Análisis de Composición Nephron y función en el riñón adultos de pez cebra

Summary

El riñón adultos de pez cebra es un sistema excelente para estudios de regeneración y enfermedad renal. Un aspecto esencial de este tipo de investigación es la evaluación de la estructura y función de nefronas. Este protocolo describe varios métodos que se pueden aplicar para evaluar la composición de túbulos nefrona y para evaluar la reabsorción renal.

Abstract

El modelo de pez cebra se ha convertido en un sistema relevante para estudiar el desarrollo del riñón, la regeneración y la enfermedad. Tanto los riñones de pez cebra embrionarias y adultas se componen de unidades funcionales conocidas como nefronas, que son altamente conservadas con otros vertebrados, incluyendo mamíferos. Investigación en el pez cebra se ha demostrado recientemente que los dos fenómenos distintivos transpiran después de nefronas adultos incurren en daños: en primer lugar, hay una regeneración robusta dentro de las nefronas existentes que reemplaza las células epiteliales del túbulo destruidas; segundo, totalmente nuevas nefronas se producen a partir de progenitores renales en un proceso conocido como neonephrogenesis. En contraste, los seres humanos y otros mamíferos parecen tener sólo una capacidad limitada para la regeneración epitelial nefrona. Hasta la fecha, los mecanismos responsables de estos fenómenos de regeneración renal siguen siendo poco conocidos. Desde riñones pez cebra adultos sufren tanto nefrona regeneración epitelial y neonephrogenesis, proporcionan un párrafo experimental excepcionalparadigma para estudiar estos eventos. Además, existe una amplia gama de herramientas genéticas y farmacológicas disponibles en el modelo de pez cebra que se pueden utilizar para delinear los mecanismos celulares y moleculares que regulan la regeneración renal. Un aspecto esencial de este tipo de investigación es la evaluación de la estructura y función de nefronas. Este protocolo describe un conjunto de técnicas de etiquetado que se pueden utilizar para medir la composición y la funcionalidad renal nefrona prueba en el riñón adultos de pez cebra. Por lo tanto, estos métodos son ampliamente aplicables para el futuro caracterización fenotípica de los paradigmas de pez cebra adultos lesión renal, que incluyen pero no se limitan a, los regímenes de exposición nephrotoxicant o métodos genéticos de la muerte celular específica, tales como la técnica de ablación celular mediada por nitrorreductasa. Además, estos métodos pueden ser utilizados para estudiar la formación de perturbaciones genéticas en riñón adulto y también podrían aplicarse para evaluar el estado renal durante el modelado de la enfermedad crónica.

Introduction

El riñón es un órgano complejo que cumple con una multitud de funciones fisiológicas en el cuerpo. La función principal del riñón es la excreción de desechos metabólicos, y esta tarea está estrechamente entrelazada con el mantenimiento de la homeostasis de fluidos. El riñón realiza estos trabajos mediante el filtrado de la sangre y la formación de la orina, mientras que concomitantemente regulación de la presión arterial, los niveles de electrolitos y el equilibrio ácido-base. Túbulos epiteliales altamente especializadas, llamadas nefronas sirven como unidad funcional básica del riñón ^1,2. En los vertebrados adultos, nefronas se organizan típicamente en una disposición en espiral que rodea herméticamente un sistema de drenaje centralizada, permitiendo así que para muchos túbulos tapen la bastante pequeño órgano. Por ejemplo, cada riñón humano puede contener más de 1 millón de nefronas ^3. Otros mamíferos como el ratón son en el orden de 8 a 10.000 nefronas por riñón ^4. El grado de complejidad renal difiere entre estos mamíferos y otros vertbrados debido a las variaciones en el número total de nefronas y su diseño arquitectónico dentro del riñón. Especies de vertebrados forman hasta tres estructuras renales sucesivas durante el desarrollo, y cada formulario muestra el aumento de la complejidad en lo que respecta a la dotación de nefronas y disposición: los pronefros, mesonefros y metanefros. La última estructura renal que deben conservarse sirve como el riñón adulto órgano-típicamente un mesonefros o un metanefros ^2. Cada forma de riñón, sin embargo, tiene una composición basada en nefrona ^2.

La nefrona es el caballo de batalla de los riñones y es responsable de la filtración de la sangre junto con la secreción y reabsorción de metabolitos. Las nefronas son estructuras tubulares simples compuestas de células epiteliales y tienen una organización segmentaria, en el que los dominios discretos, altamente especializadas de los epitelios diferenciados realizar tareas específicas. En el orden del flujo de filtrado a través de las nefronas, normalmente hay tres partes principales que comprise cada unidad: (1) el corpúsculo renal, (2) un túbulo con proximal, intermedio y segmentos distales, y (3) un conducto colector ^1. El túbulo proximal es responsable de la reabsorción de solutos orgánicos, principalmente glucosa y los aminoácidos ^1. El túbulo intermedio (o asa de Henle) es un importante sitio de la sal y el agua la regla ^1. Finalmente, ajuste fino de la sal y otros iones produce en el túbulo distal y el conducto colector y está muy regulada por el sistema endocrino ^1. A partir de ahí, el filtrado viaja a través del uréter y de la vejiga, en última instancia, saliendo el cuerpo como un producto de desecho ^1.

La pérdida de la función renal puede deberse a multitud de causas que impiden la actividad normal de nefronas. Estas causas pueden ocurrir durante el desarrollo del riñón, por ejemplo, defectos congénitos que llevan a la malformación de nefronas ⁵ o causas de los diferentes tipos de lesiones (derivada de tanto genéticos como environmeorígenes NTAL). Lesiones adquiridas son una categoría como la lesión renal aguda (IRA) o insuficiencia renal crónica (ERC). AKI implica una pérdida abrupta de la función renal, a menudo como resultado de la isquemia o la toxina de exposición ^6,7. En los mamíferos, la reparación del epitelio nefrona es posible después de este tipo de lesiones ^8, y muchas personas presentan la restauración completa de la función renal después de AKI. Sin embargo, AKI también se asocia con una alta morbilidad y mortalidad que se han reportado en un amplio 30 - rango de incidencia del 70% ^6,7. ERC, en cambio, está asociada con la pérdida progresiva de la función renal que resulta de años de daño prolongado, típicamente asociado con la fibrosis ^8,9. Además, existe una interacción entre la IRA y ERC, como cualquiera puede predisponer a un individuo a otro ^10-12. Por ejemplo, aquellos que han sufrido de AKI son más susceptibles a la enfermedad renal crónica e incluso la muerte ^13. La incidencia de la enfermedad renal, tanto en los EE.UU. y en todo el mundo, ha alcanzado epideproporciones de micrófono y se prevé que aumentará a medida que la población de edad se amplía-por lo tanto hay una necesidad creciente de identificar intervenciones de medicina regenerativa para el riñón ^14,15.

A pesar del conocimiento de que los pacientes con LRA pueden recuperar, por mucho tiempo se ha pensado que el riñón es un órgano sin poderes regenerativos innatas. Esta visión tradicional ha sido revisado de manera espectacular en los últimos años ^16. Los estudios que investigan el daño renal en ratones y ratas después de la IRA han demostrado que las células epiteliales de los túbulos nefrona pueden proliferar y reconstruir nefronas funcionales ^17-20. Aunque los mamíferos poseen esta capacidad de adaptación para regenerar nefronas, existen limitaciones notables y las respuestas de mala adaptación puede ser desencadenados que conducen a la fibrosis renal y ERC ^21. Por ejemplo, un estudio reciente demostró que la ablación repetida de células epiteliales en nefronas murinos se asoció con la regeneración disminuida y fibrosis nefronas renales HAV-sugiriendoea limita umbral de regeneración ^22. No hay evidencia de que el riñón de mamíferos adultos forma nuevas nefronas para reemplazar los perdidos o dañados, por lo tanto su destrucción conduce a un déficit de ^8,9 nefrona permanente. Curiosamente, algunos vertebrados responden a AKI por la regeneración de los epitelios de nefronas y también la producción de nuevas nefronas, un proceso conocido como neonephrogenesis o nefrona neogénesis ^23. Neonephrogenesis ocurre en los peces después de la exposición a tóxicos o resección parcial y modelos de lesión históricamente han incluido los peces de colores ^24,25, tilapia ^26, patín ^27, medaka ^28, y más recientemente, el pez cebra ^29,30. De éstos, el pez cebra proporcionar un modelo de investigación genética viable para descubrir las vías celulares y moleculares responsables de la regeneración renal.

