Analyse de néphron Composition et fonction du rein poisson zèbre adulte

Summary

Le rein adulte poisson zèbre est un excellent système pour les études de régénération et de maladies rénales. Un aspect essentiel de cette recherche est l'évaluation de la structure et la fonction des néphrons. Ce protocole décrit plusieurs méthodes qui peuvent être mises en œuvre pour évaluer la composition néphrons des tubules et d'évaluer la réabsorption rénale.

Abstract

Le modèle de poisson zèbre a émergé comme un système pertinent pour étudier le développement du rein, de la régénération et de la maladie. Les deux reins embryonnaires et adultes poisson zèbre sont composés d'unités fonctionnelles appelées néphrons, qui sont hautement conservées avec d'autres vertébrés, y compris les mammifères. La recherche dans le poisson-zèbre a récemment démontré que deux phénomènes distincts transpirent après néphrons adultes encourent des dégâts: d'abord, il ya la régénération robuste dans néphrons existants qui remplace les cellules épithéliales des tubules détruits; deuxième, entièrement nouveaux néphrons sont produites à partir de progéniteurs rénaux dans un processus connu sous le nom neonephrogenesis. En revanche, les humains et d'autres mammifères semblent avoir seulement une capacité limitée pour la régénération de l'épithélium des néphrons. À ce jour, les mécanismes responsables de ces phénomènes rein de régénération restent mal compris. Depuis reins poisson zèbre adultes subissent à la fois néphron épithéliale régénération et neonephrogenesis, ils fournissent un para expérimentale exceptionnelleparadigme pour étudier ces événements. En outre, il existe un large éventail d'outils pharmacologiques et génétiques disponibles dans le modèle de poisson zèbre qui peuvent être utilisés pour délimiter les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régulent la régénération rénale. Un aspect essentiel de cette recherche est l'évaluation de la structure et la fonction des néphrons. Ce protocole décrit un ensemble de techniques de marquage qui peuvent être utilisés pour évaluer la composition du rein et de la fonctionnalité du néphron de test dans le rein adulte de poisson zèbre. Ainsi, ces méthodes sont largement applicables à l'avenir la caractérisation phénotypique des adultes poisson zèbre paradigmes de lésions rénales, qui comprennent, mais ne sont pas limités à, des régimes d'exposition nephrotoxicant ou des méthodes génétiques de la mort cellulaire ciblée comme la technique d'ablation de cellules nitroreductase médiation. En outre, ces méthodes pourraient être utilisées pour étudier les perturbations génétiques dans la formation du rein adulte et pourraient également être appliquées pour évaluer la fonction rénale lors de la modélisation des maladies chroniques.

Introduction

Le rein est un organe complexe qui remplit une multitude de fonctions physiologiques de l'organisme. La principale fonction du rein est l'excrétion des déchets métaboliques, et cette tâche est étroitement liée avec le maintien de l'homéostasie fluide. Le rein effectue ces travaux en filtrant le sang et la formation de l'urine, tout en régulant de façon concomitante la pression artérielle, les niveaux d'électrolyte, et l'équilibre acide-base. Tubules épithéliales hautement spécialisées appelées néphrons servent de l'unité fonctionnelle de base du rein ^1,2. Chez les vertébrés adultes, néphrons sont généralement organisés dans une disposition étroitement enroulé autour d'un système de drainage centralisée, permettant ainsi de nombreux tubes pour emballer dans le assez petit orgue. Par exemple, chaque rein humain peut contenir plus de 1 million de néphrons ^3. D'autres mammifères comme la souris possèdent de l'ordre de 8 à 10000 néphrons par rein ^4. Le degré de complexité rénale diffère entre les mammifères et les autres vertebrates dues à des variations dans le nombre de néphrons totale et leur disposition architecturale dans le rein. espèces de vertébrés forment jusqu'à trois structures rénales successives au cours du développement, et chaque formulaire affiche une complexité croissante à l'égard de néphrons dotation et arrangement: les pronephros, mésonéphros, et metanephros. Le dernier bâtiment rénale doit être conservé sert de rein adulte organe, généralement un mésonéphros ou un metanephros ^2. Chaque forme de rein, cependant, a une composition à base de ^néphrons-2.

Le néphron est l'outil de travail du rein et est responsable de la filtration du sang avec un métabolite de la sécrétion et la réabsorption. Néphrons sont des structures tubulaires simples composées de cellules épithéliales et avoir une organisation segmentaire, dans lequel discrets domaines hautement spécialisés, de l'épithélium différenciés effectuer des tâches spécifiques. Dans l'ordre de l'écoulement du filtrat à travers le néphron, il ya généralement trois grandes parties qui COMPRISe chaque unité: (1) le corpuscule rénal, (2) un tubule proximal avec, intermédiaire, et segments distaux, et (3) un canal collecteur ^1. Le tube proximal est responsable de la réabsorption de solutés organiques, et plus particulièrement du glucose et des acides aminés ^1. Le tube intermédiaire (ou boucle de Henle) est un site majeur de sel et d'eau réglementation ^1. Enfin, réglage fin de sel et d'autres ions se produit dans le tubule distal et le tube collecteur et est fortement régulée par le système endocrinien ^1. A partir de là, le filtrat traverse l'uretère et de la vessie, en fin de compte la sortie du corps comme un produit de déchets ^1.

La perte de la fonction rénale peut provenir d'une multitude de causes qui empêchent l'activité des néphrons normale. Ces causes peuvent se produire au cours du développement du rein, par exemple, des anomalies congénitales qui conduisent à la malformation de néphrons ^5, ou des causes de différents types de dommages (provenant de l'environnement à la fois génétique etorigines NTAL). Blessures acquises sont généralement classés comme des blessures rénale aiguë (IRA) ou de blessure rénale chronique (IRC). AKI implique une perte soudaine de la fonction rénale, souvent résultant d'une ischémie ou d'une toxine exposition ^6,7. Chez les mammifères, la réparation de l'épithélium des néphrons est possible après de telles blessures ^8, et de nombreuses personnes présentent pleine restauration de la fonction rénale après l'IRA. Cependant, AKI est également associée à une forte morbidité et la mortalité qui ont été signalés dans un large 30 - gamme de fréquence de 70% ^6,7. CKD, en revanche, est associée à une perte progressive de la fonction rénale résultant de nombreuses années de dommages prolongée, généralement associée à une fibrose ^8,9. En outre, une interaction existe entre AKI et CKD, soit comme on peut prédisposer un individu à l'autre ^10-12. Par exemple, ceux qui ont souffert de l'insuffisance rénale aiguë sont plus sensibles à la maladie rénale chronique et même la mort ^13. L'incidence de la maladie rénale, à la fois aux États-Unis et dans le monde, a atteint épidéproportions micro et devrait augmenter que la population âgée augmente-donc il ya un besoin croissant d'identifier les interventions de la médecine régénératrice pour le rein ^14,15.

Malgré la connaissance que patients atteints d'IRA peuvent récupérer, il a longtemps pensé que le rein est un organe sans pouvoirs de régénération innées. Cette vision traditionnelle a été considérablement révisé au cours des dernières années ^16. Des études portant sur ​​des lésions rénales chez les souris et les rats après l'IRA ont montré que les cellules épithéliales des tubules des néphrons peuvent proliférer et reconstruire néphrons fonctionnels ^17-20. Bien que les mammifères possèdent cette capacité d'adaptation à régénérer néphrons, il ya des limites notables et des réponses inadaptées peuvent être déclenchées qui conduisent à la fibrose rénale et CKD ^21. Par exemple, une étude récente a démontré que l'ablation répétée des cellules épithéliales dans les néphrons murins a été associée à une diminution de la régénération et néphrons la fibrose rénale suggérant VHAea limitée seuil de régénération ^22. Il n'existe aucune preuve que l'adulte rein de mammifère forme de nouvelles néphrons pour remplacer ceux perdus ou endommagés, ainsi leur destruction conduit à un déficit de ^8,9 néphrons permanent. Fait intéressant, certains vertébrés ne répondent à AKI en régénérant néphron épithéliums et en produisant de nouvelles néphrons, un processus connu sous le neonephrogenesis ou néphron néogénèse ^23. Neonephrogenesis se produit dans les poissons après exposition à des toxines ou résection partielle, et des modèles de blessures ont toujours inclus le poisson rouge ^24,25, le tilapia ^26, patin ^27, médakas ^28, et plus récemment, le poisson zèbre ^29,30. Parmi ceux-ci, le poisson zèbre constituent un modèle de recherche génétique viable pour découvrir les voies cellulaires et moléculaires responsables de la régénération rénale.

