tråkiga metoder, till exempel, kryosektion arbete och immunomärkning. Men fläckarna som beskrivs i denna metoder artikeln är livskraftiga i kryosektion. Kryosektion analys genererar prover (jämfört med hela berget) som är bättre lämpade för immunohistokemi för att påvisa specifika peptides, men naturligtvis denna typ av analys kräver tillgång till lämpliga primära antikroppar. Tyvärr en stor begränsning i att arbeta med zebrafisk djurmodell fortfarande den dåliga tillgången på antikroppar. Således WISH fortfarande den mest använda, det vill säga, "gå till" förfarande för analys av genuttryck. ÖNSKAR använder BCIP, NBT, och / eller INT substratreaktioner för att producera lila eller röda fällningar inte är förenlig med fluorescerande färgning på kryosnitt. Ett alternativ skulle vara att åberopa användningen av fluorescerande WISH upptäckt, ett förfarande som har optimerats för zebrafisk embryonala prover och kan skräddarsys för användning med den vuxna njuren. Beskrivningen av de metoder som i denna video artikeln bör möjliggöra ytterligare experiment med tekniker som fluorescerande WISH i kombination med transgena zebrafisk linjer där enskilda segmenten är märkta med en reporter som EGFP eller mCherry. Alternativt kan de metoder som beskrivs här Could testas i kombination med andra vitala färgämnen, till exempel, andra lektiner. Således kan ytterligare anpassning och utbyggnad av de metoder som beskrivs här åberopas för att passa forskarens behov av hela monteringsnjur förberedelser och analys.

Som sådana dessa metoder har en bred potential för genomförande med zebrafisk modell för pågående förnyelse studier och även i genetisk modellering sjukdom. Det finns ett stort behov av innovativ forskning och behandlingar för njur lidanden. Miljontals människor lider av någon form av njursjukdom varje år som beror på medfödda, akuta och / eller kroniska orsaker. Vidare, förekomsten av njursjukdom fortsätter att stiga i hela världen, vilket gör dessa sjukdomar en global folkhälsofråga 14,15. Behandlingar såsom hemodialys finns varvid en extern dialysmaskin tjänar till att befria en patients blod av metabolisk avfall om deras njurar inte kan utföra denna uppgift. Tyvärr, Har detta ingripande begränsningar, eftersom pågående behandling är nödvändig för överlevnad. Dessutom kommer patienter till slut att kräva en njurtransplantation, vilket kan ta år att få en gång en patient placeras på en väntelista. Även efter att få en njurtransplantation, många patienter drabbas av negativa effekter till följd av förfarandet och måste kämpa dessa effekter för resten av deras liv. Dessa svårigheter visar på allvarliga behov av att utveckla nya behandlingar för att antingen hjälpa till att förebygga njursjukdom eller att kanske öka vävnadsregenerering 8,16,52,53. Med tanke på de uppenbara etiska begränsningarna i användningen av mänskliga försökspersoner i biomedicinska laboratorier, djurmodeller är viktiga för studiet av mänskliga sjukdomar patogenes och för testning av nya behandlingar. Som ett resultat av dess anatomiska likheter och evolutions närhet, har musen blivit den mest använda modellen för mänskliga sjukdomar 45. Det finns emellertid vissa begränsningar med detta djur, including oförmåga att visualisera organutveckling in vivo och praktiska slutföra storskaliga genetiska skärmar. Zebrafisk är en relevant och användbar modellorganism för att studera organutveckling och modellering av mänskliga sjukdomar 45,46. När det gäller mänskliga sjukdomar, funktionella homologer i zebrafisk finnas för nästan 70% av alla mänskliga gener 54,55.

Senaste arbete har visat på nyttan av zebrafisk för många områden av njurforskning 31,37,56. Studier av förnyelse och reparation i zebrafisk efter AKI tyder på att tubuli epiteliala förnyelse och neonephrogenesis är två processer som sker och överlappar hela regenere tidsförloppet 30,37. Användningen av ett aminoglykosidantibiotikum kallas gentamicin har använts som en skade paradigm genom att studera resultaten av AKI i vuxen zebrafisk 29,30,37. Under en cirka två veckor efter skada från gentamicin, den proximala tubules regenerera, och under tiden nya nefroner bildas hela orgeln 29,30,37. I allmänhet är de mekanismer som reglerar epiteliala förnyelse är fortfarande mycket kontroversiell. I en föreslagen mekanism för reparationen, det är den initiala akut skada händelse följs av en sårskorpa av döda celler in i lumen. Därefter finns det en rad de-differentiering, proliferation och migrationshändelser, varefter nya celler differentierar, återinplantering den skadade basalmembranet och återställa funktionen i skadade platsen. Alternativt har andra studier tyder på att ersättningsceller uppstår stam / progenitorceller som bor inom Nephron tubuli. När det gäller processen för neonephrogenesis i zebrafisk har cellulära aggregat observerats följande AKI med gentamicin injektion 29,30. Dessa aggregat senare mogna till nya nefroner som Plumb i redan existerande tubuli 29,30. Den röda tråden som förenar nephron epiteliala förnyelse och neonephrogenesis är deras blotta mysterium Faktor: för närvarande finns exponentiellt fler frågor om hur dessa regenerativa bedrifter inträffar än det finns tillgängliga insikter.