En este artículo de vídeo, nos demuestran cómo etiquetar los segmentos de la nefrona en el pez cebra adulto. El conocimiento de la anatomía de nefronas, las características moleculares,y las características funcionales son esenciales para los estudios renales futuros exitosos utilizando el pez cebra. El riñón adultos de pez cebra es una estructura mesonefros y es inherentemente menos complejo en cuanto a número de nefronas y organización de la estructura metanefros se encuentra en los mamíferos adultos, aves y reptiles ^31. Sin embargo, la organización del segmento de nefronas pez cebra es análogo a los mamíferos, y se documentó por primera vez en el riñón de embriones en base a estudios de expresión génica ^31-35. Nefronas embrión de pez cebra contienen segmentos lineales tubulares que incluyen el túbulo contorneado proximal (PCT), túbulo proximal recto (PST), distal temprana (DE), y distal tardía (DL) ^31-35 (Figura 1). Nefronas adultos de pez cebra poseen segmentos tubulares similares ^30,31,36,37 (Figura 1). El PCT también se puede identificar por un fenotipo funcional: las células epiteliales en la PCT incorporarán compuestos de dextrano marcados con fluorescencia (10-70 kDa en tamaño) presentes en elcirculación, que se ha utilizado tanto en el pez cebra riñón embrionarias y adultas para evaluar la captación endocítica por estas células del túbulo proximal ^38-41 (Figura 1). Una de las diferencias en los segmentos de la nefrona entre el pez cebra y mamíferos es que el pez cebra carecen de un túbulo intermedio o asa de Henle ^30-37; ya que este segmento funciones en los mamíferos para conservar el agua, y el pez cebra son una especie de agua dulce, sin la urgencia de concentrar la orina, no es de extrañar que el pez cebra carecen de este segmento de ^32,33. Así, la composición global nefrona se conserva en gran medida entre el pez cebra y el riñón de los mamíferos ^32,33. Estas similitudes han permitido pez cebra a ser una herramienta de investigación eficaz para investigar las funciones de los genes renales-expresado durante nefrogénesis desarrollo ^32-35,42 y modelar numerosas enfermedades renales ^43,44, lo que añade a la lista sustancial de las condiciones humanas que pueden ser investigado utilizandopez cebra ^45,46.

Hoy en día, el riñón adultos de pez cebra es un modelo atractivo para los estudios comparativos de la regeneración renal debido a su maleabilidad genética y el paladar expansión de los recursos tecnológicos disponibles para interrogar a la función de genes y vías de señalización en esta especie. Varios estudios han utilizado el mesonefros pez cebra para investigar los mecanismos de regeneración después de AKI ^29,30,37. Para continuar la investigación AKI usando el riñón adultos de pez cebra, es esencial disponer de métodos exquisitos para etiquetar las diferentes regiones y métodos nefrona para estudiar la funcionalidad de nefronas. Existen varios métodos para el análisis de riñón adulto han sido adaptados de los protocolos de riñón embrionario. La inyección intraperitoneal de dextrano marcado con fluorescencia en el pez cebra adultos etiqueta el epitelio PCT en mesonefros nefronas a través de endocitosis ^30, como en embriones de pez cebra ^38-41 (Figura 1). Este método ha sido utilizado para visualize cuando los túbulos proximales a recuperar su propiedad reabsorbiendo siguiente AKI, que permite una evaluación de la función fisiológica restaurado ³⁰ (Figura 1). Otra característica de la nefrona túbulo proximal es que las células epiteliales en este segmento poseen un borde en cepillo ³⁷ que muestra altos niveles de actividad de la fosfatasa alcalina endógena. Por lo tanto, el epitelio proximal puede ser localizada visualmente en el riñón pez cebra adultos usando una técnica basada en la fluorescencia conocido como elfo (marcado con enzima-Fluorescencia) -97 ^47.

Aquí se describe cómo llevar a cabo ensayos de absorción de dextrano fluorescentes ^30,48 en el riñón adultos de pez cebra, a fin de obtener una evaluación funcional del túbulo proximal y mapear el tamaño y los contornos de este segmento tubular. A continuación, se describen las técnicas para etiquetar las regiones del túbulo proximal de la nefrona adulto con la etiqueta fluorescente fosfatasa alcalina. En tercer lugar, se muestra por primera vez que el rodioamina marcada con lectina aglutinina Dolichos biflorus (DBA), que se ha utilizado como un marcador general de los conductos colectores en el riñón de los mamíferos ^49, marca los túbulos distales del riñón adultos de pez cebra. Como DBA es mutuamente exclusivo a la tinción de fosfatasa alcalina, estas etiquetas proporcionan una manera de distinguir ampliamente pan-proximal frente tramos pan-distales de la nefrona adultos de pez cebra. A lo largo de la ejecución de estas manchas fluorescentes en toda ambas montura y secciones histológicas de criostato, relacionamos estas etiquetas con dominios de expresión de genes transportadores de soluto que identifican de forma única cada segmento de la nefrona. Por lo tanto, este protocolo también contiene una guía de los procedimientos de procesamiento de tejidos modificados para tejido adulto todo el montaje hibridación in situ (DESEO) el análisis basado en el protocolo DESEO embrión ^50. Estos procedimientos se pueden utilizar en diversas combinaciones (Figura 2) para documentar atributos morfológicos y funcionales of adultos nefronas renales pez cebra. Por lo tanto, estos protocolos se pueden aplicar a estudios de regeneración, la caracterización fenotípica de otros modelos de enfermedades renales, e incluso utilizarse para estudiar la formación del riñón adulto.

Protocol

Los procedimientos para trabajar con el pez cebra se describe en este protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Notre Dame. Nota: Una guía para el riñón y nefrona anatomía en el pez cebra se proporciona (Figura 1). Una visión general de los métodos descritos en este protocolo se proporciona como un diagrama de flujo (Figura 2) para ilustrar cómo los procedimientos de etiquetado múltiple se puede realizar en la misma muestra de riñón. Para la parte 7 en la preparación DESEOS para estudios renales de adultos, los pasos que se indican aquí cómo modificar el tratamiento de los embriones de pez cebra, según lo publicado recientemente ^50, para proporcionar una guía técnica para el análisis DESEO éxito del órgano renal.

1. adultos de pez cebra inyección intraperitoneal con dextrano de Interés

1. Preparar el dextrano marcado con fluorescencia de stock deseada (s) disolviendo el polvo de dextrano en agua destilada a una concentraciónde 50 mg / ml, a continuación, almacenar alícuotas en tubos de microcentrífuga a -20 º C en la oscuridad. Nota: Varios dextranos marcados con fluorescencia están disponibles comercialmente. Seleccione el dextrano para uso basado en la combinación de otras etiquetas que se desean, y asegúrese de que los filtros fluorescentes apropiados están disponibles con los microscopios que se utilizarán. Dextranos-Lisina fixable muestran fluorescencia sin pasos adicionales de etiquetado de muestras de vida, muestra de tejido suelta de ejemplares sacrificados, y las muestras fijadas.
2. Descongele el dextrano de stock deseado y almacenar en hielo en la oscuridad mientras realiza los pasos 1.3-1.5. Envuelva el tubo de microcentrífuga en papel de aluminio para protegerlo de la luz durante la manipulación.
3. Anestesiar a un pez cebra adulto entre 5-7 meses de edad, colocando el pescado en un plato que contenía 0,02% tricaína o 0.001% de 2-fenoxietanol aproximadamente 1 - 2 min. Nota: Es preferible usar pez cebra adulto de este rango de edad, porque los peces más jóvenes pueden tener small riñones que son difíciles de diseccionar, y muestras de riñón de peces viejos pueden contener las masas de tejido cicatricial que no pueden ser analizados. Cuando anestesiado adecuadamente, el pez cebra adultos no exhiben una respuesta al tacto estimulación, que puede ser probado mediante el uso de una cuchara o sonda roma a tocar suavemente la aleta caudal de los peces.
4. Usando una cuchara de plástico, levante el pescado del plato, se decanta la solución y coloque cuidadosamente el animal en un molde esponja húmeda, ventral hacia arriba.
5. El uso de un 31 G 1.0 cc jeringa de insulina, inyecte 20 l de solución de dextrano descongelado en el espacio intraperitoneal. Orientar la aguja de modo que la inserción se produce en un ángulo de poca profundidad en la línea media ventral del abdomen. Para evitar perforar órganos, insertar la aguja a continuación, elevarlo ligeramente con el fin de levantar la pared del cuerpo de los peces y crear un espacio en el que para inyectar la solución de dextrano ^48. Nota: Alternativamente, el stock de dextrano se puede diluir, por ejemplo, en una proporción de 1: 2 o 2: 1 (dextrano: disagua destilada), para reducir la fluorescencia de fondo en la muestra.
6. Volver suavemente el pescado al tanque para permitir la recuperación de la anestesia. Nota: La captación de dextrano por el segmento de túbulo proximal se produce entre 8 - 12 horas y se puede detectar por lo menos hasta 3 días después de la inyección (dpi). El análisis a 3 dpi proporciona una fuerte señal túbulo con baja fluorescencia de fondo en las poblaciones estromales renales. Continúe con la Parte 2 para toda examen monte de captación de dextrano solo, si no se desea un etiquetado adicional. Para el etiquetado combinatorio, continúe con la Parte 3 para preparar el tejido para su examen conjunto de montaje de la captación de dextrano, a continuación, la parte 4 a doble etiqueta con fosfatasa y / o la parte 5 alcalina, para realizar doble DBA o triple etiquetado. Para la investigación usando las secciones histológicas, continúe con la parte 6 para recibir instrucciones sobre cómo hacer finas secciones del riñón usando un criostato y cómo manchar estos con diferentes etiquetas y / o inmunohistoquímica con antib primaria y secundariaodies.