Dans cet article, vidéo, nous démontrons comment étiqueter les segments de néphrons chez le poisson zèbre adulte. Connaissance des néphrons anatomie, les caractéristiques moléculaires,et les caractéristiques fonctionnelles sont indispensables pour les études rénales futurs succès en utilisant le poisson zèbre. Le rein de poisson zèbre adulte est une structure de mésonéphros et est par nature moins complexe en termes de nombre de néphrons et de l'organisation de la structure de metanephros chez les mammifères adultes, aviaires et reptiles ^31. Cependant, le poisson-zèbre organisation segment de néphron est analogue pour les mammifères, et a été documentée dans le rein embryonnaire sur la base des études d'expression génique ^31-35. Néphrons d'embryons de poisson zèbre contiennent des segments linéaires tubulaires qui incluent le tubule contourné proximal (PCT), tubule proximal droite (PST), distale tôt (DE), et distale retard (DL) ^31-35 (Figure 1). Néphrons adultes poisson zèbre possèdent segments tubulaires similaires ^30,31,36,37 (Figure 1). Le PCT peut également être identifié par un phénotype fonctionnel: les cellules épithéliales de la PCT seront incorporer des composés de dextrane marquées par fluorescence (10-70 kDa en taille) présents dans lecirculation, qui a été utilisé à la fois dans le poisson zèbre de rein embryonnaire et adulte afin d'évaluer l'absorption endocytique par les cellules du tubule proximal ^{38 à 41} (figure 1). Une différence dans les segments du néphron entre le poisson-zèbre et les mammifères, c'est que le poisson-zèbre manquent un tube intermédiaire, ou l'anse de ^{Henle, 30-37;} car le fonctionnement de ce secteur chez les mammifères d'économiser l'eau, et le poisson-zèbre est une espèce d'eau douce sans l'urgence de concentrer leur urine, il n'est pas surprenant que le poisson-zèbre manque ce segment ^32,33. Ainsi, la composition d'ensemble du néphron est largement conservée entre le poisson zèbre et le rein des mammifères ^32,33. Ces similitudes ont permis de poisson zèbre à être un outil de recherche efficace pour étudier les fonctions des gènes rénales exprimée pendant néphrogenèse développement ^32-35,42 et de modéliser de nombreuses maladies rénales ^43,44, ce qui ajoute à la liste substantielle de la situation des droits qui peuvent être étudiée en utilisantpoisson zèbre ^45,46.

Aujourd'hui, le rein de poisson zèbre adulte est un modèle attractif pour les études comparatives de régénération rénale en raison de sa traçabilité génétique et le palais en éveil des ressources technologiques disponibles pour interroger la fonction des gènes et voies de signalisation dans cette espèce. Plusieurs études ont utilisé les mésonéphros poisson zèbre pour étudier les mécanismes de régénération après AKI ^29,30,37. Pour la recherche AKI continué à utiliser le rein de poisson zèbre adulte, il est essentiel de disposer de méthodes exquis pour étiqueter les différentes régions et les méthodes néphrons pour étudier la fonctionnalité des néphrons. Plusieurs méthodes d'analyse de rein adulte ont été adaptées à partir des protocoles de rein embryonnaire. L'injection intrapéritonéale de dextran marqué par fluorescence dans le poisson zèbre adulte étiquettes l'épithélium du PCT dans mésonéphros néphrons par endocytose ^30, comme dans embryons de poisson zèbre ^38-41 (Figure 1). Cette méthode a été utilisée pour visualize quand tubules proximaux à retrouver leurs biens résorber suivante AKI, qui permet à un évaluation de restaurer la fonction physiologique ³⁰ (Figure 1). Une autre caractéristique du néphron tubule proximal est que les cellules epitheliales dans ce segment présentent une bordure en brosse ³⁷ montre que des niveaux élevés de l'activité phosphatase alcaline endogène. Ainsi, l'épithélium proximale peut être localisé visuellement chez l'adulte rein poisson zèbre en utilisant une technique basée sur la fluorescence connu comme Elf-(marqué par une enzyme de fluorescence) -97 ^47.

Ici, nous décrivons comment effectuer fluorescentes essais d'absorption de dextran ^30,48 chez l'adulte rein poisson zèbre, de façon à obtenir une évaluation fonctionnelle du tubule proximal et la carte de la taille et les contours de ce segment de tubule. Ensuite, nous décrivons les techniques d'étiqueter les régions du tubule proximal du néphron adulte avec l'étiquette fluorescente phosphatase alcaline. En troisième lieu, on montre pour la première fois que le Rhodamine-tagged lectine agglutinine de Dolichos biflorus (DBA), qui a été utilisé comme marqueur général des tubes collecteurs dans les reins des mammifères ^49, marque les tubules distaux du rein adulte de poisson zèbre. En tant que DBA est mutuellement exclusif de coloration alcaline phosphatase, ces étiquettes offrent un moyen de distinguer large pan-proximale par rapport étendues pan-distale de l'adulte néphron poisson zèbre. Tout au long de la mise en œuvre de ces colorants fluorescents à la fois toute la montagne et des coupes histologiques cryostat, nous corréler ces étiquettes avec des domaines d'expression des gènes soluté de transporteurs qui identifient de façon unique chaque segment de néphrons. Par conséquent, ce protocole contient également un guide sur les procédures de traitement des tissus modifiés pour l'ensemble de tissu adulte montage hybridation in situ (WISH) analyse dans la base de notre embryon protocole WISH ^50. Ces procédures peuvent être utilisées dans diverses combinaisons (Figure 2) de documenter les attributs morphologiques et fonctionnelles of adultes néphrons rénaux poisson zèbre. Ainsi, ces protocoles peuvent être appliqués à des études de régénération, la caractérisation phénotypique des autres modèles de maladie rénale, et encore utilisés pour étudier la formation de rein adulte.

Protocol

Les procédures pour travailler avec le poisson zèbre décrite dans ce protocole a été approuvé par le Comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle à l'Université de Notre Dame. Remarque: Un guide pour les reins et les néphrons anatomie chez le poisson zèbre est fourni (Figure 1). Une vue d'ensemble des méthodes décrites dans ce protocole est fourni un organigramme (figure 2) pour illustrer la façon dont plusieurs procédures d'étiquetage peut être effectuée sur le même échantillon de rein. Pour la partie 7 de la préparation de WISH pour les études rénaux adultes, les étapes présentées ici indiquent comment modifier le traitement des embryons de poisson zèbre, comme l'a récemment publié ^50, afin de fournir un guide technique pour la réussite de l'analyse de recherche de l'organe de rein.

1 poisson zèbre adulte injection intra-péritonéale avec Dextran d'intérêt

1. Préparer le dextrane marqué par fluorescence stock (s) souhaitée par dissolution de la poudre de dextrane dans l'eau distillée à une concentrationde 50 mg / ml, puis stocker aliquotes dans des microtubes à -20 ° C dans l'obscurité. Remarque: Différents dextranes marqués par fluorescence sont disponibles dans le commerce. Sélectionnez le dextran pour une utilisation basée sur la combinaison d'autres étiquettes que l'on souhaite, et assurez-vous que les filtres fluorescents appropriés sont disponibles avec les microscopes qui seront utilisés. dextranes de lysine-fixable montrent une fluorescence sans autres étapes en matière d'étiquetage dans des échantillons de vie, échantillon de tissu non fixé à partir de spécimens euthanasiés, et les échantillons fixés.
2. Décongeler le dextran stock souhaité et stocker de la glace dans l'obscurité tout en effectuant les étapes 1.3 à 1.5. Enroulez le microtube dans une feuille d'aluminium pour le protéger de la lumière lors de la manipulation.
3. Anesthésier un poisson zèbre adulte entre 5-7 mois d'âge en plaçant le poisson dans un plat contenant soit 0,02% tricaïne ou 0,001% de 2-phénoxyéthanol pour environ 1 - 2 min. Remarque: Il est préférable d'utiliser le poisson zèbre adulte de cette tranche d'âge parce que les jeunes poissons peuvent avoir small reins qui sont difficiles à disséquer, et des échantillons de rein à partir de vieux poissons peuvent contenir des masses de tissu cicatriciel qui ne peuvent pas être analysés. Lorsqu'il est correctement anesthésié, le poisson zèbre adulte ne présentera pas une réponse à la stimulation toucher, qui peut être testé à l'aide d'une cuillère ou d'une sonde émoussée à toucher doucement la nageoire caudale des poissons.
4. Avec une cuillère en plastique, soulevez le poisson dans le plat, décanter la solution et placer soigneusement l'animal sur un moule en éponge humide, ventrale vers le haut.
5. L'utilisation d'un 31 G 1.0 cc seringue à insuline, injecter 20 pi de décongelé solution stock dextran dans l'espace intra-péritonéale. Orienter l'aiguille de sorte que l'insertion se produit à un angle faible sur la ligne médiane ventrale de l'abdomen. Pour éviter de percer les organes, insérer l'aiguille puis le relever légèrement de façon à soulever la paroi du corps du poisson et de créer un espace dans lequel pour injecter la solution de dextran ^48. Remarque: vous pouvez le stock dextran peut être dilué, par exemple, dans un rapport de 1: 2 ou 2: 1 (dextran: diseau distillée), afin de réduire la fluorescence de fond dans l'échantillon.
6. Retourner délicatement le poisson dans le réservoir pour permettre la récupération de l'anesthésie. Note: L'absorption de dextran par le segment de tubule proximal se produit dans les 8 - 12 heures et peut être détecté au moins jusqu'à 3 jours après l'injection (dpi). Analyse à 3 dpi fournit le signal de tube solide avec une faible fluorescence de fond dans les populations stromales rénales. Passez à la partie 2 pour l'ensemble de l'examen de montage de l'absorption de dextran seul, si l'étiquetage supplémentaire n'est pas souhaitée. Pour l'étiquetage combinatoire, passez à la partie 3 de préparer le tissu pour toutes les épreuves de montage de l'absorption de dextran, puis la partie 4 à double étiquette avec la phosphatase et / ou de la partie 5 alcaline, pour effectuer double DBA ou triple étiquetage. Pour la recherche utilisant des coupes histologiques, passez à la partie 6 pour les instructions sur la façon de faire de fines tranches de rein en utilisant un cryostat et comment ceux-ci se colore avec diverses étiquettes et / ou immunohistochimie avec antib primaire et secondaireodies.