Men hittills, flera spännande bevislinjer stödjer uppfattningen att njurregenere forskning med zebrafisk faktiskt kan ge relevanta jämförelse insikter i mänskligt AKI som också kan ha direkt translationell potential 56-58. Kemisk screening för att identifiera små molekyler som ökar proliferationen av renala progenitorceller i den zebrafisk embryot nyligen lett till identifiering av histondeacetylasinhibitorn metyl-4-(fenyltio) butanoat (m4PTB) 56,57. Administration av denna förening till zebrafisk larver med gentamicin-inducerad AKI visade att larver överlevnad ökat och att renal tubulär proliferation förstärktes 56,58. När möss med måttlig ischemiinducerad AKI behandlades med m4PTB, var deras återhämtning påskyndas i intressebolagiation med en minskning av både tubulär atrofi och cellcykelstopp av prolifererande njur tubulära celler 58. Dessa resultat tyder på att de vägar som ansvarar för normal zebrafisk njurutveckling och / eller den regenerativa svar på AKI kommer att bevaras med däggdjur 56.

Medan ytterligare studier behövs för att retas isär mekanismerna för förnyelse-nämligen att identifiera de signalvägar som är involverade och förstå deras interaktion-zebrafisk ger ett lovande sätt att fullfölja detta viktiga mål inom nefrologi fältet. Verktyg såsom nefronet celletiketter som beskrivs i detta protokoll utgör en grupp av analyser som kan användas för att utvärdera njur sammansättning och funktion i AKI-modeller. Vidare kan de användas för att karaktärisera transgena modeller av njursjukdom och kan ge sätt att identifiera kemiska läkemedel med förmåga att främja återställande av nefronet struktur efter njur dammenålder.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av finansiering till RAW något av följande: National Institutes of Health ger K01 DK083512, DP2 OD008470 och R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Startat Scholar beviljande av bidrag nr 5-FY12-75; starta medel från University of Notre Dame College of Science och Institutionen för Biological Sciences; och en generös gåva till University of Notre Dame från Elizabeth och Michael Gallagher på uppdrag av Gallagher familj att främja stamcellsforskning. De finansiärer hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet. Vi tackar de stavar av Institutionen för Biological Sciences för deras stöd, och Centrum för Zebrafish forskning vid Notre Dame för deras enastående engagemang i vård och omsorg i vår zebrafisk koloni. Slutligen tackar vi medlemmarna i vår forskningslabb för sina kommentarer, diskussioner och insikter om det arbetet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X PBS Made by diluting 10 X PBS in distilled water.
1X PBST 0.1% Tween-20 detergent in 1 X PBS.
1X PBS with 0.05 % Tween 0.05% Tween-20 detergent in 1 X PBS.
Tween 20 American Bioanalytical AB02038
4% PFA/1X PBS Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20°C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. 
Fine Forceps Roboz RS-1050 Dumont Tweezers Pattern #55 
Glass slide Thermo-Fisher 4445 White Frost 
Glass coverslip Thermo-Fisher 12-540A 18 x 18 mm
Modeling clay Hasbro Playdoh Other modeling clays can be substituted and work similarly
Slide holder Thermo-Fisher 12-587 Optional: cardboard tray to store slides flat
Bleaching solution Bleach mix formula (for a 20 ml solution):
1.6 ml of 10% Potassium hydroxide solution
0.6 ml of 30% Hydrogen peroxide solution
100 μl of 20% Tween
Fill to 20 ml with distilled water
Potassium hydroxide Sigma 221473
Hydrogen peroxide Sigma H1009
Blocking solution Blocking Solution (for a 10 ml solution):
8 ml of 1X PBS with 0.05% Tween
2 ml of fetal calf serum
150 μl of DMSO
Alkaline phosphatase activity detection Invitrogen E6601 We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.  To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer's instructions. 