2. Disección y Flat Preparativos del riñón adultos de pez cebra de una muestra de animales Unfixed visualizar fluorescente dextrano etiquetado del túbulo proximal

1. La eutanasia el adulto pez cebra dextrano inyectado colocándolo en un plato con 0,2% Tricaína pH 7,0 durante 4 - 5 min. Nota: Asegúrese de que el pescado ha sido sacrificado antes de continuar, controlando cuidadosamente si las branquias han cesado el movimiento y el corazón ha dejado de latir ^36.
2. Usando una cuchara de plástico, levante el pescado de la solución tricaína, se decanta la solución y colocar al animal en un pañuelo o toalla de papel.
3. Use un par de tijeras afiladas de disección para realizar un corte detrás del opérculo branquial y quitar de la cabeza.
4. Inmediatamente abrir el cuerpo de los peces con las tijeras de disección haciendo una incisión ventral de largo desde la cabeza hasta la base de la aleta caudal.
5. Retire los órganos internos de los peces utilizando un par de pinzas finas.
6. Use agujas de disección super-finas al pin abierta las paredes del cuerpo con el fin de permitir la visualización del órgano del riñón, que es adherente a la pared dorsal del animal.
7. Utilice unas pinzas finas para separar el riñón de la pared dorsal.
8. Coloque suavemente el riñón en un vial de vidrio de 5 ml que contiene 1X PBS y lavar 3 veces con 3 - 5 ml de 1X PBS fresco durante 5 minutos cada uno. Nota: El uso de un vial de vidrio para la manipulación de muestras de riñón adultos facilita la visualización de los tejidos y permite lavados con volúmenes grandes (en relación con la masa de tejido) de aproximadamente 3 - 5 de ml. Alternativamente, un 12-así placa de cultivo celular se puede utilizar. Mientras que un tubo de microcentrífuga de plástico se podría usar, los tubos de tamaño estándar (1,5 ml) podrían restringir el lavado.
9. Retire el riñón con una pipeta de transferencia y el lugar en un portaobjetos de vidrio limpio con 1-2 gotas de 1X PBS.
10. Utilice unas pinzas finas para aplanar el riñón en la diapositiva, asegurándose de no tejido ha encrespado o de otro modo volcadosobre sí mismo. Nota: Alternativamente, una herramienta de alambre de tungsteno puede ser utilizado para hacer pequeñas incisiones en el tejido conectivo para facilitar el posicionamiento plana del riñón.
11. Coloque pequeños trozos de plastilina en cada esquina de un cubreobjetos mm de vidrio de 18 x 18, que figura lentamente el cubreobjetos sobre el riñón. Nota: Un poco ángulo del cubreobjetos durante la colocación para minimizar atrapar burbujas de aire en la solución ^50. Las chuletas de modelado de arcilla son de aproximadamente 2 mm de diámetro (Figura 2A). Alternativamente, chuletas de grasa de vacío pueden estar sustituidos en lugar de la arcilla de modelar. Añadir una caída adicional de 1X PBS para llenar el espacio entre el cubreobjetos y portaobjetos de vidrio si es necesario.
12. Observe y / o la imagen del riñón colocando el portaobjetos de vidrio en el campo de vista en un microscopio estereoscópico o compuesto con el filtro adecuado. Nota: Consulte la Figura 2A para el aspecto macroscópico de esta preparación.

3. Fixación, Disección, permeabilización y eliminación de la pigmentación del riñón adultos de pez cebra

1. Prepare una solución de fijación fresco del 4% de paraformaldehído (PFA) / 1X PBS / 0,1% de DMSO o descongelar una alícuota congelada de 4% PFA / 1 X PBS y añadir 0,1% de DMSO. Precaución: PFA es tóxico y soluciones de PFA debe ser manejado en una campana química mientras usa el equipo de protección personal adecuado, incluyendo guantes y una bata de laboratorio. Además, el polvo de PFA debe ser manejado con cuidado al tomar la solución madre.
2. Llene una bandeja de disección con solución fijadora suficiente para sumergir todo el animal.
3. La eutanasia y montar el pez cebra seleccionado en solución de fijación (consulte los puntos 2.2 a 2.6). Nota: El pescado seleccionada puede ser una muestra de riñón de pez cebra no tratados, o un riñón aislado de un pez cebra que anteriormente recibió una inyección intraperitoneal de dextrano (Parte 1).
4. Fijar la muestra O / N (12 - 16 horas) a ^{4 °} C.
5. Al día siguiente, utilice unas pinzas finas para cuidarseparar completamente el riñón de la pared dorsal del cuerpo y colocar el órgano en un vial de vidrio usando una pipeta de transferencia. Nota: Como alternativa, una de 12 pocillos o de 24 pocillos placa de cultivo se puede utilizar. Mientras que un tubo de microcentrífuga de plástico se podría usar, los tubos de tamaño estándar (1,5 ml) podrían restringir el lavado.
6. Lavar el riñón diseccionado 3 veces con 3 - 5 ml de 1X PBS con 0,05% de Tween durante 5 minutos cada uno.
7. Retire el PBS 1X con 0,05% de Tween y enjuague el riñón con 3 ml de una solución de sacarosa al 5% (en 1X PBS) durante 30 min.
8. Reemplace con 3 ml de solución de sacarosa al 30% (en PBS 1X) y tienda de O / N (12 - 16 horas) a ^{4 °} C. Nota: Las soluciones de sacarosa permeabilizar las membranas celulares, permitiendo posteriormente etiquetado específico de los reactivos a medida que penetran el tejido.
9. Al día siguiente, eliminar la solución de sacarosa al 30% y lavar el riñón 2 veces con 5 ml de 1X PBS con 0,05% de Tween durante 5 minutos cada uno.
10. Vuelva a colocar la PBS 1X con 0,05% de Tween con 3 -5 ml de solución de blanqueo para eliminar la pigmentación de los melanocitos presentes en el órgano del riñón.
11. Coloque vial de vidrio en un rotador y observar cuidadosamente como pigmentación desaparece. Nota: La despigmentación suele durar aproximadamente 20 minutos cuando se realiza después del tratamiento sacarosa, pero en ocasiones puede llegar a tardar hasta 60 minutos. Si la solución de blanqueo se deja en el riñón durante demasiado tiempo, la desintegración del órgano puede ocurrir; se aconseja vigilar la muestra cada 10-15 minutos para comprobar la integridad del tejido.
12. Cuando la pigmentación se ha eliminado desde el riñón, lavar dos veces con 3 - 5 ml de 1X PBS con 0,05% de Tween.
13. Vuelva a colocar la PBS 1X con 0,05% de Tween con 3 - 5 ml de solución de PFA 4% durante 1 hora a temperatura ambiente.
14. Eliminar la solución de PFA 4% y lavar el riñón 3 veces con 3 - 5 ml de 1X PBS con 0,05% de Tween durante 5 minutos cada uno. Nota: Una vez que la fijación es completa, el riñón también se puede montar en un portaobjetos de vidrio y se evaluó para absorción de dextrano sans la PIGM melanocitosentación, realizando los pasos 2.8 a 2.12.
15. Retire el PBS 1X con 0,05% de Tween y reemplazar con 3 - 5 ml de solución de bloqueo, a continuación, se incuba el riñón a RT en el bloque durante 2 horas.
16. Cuando el bloqueo se ha completado, proceder directamente a la tinción de protocolo seleccionado. Nota: El riñón puede ahora ser procesada a través de uno o más de otros procedimientos para llevar a cabo estudios de marcaje con diferentes reactivos. Para toda etiquetado monte del túbulo proximal con sólo fosfatasa alcalina, proceda a la Sección 4. Para toda etiquetado monte de sólo el túbulo distal vaya a la Sección 5. Alternativamente, las secciones 4 y 5 se pueden realizar en sucesión lineal para la detección dual en todo el montaje .

4. Titulación de riñón adulto segmentos proximal del túbulo con alcalina detección de fosfatasa

1. Retire el bloque y lavar el riñón 3 veces con 3 - 5 ml de 1X PBS con 0,05% de Tween durante 5 minutos cada uno, y luego vuelva a colocar la PBS 1X con 0,05% de Tween con 3-5 mlde 1X PBS. Deje que el riñón en remojo durante al menos 10 min. Nota: Durante este tiempo, transferir el riñón a una de 12 pocillos o de 24 pocillos placa de cultivo si el tejido se ha mantenido en un vial de vidrio de pasos de procesamiento anteriores.
2. Vuelva a colocar la PBS 1X con la solución de sustrato de fosfatasa alcalina de trabajo suficiente (Consulte kit de detección situada en la Tabla de Materiales) para cubrir la muestra, a continuación, colocar la muestra en un aparato rotatorio durante 30 minutos a temperatura ambiente. Mantenga la muestra protegida de la luz.
3. Detener la reacción lavando el riñón en la solución tampón de lavado fosfatasa alcalina.
4. Enjuague el riñón con 3 cambios de solución tampón de lavado más de 10 - 15 min. Nota: Después de este paso, vaya directamente a la parte 5, Paso 5.1 (por lo tanto omitir temporalmente Pasos 04.05 a 04.06), si se desea también etiquetado con DBA. Paso opcional: Para etiquetar y visualizar los núcleos de células en el órgano, empape el riñón en solución de yoduro de propidio. Preparar una acción de yoduro de propidio disolviendo el polvo a una concentraciónción de 1 mg / ml (1,5 mM) en agua destilada. Diluir el stock hasta 500 nM en 2X SSC y se incuba el riñón en esta solución durante 30 min. Enjuague con 1X PBS y vaya al paso 4.5.
5. Retire la solución tampón de lavado y montar el riñón en un portaobjetos de vidrio limpio en el medio de montaje fosfatasa incluido en el kit de marcaje (Consulte los puntos 2.9 a 2.12). Nota: El medio de montaje ha sustituido a la PBS 1X desde el paso 2.9.
6. Visualice la fosfatasa alcalina manchado riñón usando un microscopio estereoscópico o compuesto con un conjunto de filtros / DAPI, Hoechst. Nota: Paso opcional: Visualice el yoduro de propidio usando una rodamina-tetrametil (TRITC) o Texas filtro rojo.