2 Dissection et plat Préparation Mont du rein poisson zèbre adulte à partir d'un échantillon d'animaux non fixés pour visualiser fluorescent Dextran étiquetage du tubule proximal

1. Euthanasier le poisson zèbre adulte dextran-injecté en le plaçant dans un plat avec 0,2% Tricaine pH 7,0 pendant 4 - 5 min. Remarque: Assurez-vous que le poisson a été euthanasié avant de procéder, en surveillant attentivement si les branchies ont cessé le mouvement et le cœur a cessé de battre ^36.
2. Avec une cuillère en plastique, soulevez le poisson de la solution Tricaine, décanter la solution et placer l'animal sur une serviette en tissu ou en papier.
3. Utilisez une paire de ciseaux de dissection pour faire une coupe derrière l'opercule des branchies et retirer la tête.
4. Ouvrir immédiatement le corps du poisson avec des ciseaux de dissection en faisant une longue incision ventrale de la tête à la base de la nageoire caudale.
5. Retirez les organes internes du poisson à l'aide d'une paire de pinces fines.
6. Utilisation super-fines aiguilles de dissection à la broche ouvert les parois du corps de façon à permettre la visualisation de l'organe de rein, qui adhère à la paroi dorsale de l'animal.
7. Utilisez des pinces fines pour détacher le rein à partir de la paroi dorsale.
8. Placez délicatement le rein dans un flacon de verre de 5 ml contenant du PBS 1X et laver 3 fois avec 3 - 5 ml de PBS 1X frais de 5 min chacune. Remarque: L'utilisation d'un flacon en verre pour la manipulation des échantillons de rein adultes facilite la visualisation du tissu et permet des lavages avec de grandes quantités (par rapport à la masse de tissu) d'environ 3-5 ml. En variante, une boîte de culture cellulaire de 12 puits peut être utilisé. Bien que d'un tube à centrifuger en plastique pourrait être utilisé, les tubes de taille standard (1,5 ml) pourraient limiter le lavage.
9. Retirer le rein avec une pipette de transfert et le lieu sur une lame de verre propre avec 1-2 gouttes de PBS 1X.
10. Utilisez des pinces fines pour aplatir le rein sur la diapositive, en vous assurant qu'aucun tissu courbés ou autrement renversésur elle-même. Remarque: En variante, un outil de fil de tungstène peut être utilisé pour faire de petites incisions dans le tissu conjonctif de faciliter le positionnement à plat du rein.
11. Placez des petits morceaux de pâte à modeler à chaque coin d'une lamelle de 18 x 18 mm en verre et mettre lentement la lamelle sur le rein. Remarque: Légèrement angle de la lamelle lors de la pose de minimiser la formation de bulles dans la solution ^50. Les mottes d'argile de modélisation sont d'environ 2 mm de diamètre (figure 2A). Alternativement, les mottes de gazon de la graisse à vide peuvent être substitués à la place de la pâte à modeler. Ajouter une goutte supplémentaire de PBS 1X pour remplir l'espace entre la lame et la lamelle de verre si nécessaire.
12. Observer et / ou l'image du rein en plaçant la lame de verre dans le champ de vision d'un microscope binoculaire ou d'un composé avec le filtre approprié. Remarque: Reportez-vous à la figure 2A pour l'aspect macroscopique de cette préparation des lames.

3. Fixation, Dissection, perméabilisation et enlèvement de pigmentation de la rein poisson zèbre adulte

1. Préparer une solution de fixateur frais de paraformaldéhyde à 4% (PFA) / PBS 1X / 0,1% de DMSO ou de décongeler une aliquote congelée de PFA à 4% / PBS 1 X et ajouter 0,1% de DMSO. Attention: PFA est toxique et solutions PFA doit être manipulé à une hotte chimique tout en portant un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants et une blouse de laboratoire. En outre, la poudre PFA doit être manipulé avec soin lors de la solution mère.
2. Remplissez un bac de dissection avec une solution de fixateur pour submerger l'animal entier.
3. Euthanasier et monter le poisson zèbre sélectionné dans la solution de fixation (voir les étapes 02.02 à 02.06). Remarque: Le poisson choisi peut être un non traités échantillon de rein de poisson zèbre ou un rein isolé d'un poisson zèbre qui a déjà reçu une injection intrapéritonéale de dextran (Partie 1).
4. Fixer l'échantillon O / N (12 - 16 h) à 4 ^o C.
5. Le jour suivant, utilisez une pince fine aux soinsdétacher complètement du rein de la paroi dorsale du corps et placer l'organe dans un flacon en verre en utilisant une pipette de transfert. Remarque: Vous pouvez également, une boîte de culture de 12 puits ou 24 puits peut être utilisé. Bien que d'un tube à centrifuger en plastique pourrait être utilisé, les tubes de taille standard (1,5 ml) pourraient limiter le lavage.
6. Laver le rein disséqué 3 fois avec 3 - 5 ml de PBS 1X avec 0,05% de Tween pendant 5 minutes chacun.
7. Retirer le PBS 1X avec 0,05% de Tween et rincer le rein avec 3 ml d'une solution de saccharose à 5% (dans du PBS 1X) pendant 30 min.
8. Remplacez-le par 3 ml de solution à 30% de saccharose (dans du PBS 1X) et magasin O / N (12 - 16 h) à 4 ^o C. Remarque: Les solutions de saccharose perméabilisent les membranes cellulaires, ce qui permet par la suite l'étiquetage spécifique des réactifs car elles pénètrent le tissu.
9. Le jour suivant, on élimine la solution de saccharose à 30% et on lave le rein deux fois avec 5 ml de PBS 1X avec 0,05% de Tween pendant 5 min chacun.
10. Remplacez le 1X PBS avec 0,05% de Tween avec 3 -5 ml d'une solution de blanchiment pour enlever la pigmentation des mélanocytes présents sur l'organe de rein.
11. Placez flacon de verre sur un rotateur et regarder attentivement que la pigmentation disparaît. Remarque: Dépigmentation prend généralement environ 20 minutes lorsqu'elle est effectuée après le traitement de saccharose, mais de temps en temps peut prendre aussi longtemps que 60 minutes. Si la solution de blanchiment est laissée sur le rein pendant trop longtemps, la désintégration de l'organe peut se produire; il est conseillé de surveiller l'échantillon toutes les 10-15 minutes pour vérifier l'intégrité des tissus.
12. Lorsque la pigmentation a été éliminé par le rein, laver deux fois avec 3-5 ml de PBS 1X avec 0,05% de Tween.
13. Remplacez le 1X PBS avec 0,05% de Tween avec 3 - 5 ml de solution PFA 4% pendant 1 heure à température ambiante.
14. Retirer la solution de PFA à 4% et le rein laver trois fois avec 3-5 ml de PBS 1X Tween à 0,05% pendant 5 minutes chacun. Remarque: Une fois que la fixation est terminée, le rein peut également être montée sur une lame de verre et d'une évaluation de dextrane sans d'absorption de la pigm mélanocytaireise, en effectuant les étapes 2.8 à 2.12.
15. Retirer le PBS 1X Tween à 0,05% et le remplacer par 3-5 ml d'une solution de blocage, puis incuber à la température ambiante du rein dans le bloc pendant 2 heures.
16. Lorsque le blocage est complet, passez directement au protocole de coloration sélectionné. Remarque: Le rein peut maintenant être traitée par un ou plusieurs autres procédures afin de mener des études d'étiquetage avec des réactifs différents. Pour l'ensemble de l'étiquetage de montage du tubule proximal avec seulement la phosphatase alcaline, passez à la section 4 Pour l'ensemble de l'étiquetage de montage de seulement le tube distal aller à la section 5 Alternativement, les articles 4 et 5 peuvent être effectuées en succession linéaire de double détection dans la montagne toute .

4 Marquer les reins des adultes segments tubule proximal avec la phosphatase alcaline de détection

1. Retirez le bloc et laver le rein 3 fois avec 3 - 5 ml de PBS 1X avec 0,05% de Tween pendant 5 minutes chaque, puis remplacer le PBS 1X avec 0,05% de Tween avec 3 - 5 mlde PBS 1X. Laissez le rein tremper pendant au moins 10 min. Remarque: Pendant ce temps, transférer le rein à une boîte de culture de 12 puits ou 24 puits si le tissu a été conservé dans un flacon en verre pour les étapes de traitement précédentes.
2. Remplacez le PBS 1X avec la solution de substrat de la phosphatase alcaline de travail suffisante (Reportez-vous à kit de détection situé dans le tableau des matériaux) pour couvrir l'échantillon, puis placer l'échantillon sur un agitateur pendant 30 min à température ambiante. Conserver l'échantillon abri de la lumière.
3. Arrêter la réaction par lavage du rein dans une solution alcaline d'un tampon de lavage de la phosphatase.
4. Rincer le rein avec 3 changements de solution tampon de lavage de plus de 10 - 15 min. Remarque: Après cette étape, passez directement à la partie 5, l'étape 5.1 (donc en omettant temporairement étapes 4.5 à 4.6) si l'étiquetage de DBA est également souhaitée. Etape facultative: Pour étiqueter et de visualiser les noyaux des cellules de l'organe, faire tremper le rein dans une solution d'iodure de propidium. Préparer un iodure de propidium en dissolvant la poudre à une concentrationtion de 1 mg / ml (1,5 mm) dans de l'eau distillée. Diluer le stock à 500 nM dans du SSC 2X et incuber le rein dans cette solution pendant 30 min. Rincer avec de PBS 1X et passez à l'étape 4.5.
5. Retirer la solution tampon de lavage et monter le rein sur une lame de verre propre dans le milieu de montage de la phosphatase inclus dans le kit de marquage (Reportez-vous aux étapes 2.9 à 2.12). Remarque: Le support de montage a remplacé le PBS 1X de l'étape 2.9.
6. Visualisez la phosphatase alcaline teinté rein en utilisant une loupe binoculaire ou microscope composé avec un / filtre DAPI ensemble Hoechst. Remarque: L'étape facultative: Visualiser l'iodure de propidium l'aide d'un tétraméthyl-rhodamine (TRITC) ou Texas filtre rouge.