Alkaline phosphatase wash solution Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 ml solution):
5 ml of 0.5 M EDTA
120 mg of Levamisole
95 ml of 1X PBS
Dextran, fluorescein, 40,000 MW Invitrogen D1844 Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, cascade blue, 10,000 MW Invitrogen D1976 Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW Invitrogen D1825 Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW Invitrogen D1817 Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine Vector laboratories RL-10-32 DBA Staining Solution (for a 100 μl solution):
1 μl of DBA
99 μl of 1X PBS
Propidium iodide Invitrogen E6601
DAPI Invitrogen P1304MP
Vectashield hard set mounting medium Vector laboratories H-1400
Micro cover glass VWR 48393081
Dimethyl sulfoxide, DMSO American Bioanalytical 67-68-5
Sucrose Sigma S0289
EDTA, 0.5 M solution, pH 8.0 American Bioanalytical AB00502
Levamisole Sigma L-9756
Tissue freezing medium Triangle Biomedical Sciences, Inc. TFM-C
Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10 x 10x 5 mm Sakura Finetek 4565
TruBond 380 adhesive microscope slides Tru Scientific 0380W
Liquid blocker – super PAP pen Electron Microscopy Sciences 71312
Immuno stain moisture chamber Evergreen Scientific 240-9020-Z10
Cryostat Therm Microm™ HM 525 Cryostat
Stereomicroscope Nikon SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection. 
Compound microscope Nikon 96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reilly, R. F., Bulger, R. E., Kriz, W. Structural-functional relationships in the kidney. Diseases of the Kidney and Urinary Tract. RW, S. chrier Lippincott Williams Wilkins. Philadelphia, PA. 2-53 (2007).
  2. Dressler, G. R. The cellular basis of kidney development. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 509-529 (2006).
  3. Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. Anat Rec. 232, 194-201 (1992).
  4. Cebrian, C., Borodo, K., Charles, N., Herzlinger, D. A. Morphometric index of the developing murine kidney. Dev Dyn. 231, 601-608 (2004).
  5. Schedl, A. Renal abnormalities and their developmental origin. Nat Rev Genet. 8, 791-802 (2007).
  6. Ricci, Z., Cruz, D. N., Ronco, C. Classification and staging of acute kidney injury: beyond the RIFLE and AKIN criteria. Nat Rev Nephrol. 7, 201-208 (2011).
  7. Faubel, S., et al. Ongoing clinical trials in AKI. Clin J Am Soc Nephrol. 7, 861-873 (2012).
  8. Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospects and challenges. Clin Transl Med. 2, 11 (2013).
  9. Liu, Y. Cellular and molecular mechanisms of renal fibrosis. Nat Rev Nephrol. 7, 684-696 (2011).
  10. Murugan, R., Kellum, J. A. Acute kidney injury: what’s the prognosis. Nat Rev Nephrol. 7, 209-217 (2011).
  11. Palevsky, P. M. Chronic-on-acute kidney injury. Kidney Int. 81, 430-431 (2012).
  12. Chawla, L. S., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease: an integrated clinical syndrome. Kidney Int. 82, 516-524 (2012).
  13. Bucaloiu, I. D., Kirchner, H. L., Norfolk, E. R., Hartle, J. E., Perkins, R. M. Increased risk of death and de novo chronic kidney disease following reversible acute kidney injury. Kidney Int. 81, 477-485 (2012).
  14. Collins, A. J., et al. USRDS 2012 Annual Data Report: Atlas of Chronic Kidney Disease and End-Stage Renal Disease in the United States (2012). Lancet. 365, 331-340 (2012).
  15. El Nahas, M. eguid, Bello, A., K, A. Chronic kidney disease: the global challenge. Lancet. 365, 331-340 (2005).
  16. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction. Biochem J. 444, 153-168 (2012).
  17. Toback, F. G. Regeneration after acute tubular necrosis. Kidney Int. 41, 226-246 (1992).
  18. Thadhani, R., Pascual, M., Bonventre, J. V. Acute renal failure. N Engl J Med. 334, 1448-1460 (1996).
  19. Bonventre, J. V. Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure. J Am Soc Nephrol. 14, S55-S61 (2003).
  20. Romagnani, P., Kalluri, R. Possible mechanisms of kidney repair. Fibrogenesis Tissue Repair. 2, 3 (2009).
  21. Bonventre, J. V., Yang, L. Cellular pathophysiology of ischemic acute kidney injury. J Clin Invest. 121, 4210-4221 (2011).
  22. Grgic, I., et al. Targeted proximal tubule injury triggers interstitial fibrosis and glomerulosclerosis. Kidney Int. 82, 172-183 (2012).