5. Delimitar el riñón adulto segmentos distales del túbulo con Rodamina DBA

1. Preparar una solución de trabajo DBA 200 l por dilución de DBA (2 mg / ml) 1: 100 en PBS 1X.
2. Vuelva a colocar la PBS 1X con solución de Tween al 0,05% con la solución de DBA 200 l.
3. Coloque el rotor para1 hora a TA.
4. Eliminar la solución de DBA y lavar el riñón 3 veces con 3 - 5 ml de 1X PBS durante 5 minutos cada uno. Nota: Paso opcional: Para etiquetar y visualizar los núcleos de células en el órgano junto con la etiqueta de DBA, empape el riñón en solución de DAPI para detectar con un / filtro de DAPI, Hoechst (rodamina DBA mancha puede ser detectado con un TRITC o Texas filtro rojo). Preparar una acción DAPI disolviendo polvo a una concentración de 5 mg / ml (14,3 mm). Diluir el stock hasta 300 nM en 2X SSC y se incuba el riñón en esta solución durante 20 min. Enjuague con 1X PBS y vaya al paso 5.5. Si la Parte 4 de procesamiento se ha realizado, tenga en cuenta que DAPI y fosfatasa alcalina se detectan tanto con un filtro / DAPI, Hoechst.
5. Retire el PBS 1X y montar el riñón en un portaobjetos de vidrio limpio (consulte los pasos 2.9 a 2.12).
6. Visualice los segmentos distales DBA-manchada del riñón utilizando un filtro rojo estándar TRITC o Texas situado en un microscopio estereoscópico o compuesto microscopio de fluorescencia. Nota: s opcionalestep: Visualice el DAPI utilizando un filtro / DAPI, Hoechst.

6. incrustación, cryosectioning y colorante (colorantes vitales y inmunohistoquímica Etiquetado) de adultos de pez cebra riñón Tissue

1. Seleccione peces para su análisis, a continuación, la eutanasia, corregir y permeabilizar como se describe (Pasos 3.2 a 3.8). Nota: Fijar peces adultos en 9: 1 de etanol: formaldehído / 0,1% de DMSO en lugar de 4% de paraformaldehído / 1X PBS / 0,1% de DMSO para el procedimiento cryosection para producir secciones de dextrano, fosfatasa alcalina, y la visualización DBA. Sin embargo, tenga en cuenta que las fijaciones a base de paraformaldehído pueden ser compatibles para algunos procedimientos de inmunohistoquímica. Además, no es necesario el blanqueo del riñón adulto para el análisis criosección, debido a que los melanocitos son superficiales y no afectan a la visualización de las células de la nefrona que componen el "interior" del órgano renal.
2. Al día siguiente, eliminar la solución de sacarosa al 30% y reemplazar con 1: 1 tejido medio de congelación: 30% sucrose durante 4 horas a RT.
3. Retire la solución 1: 1 e incrustar muestras de riñón en tejido 100% congelación en criomoldes medio y lugar a -80 ^{º C} durante al menos 1 hora.
4. Transversalmente cortar secciones en serie, de aproximadamente 12 m de espesor, a través de todo el riñón adulto.
5. Montar cryosections congelados en portaobjetos de microscopio adhesivas y dejar secar al aire durante 1 hora a ⁵⁰ ° C.
6. Tienda desliza a -80 ^{º C} hasta su uso.
7. Cuando cryosections están listos para ser etiquetados, retire el portaobjetos de -80 ^o C y colocarla sobre el portaobjetos más caliente a 50 ^{º C} durante 45 min.
8. El uso de un bolígrafo bloqueador líquido, dibujar un círculo alrededor de los cryosections y dejar secar durante 15 minutos en la diapositiva más caliente a ⁵⁰ ° C.
9. Retirar los portaobjetos de la diapositiva más caliente y colocar plana en una cámara húmeda a temperatura ambiente.
10. Rehidratar los cryosections mediante la adición de 1X PBS con 0,05% de Tween a la parte rodeada de los portaobjetos durante 20 min. Nota: Aproximadamente 200 a 300 y# 956; l se necesita para cubrir cada parte rodeada en un portaobjetos.
11. Vuelva a colocar la PBS 1X con solución de Tween al 0,05% con 1X PBS fresco y se incuba durante 10 min.
12. Eliminar 1X PBS e incubar cryosections en una solución de bloqueo durante 2 h. Nota: Para obtener unos 10 ml de solución de bloqueo, combine 8 ml 1X PBS con 0,05% de Tween, 2 ml de suero fetal bovino y 150 l de DMSO. Para llevar a cabo la inmunohistoquímica después de la etapa de bloqueo, Incubar el portaobjetos con el anticuerpo primario diluido en fresco deseado bloque de O / N a ^{4 °} C, lavar una vez usando 1X PBS con 0,05% de Tween, se incuba durante 2 hr a RT con solución de anticuerpo secundario diluido en 1X PBS con 0,05% de Tween, lavar una vez usando 1X PBS con 0,05% de Tween, y montar un cubreobjetos sobre el portaobjetos con medio de montaje. Las diluciones de anticuerpos requeridos variarán y los ensayos deben realizarse para seleccionar las diluciones óptimas. La recuperación de antígenos también puede facilitar immunolabeling, y se realiza antes de bloquear. Inmediatamente después de las diapositivas se descongelaron a 50 ^o C(Paso 6.8) incubar los cryosections entre 95 ^{º C-100 º C} durante 40 minutos en tampón de citrato de sodio 10 mM precalentado. Enfriar los portaobjetos durante 30 minutos, luego se lava dos veces en 1X PBS con 0,05% de Tween, y continúe con el paso 6.11.
13. Eliminar la solución de bloqueo y lavar cryosections 3 veces con 1X PBS durante 5 minutos cada uno.
14. Reemplazar 1X PBS con solución de tinción DBA y se incuba durante 1 hr. Nota: Diluir 1 l DBA en 99 l de 1X PBS para hacer una solución de tinción de 100 l.
15. Retire la solución de tinción y lavar DBA cryosections 3 veces con 1X PBS durante 5 minutos cada uno.
16. Aplique la etiqueta de fosfatasa alcalina e incubar en cryosections durante 10 min.
17. Lavar la fosfatasa alcalina frente a las secciones criogénicas con una serie de 3 lavados de tampón de lavado durante 10 min cada uno. Nota: Para obtener una solución de tampón de lavado 100 ml, se combinan 5 ml de EDTA 0,5 M y 120 mg de levamisol en 95 ml de 1X PBS. Para etiquetar núcleos, incubar las secciones con yoduro de propidio o DAPI en la diluciones se ha señalado anteriormente (Pasos 4.4, 5.4, respectivamente) durante 30 min a RT. Seleccionar un tinte nuclear compatible con la combinación de otras manchas fluorescentes que se han elegido.
18. Quite todo el líquido de los cryosections y coloque 2 gotas de medio de montaje en portaobjetos de microscopio.
19. Con cuidado, coloque el vidrio micro cubierta en el portaobjetos de un microscopio. Criosecciones están ahora listos para la imagen con el filtro (s) apropiada.

7. Procesamiento DESEOS para adultos de pez cebra renales Muestras

1. Seleccione el espécimen de pez cebra deseados (s), la eutanasia, fijar y diseccionar el riñón como se describe (Pasos 3.1 a 3.5). Nota: Es imprescindible el uso de una solución de fijación de 4% de paraformaldehído (PFA) / 1X PBS con 0,1% de DMSO para permeabilizar el riñón. Coloque el riñón en un vial de vidrio para facilitar la visualización durante etapas de procesamiento posteriores.
2. Retire el fijador y lavar el riñón dos veces con 5 ml de 1X PBST.
3. Retire el PBS 1X y lavar el riñón wi dos vecesº 100% de metanol, a continuación, se incuba el riñón a -20 ^{° C} durante al menos 20 min para permeabilizar. Nota: disecado riñones se pueden almacenar indefinidamente ^-20 ° C.
4. Rehidratar el riñón mediante la realización de una serie de 5 min lavados con 3 - 5 ml de metanol al 50% / 1X PBST, 30% de metanol / 1X PBST, y dos veces con 1X PBST.
5. Bleach el riñón para eliminar la pigmentación como se describe (Pasos 03.10 a 03.14).
6. Tratar el riñón con 10 mg / ml de proteinasa K / PBST 1X con 0,1% de DMSO durante 20 min, luego enjuague dos veces con 1X PBST y después de la corrección en PFA al 4% / 1X PBST durante 20 min a O / N. Nota: Siempre preparar la solución de proteinasa K a trabajar inmediatamente antes de la digestión de la muestra mediante la combinación de 50 l de proteinasa K recién descongelado de stock (10 mg / ml), 50 ml de 1X PBST, y 50 l de DMSO.
7. Procesar el riñón para DESEO simple o doble, siguiendo los pasos de síntesis ribosonda, prehibridación, la hibridación, anti-digoxigenina / incubación del anticuerpo anti-fluoresceína y detección como recientemente descrito ^49. Nota: Todo el montaje de imágenes de las manchas de riñón se debe realizar dentro de varios días de la realización de la reacción de tinción. Manchas Nephron tienden a desaparecer muy rápidamente, especialmente las etiquetas de sustrato rojos. Para nefrona fotografía, plana montar la muestra de riñón como se describe más arriba en los pasos 2.10 a 2.12, y la imagen utilizando un microscopio estereoscópico o compuesto. Filtros de contraste diferencial de interferencia se pueden emplear para visualizar mejor los contornos celulares de nefronas para facilitar el análisis de la muestra.

Representative Results

Cada uno de los protocolos se realizó en el pez cebra de tipo salvaje. Ejemplos de los datos obtenidos documento la composición estructural normal y propiedades de las nefronas en el riñón pez cebra adulto sano. El pez cebra adulto posee un mesonefros o segunda forma de riñón que se encuentra en la pared dorsal del cuerpo (Figura 1A). El riñón adulto es relativamente plana y contiene una cabeza llamada, el tronco, y la región de la cola con melanocitos superficiales dispersos por estas regiones (Figura 1A). El tejido renal contiene matrices de nefronas que conectan y drenan en conductos colectores centrales (Figura 1A) ramificado. Cada nefrona está polarizada a lo largo de su longitud, con un filtro de sangre (o corpúsculo renal) en un extremo, seguido por una serie de segmentos tubulares, y por último termina en un conducto que recoge la solución que se excreta (Figura 1A). Cada túbulo nefrona adulto contiene segmentación proximales y distalests de células, delimitadas por la expresión de los transportadores de soluto específicos ^30,31,36,37, que se conserva con el patrón segmentario exhibida por nefronas embrionarias ^31-35 (Figura 1B). Por ejemplo, las transcripciones cubilin marcan el túbulo proximal ³⁹ (PCT y PST) y las transcripciones clcnk marcan el túbulo distal ³² (DE y DL) (Figura 1B). Además, el segmento de PCT se distingue por la expresión de slc20a1a, el PST se distingue por la expresión de slc13a1, el DE se distingue por la expresión de slc12a1, y la DL se distingue por la expresión de SLC12A3 ³²   (Figura 1B). Las diferencias entre los túbulos nefrona adultos en comparación con las embrionarias son que los segmentos distales muestran circunvoluciones (DE, dl) y las ramas del segmento DL ampliamente en el adulto, que es distinto del lineal, no ramificado anatomía de estas regiones en el EMBRyo ^30,31,36,37 (Figura 1A). En ambos adulto y embrionario ^{30 38-41} túbulos nefrona, el epitelio PCT se puede distinguir debido a sus propiedades endocítica y puede ser visualizada y evaluada para la función de reabsorción basado en la capacidad de absorción conjugados de dextrano fluorescentes (Figura 1B). Además, como se demuestra en las figuras siguientes, el túbulo proximal adulto (PCT y PST, o la región pan-proximal) se marca por la fosfatasa alcalina, mientras que el túbulo distal (DE y DL, o la región pan-distal) está marcado por el DBA (Figura 1B). Los métodos utilizados en el presente documento a segmentos de la nefrona pez cebra etiqueta adultos usando la captación de dextrano, fosfatasa alcalina, DBA, inmunohistoquímica o desea se puede realizar en varias combinaciones, en todo el montaje o con cortes histológicos de tejido renal (Figura 2). Esto permite una gran flexibilidad y variedad en la composición de nefronas es que deben evaluarse (Figura 2).

El riñón adulto puede ser montado de plano sobre un portaobjetos de vidrio para el análisis, con los divots de arcilla de modelado (o, alternativamente, grasa de vacío) utilizado para suspender el cubreobjetos sobre el tejido (Figura 3A). Como la longitud de riñón típica es de aproximadamente 5-7 mm, tiene un tamaño propicio para la formación de imágenes en un microscopio estéreo o compuesto (Figura 3A). Bajo iluminación de campo claro, una población superficial de melanocitos pigmentados de negro, puede ser visualizado en asociación con el tejido del riñón, y la vasculatura, tales como la aorta se puede ver debido a que los eritrocitos circulantes tienen una tonalidad roja (Figura 3B). Después de la inyección intraperitoneal de dextrano-FITC, dominios PCT ubicados en todo el mesonefros se sigue con un 3 días más tarde, y la imagen usando un filtro FITC en un microscopio de fluorescencia (Figura 3C). Mientras que los melanocitos ocultan parcialmente la visualización de los túbulos renales individuales (Figure 3C '), los melanocitos no impiden la cuantificación del número de nefronas o la evaluación de diámetro de los túbulos y la longitud. Después de la inyección intraperitoneal de dextrano fluoro-rubí, el blanqueado de la muestra fijada eliminado la pigmentación de los melanocitos, y segmentos del PCT se observaron con la iluminación de campo claro sola (Figura 3D). Gotitas de lípidos de la cavidad corporal abdominal veces se puede ver en asociación con las preparaciones de órganos enteros de riñón (Figura 3A) segmentos .Individual PCT mostrar circunvoluciones, bobinas (Figura 3D '), pero también se pueden caracterizar por tramos relativamente lineales (Figura 3D ").

Diferentes conjugados de dextrano proporcionan diferentes niveles de claridad general en el etiquetado túbulo proximal. En particular, dextrano-FITC o dextrano fluoro-rubí llevó a crujientes etiquetas nefrona con fondo mínimo (Figuras 3C-D "). Tanto el blu cascada dextranoe y Lucifer amarillo conjugados mostraron la captación de túbulo proximal en el riñón adulto (Figura 4A, 4B). Curiosamente, los riñones expuestos a azul cascada dextrano mostraron fluorescencia PCT relativamente específico con un poco de fondo (Figura 4a, 4a '), mientras que los riñones expuestos a amarillo lucifer dextrano habían marcado segmentos PCT pero mostró señal de fondo notable, con tinción fluorescente no específico presente durante todo en el estroma renal, o el espacio entre las nefronas (Figura 4B, 4B '). Por último, el uso de dextrano-fluoro rubí siempre etiquetado túbulo proximal superior, con un mínimo o ningún fondo, incluso cuando se ve en una gama de diferentes aumentos (Figura 4C, 4C '). En todos los casos, el patrón tubular distintivo de la captación de dextrano conjugado correlacionada con la expresión de deseos de transcripciones que codifican slc20a1a, un marcador específico establecido-PCT ^30-32 (Figura 4D). Nephren los segmentos del PCT teñidas con ribosonda antisentido slc20a1a mostrado bobinas del PCT en forma de S, así como segmentos del PCT con menor intensidad en espiral (Figura 4D '), como se ha observado durante los ensayos conjugadas dextrano marcado (Figura 3D', en 3D ").

Otras preparaciones de riñón, como la detección de la actividad proximal fosfatasa alcalina túbulo (Figura 5A, 5B, 5C) se realizaron de manera similar después de la eliminación de la pigmentación de los melanocitos. Esto permitió proximal imágenes nefrona túbulo y análisis sin ninguna obstrucción. Endógeno reactividad de la fosfatasa alcalina en la nefrona es una característica importante del túbulo proximal ^1,47. Tinción de fosfatasa alcalina es altamente específico para las regiones proximales de la nefrona, en comparación con el patrón de expresión de WISH pan-proximal del gen cubilin ³⁹ (Figura 5D, 5D '). Reactividad de fosfatasa alcalina fue más intensa en el abetosección ST del túbulo proximal que corresponde a la PCT (Figura 5B), similar al patrón de expresión cubilin (Figura 5D, 5D '), que también tenía más altos niveles de transcripción relativos en la PCT. El PCT se distinguió por su diámetro ligeramente más ancho, la expresión específica de la mafba factor de transcripción (Figura 5E, 5E '), y la expresión específica de la slc20a1a gen transportador de solutos (Figura 4D, 4D'). La reactividad de la fosfatasa alcalina también etiquetado como un tramo de túbulo proximal con un diámetro más delgado que corresponde al segmento de PST (Figura 5B), basado en la comparación a la transcripción la expresión del segmento específico de la slc13a1 gen transportador de soluto (Figura 5F, 5F '). Los dominios de expresión de deseos de la slc20a1a marcador PCT y PST marcador slc13a1 son mutuamente excluyentes (Figura 5G cubilin (puntas de flecha negras en. Figura 5G ', 5G ", 5G"' ).

Para confirmar aún más la relación de la reactividad de la fosfatasa alcalina con la identidad túbulo proximal, todo el montaje co-etiquetado de la tinción de fosfatasa alcalina se realizó en riñones de pez cebra que recibieron una inyección intraperitoneal de dextrano fluoro-rubí 3 días antes (Figura 6A-C). Dextrano fluoro-rubí mostró superposición con fosfatasa alcalina en tan sólo la parte más ancha de diámetro del dominio túbulo proximal que corresponde a la PCT (ejemplos en la Figura 6D-I). El dominio de dextrano-positivo se detuvo bruscamente en el sitio donde el diámetro del túbulo proximal adelgazado, es decir, donde se reunieron con el PCT y PST, (flecha blancacabezas en la Figura 6) y sólo la reactividad de la fosfatasa alcalina se observó en el segmento posterior (PST ejemplos en la Figura 6D-I). La fluorescencia de fondo a partir de la reacción de la fosfatasa alcalina también tenuemente esbozó la par de las principales pistas de conductos colectores paralelos que se encuentra en el riñón adulto ^29,30 -ducts que se distinguen por tener el diámetro más ancho de cualquier tubo renal asociada (asteriscos en la figura 6A, 6D, 6E, 6G, 6H). A continuación, se observó la co-etiquetado de los túbulos de la nefrona con fosfatasa alcalina y dextrano absorción en el análisis cryosection (Figura 6J, perímetros del túbulo se indica con puntos blancos). En sección transversal, la reactividad de la fosfatasa alcalina se observó en una banda gruesa en la superficie apical del epitelio tubular, consistente con la ultraestructura del borde en cepillo, mientras que el espacio citosólico de células tubular correspondiente mostró reactividad dextrano fluoro-rubí (Figura 6J). Notablemente, stained túbulos eran o doble positiva para fosfatasa alcalina y dextrano, que conduce a su identificación como segmentos del PCT, o por separado a positiva para fosfatasa alcalina (Figura 6J, túbulo perímetro se indica en puntos amarillos), lo que lleva a una identificación como un segmento PST (nota: otro túbulos presentes fueron negativos para ambos manchas, datos no mostrados) (Figura 6J). Además, la tinción de fosfatasa alcalina (Figura 6K) se combinó con éxito con una etiqueta nuclear, yoduro de propidio (Figura 6L), facilitando el recuento de células (superposición en la Figura 6M).

El túbulo distal de la nefrona adultos de pez cebra se marcó con conjugado con rodamina DBA (Figura 7). Todo el montaje de doble etiquetado con DBA y fosfatasa alcalina se realizó en riñones de pez cebra de tipo silvestre (Figura 7A-C). DBA y fosfatasa alcalina reactividad mostró ningún solapamiento en los túbulos nefrona ( Figura 7G, 7H, 7J), mientras que la ramificación no se observó nunca en los segmentos del túbulo teñidas con fosfatasa alcalina. Cryosections renales se obtuvieron de pez cebra de tipo salvaje que llevan un transgén en el que el promotor ENPEP impulsa eGFP (Tg: ENPEP: eGFP), como las etiquetas de las buenas prácticas agrarias, tanto los túbulos proximales y distales de la nefrona ⁵¹ (Figura 7I). La inmunohistoquímica se realizó para detectar GFP, así como para etiquetar todos los túbulos renales (verdes, la Figura 7I), seguido por marcado fluorescente con fosfatasa alcalina y DBA (turquesa y rojo, respectivamente, la figura 7I). Análisis de secciones tubulares reveló que los túbulos estaban ya sea positiva para fosfatasa alcalina o DBA, pero no ambas etiquetas (Figura 7I). Sólo bañera raraEGLAS mostró reactividad con fosfatasa alcalina ni mancha, ni DBA, posiblemente debido al ángulo de la sección tubular (flecha blanca, la Figura 7I). Además, la tinción de DBA se combinó con éxito en la tinción de riñón montar todo con la etiqueta nuclear DAPI (Figura 7J), de nuevo haciendo hincapié en la naturaleza característica ramificada de los segmentos tubulares distales (puntas de flecha en blanco, Figura 7J).

A continuación, para comparar aún más los patrones de absorción de FITC-dextrano, fosfatasa alcalina, y DBA, triple etiquetado fue examinado por vía intraperitoneal inyección de adultos de pez cebra con dextrano-FITC, seguido por el aislamiento de riñón 3 días más tarde seguido por cryosectioning y la tinción de fosfatasa alcalina y DBA (ejemplos proporcionados en la Figura 8A-E). Túbulos renales mostraron tres categorías de combinaciones de etiquetas: túbulos que eran doble positiva para fosfatasa alcalina y segmentos del PCT dextrano denotado (líneas de puntos blancos), Tubules positiva para la fosfatasa alcalina solo denotan segmentos PST (líneas de puntos amarillos), y los túbulos distales fueron etiquetados con sólo DBA (roja punteada esboza la figura 8A-E). Puntos de ramificación Además, sólo el DBA positivo túbulos mostraban (Figura 8E). Mediante el análisis de WISH, este patrón de ramificación distintivo de la distal, túbulos DBA positivos correlaciona con los patrones de expresión génica de las transcripciones del transportador de soluto que son específicos para los segmentos tubulares distales (Figura 8F-I). Las transcripciones que codifican clcnk, que marca todo el túbulo distal (DE y DL) eran finas de diámetro, abundante en el riñón, y los puntos de ramificación contenidos (punta de flecha negro Figura 8F, 8F '). En comparación, los segmentos tubulares que mostraron expresión de slc12a1 o SLC12A3, que son marcadores de la DE y DL, respectivamente, fueron menos abundantes en muestras de riñón en general en comparación con clcnk expresión (comparar Figura 8 G y 8F, 8H). Además, los segmentos tubulares que expresaban slc12a1 rara vez, o nunca, ramificada (Figura 8G, 8G '), mientras que las regiones del túbulo que expresaban SLC12A3 se ramificados con frecuencia en los acuerdos de molinete como característicos (Figura 8H, 8H', 8H ", 8H" ' , puntas de flecha negras). Por último, el doble deseo para el slc20a1a marcador PCT y el clcnk marcador distal mostró que estas manchas no se solapaban (Figura 8I). En particular, los tramos de segmentos PCT slc20a1a expresando no estaban unidos a clcnk túbulos que expresaban, que se esperaba ya que el PST se encuentra entre estas regiones (Figura 8I). Tomados en conjunto, los ensayos de etiquetado túbulos renales con la captación de dextrano, la reactividad de la fosfatasa alcalina, DBA, y el deseo de las transcripciones de genes específicos, permite el discernimiento de proximal frente a los segmentos distales.

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Figura 1. Nephron anatomía en el riñón adultos de pez cebra. Dibujos esquemáticos de la (A) de adultos de pez cebra riñón y (B) una tabla de comparación de características moleculares segmento exhibidos por adulto y nefronas pez cebra embrionarias. (A) (Arriba a la izquierda) El riñón adulto es un órgano plano situado en la pared dorsal del cuerpo. (Arriba a la derecha), cuando se ve desde una perspectiva ventral, el riñón tiene una morfología distintiva curvada, que consiste en regiones de la cabeza, tronco y cola, y también tiene una población de la superficie de los melanocitos asociados. Ampliación (parte inferior izquierda) muestra un esquema de un árbol típico de la nefrona del riñón adultos de pez cebra, en el que cada sola nefrona posee un filtro de sangre (corpúsculo renal) en un extremo, seguido de un túbulo proximal, túbulo distal y el conducto. Color esquemático (bottom derecha) muestra un diagrama lineal de un adulto árbol nefrona para comparar las características del segmento con los de nefronas embrionarias (B). Las nefronas embrión de pez cebra contienen segmentos tubulares que incluyen el túbulo contorneado proximal (PCT), proximal túbulo recto (PST), distal temprana (DE), y distal tardía (DL), con dominios de expresión de genes respectivos listados a continuación. Nefronas en el pez cebra adultos tienen una composición segmentaria y firma molecular análogo basado en los dominios de expresión de genes que codifican transportadores de soluto similar, aunque una distinción notable en comparación con el embrión es que varias nefronas pueden estar unidos a través de un segmento de DL ramificada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. mapa Diagrama de flujo que indica la relación entre los métodos descritos en este protocolo, que indica cómo los métodos se pueden realizar individualmente o en combinaciones diversas. Después de la inyección intraperitoneal de marcado dextrano-lisina se puede fijar en el pez cebra adultos, el riñón puede ser visualizado en un Todo el montaje preparación, ya sea solo o en combinación con fosfatasa alcalina y / o manchas de DBA. Alternativamente, el riñón pez cebra seleccionado puede ser examinada después de seccionar el tejido histológico con un criostato. Las secciones se pueden teñir para etiquetar numerosas combinaciones de atributos, mediante inmunohistoquímica, tinción nuclear, tinción DBA, y / o reactividad de la fosfatasa alcalina. Además, las secciones renales se pueden visualizar directamente la presencia de la captación de dextrano-lisina se puede fijar en los segmentos del PCT. Por último, los riñones seleccionados pueden ser procesados ​​para la expresión espacio-temporal de la expresión génica utilizando DESEOS. Los números entre corchetes se refieren a correspoNding partes de protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Adulto riñón pez cebra plana de montaje en la preparación y aplicación de visualizar la captación de dextrano conjugado en el segmento PCT de nefronas renales. (A) Imagen de campo claro de una muestra de riñón planas montar preparación, en el que el órgano se ha posicionado plana sobre un portaobjetos de vidrio, con un cubreobjetos colocado en la parte superior del tejido que descansa sobre cuatro chuletas de modelado de la arcilla (color rosa caliente). Aquí la preparación renal se forma la imagen junto a una regla métrica para proporcionar una comparación a escala. El riñón adulto normal es de aproximadamente 7.5 milímetros (mm) desde la cabeza hasta la cola. (B) Imagen de campo claro de una blanqueadariñón. La pigmentación negro corresponde a la población dispersa de melanocitos que se encuentran en asociación con el riñón, y la aorta se ejecuta a lo largo de la línea media del riñón. (C) Visualización de los segmentos de la nefrona PCT 3 días después de la inyección intraperitoneal de 40 kDa de dextrano-fluoresceína (FITC) , sin necesidad de decoloración del riñón adulto. Segmentos del PCT se ven en todo el riñón, pero se ven parcialmente ocultos por los melanocitos. (C ') Zoom digital de una sola nefrona, con melanocitos (flecha blanca). (D) Imagen de un riñón adulto 3 días después de la inyección intraperitoneal de 10 kDa dextrano fluoro-rubí, la fijación de los riñones, y la decoloración. La pigmentación de melanocitos fue removido y las regiones del PCT se visualizaron aquí basado en su captación endocítica de dextrano bajo iluminación de campo claro. Gotitas de lípidos (flecha) desde el abdomen a veces pueden verse en asociación con las muestras de tejido renal. (D ', D ") Repreimágenes representativas muestran ligeras variaciones morfológicas entre segmentos del PCT. Mientras que muchos PCT nefrona están estrechamente enrollados (D '), otros nefronas contienen regiones del PCT que tienen un mínimo de bobinado (D "). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

. Etiquetado Figura 4. adulto segmento túbulo PCT nefrona del riñón pez cebra de tipo silvestre se inyectaron por vía intraperitoneal con un único conjugado de dextrano fluorescente; entonces su riñón se examinó 3 días después de la inyección para la visualización PCT. (A, A ') en cascada azul de dextrano, 10 kDa (B, B') de dextrano amarillo lucifer, 10 kDa y (C, C ') de dextrano f luoro-rubí, 10 kDa todo etiquetar preferentemente los segmentos del PCT en nefronas renales. Tanto cascada espectáculo amarillo lucifer dextrano azul y algunos etiquetado no específica de poblaciones de células estromales situados entre nefronas, con mucho mayor fondo observado en los riñones tratados lucifer amarillo. En contraste, dextrano fluoro-rubí mostró reducido drásticamente fondo con etiquetado PCT intenso. (D, D ') Un riñón adulto manchado por el deseo para detectar la ubicación de las transcripciones que codifican slc20a1a, un marcador específico del tipo de célula transportador PCT. El dominio de expresión de slc20a1a coincida con el patrón característico de la captación de dextrano observado en el riñón, con una distribución de diversos dominios del PCT fuertemente enrollados / bucle, así como tramos del PCT más alargadas que muestran un diámetro de ancho constante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5. resultado Representante de la tinción de fosfatasa alcalina, un marcador pan-túbulo proximal, en el riñón pez cebra adulto en comparación con otros marcadores del túbulo proximal evaluados con DESEOS. Tinción fosfatasa (AC) alcalina (turquesa) ilumina la nefrona túbulo proximal, destacando tanto el PCT y PST. (DF ') DESEO único para los genes que figuran (cada uno en la tinción de color púrpura). (D, D') El patrón de expresión de cubilin , un pan-proximal (PCT-PST) marcador, se correlaciona con la fosfatasa alcalina (D, D '). En comparación, los DESEOS de mafba marca el PCT (E, E ') y slc13a1 marca el PST (F, F'). En (GG "') doble DESEOS para el marcador PCT slc20a1a </ Em> (rojo) y el slc13a1 marcador PST (púrpura) muestra que los segmentos marcados por estos marcadores no se superponen, y en lugar de que sus dominios de expresión ocupan posiciones adyacentes cuando nefronas individuales son examinados de cerca (G'-G "'). Puntas de flechas negras indican la unión entre los segmentos del PCT y PST, que normalmente se asocia con un cambio de diámetro de los túbulos de mayor a menor, respectivamente. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. fosfatasa alcalina y dextrano captación espectáculo solapamiento en el segmento de PCT de nefronas renales adultas, y fosfatasa alcalina tinción es compatible con co-etiquetado nuclear con yoduro de propidio. (AI) (AC) imagen fusionada e imágenes separadas de la zona de silla de un único riñón. (DF) y (GI) Dos conjuntos de imágenes fusionadas y las imágenes separadas del Ejemplo nefronas. (I) cryosection análisis confirma co-etiquetado de la fosfatasa alcalina y dextrano fluoro-rubí en segmentos del PCT (descrito en los puntos blancos), mientras que la fosfatasa alcalina sola etiqueta el PST segmento (que se señala en los puntos amarillos). (KM) Un riñón fuemarcada con (K) de la fosfatasa alcalina (turquesa) y yoduro de (L) de propidio (púrpura), lo que permite la (M) se fusionaron visualización de las células del túbulo proximal y sus núcleos, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7. fosfatasa alcalina y DBA son mutuamente exclusivas etiquetas de segmento que marcan el pan-regiones proximal y pan-distales, respectivamente, presentes en las nefronas del riñón adultos de pez cebra. (AH) preparados todo el montaje de un riñón pez cebra manchada con fosfatasa alcalina y rodamina-DBA. Fosfatasa alcalina (turquesa) y DBA (rojo) no muestran la superposición en el riñón. Los niveles de fondo de fosfa alcalinatase iluminar el par de conductos colectores principales en cada riñón (asteriscos, *), que son el distintivo debido a su amplia diámetro. DBA túbulos positivos son más delgadas de diámetro y caracterizan con frecuencia por la presencia de puntos de ramificación (puntas de flecha blancas). (AC) de imagen y las imágenes separadas de la región de silla de montar de un solo riñón fusionada. (DF) Un conjunto de imágenes fusionadas y las imágenes separadas de ejemplo nefronas. (G, H) Los ejemplos adicionales, con túbulos ramificados DBA junto a la fosfatasa alcalina túbulos positivos, se fusionaron las imágenes. análisis (I) cryosection confirma que la fosfatasa alcalina y la etiqueta DBA secciones tubulares distintos, y sólo raras túbulos muestran ninguna etiqueta (flecha blanca ), probablemente debido al ángulo de la sección para que túbulo. Para este análisis, los peces transgénicos de tipo salvaje, Tg: ENPEP: eGFP, se utilizaron y todos los túbulos renales en este riñón se immunolabeled con un anticuerpo primario para detectar GFP (J). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8. etiquetado Triple de cryosections riñón adulto con captación de dextrano, fosfatasa alcalina, y DBA comparación con el análisis de WISH segmento distal. Riñones (AE) adultos fueron inyectados por vía intraperitoneal con FITC-dextrano (verde), y los riñones recogieron 3 días más tarde para incrustar y cryosectioning. La tinción con fosfatasa alcalina (turquesa) y DBA (rojo) reveló tres poblaciones de túbulos: segmentos del PCT que fueron positivos para la reactividad alcalina fosfatasa y dextcorrió (descrito en los puntos blancos), los segmentos de PST que fueron positivos para la reactividad solamente con fosfatasa alcalina (descrito en puntos amarillos), y los segmentos del túbulo distal que fueron positivos para DBA solamente (descrito en puntos rojos), que también mostró puntos de ramificación distal característicos. ( AD) Imagen Fusionada y las imágenes separadas de un ejemplo sección. (E) Fusionada imagen de otra sección de ejemplo. (FI) La comparación de los patrones de expresión de genes distales del túbulo por única (FH '") y doble (I) DE DESEOS. El (FH ') de WISH único para los genes enumerados (cada uno en la tinción púrpura). (F, F') El patrón de expresión de clcnk, un (DE-DL) marcador pan-distal, se detectó en los túbulos finas que contenían los puntos de ramificación (punta de flecha negro). (G, G ') En comparación, DESEO para slc12a1 marca la DE sin puntos de ramificación detectados, y (HH' ") <em> SLC12A3 marca el DL, un segmento caracterizado por numerosos puntos de ramificación a lo largo del órgano renal (puntas de flecha negras). (I) DESEO doble para el slc20a1a marcador PCT (rojo) y el clcnk pan-distal (púrpura). Los segmentos marcados por estos marcadores no se superponen, y en lugar de sus dominios de expresión ocupan posiciones no adyacentes, de manera que las bobinas del PCT individuales (abajo a la derecha) no lo hacen tope con túbulos distales, y los segundos ocupan lugares discretos y poseen puntos de ramificación sello (punta de flecha negro ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Aquí, hemos descrito los métodos que permiten la visualización de los componentes del segmento de nefronas en el pez cebra adulto. La inyección de conjugados de dextrano fluorescentes permite etiquetado PCT preferencial debido a las propiedades endocíticas de estas células del túbulo proximal ^30,38. Este método se puede realizar con gran flexibilidad debido a la existencia de dextranos que se puede obtener con un grupo de diferentes conjugados fluorescentes. Además, el uso de dextranos-lisina fijable es una forma especialmente conveniente para etiquetar PCT segmentos, ya que no se requieren procedimientos de etiquetado secundarias. Esto permite la detección de señal relativamente sencillo y es compatible con muchos otros marcadores fluorescentes, immunolabeling, y el uso de líneas transgénicas reportero. Etiquetado de fosfatasa alcalina también marca el túbulo proximal, con una fuerte reactividad en el PCT y reactividad ligeramente más débil en el PST. Finalmente, la tinción DBA permite el etiquetado de los segmentos tubulares distales, que muestran un characteristic ramificado morfología. Varias moléculas de lectina, que son proteínas de unión a azúcar de origen no inmune, se han utilizado ampliamente para distinguir segmentos de nefrones de mamíferos ^47. Es interesante que DBA en el pez cebra se correlaciona con segmentos del túbulo distal, ya que se utiliza para marcar los conductos colectores en los riñones de mamíferos ^47.

Tomados en conjunto, estos métodos pueden ser utilizados en diversas combinaciones para documentar la composición y la función renal. Puesto que todos estos métodos se pueden utilizar en las preparaciones de riñón enteros, proporcionan herramientas para evaluar la estructura y la función de nefronas en todo el órgano, sin depender enteramente en el uso de más tiempo, los métodos tediosos, por ejemplo, el trabajo cryosection y immunolabeling. Sin embargo, las manchas descritas en este artículo son métodos viables en sección criogénica. Análisis criosección genera muestras (en comparación con todo el montaje) que son más adecuados para la inmunohistoquímica para detectar Pepti específicosdes, aunque, por supuesto, este tipo de análisis requiere la disponibilidad de anticuerpos primarios adecuados. Lamentablemente, uno de las principales limitaciones en el trabajo con el modelo animal pez cebra sigue siendo la escasa disponibilidad de anticuerpos. Así DESEO sigue siendo el más utilizado, es decir, 'go-to ", procedimiento para el análisis de la expresión génica. DESEO utilizando reacciones de sustrato BCIP, NBT, y / o INT para producir precipitados morados o rojos no es compatible con la tinción fluorescente en cryosections. Una opción sería para invocar el uso de la detección de WISH fluorescente, un procedimiento que ha sido optimizado para muestras de embriones de pez cebra y podría ser adaptado para su uso con el riñón adulto. La descripción de los métodos en este artículo de vídeo debería permitir una mayor experimentación con técnicas como DESEOS fluorescente en combinación con las líneas de pez cebra transgénico en el que los segmentos individuales están etiquetados con un reportero como eGFP o mCherry. Alternativamente, los métodos descritos aquí COULd ser probado en combinación con otros colorantes vitales, por ejemplo, otras lectinas. De esta manera, una mayor adaptación y ampliación de los métodos descritos aquí se pueden invocar para satisfacer las necesidades del investigador para preparaciones enteras renales montaje y análisis.

Como tales, estos métodos tienen un amplio potencial para la aplicación con el modelo de pez cebra para los estudios de regeneración en curso y también en el modelado de la enfermedad genética. Hay una necesidad apremiante para la investigación y los tratamientos innovadores para las aflicciones renales. Millones de personas sufren de algún tipo de enfermedad renal cada año que resulta de causas congénitas, agudos y / o crónicos. Además, la prevalencia de la enfermedad renal sigue aumentando en todo el mundo, por lo que estas enfermedades un problema de salud pública mundial ^14,15. Tratamientos como la hemodiálisis están disponibles mediante el cual una máquina de diálisis externa sirve para extraer la sangre de los desechos metabólicos del paciente si sus riñones no son capaces de realizar este papel. Desafortunadamente, Esta intervención tiene limitaciones, como el tratamiento continuo es necesario para la supervivencia. Por otra parte, los pacientes necesitaran un trasplante de riñón, que puede tomar años para recibir una vez que un paciente se coloca en una lista de espera. Incluso después de la obtención de un trasplante de riñón, muchos pacientes sufren efectos adversos como resultado del procedimiento y deben luchar contra estos efectos para el resto de sus vidas. Estas dificultades ponen de manifiesto la necesidad seria para el desarrollo de nuevos tratamientos para ayudar a prevenir ya sea enfermedad del riñón o tal vez para aumentar la regeneración de tejidos ^8,16,52,53. Dadas las limitaciones éticas evidentes del uso de sujetos de prueba humanos en laboratorios biomédicos, los modelos animales son esenciales para el estudio de la patogénesis de la enfermedad humana y para la prueba de nuevos tratamientos. Como resultado de su similitud y proximidad anatómica evolutiva, el ratón se ha convertido en el modelo más ampliamente utilizado de la enfermedad humana ^45. Sin embargo, hay ciertas limitaciones con este animal, incluído,ing incapacidad para visualizar el desarrollo de órganos in vivo y la practicidad de completar pantallas genéticos a gran escala. El pez cebra es un organismo relevante y útil modelo para el estudio del desarrollo de órganos y el modelado de la enfermedad humana ^45,46. En lo que respecta a las enfermedades humanas, existen homólogos funcionales en el pez cebra para casi el 70% de todos los genes humanos ^54,55.

Trabajos recientes han puesto de manifiesto la utilidad de pez cebra para muchas áreas de la investigación renal ^31,37,56. Los estudios de regeneración y reparación en el pez cebra después de AKI sugieren que la regeneración del epitelio del túbulo y neonephrogenesis son dos procesos que se producen y se superponen a lo largo de la regeneración timecourse ^30,37. El uso de un llamado gentamicina antibiótico aminoglucósido se ha utilizado como un paradigma de lesión a través del cual para estudiar los resultados de AKI en ^29,30,37 adultos de pez cebra. Durante un período de dos semanas después de una lesión de aproximadamente de gentamicina, el Tubul proximales regeneran, y mientras tanto nuevas nefronas se forman a lo largo del órgano ^29,30,37. En general, los mecanismos que regulan la regeneración epitelial siguen siendo muy controvertidos. En un mecanismo propuesto del proceso de reparación, no es el evento inicial de lesión aguda seguida de un desprendimiento de las células muertas en el lumen. A continuación, hay una serie de de-diferenciación, proliferación, y eventos de migración, después de lo cual las nuevas células se diferencian, repoblación de la membrana basal heridos y restaurar la función a la zona lesionada. Por otra parte, otros estudios han sugerido que las células de reemplazo se derivan de células madre / progenitoras que residen dentro de los túbulos nefrona. En cuanto al proceso de neonephrogenesis en el pez cebra, los agregados celulares se han observado siguiente AKI por inyección de gentamicina ^29,30. Estos agregados posteriormente maduran hasta convertirse en nuevas nefronas que sondean en los túbulos ya existentes ^29,30. El hilo común que une nefrona regeneración epitelial y neonephrogenesis es su factor de misterio enorme: en la actualidad no son exponencialmente más preguntas acerca de cómo se producen estas hazañas regenerativas que existen puntos de vista disponibles.

Hasta la fecha, sin embargo, varias líneas interesantes de evidencia apoyan la noción de que la investigación de regeneración renal utilizando el pez cebra puede de hecho brindar conocimientos comparativos pertinentes en AKI humano que también puede tener directa traslacional potencial ^56-58. Química de detección para identificar pequeñas moléculas que aumentan la proliferación de células progenitoras renales en el embrión de pez cebra recientemente llevado a la identificación de la -butanoato inhibidor de histona desacetilasa metil-4-(feniltio) (m4PTB) ^56,57. La administración de este compuesto para las larvas de pez cebra con inducida por gentamicina-AKI reveló que la supervivencia larval aumenta y que la proliferación tubular renal se mejoró ^56,58. Cuando los ratones con lesión renal aguda inducida por isquemia moderada fueron tratados con m4PTB, su recuperación se aceleró en asociation con una reducción tanto en la atrofia y el ciclo celular tubular detención de la proliferación de las células tubulares renales ^58. Estos hallazgos sugieren que las vías responsables para el desarrollo normal del pez cebra renal y / o la respuesta regenerativa a AKI se conservarán con los mamíferos ^56.

Así, mientras que se necesitan más estudios para desmenuzar los mecanismos de regeneración-es decir, para identificar las vías de señalización que intervienen y comprender su interacción-el pez cebra proporciona una vía prometedora para perseguir esta meta importante en el campo de la nefrología. Herramientas tales como las etiquetas de células nefrona descritos en este protocolo representan un grupo de ensayos que pueden ser utilizados para evaluar la composición y la funcionalidad renal en modelos AKI. Además, se pueden aplicar para caracterizar modelos transgénicos de la enfermedad renal y pueden proporcionar maneras de identificar agentes terapéuticos químicos capaces de promover la restauración de la estructura después de la presa nefrona renalla edad.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X PBS			Made by diluting 10 X PBS in distilled water.
1X PBST			0.1% Tween-20 detergent in 1 X PBS.
1X PBS with 0.05 % Tween			0.05% Tween-20 detergent in 1 X PBS.
Tween 20	American Bioanalytical	AB02038
4% PFA/1X PBS			Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20°C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.
Fine Forceps	Roboz	RS-1050	Dumont Tweezers Pattern #55
Glass slide	Thermo-Fisher	4445	White Frost
Glass coverslip	Thermo-Fisher	12-540A	18 x 18 mm
Modeling clay	Hasbro	Playdoh	Other modeling clays can be substituted and work similarly
Slide holder	Thermo-Fisher	12-587	Optional: cardboard tray to store slides flat
Bleaching solution			Bleach mix formula (for a 20 ml solution): 1.6 ml of 10% Potassium hydroxide solution 0.6 ml of 30% Hydrogen peroxide solution 100 μl of 20% Tween Fill to 20 ml with distilled water
Potassium hydroxide	Sigma	221473
Hydrogen peroxide	Sigma	H1009
Blocking solution			Blocking Solution (for a 10 ml solution): 8 ml of 1X PBS with 0.05% Tween 2 ml of fetal calf serum 150 μl of DMSO
Alkaline phosphatase activity detection	Invitrogen	E6601	We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.  To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer's instructions.
Alkaline phosphatase wash solution			Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 ml solution): 5 ml of 0.5 M EDTA 120 mg of Levamisole 95 ml of 1X PBS
Dextran, fluorescein, 40,000 MW	Invitrogen	D1844	Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, cascade blue, 10,000 MW	Invitrogen	D1976	Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW	Invitrogen	D1825	Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW	Invitrogen	D1817	Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine	Vector laboratories	RL-10-32	DBA Staining Solution (for a 100 μl solution): 1 μl of DBA 99 μl of 1X PBS
Propidium iodide	Invitrogen	E6601
DAPI	Invitrogen	P1304MP
Vectashield hard set mounting medium	Vector laboratories	H-1400
Micro cover glass	VWR	48393081
Dimethyl sulfoxide, DMSO	American Bioanalytical	67-68-5
Sucrose	Sigma	S0289
EDTA, 0.5 M solution, pH 8.0	American Bioanalytical	AB00502
Levamisole	Sigma	L-9756
Tissue freezing medium	Triangle Biomedical Sciences, Inc.	TFM-C
Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10 x 10x 5 mm	Sakura Finetek	4565
TruBond 380 adhesive microscope slides	Tru Scientific	0380W
Liquid blocker – super PAP pen	Electron Microscopy Sciences	71312
Immuno stain moisture chamber	Evergreen Scientific	240-9020-Z10
Cryostat	Therm	Microm™ HM 525 Cryostat
Stereomicroscope	Nikon	SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC	Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.
Compound microscope	Nikon	96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red	Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.