5. Délimiter les reins des adultes segments distaux tubules avec la rhodamine DBA

1. Préparer une solution de travail de DBA 200 ul de la dilution de DBA (2 mg / ml) à 1: 100 dans du PBS 1X.
2. Remplacer la solution avec du PBS 1X Tween 0,05% avec la solution de DBA 200 ul.
3. Placez-les sur la coiffe pour1 heure à température ambiante.
4. Enlever la solution de DBA et laver le rein 3 fois avec 3 - 5 ml de PBS 1X pendant 5 min chacun. Remarque: L'étape facultative: Pour étiqueter et de visualiser les noyaux des cellules de l'organe avec l'étiquette de DBA, tremper le rein en solution DAPI à détecter avec un filtre du / DAPI Hoechst (rhodamine DBA tache peut être détecté avec un TRITC ou Texas filtre rouge). Préparer un stock DAPI en dissolvant la poudre à une concentration de 5 mg / ml (14,3 mm). Diluer le stock à 300 nM dans du SSC 2X et incuber le rein dans cette solution pendant 20 min. Rincer avec de PBS 1X et passez à l'étape 5.5. Si la partie 4 de traitement a été effectué, garder à l'esprit que DAPI et la phosphatase alcaline sont tous deux détectés avec un filtre / DAPI Hoechst.
5. Retirez le PBS 1X et monter le rein sur une lame de verre propre (voir les étapes 2.9 à 2.12).
6. Visualisez les segments distaux DBA-taché du rein en utilisant un filtre rouge standard TRITC ou Texas mettre sur un microscope stéréoscopique ou composé microscope à fluorescence. Remarque: s en optiontep: Visualisez la DAPI l'aide d'un filtre / DAPI Hoechst.

6. Embedding, Cryosectioning et coloration (colorants vitaux et immunohistochimie étiquetage) de poisson zèbre adulte rein tissus

1. Sélectionnez poissons pour analyse, puis l'euthanasier, fixer et perméabiliser comme décrit (étapes 03.02 à 03.08). Remarque: Fixer les poissons adultes dans 9: 1 éthanol: formaldéhyde / 0,1% de DMSO au lieu de 4% de paraformaldéhyde / PBS 1X / 0,1% de DMSO pour la procédure de cryosection pour produire des sections de dextran, la phosphatase alcaline, et DBA visualisation. Cependant, gardez à l'esprit que les fixations en fonction paraformaldehyde peuvent être compatibles pour certaines procédures d'immunohistochimie. En outre, le blanchiment du rein adulte n'est pas nécessaire pour l'analyse de cryosection, parce que les mélanocytes sont superficielles et n'affectent pas la visualisation des cellules de néphrons qui composent «l'intérieur» de l'organe de rein.
2. Le lendemain, retirez la solution de saccharose à 30% et le remplacer par 1: 1 tissu milieu de congélation: 30% sucrose pendant 4 heures à température ambiante.
3. Retirer la solution 1: 1 et d'intégrer des échantillons de reins dans les tissus 100% dans le milieu de congélation cryomoules et le lieu de -80 ^o C pendant au moins 1 h.
4. Coupée transversalement coupes en série, environ 12 um d'épaisseur, à travers le rein adulte.
5. Montez cryosections gelés sur des lames adhésives et laisser sécher à l'air pendant 1 heure à 50 ^° C.
6. Magasin glisse à -80 ^o C jusqu'à utilisation.
7. Lorsque cryosections sont prêts à être étiquetés, retirer le microscope glisse de -80 ^o C et placer sur la lame chaude à 50 ^° C pendant 45 min.
8. L'utilisation d'un stylo bloqueur liquide, dessinez un cercle autour des cryosections et laisser sécher pendant 15 min sur la lame chaude à 50 ^° C.
9. Retirer les lames de la lame chaude et placer à plat dans une chambre humide à température ambiante.
10. Réhydrater les coupes cryogéniques en ajoutant du PBS 1X Tween à 0,05% de la partie encerclée de diapositives pendant 20 min. Remarque: Environ 200 à 300 et# 956; l est nécessaire pour couvrir chaque partie encerclée sur une diapositive.
11. Remplacez le PBS 1X avec une solution de Tween 0,05% avec des produits frais du PBS 1X et incuber pendant 10 min.
12. Retirer du PBS 1X et incuber cryosections dans une solution de blocage pendant 2 h. Remarque: Pour un 10 ml de solution de blocage, mélanger 8 ml de PBS 1X avec 0,05% de Tween, 2 ml de sérum de veau foetal et 150 pi de DMSO. Pour effectuer immunohistochimie après l'étape de blocage, incuber la lame avec l'anticorps primaire désirée dilué dans le bloc O frais / N à 4 ^° C, laver une fois à l'aide de PBS 1X avec 0,05% de Tween, incuber pendant 2 heures à température ambiante avec une solution d'anticorps secondaire dilué dans 1X PBS avec 0,05% de Tween, laver une fois en utilisant du PBS 1X avec 0,05% de Tween, et monter une lamelle sur la lame avec un milieu de montage. Les dilutions d'anticorps nécessaires varient et les essais devraient être effectués afin de sélectionner les dilutions optimales. récupération de l'antigène peut également faciliter immunomarquage, et est effectué avant le blocage. Immédiatement après diapositives sont décongelés à 50 ^o C(Étape 6.8) incuber les cryosections entre 95 ^o C-100 ^o C pendant 40 min dans du tampon de citrate de sodium 10 mM préchauffé. Refroidir les diapositives pendant 30 minutes, puis laver deux fois dans du PBS 1X avec 0,05% de Tween, et passez à l'étape 6.11.
13. Retirer la solution de blocage et laver cryosections 3 fois avec du PBS 1X pendant 5 minutes chacun.
14. Remplacer PBS 1X avec une solution DBA de coloration et incuber pendant 1 heure. Remarque: Diluer 1 pl DBA dans 99 ul de PBS 1X pour obtenir une solution de coloration de 100 pi.
15. Retirer la solution DBA colorante et laver cryosections 3 fois avec du PBS 1X pendant 5 minutes chacun.
16. Appliquer l'étiquette de la phosphatase alcaline et incuber sur cryocoupes pendant 10 min.
17. Laver la phosphatase alcaline au large des coupes cryogéniques d'une série de trois lavages de tampon de lavage de 10 min chacun. Remarque: Pour une solution de 100 ml de tampon de lavage, mélanger 5 ml d'EDTA 0,5 M et 120 mg de lévamisole dans 95 ml de PBS 1X. Pour marquer les noyaux, incuber les sections avec de l'iodure de propidium ou DAPI à la dilutions précédemment (étapes 4.4, 5.4, respectivement) pendant 30 min à température ambiante. Sélectionner un colorant nucléaire compatible avec la combinaison d'autres colorants fluorescents qui ont été choisis.
18. Retirer tout le liquide des cryosections et placer 2 gouttes de milieu de montage sur lame de microscope.
19. Placez délicatement micro couvercle en verre sur la lame de microscope. Cryosections sont maintenant prêtes à l'image avec le filtre approprié (s).

7. Traitement des WISH pour adultes de poisson-zèbre échantillons de rein

1. Sélectionnez l'échantillon de poisson zèbre souhaitées (s), l'euthanasie, fixer et disséquer le rein comme décrit (étapes 3.1 à 3.5). Remarque: Il est indispensable d'utiliser une solution de fixation de 4% de paraformaldéhyde (PFA) / 1X PBS avec 0,1% de DMSO à perméabiliser le rein. Placer le rein dans une fiole en verre pour une visualisation facile lors des étapes ultérieures de traitement.
2. Retirez le fixateur et laver le rein deux fois avec 5 ml de 1X PBST.
3. Retirez le PBS 1X et laver le rein wi deux foise 100% de méthanol, puis incuber le rein à -20 ^o C pendant au moins 20 min pour perméabiliser. Remarque: disséqué les reins peuvent être stockées indéfiniment à -20 ^° C.
4. Réhydrater le rein en effectuant une série de lavages de 5 min avec 3 à 5 ml de methanol à 50% / PBST 1X, 30% de méthanol / 1 X PBST et deux fois avec du PBST 1X.
5. Bleach du rein à éliminer la pigmentation comme décrit (étapes 3.10 à 3.14).
6. Traiter le rein avec 10 pg / ml protéinase K / 1X PBST avec 0,1% de DMSO pendant 20 minutes, puis rincer deux fois avec 1X PBST et post-fix dans 4% PFA / 1X PBST pendant 20 min à O / N. Remarque: Toujours préparer la protéinase K solution de travail immédiatement avant la digestion d'échantillons en combinant 50 l de protéinase K fraîchement décongelé actions (10 mg / ml), 50 ml de PBST 1X et 50 pi de DMSO.
7. Traiter le rein pour WISH simple ou double suivant les étapes de la synthèse de la ribosonde, pré-hybridation, hybridation, anti-digoxigénine / anti-fluorescéine incubation d'anticorps et DETECtion comme l'a récemment décrit ^49. Tout le montage imagerie de taches rénaux doit être effectuée en quelques jours de réaliser la réaction de coloration: Note. Taches néphrons ont tendance à s'estomper très rapidement, en particulier les étiquettes de substrat rouges. Pour néphron photographie, montage à plat l'échantillon de rein comme décrit ci-dessus dans les étapes 2.10 à 2.12, et de l'image en utilisant un stéréomicroscope ou composé. Contraste des filtres d'interférence différentielles peuvent être utilisés pour mieux visualiser les contours cellulaires de néphrons pour faciliter l'analyse de l'échantillon.

Representative Results

Chacun des protocoles a été réalisé sur le type sauvage du poisson zèbre. Des exemples de données obtenues document, la composition de structure normale et les propriétés des néphrons intérieur du poisson zèbre rein adulte en bonne santé. Le poisson zèbre adulte possède un mésonéphros, ou deuxième forme de rein qui se trouve sur la paroi du corps dorsale (figure 1A). Le rein adulte est relativement plat et contient une tête dite, le tronc et la queue région mélanocytes superficielles disséminés dans ces régions (figure 1A). Le tissu rénal contient des tableaux de néphrons qui se connectent et se jettent dans les conduits de collecte central (figure 1A) ramifié. Chaque néphron est polarisée le long de sa longueur, avec un filtre à sang (ou corpuscule rénal), à une extrémité, suivie par une série de segments tubulaires, et aboutissant enfin à un conduit qui recueille la solution qui sera éliminé (figure 1A). Chaque tubule du néphron adulte contient segmentaire proximale et distalets de cellules, délimitées par l'expression des transporteurs de solutés spécifiques ^30,31,36,37, qui est conservée avec le motif exposé de néphrons segmentaire embryonnaires ^{de 31 à 35} (figure 1B). Par exemple, les transcriptions de cubiline marquent le tubule proximal ³⁹ (PCT et la TVP) et des transcriptions de clcnk marquent le tube distal ³² (DE et DL) (figure 1B). En outre, le segment de PCT est caractérisé par l'expression de slc20a1a, le PST est distingué par expression de slc13a1, le DE est caractérisé par l'expression de slc12a1, et la DL est caractérisée par l'expression de ³² slc12a3   (Figure 1B). Les différences entre les tubules du néphron adulte par rapport à ceux embryonnaires sont que des segments distaux présentent des spires (DE, DL) et les branches de segments de DL largement chez l'adulte, qui est distinct de l'linéaire, anatomie non ramifiée de ces régions dans le embryo ^30,31,36,37 (figure 1A). Dans les deux ³⁰ adulte et embryonnaire ^38-41 tubules du néphron, l'épithélium de la PCT peuvent être distinguées en raison de ses propriétés d'endocytose et peut être visualisée et évaluée pour fonction de réabsorption sur la base de la capacité d'absorption des conjugués fluorescents de dextrane (figure 1B). En outre, comme le montrent les figures suivantes, le tube adulte proximale (PCT et la TVP, ou la région pan-proximale) est marqué par la phosphatase alcaline, tandis que le tube distal (DE et DL, ou la région pan-distale) est marqué par DBA (Figure 1B). Les méthodes utilisées ici pour adultes étiquette segments de néphron poisson zèbre en utilisant l'absorption de dextran, la phosphatase alcaline, DBA, immunohistochimie ou WISH peuvent être effectuées dans diverses combinaisons, dans la montagne tout ou avec des coupes histologiques de tissu rénal (figure 2). Ceci permet une grande flexibilité et la variété lorsque la composition des néphrons est à évaluer (La figure 2).

Le rein adulte peut être monté à plat sur ​​une lame de verre pour analyse, avec des mottes de pâte à modeler (ou en variante, la graisse à vide) utilisé pour suspendre la lamelle couvre-objet sur ​​le tissu (Figure 3A). Comme la longueur du rein typique est d'environ 7.5 mm, il a une dimension favorable à la formation d'image sur un microscope stéréo ou d'un composé (figure 3A). Sous un éclairage en fond clair, une population de mélanocytes superficiel avec pigmentation noire peut être visualisée en liaison avec le tissu rénal, et le système vasculaire tels que l'aorte peut être vu du fait que les globules rouges circulants ont une teinte rouge (figure 3B). Après injection intrapéritonéale de dextran-FITC, répartis sur l'ensemble des domaines PCT mésonéphros sont encore étiquetés 3 jours plus tard, et imagés en utilisant un filtre FITC sur un microscope à fluorescence (Figure 3C). Alors que les mélanocytes masquent en partie la visualisation des tubules rénaux individuels (Figure 3C '), les mélanocytes n'empêchent pas de quantification numéro de néphron ou l'évaluation du diamètre et de la longueur de tube. Après injection intrapéritonéale de dextran fluoro-rubis, blanchiment de l'échantillon fixe éliminé la pigmentation des mélanocytes, et segments du PCT ont été observés avec éclairage de champ lumineux seul (figure 3D). Les gouttelettes lipidiques de la cavité du corps abdominale peuvent parfois être vus en association avec des préparations d'organes des reins entiers (figure 3A) segments .Individual PCT montrer circonvolutions, des bobines (Figure 3D »), mais peuvent aussi être caractérisées par des étendues relativement linéaires (figure 3D").

Conjugués dextrane différents fournis différents niveaux de clarté globale en proximal tubule étiquetage. En particulier, le dextran-FITC dextran ou fluoro-ruby a conduit à la netteté des étiquettes de néphrons avec un minimum de fond (figures 3C-D "). Tant la cascade Blu dextranee et jaune lucifer conjugués ont montré l'absorption du tubule proximal du rein adulte (figure 4A, 4B). Fait intéressant, les reins exposés à du dextrane bleu cascade ont montré une fluorescence PCT relativement spécifique avec un certain arrière-plan (figure 4A, 4A '), tandis que les reins exposés au jaune de Lucifer dextrane ont marqué segments PCT mais a montré perceptible signal de fond, la non-spécifique coloration fluorescente présente dans l'ensemble de le stroma rénale, ou l'espace entre les néphrons (Figure 4B, 4B '). Enfin, l'utilisation de dextran-fluoro rubis condition supérieure proximale étiquetage des tubules, avec peu ou pas d'expérience même vu sous un éventail de différents grossissements (figure 4C, 4C). Dans tous les cas, le modèle tubulaire distinctif de l'absorption de dextran conjugué corrélée avec l'expression de recherche de transcrits codant pour slc20a1a, un marqueur spécifique PCT établie ^30-32 (figure 4D). Nephrsur les segments colorés avec de la PCT slc20a1a ribosonde antisens affichée bobines de PCT en forme de S, ainsi que des segments du PCT moins fortement enroulés (Figure 4D), comme observé au cours des essais marqués conjugués dextrane (figure 3D ', 3D ").

D'autres préparations du rein, telles que la détection de l'activité de la phosphatase alcaline tubule proximal (figure 5A, 5B, 5C) ont été réalisées de manière similaire, après l'enlèvement de la pigmentation des mélanocytes. Cela a permis proximal tubule du néphron imagerie et l'analyse sans aucune obstruction. Endogène alcaline phosphatase réactivité dans le néphron est l'une caractéristique majeure du tubule proximal ^1,47. Alcaline phosphatase de coloration est très spécifique pour les régions proximales du néphron, par rapport au motif d'expression WISH pan-proximal du gène de la cubiline ³⁹ (figure 5D, 5D). Phosphatase alcaline réactivité était plus intense dans le sapinr section du tube proximal qui correspond à la PCT (Figure 5B), similaire au motif d'expression cubiline (Figure 5D, 5D), qui avait également plus hauts niveaux de transcription par rapport à la PCT. La PCT a été distinguée par son diamètre un peu plus large, l'expression spécifique du facteur de transcription mafba (figure 5E, 5F), et l'expression spécifique du gène slc20a1a de soluté de transporteur (Figure 4D, 4D '). Phosphatase alcaline réactivité également marquée d'un tronçon de tube proximal avec un diamètre plus mince qui correspond au segment PST (figure 5B) sur la base de la comparaison de la transcription expression spécifique au segment du slc13a1 génique soluté de transporteur (Figure 5F, 5F). Les domaines d'expression du souhait de la slc20a1a marqueur du PCT et la TVP marqueur slc13a1 s'excluent mutuellement (figure 5G la cubiline (flèches noires en. figure 5G ', 5G ", 5G"' ).

Pour confirmer davantage la relation de alcaline réactivité de la phosphatase avec l'identité de tubule proximal, l'ensemble de montage co-marquage de alcaline coloration de la phosphatase a été effectuée sur des reins de poisson-zèbre ayant reçu une injection intrapéritonéale de dextrane fluoro-rubis 3 jours avant (figure 6A-C). Dextran-fluoro rubis a montré un chevauchement avec la phosphatase alcaline dans seulement la partie la plus large diamètre du domaine de tubule proximal qui correspond à la PCT (exemples de la figure 6D-I). Le domaine de dextran-positif brusquement arrêté à l'endroit où le diamètre du tubule proximal amincie, c'est à dire, où le PCT et la TVP sont réunis, (flèche blanchela tête de la figure 6) et que la phosphatase alcaline réactivité a été observée dans le segment postérieur (PST des exemples de la figure 6D-I). Arrière-plan de fluorescence de la réaction de la phosphatase alcaline aussi faiblement exposé la paire de parallèles principales pistes de conduit de collecte trouvé dans le rein adulte ^29,30 -ducts qui se caractérisent en ayant le diamètre le plus large de tout tube rénale associée (astérisques sur la figure 6A, 6D, 6E, 6G, 6H). Ensuite, le co-marquage des tubules du néphron avec la phosphatase alcaline et le dextrane absorption a été observée dans l'analyse de cryosection (figure 6J, périmètres tubules décrit avec des points blancs). En coupe transversale, la phosphatase alcaline réactivité a été observée dans une bande épaisse à la surface apicale de l'épithélium tubulaire, compatible avec ultrastructure de bordure en brosse, tandis que l'espace cytosolique des cellules tubulaires correspondant montré dextran fluoro-ruby réactivité (Figure 6J). Notamment, Stained tubules étaient soit positive double de la phosphatase alcaline et de dextran, conduisant à leur identification en tant que segments du PCT, ou seuls positif pour la phosphatase alcaline (figure 6J, tubule périmètre décrit dans les points jaunes), conduisant à une identification comme un segment PST (note: autre tubules présents étaient négatifs pour les deux taches, données non présentées) (Figure 6J). De plus, la coloration à la phosphatase alcaline (figure 6K) a été combiné avec succès avec un marqueur nucléaire, l'iodure de propidium (figure 6L), ce qui facilite le comptage des cellules (de superposition sur la figure 6M).

Le tube distal du néphron adulte de poisson zèbre a été marqué avec de la rhodamine-conjugué DBA (figure 7). Tout le montage double marquage avec DBA et la phosphatase alcaline a été effectuée sur des reins de type sauvage poisson zèbre (figure 7A-C). DBA et la phosphatase alcaline réactivité montré aucun chevauchement dans les tubules du néphron ( la figure 7G, 7H, 7J), tandis que la ramification n'a jamais été observée dans les segments tubulaires colorées avec de la phosphatase alcaline. Cryosections du rein ont été recueillies à partir de poisson zèbre de type sauvage qui portent un transgène, dans lequel le promoteur conduit ENPEP eGFP (Tg: ENPEP: eGFP), en tant que marqueurs de la GFP à la fois proximale et distale tubules du néphron ⁵¹ (figure 7I). L'immunohistochimie a été réalisée pour détecter la GFP, de manière à marquer l'ensemble des tubules rénaux (vert, la figure 7I), suivi par un marquage fluorescent à la phosphatase alcaline et DBA (turquoise et rouge, respectivement, la figure 7I). Analyse des sections tubulaires a révélé que les tubes étaient soit positive pour la phosphatase alcaline ou DBA, mais pas les deux étiquettes (figure 7I). Seulement baignoire rareules ont montré une réactivité avec la phosphatase alcaline ni tache ni DBA, probablement en raison de l'angle de la section de tube (flèche blanche, la figure 7I). De plus, la coloration a été combiné DBA avec succès dans l'ensemble de montage avec le rein coloration nucléaire DAPI étiquette (figure 7J), mettant l'accent sur ​​la nature caractéristique encore ramifié de segments de tube distal (flèches blanches, la figure 7J).

Ensuite, à comparer en outre les modes de dextran-FITC absorption, la phosphatase alcaline, et DBA, triple marquage a été examiné par l'injection intrapéritonéale de poisson zèbre adulte avec dextran-FITC, suivie par l'isolement du rein 3 jours plus tard suivie cryosectioning et coloration à la phosphatase alcaline et DBA (exemples fournis dans la figure 8A-E). Tubules rénaux ont montré trois catégories de combinaisons d'étiquettes: tubules qui étaient à double positif pour la phosphatase alcaline et de dextran noté segments du PCT (pointillés blancs), Tubules positives pour la phosphatase alcaline seul notés segments PST (lignes en pointillés jaunes), et tubules distaux ont été marqués par tout DBA (rouge pointillé décrit figure 8A-E). Points de branchement en outre, que DBA positif tubules exposés (figure 8E). Par l'analyse de WISH, ce mode de ramification distinctif de la distale, tubes positifs DBA en corrélation avec les profils d'expression génique de transcriptions soluté de transporteurs qui sont spécifiques pour les segments des tubules distaux (Figure 8F-I). Transcrits codant clcnk, qui marque l'ensemble du tube distal (DE et DL) étaient minces de diamètre, abondant dans le rein, et des points de branchement contenues (flèche noire figure 8F, 8F). En comparaison, les segments des tubules qui montraient une expression de slc12a1 ou slc12a3, qui sont des marqueurs de la DE et DL, respectivement, étaient moins abondants dans les échantillons de rein globale par rapport à clcnk expression (comparer la figure 8 G et 8F, 8H). En outre, des segments tubulaires qui ont exprimé slc12a1 étaient rarement, voire jamais, ramifié (Figure 8G, 8G), tandis que les régions tubules qui ont exprimé slc12a3 étaient souvent ramifiés en caractéristiques arrangements pinwheel comme (Figure 8H, 8H », 8H", 8H "' , pointes de flèches noires). Enfin, double WISH pour la slc20a1a marqueur du PCT et le marqueur clcnk distale a montré que ces taches ne sont pas imbriqués (figure 8E). Notamment, les étendues de slc20a1a exprimant segments du PCT n'ont pas été joints à clcnk tubules exprimant, qui était attendu depuis le PST est situé entre ces régions (figure 8I). Pris ensemble, les dosages de l'étiquetage des tubules rénaux à l'absorption de dextran, la phosphatase alcaline réactivité, DBA, et que vous souhaitez pour les transcriptions de gènes spécifiques, permet le discernement de proximale par rapport segments distaux.

t "fo: keep-together.within page =" always ">
Figure 1 néphron anatomie dans le rein de poisson zèbre adulte. Dessins schématiques de la (A) adulte poisson zèbre reins et (B) un tableau comparatif des caractéristiques moléculaires des segments présentés par adulte et néphrons poisson zèbre embryonnaires. (A) (en haut à gauche) Le rein adulte un organe plat est situé sur la paroi dorsale du corps. (En haut à droite), Vu du point de vue ventrale, le rein a une morphologie courbe caractéristique, composée des régions de tête, du tronc et de la queue, et a également une population de surface des mélanocytes associés. L'élargissement (en bas à gauche) montre une représentation schématique d'un arbre de néphron typique dans le rein poisson zèbre adulte, dans laquelle chaque néphron unique possède un filtre de sang (corpuscule rénal) sur une extrémité, suivie d'une tubule proximal, tube distal, et le conduit. Couleur schématique (boTTOM droite) montre un schéma linéaire d'un adulte arbre des néphrons de comparer les caractéristiques des segments avec ceux des néphrons embryonnaires (B). Les néphrons d'embryons de poisson zèbre contiennent des segments des tubules qui incluent le tubule contourné proximal (PCT), tubule proximal droite (PST), distale tôt (DE), et distale retard (DL), avec le gène respectif domaines d'expression ci-dessous. Néphrons dans le poisson zèbre adulte ont une composition en forme de segment et de la signature moléculaire analogue en fonction des domaines d'expression de gènes qui codent pour des transporteurs de soluté similaire, bien qu'une distinction notable par rapport à l'embryon est que plusieurs néphrons peuvent être unis au moyen d'un segment de DL ramifié. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: Organigramme carte indiquant la relation entre les méthodes décrites dans ce protocole, indiquant comment les méthodes peuvent être réalisées individuellement ou en combinaisons variées. Suite à l'injection intrapéritonéale de marqué dextran lysine-fixable dans le poisson zèbre adulte, le rein peut être visualisée dans un monter toute la préparation, que ce soit seul ou en combinaison avec de la phosphatase alcaline et / ou les taches DBA. Alternativement, le rein poisson zèbre sélectionné peut être examiné après le tissu histologique sectionnement d'un cryostat. Les sections peuvent être colorées pour marquer de nombreuses combinaisons d'attributs, par immunohistochimie, une coloration nucléaire, DBA coloration, et / ou la réactivité de la phosphatase alcaline. En outre, les sections rénales peuvent être visualisés directement par la présence de lysine-dextrane absorption peut être fixé dans des segments du PCT. Enfin, les reins sélectionnés peuvent être traitées à l'expression spatio-temporelle de l'expression des gènes en utilisant WISH. Les chiffres entre parenthèses renvoient à corresponding parties de protocole. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3 adultes rein poisson zèbre élaboration et l'application de montage plat pour visualiser l'absorption dextran conjugué dans le segment du PCT de néphrons du rein. (A) l'image en fond clair d'un rein échantillon plat préparation monter, dans lequel l'organe a été positionné à plat sur ​​une lame de verre, avec une lamelle placée sur le dessus du tissu qui se repose sur quatre mottes de pâte à modeler (de couleur rose chaud). Voici la préparation rénale est imagé à côté d'une règle métrique pour permettre une comparaison à l'échelle. Le rein adulte typique est d'environ 5-7 millimètres (mm) de la tête à la queue. (B) l'image d'un fond clair écrurein. La pigmentation noire correspond à la dispersion de la population de mélanocytes trouvés en association avec le rein et l'aorte longe la ligne médiane du rein. (C) Visualisation des segments du PCT néphroniques 3 jours après l'injection intrapéritonéale de 40 kDa dextran fluorescéine (FITC) , sans blanchiment du rein adulte. Segments PCT sont vus à travers le rein mais sont en partie masquées en raison des mélanocytes. (C ') Le zoom numérique d'un seul néphron, avec les mélanocytes (flèche blanche). (D) Image d'un rein adulte 3 jours après l'injection intrapéritonéale de 10 kDa dextrane fluoro-rubis, la fixation du rein, et de blanchiment. La pigmentation des mélanocytes a été éliminé et les régions de PCT ont été visualisés ici sur la base de leur absorption endocytique de dextran sous un éclairage en fond clair. Les gouttelettes lipidiques (flèche) de l'abdomen sont parfois visibles en association avec des échantillons de tissus rénaux. (D ', D ") reprénisations images représentent de légères variations morphologiques entre les segments du PCT. Alors que de nombreux PCT néphrons sont étroitement enroulées (D '), d'autres contiennent des néphrons régions du PCT qui ont un minimum de bobinage (D "). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

. L'étiquetage figure 4 adultes segment du tubule rénal néphron du PCT de type sauvage ont été le poisson zèbre par voie intrapéritonéale injecté avec un seul conjugué dextran fluorescent; puis leur rein a été examiné les 3 jours après l'injection pour la visualisation du PCT. (A, A ') de dextrane bleu cascade, de 10 kDa (B, B') de dextrane jaune lucifer, 10 kDa et (C, C ') f dextrane luoro-rubis, 10 kDa tout étiqueter préférentiellement les segments du PCT dans néphrons rénaux. Les deux dextran bleu cascade et lucifer spectacle jaune un peu de marquage non spécifique des populations de cellules stromales situées entre les néphrons, avec un fond beaucoup plus élevé observé dans lucifer reins traités jaunes. En revanche, le dextrane fluoro-rubis montré fond considérablement réduit avec intense étiquetage du PCT. (D, D ') d'un rein adulte colorées par WISH pour détecter l'emplacement de transcrits codant slc20a1a, un marqueur spécifique du type cellulaire de transporteur de la PCT. Le domaine d'expression de slc20a1a correspond à la forme caractéristique de l'absorption de dextran observée dans le rein, avec une distribution de différents boucle domaines étroitement enroulés / PCT ainsi que des étirements plus allongées PCT qui montrent un diamètre uniforme de large. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

ontenu "fo: keep-together.within page =" always ">
Figure 5 résultat Représentant de la coloration de la phosphatase alcaline, un marqueur des tubules pan-proximale, chez l'adulte rein poisson zèbre par rapport à d'autres marqueurs du tubule proximal évalués à souhait. (AC) phosphatase alcaline coloration (turquoise) illumine le néphron tubule proximal, soulignant à la fois du PCT et de la TVP. (DF) WISH unique pour les gènes cotées (chacune une coloration pourpre). (D, D ') Le profil d'expression de la cubiline , un marqueur pan-proximal (PCT-PST), en corrélation avec la phosphatase alcaline (D, D '). En comparaison, WISH pour mafba marque le PCT (E, E ') et slc13a1 marque le PST (F, F'). Dans (GG ") à double WISH pour le marqueur PCT slc20a1a </ Em> (rouge) et le marqueur slc13a1 PST (violet) montre que les segments marqués par ces marqueurs ne se chevauchent pas, et plutôt que leurs domaines d'expression occupent des positions adjacentes quand néphrons simples sont examinés de près (de type G, G "). Flèches noires indiquent la jonction entre les segments du PCT et la TVQ, qui est généralement associée à un changement de diamètre des tubules de grand à petit, respectivement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6 phosphatase alcaline et de dextran absorption spectacle chevauchement dans le segment du PCT de néphrons rénaux adultes, et la phosphatase alcaline coloration est compatible avec le co-marquage nucléaire avec l'iodure de propidium. (AI) (AC) image fusionnée et des images distinctes de la zone de la selle d'un seul rein. (DF) et (GI) Deux séries d'images fusionnées et images distinctes d'exemples de néphrons. (I) analyse de Coupe à congélation confirme co-marquage de la phosphatase alcaline et de dextran fluoro-ruby dans les segments du PCT (décrit dans les points blancs), alors que la phosphatase alcaline seule étiquette le PST segment (décrit dans les points jaunes). (KM) Un rein étaitmarqué avec (K) de la phosphatase alcaline (turquoise) et (L) l'iodure de propidium (violet), permettant à l'(M) ont fusionné visualisation des cellules des tubules proximaux et leurs noyaux, respectivement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7 phosphatase alcaline et DBA sont mutuellement exclusifs étiquettes de segment qui marquent le pan-régions proximale et distale pan-, respectivement, présents dans adultes néphrons du rein de poisson zèbre. (AH) préparations de montage entières d'un rein poisson zèbre coloré avec de la phosphatase alcaline et de la rhodamine-DBA. Phosphatase alcaline (turquoise) et DBA (rouge) ne montrent pas de chevauchement dans les reins. niveaux de phospha alcalin de fondtase éclairer la paire de grands canaux collecteurs dans chaque rein (astérisques, *), qui se distinguent en raison de leur grand diamètre. DBA tubules positifs sont plus minces de diamètre et caractérisées souvent par la présence de points de branchement (têtes de flèches blanches). (AC) l'image et des images distinctes de la région selle d'un rein unique issu de la fusion. (DF) Un ensemble d'images fusionnées et images séparées de exemple néphrons. (G, H) des exemples supplémentaires, avec tubules DBA ramifiés aux côtés de la phosphatase alcaline tubules positifs, la fusion des images. analyse (I) de Coupe à congélation confirme que les articles tubulaires distinctes phosphatase alcaline et l'étiquette de DBA, et seulement tubules rares montrent ni étiquette (flèche blanche ), probablement due à l'angle de l'article pour que tubule. Pour cette analyse, les poissons transgéniques de type sauvage, Tg: ENPEP: eGFP, ont été utilisés et toutes les tubules rénaux dans ce rein ont été immunomarquées avec un anticorps primaire pour détecter la GFP (J). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 8: étiquetage Triple de cryosections rénaux adultes avec l'absorption de dextran, la phosphatase alcaline, et DBA par rapport à distale analyse segment de WISH. Reins (AE) adultes ont été injectés par voie intrapéritonéale avec le dextran-FITC (vert), et les reins prélevés 3 jours plus tard pour l'enrobage et cryosectioning. La coloration à la phosphatase alcaline (turquoise) et DBA (rouge) a révélé trois populations de tubes: segments du PCT qui étaient positifs pour la phosphatase alcaline et la réactivité dextcouru (décrit dans les points blancs), les segments PST qui étaient positifs seulement pour la réactivité de la phosphatase alcaline (décrit dans les points jaunes), et les segments des tubules distaux positifs pour DBA uniquement (décrit dans les points rouges) qui a également montré des points de ramification distale caractéristiques. ( image AD) image fusionnée et images séparées de l'article d'un exemple. (E) issu de la fusion d'un autre exemple de section. (FI) Comparaison des profils d'expression des gènes des tubules distaux par simple (FH ") et double (I) WISH. Le (FH) de WISH unique pour les gènes répertoriés (chacun dans la coloration violette). (F, F ') Le profil d'expression de clcnk, un (DE-DL) marqueur pan-distale, a été détectée dans les tubules minces qui contenaient des points succursales (flèche noire). (G, G ') En comparaison, WISH pour slc12a1 marque la DE sans points de branchement détectés, et (HH' ") <em> slc12a3 marque le DL, un segment caractérisé par de nombreux points de branchement à travers l'organe de rein (têtes de flèches noires). (I) Double WISH pour la slc20a1a marqueur PCT (rouge) et le clcnk pan-distale (violet). Les segments marqués par ces marqueurs ne se chevauchent pas, et plutôt leurs domaines d'expression occupent des positions non adjacentes, telles que les bobines PCT individuels (en bas à droite) ne sont pas contiguës tubules distaux, et celui-ci occupent des emplacements distincts et possèdent des points de branchement de cachet (flèche noire ). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Ici, nous avons décrit des procédés qui permettent la visualisation des composants de segments de néphron dans le poisson zèbre adulte. L'injection de dextran conjugués fluorescents permet préférentiel étiquetage du PCT en raison des propriétés d'endocytose de ces cellules des tubules proximaux ^30,38. Cette méthode peut être réalisée avec une grande flexibilité en raison de l'existence des dextranes qui peut être obtenu avec une multitude de différents conjugués fluorescents. En outre, l'utilisation de dextranes de lysine peut être fixé est d'une manière particulièrement commode pour étiqueter PCT segments, comme les procédures d'étiquetage secondaires ne sont pas nécessaires. Cela permet la détection du signal relativement simple et est compatible avec de nombreux autres marqueurs fluorescents, immunomarquage, et l'utilisation de lignes de journaliste transgéniques. Alcaline phosphatase étiquetage de marque aussi le tubule proximal, avec une forte réactivité dans le PCT et réactivité légèrement plus faible dans le PST. Enfin, la coloration de DBA permet l'étiquetage des segments des tubules distaux, qui affichent un characteristic morphologie ramifiée. Différentes molécules de lectine, qui sont des protéines de sucre de liaison d'origine non immune, ont été largement utilisés pour distinguer les segments de néphron de mammifère ^47. Il est intéressant de noter que DBA dans le poisson zèbre est en corrélation avec les segments de tube distal, comme il est utilisé pour marquer les tubes collecteurs dans les reins de mammifères ^47.

Pris ensemble, ces procédés peuvent être utilisés dans diverses combinaisons pour documenter la composition et la fonction rénale. Depuis toutes ces méthodes peuvent être utilisées dans les préparations de rein entiers, ils fournissent des outils pour évaluer la structure et la fonction des néphrons tout au long de l'organe sans dépendre entièrement de l'utilisation de plus de temps, les méthodes fastidieuses, par exemple, le travail de cryosection et immunomarquage. Cependant, les colorants décrits dans cet article sont des méthodes viable en cryosection. analyse de Coupe à congélation génère des échantillons (par rapport à l'ensemble de montage) qui sont mieux adaptés pour l'immunohistochimie pour détecter Pepti spécifiquesdes, même si bien sûr ce type d'analyse nécessite la disponibilité d'anticorps primaires appropriés. Malheureusement une limitation majeure à travailler avec le modèle animal le poisson zèbre reste la faible disponibilité d'anticorps. Ainsi WISH reste le plus largement utilisé, c'est à dire, "go-to", procédure pour l'analyse de l'expression génique. WISH utilisant des réactions de substrat BCIP, NBT, et / ou INT à produire des précipités violets ou rouges n'est pas compatible avec coloration fluorescente sur cryosections. Une option serait d'invoquer l'utilisation de la détection de WISH fluorescent, une procédure qui a été optimisé pour les échantillons embryonnaires de poisson zèbre et pourraient être adaptés pour une utilisation avec le rein adulte. La description des méthodes de cet article de la vidéo doit permettre de poursuivre l'expérimentation des techniques comme WISH fluorescent en combinaison avec des lignes de poisson zèbre transgénique dans les segments individuels sont étiquetés avec un journaliste comme eGFP ou mCherry. Alternativement, les méthodes décrites ici CoulD être testé en combinaison avec d'autres colorants vitaux, par exemple, d'autres lectines. Ainsi, outre l'adaptation et l'expansion des méthodes décrites ici peuvent être invoquées pour répondre aux besoins du chercheur pour préparations entières de rein de montage et d'analyse.

En tant que tels, ces procédés ont un large potentiel d'application avec le modèle de poisson zèbre pour les études en cours de régénération et également dans la modélisation de la maladie génétique. Il ya un besoin urgent pour la recherche innovante et les traitements contre les affections rénales. Des millions de personnes souffrent d'une forme de la maladie rénale chaque année qui résulte de causes congénitales, aigu, et / ou chroniques. En outre, la prévalence de la maladie rénale continue d'augmenter dans le monde entier, faisant de ces maladies une émission de la santé publique mondiale ^14,15. Les traitements tels que l'hémodialyse sont disponibles grâce auquel une machine de dialyse externe sert à débarrasser le sang des déchets métaboliques du patient si leurs reins ne sont pas en mesure de remplir ce rôle. Malheureusement, Cette intervention a des limites, comme le traitement en cours est nécessaire pour la survie. En outre, les patients auront éventuellement besoin d'une transplantation rénale, qui peut prendre des années pour recevoir une fois par patient est placé sur une liste d'attente. Même après l'obtention d'une greffe de rein, de nombreux patients souffrent d'effets indésirables à la suite de la procédure et doivent combattre ces effets pour le reste de leur vie. Ces difficultés montrent la nécessité grave pour le développement de nouveaux traitements pour soit prévenir les maladies du rein ou à augmenter peut-être la régénération des tissus ^8,16,52,53. Compte tenu des limites éthiques évidentes de l'utilisation de sujets humains dans les laboratoires biomédicaux, les modèles animaux sont essentiels pour l'étude de la pathogenèse de la maladie humaine et pour les essais de nouveaux traitements. En raison de sa ressemblance anatomique et la proximité de l'évolution, la souris est devenu le modèle le plus utilisé de la maladie humaine ^45. Cependant, il ya certaines limites de cet animal, yment incapacité de visualiser le développement des organes in vivo et la praticité de remplir les écrans génétiques à grande échelle. Le poisson zèbre sont un organisme modèle pertinent et utile pour l'étude du développement des organes et de la modélisation des maladies humaines ^45,46. En ce qui concerne les maladies humaines, des homologues fonctionnels chez le poisson zèbre existent pour près de 70% de tous les gènes humains ^54,55.

Des travaux récents ont mis en évidence l'utilité de poisson zèbre pour de nombreux domaines de ^31,37,56 de recherche du rein. Études de régénération et de réparation chez le poisson zèbre après l'IRA suggèrent que tubule épithéliale régénération et neonephrogenesis sont deux processus qui se produisent tout au long et se chevauchent la régénération timecourse ^30,37. L'utilisation d'un aminoglycoside antibiotique appelé la gentamicine a été utilisé comme un paradigme de la blessure qui permet d'étudier les résultats de l'IRA en ^29,30,37 poisson zèbre adulte. Au cours d'une de deux semaines environ blessure période suivante de la gentamicine, la Tubul proximalees régénérer, et en attendant de nouveaux néphrons forment tout au long de l'organe ^29,30,37. En général, les mécanismes qui régulent la régénération épithéliale restent très controversée. Dans un mécanisme proposé du processus de réparation, il est l'événement de blessure aiguë initiale suivie par une desquamation des cellules mortes dans la lumière. Ensuite, il existe une série de dé-différentiation, la prolifération, la migration et événements, après quoi de nouvelles cellules se différencient, repeupler la membrane basale lésé et à rétablir la fonction du site lésé. Alternativement, d'autres études ont suggéré que les cellules de remplacement proviennent de cellules souches / progénitrices qui résident dans les tubules de néphrons. En ce qui concerne le processus de neonephrogenesis chez le poisson zèbre, les agrégats cellulaires ont été observés AKI suivante par injection de gentamicine ^29,30. Ces agrégats maturité plus tard dans de nouveaux néphrons qui sondent en tubules ^29,30 existants. Le fil conducteur qui unit néphron épithéliale régénération et neonephrogenesis est leur facteur de mystère pure: à l'heure actuelle il ya exponentiellement plus de questions sur la façon dont ces exploits se produit une régénération qu'il n'y idées disponibles.

À ce jour, cependant, plusieurs lignes intéressantes de données appuient l'idée que la recherche de la régénération rénale en utilisant le poisson zèbre peut en effet fournir des indications pertinentes comparables en AKI humain qui peut aussi avoir directement translation potentiel ^56-58. criblage de produits chimiques afin d'identifier de petites molécules qui augmentent la prolifération des cellules souches rénales chez l'embryon de poisson zèbre a récemment conduit à l'identification de la -butanoate inhibiteur de l'histone déacétylase de méthyl-4-(phénylthio) (m4PTB) ^56,57. L'administration de ce composé pour les larves de poisson zèbre avec AKI la gentamicine a révélé que la survie des larves augmente et que la prolifération tubulaire rénale a été renforcée ^56,58. Lorsque les souris modérée AKI induite par l'ischémie ont été traités avec m4PTB, leur récupération a été accélérée dans association avec une réduction à la fois et l'atrophie tubulaire cycle cellulaire arrêt de la prolifération des cellules des tubules rénaux ^58. Ces résultats suggèrent que les voies responsables pour le développement normal du poisson zèbre rénale et / ou la réponse régénérative à AKI seront conservées avec les mammifères ^56.

Ainsi, tandis que d'autres études sont nécessaires pour démêler les mécanismes de régénération, à savoir d'identifier les voies de signalisation qui sont impliqués et de comprendre leur interaction-le poisson zèbre offre une avenue prometteuse pour poursuivre cet objectif important dans le domaine de la néphrologie. Des outils tels que les étiquettes de cellules néphron décrites dans ce protocole constituent un groupe de tests qui peuvent être utilisés pour évaluer la composition rénale et la fonctionnalité des modèles AKI. En outre, ils peuvent être appliqués à caractériser des modèles transgéniques de la maladie rénale et peuvent fournir des moyens pour identifier les agents thérapeutiques chimiques capables de promouvoir la restauration de la structure de barrage après néphron rénalâge.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X PBS			Made by diluting 10 X PBS in distilled water.
1X PBST			0.1% Tween-20 detergent in 1 X PBS.
1X PBS with 0.05 % Tween			0.05% Tween-20 detergent in 1 X PBS.
Tween 20	American Bioanalytical	AB02038
4% PFA/1X PBS			Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20°C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.
Fine Forceps	Roboz	RS-1050	Dumont Tweezers Pattern #55
Glass slide	Thermo-Fisher	4445	White Frost
Glass coverslip	Thermo-Fisher	12-540A	18 x 18 mm
Modeling clay	Hasbro	Playdoh	Other modeling clays can be substituted and work similarly
Slide holder	Thermo-Fisher	12-587	Optional: cardboard tray to store slides flat
Bleaching solution			Bleach mix formula (for a 20 ml solution): 1.6 ml of 10% Potassium hydroxide solution 0.6 ml of 30% Hydrogen peroxide solution 100 μl of 20% Tween Fill to 20 ml with distilled water
Potassium hydroxide	Sigma	221473
Hydrogen peroxide	Sigma	H1009
Blocking solution			Blocking Solution (for a 10 ml solution): 8 ml of 1X PBS with 0.05% Tween 2 ml of fetal calf serum 150 μl of DMSO
Alkaline phosphatase activity detection	Invitrogen	E6601	We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.  To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer's instructions.
Alkaline phosphatase wash solution			Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 ml solution): 5 ml of 0.5 M EDTA 120 mg of Levamisole 95 ml of 1X PBS
Dextran, fluorescein, 40,000 MW	Invitrogen	D1844	Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, cascade blue, 10,000 MW	Invitrogen	D1976	Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW	Invitrogen	D1825	Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW	Invitrogen	D1817	Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine	Vector laboratories	RL-10-32	DBA Staining Solution (for a 100 μl solution): 1 μl of DBA 99 μl of 1X PBS
Propidium iodide	Invitrogen	E6601
DAPI	Invitrogen	P1304MP
Vectashield hard set mounting medium	Vector laboratories	H-1400
Micro cover glass	VWR	48393081
Dimethyl sulfoxide, DMSO	American Bioanalytical	67-68-5
Sucrose	Sigma	S0289
EDTA, 0.5 M solution, pH 8.0	American Bioanalytical	AB00502
Levamisole	Sigma	L-9756
Tissue freezing medium	Triangle Biomedical Sciences, Inc.	TFM-C
Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10 x 10x 5 mm	Sakura Finetek	4565
TruBond 380 adhesive microscope slides	Tru Scientific	0380W
Liquid blocker – super PAP pen	Electron Microscopy Sciences	71312
Immuno stain moisture chamber	Evergreen Scientific	240-9020-Z10
Cryostat	Therm	Microm™ HM 525 Cryostat
Stereomicroscope	Nikon	SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC	Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.
Compound microscope	Nikon	96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red	Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.