  23. Reimschuessel, R. A fish model of renal regeneration and development. ILAR J. 42, 285-291 (2001).
  24. Reimschuessel, R., Williams, D. Development of new nephrons in adult kidneys following gentamicin-induced nephrotoxicity. Ren Fail. 17, 101-106 (1995).
  25. Salice, C. J., Rokous, J. S., Kane, A. S., Reimschuessel, R. New nephron development in goldfish (Carassius auratus) kidneys following repeated gentamicin-induced nephrotoxicosis. Comp Med. 51, 56-59 (2001).
  26. Augusto, J., Smith, B., Smith, S., Robertson, J., Reimschuessel, R. Gentamicin-induced nephrotoxicity and nephroneogenesis in Oreochromis nilotica, a tilapian fish. Dis Aquatic Org. 26, 49-58 (1996).
  27. Elger, M., et al. Nephrogenesis is induced by partial nephrectomy in the elasmobranch Leucoraja erinacea. J Am Soc Nephrol. 14, 1506-1518 (2003).
  28. Watanabe, N., et al. Kidney regeneration through nephron neogenesis in medaka. Develop Growth Differ. 51, 135-143 (2009).
  29. Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
  30. Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-101 (2011).
  31. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
  32. Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, e189 (2007).
  33. Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-1127 (2008).
  34. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  35. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev Biol. 386, 111-122 (2014).
  36. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. 54, (2011).
  37. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
  38. Drummond, I. A., et al. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125, 4655-4667 (1998).
  39. Anzenberger, U., et al. Elucidation of megalin/LRP2-dependent endocytic transport processes in the zebrafish pronephros. J Cell Sci. 15, 2127-2137 (2006).
  40. Majumdar, A., Drummond, I. A. The zebrafish floating head mutant demonstrates podocytes play an important role in directing glomerular differentiation. Dev Biol. 222, 147-157 (2000).
  41. Kramer-Zucker, A. G., Wiessner, S., Jensen, A. M., Drummond, I. A. Organization of the pronephric filtration apparatus in zebrafish requires Nephrin, Podocin, and the FERM domain protein Mosaic eyes. Dev Biol. 285, 316-329 (2005).
  42. Brien, L. L., Grimaldi, M., Kostun, Z., Wingert, R. A., Selleck, R., Davidson, A. J. Wt1a, Foxc1a, and the Notch mediator Rbpj physically interact and regulate the formation of podocytes in zebrafish. Dev Biol. 358, 318-330 (2011).
  43. Ebarasi, L., Oddsson, A., Hultenby, K., Betsholtz, C., Tryggvason, K. Zebrafish: a model system for the study of vertebrate renal development, function, and pathophysiology. Curr Opin Nephrol Hypertens. 20, 416-424 (2011).
  44. Swanhart, L. M., Cosentino, C. C., Diep, C. Q., Davidson, A. J., de Caestecker, M., Hukriede, N. A. Zebrafish kidney development: basic science to translational research. Birth Defects Res C Embryo Today. 93, 141-156 (2011).
  45. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  46. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
  47. Cox, W. G., Singer, V. L. A high-resolution, fluorescence-based method for localization of endogenous alkaline phosphatase activity. J Histochem Cytochem. 47, 1443-1456 (1999).
  48. Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish kidney development. Methods Cell Biol. 100, 233-260 (2010).
  49. Watson, L., Vassallo, J., Cantor, G., Lehman-McKeeman, L. Lectin histochemistry: an alternative to immunohistochemistry for identify specific structures in rat papillary necrosis. HistoLogic. 41, 28-31 (2008).
  50. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J Vis Exp. e51604 (2014).
  51. Seiler, C., Pack, M. Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene. Gene Expr Patterns. 11, 118-121 (2011).
  52. Little, M. H. Regrow or repair: potential regenerative therapies for the kidney. J Am Soc Nephrol. 17, 2390-2401 (2006).
  53. Romagnani, P., Lasagni, L., Remuzzi, G. Renal progenitors: an evolutionary conserved strategy for kidney regeneration. Nat Rev Nephrol. 9, 137-146 (2013).
  54. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
  55. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
  56. Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and acute kidney disease: translational research insights from zebrafish chemical genetics. General Med. 1, (3), (2013).
  57. Groh, E. D., et al. Inhibition of histone deacetylase expands the renal progenitor population. J Am Soc Nephrol. 21, 794-802 (2010).
  58. Cosentino, C. C., et al. Histone deacetylase inhibitor enhances recovery after AKI. J Am Soc Nephrol. 24, 943-953 (2013).
Analys av Nephron sammansättning och funktion i vuxen Zebrafish Kidney
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (90), e51644, doi:10.3791/51644 (2014).More

McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (90), e51644, doi:10.3791/51644 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter