Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Analyse af Nephron opbygning og funktion i Voksen Zebrafisk Kidney

doi: 10.3791/51644 Published: August 9, 2014

Summary

Zebrafisk voksen nyre er et glimrende system til nyre regenerering og sygdom studier. Et vigtigt aspekt af denne forskning er vurderingen af ​​nephron struktur og funktion. Denne protokol beskriver flere metoder, der kan gennemføres for at vurdere nefron tubulus sammensætning og vurdere renal reabsorption.

Abstract

Zebrafisk model har vist sig som et relevant system til at studere nyre udvikling, regenerering og sygdom. Både embryonale og voksne zebrafisk nyrer er sammensat af funktionelle enheder kaldet nefroner, som er stærkt konserverede med andre hvirveldyr, herunder pattedyr. Forskning i zebrafisk har for nylig vist, at to markante fænomener svede efter voksne nefroner pådrage sig skader: første, der er robust regenerering inden for eksisterende nefroner, der erstatter den ødelagte tubulus epitelceller; sekund, er helt nye nefroner produceret fra nyre stamceller i en proces kendt som neonephrogenesis. I modsætning hertil mennesker og andre pattedyr synes kun at have en begrænset evne til nephron epitelial regenerering. Til dato, de mekanismer, der er ansvarlige for disse nyreregenerering fænomener stadig dårligt forstået. Da voksne zebrafisk nyrer gennemgå både nephron epitelial regenerering og neonephrogenesis, giver de en fremragende eksperimentel paraparadigme for at studere disse begivenheder. Endvidere er der en lang række genetiske og farmakologiske værktøjer i zebrafisk model, der kan bruges til at afgrænse de cellulære og molekylære mekanismer, der regulerer nedsat regenerering. Et væsentligt aspekt af denne forskning er evalueringen af ​​nephron struktur og funktion. Denne protokol beskriver et sæt af mærkningsteknikker, der kan bruges til at måle nedsat sammensætning og test nephron funktionalitet i den voksne zebrafisk nyre. Således er disse metoder er bredt anvendelig til den fremtidige fænotypisk karakterisering af voksne zebrafisk nyreskade paradigmer, som omfatter, men er ikke begrænset til, eksponering regimer nephrotoxicant eller genetiske metoder til målrettet celledød, såsom nitroreduktase medierede celle ablation teknik. Endvidere kunne disse metoder anvendes til at undersøge genetiske forstyrrelser i voksen nyre dannelse og kan også anvendes til at vurdere nyrestatus under kronisk sygdom modellering.

Introduction

Nyrerne er et komplekst organ, der opfylder en lang række fysiologiske funktioner i kroppen. Den forreste nyrefunktionen er metaboliske affald udskillelse, og denne opgave hænger nøje sammen med opretholdelsen af ​​væske homeostase. Nyrerne udfører disse jobs ved at filtrere blodet og danner urin, mens samtidig at regulere blodtrykket, elektrolyt niveauer, og syre-base balance. Meget specialiserede epitelial tubuli kaldet nefroner tjene som den grundlæggende funktionelle enhed i nyrerne 1,2. Hos voksne hvirveldyr, er nefroner typisk organiseret i et tæt sammenrullet arrangement omkring et centraliseret drænsystem, hvilket giver mulighed for mange tubuli at pakke ind i den forholdsvis lille orgel. For eksempel kan hvert menneske nyre indeholde over 1 million nefroner 3. Andre pattedyr som musen besidder på rækkefølgen af 8-10.000 nefroner pr nyre 4. Graden af ​​nedsat kompleksitet varierer mellem disse pattedyr og andre vertebrates følge af variationer i den samlede nefron nummer og deres arkitektoniske udformning i nyrerne. Hvirveldyr danner så mange som tre på hinanden nyre strukturer under udvikling, og hver viser stigende kompleksitet med hensyn til nefron begavelse og arrangement: de pronephros, mesonephros og metanephros. Den sidste renal struktur, der skal bevares tjener som voksen nyre orgel-typisk et mesonephros eller en metanephros 2. Hver nyre form har imidlertid en nephron sammensætning baseret på 2.

Nephron er arbejdshesten i nyren og er ansvarlig for filtrering blod sammen med metabolit sekretion og reabsorption. Nefroner er simple rørformede strukturer består af epitelceller og har en segmental organisation, hvor diskrete, højt specialiserede domæner af differentierede epiteler udføre specifikke opgaver. I rækkefølgen af ​​filtratet strømning gennem nephron er der typisk tre hoveddele, der Comprise hver enhed (1) renal blodlegemer, (2) en tubulus med proksimale, mellemliggende og distale segmenter, og (3) en samlekanal 1. Den proximale tubulus er ansvarlig for reabsorption af opløste organiske forbindelser, især glucose og aminosyrer 1. Den mellemliggende tubulus (eller Henles slynge) er en stor stedet for salt og vand regel 1. Endelig finjustering af salt og andre ioner forekommer i den distale tubulus og opsamling kanal og er stærkt reguleret af det endokrine system 1. Derfra filtratet bevæger sig gennem urinlederen og blære, i sidste ende forlader kroppen som et spildprodukt 1.

Tabet af nyrefunktion kan stamme fra et væld af årsager, der forhindrer normal nefron aktivitet. Disse årsager kan forekomme under nyre udvikling, fx medfødte defekter, der fører til misdannelser af nefroner 5, eller årsager fra forskellige typer af skade (som følge af både genetisk og environmental oprindelse). Erhvervede skader er stort set kategoriseres som akut nyreskade (AKI) eller kronisk nyreskade (CKD). AKI indebærer en brat tab af nyrefunktion, hvilket ofte resulterer i iskæmi eller toksin eksponering 6,7. I pattedyr, nefron epitelial reparation er muligt efter sådanne skader 8, og mange mennesker udviser fuld genindførelse af nyrefunktionen efter AKI. Dog er AKI også forbundet med høj sygelighed og dødelighed, der er blevet rapporteret på tværs af en bred 30-70% forekomst interval 6,7. CKD, i modsætning, er forbundet med progressivt tab af nyrefunktion, som resulterer fra år af langvarig skade, typisk forbundet med fibrose 8,9. Endvidere findes et samspil mellem AKI og CKD, som enten det ene kan prædisponere en person til den anden 10-12. For eksempel dem, der har lidt af AKI er mere modtagelige for CKD og endda død 13. Forekomsten af ​​nyresygdom, både i USA og på verdensplan, har nået epidemic proportioner og forventes at stige som den ældre befolkning udvider-derfor er der et stigende behov for at identificere regenerativ medicin interventioner for nyre 14,15.

På trods af viden om, at AKI patienter kan genvinde, har det længe været antaget, at nyren er et organ uden medfødte regenerative kræfter. Denne traditionelle opfattelse er blevet revideret drastisk i de seneste år 16. Undersøgelser af nyreskade hos mus og rotter efter AKI har vist, at nephron tubulære epitelceller kan formere sig og genopbygge funktionelle nefroner 17-20. Selv pattedyr besidder denne adaptive evne til at regenerere nefroner, der er bemærkelsesværdige begrænsninger og utilpasset respons kan udløses som fører til nyrefibrose og CKD 21. For eksempel en nylig undersøgelse viste, at gentagen celle ablation epitelial i murine nefroner var forbundet med formindsket regenerering og nyrefibrose-tyder nefroner HAVea begrænset regenerering tærskel 22. Der er intet bevis for, at pattedyr nyre voksen danner nye nefroner til at erstatte mistede eller beskadigede dem, og dermed deres ødelæggelse fører til en permanent 8,9 nefron underskud. Interessant, nogle hvirveldyr reagere på AKI ved at regenerere nefron epiteler og ved også at producere nye nefroner, der er nævnt en proces som neonephrogenesis eller nephron neogenesis 23. Neonephrogenesis forekommer i fisk efter toksin eksponering eller delvis resektion, og skade modellerne historisk har medtaget guldfisk 24,25, tilapia 26, skate 27 Medaka 28, og for nylig, zebrafisk 29,30. Af disse zebrafisk give en levedygtig genetisk forskning model til at opdage de cellulære og molekylære veje, der er ansvarlige for nedsat regenerering.

I denne video artikel vil vi vise, hvordan man mærke nefronenheder segmenter hos voksne zebrafisk. Kendskab nephron anatomi, molekylære funktioner,og funktionelle egenskaber er afgørende for en vellykket fremtidige nyre undersøgelser under anvendelse af zebrafisk. Den voksne zebrafisk nyre er en mesonephros struktur og er i sagens natur mindre kompleks i form af nephron nummer og organisation end den metanephros struktur findes hos voksne pattedyr, fugle og krybdyr 31. Imidlertid zebrafisk nephron segment organisation er analog til pattedyr og blev først dokumenteret i den embryoniske nyre baseret på genekspressionsstudier 31-35. Zebrafisk embryo nefroner indeholder lineære tubulære segmenter, der omfatter den proximale tubulus contortus (PCT), proksimal lige tubulus (PST), distale tidligt (DE), og den distale sent (DL) 31-35 (figur 1). Zebrafisk voksne nefroner besidder lignende rørformede segmenter 30,31,36,37 (figur 1). PCT kan også identificeres ved en funktionel fænotype: epitelceller i PCT vil inkorporere fluorescensmærkede dextran forbindelser (10-70 kDa i størrelse) til stede iomsætning, som er blevet anvendt i både embryonale og voksen zebrafisk nyre at vurdere endocytisk optagelse af disse proximale tubuliceller 38-41 (figur 1). En forskel i nefronenheder segmenter mellem zebrafisk og pattedyr, er, at zebrafisk mangler en mellemliggende tubulus eller Henles slynge 30-37; da dette segment fungerer i pattedyr at spare på vandet, og zebrafisk er et ferskvandsarter uden en presserende at koncentrere deres urin, er det ikke overraskende, at zebrafisk mangler dette segment 32,33. Således er den samlede nephron sammensætning stort set bevaret mellem zebrafisk og pattedyr nyre 32,33. Disse ligheder har gjort det muligt zebrafisk at være et effektivt søgeredskab til at undersøge funktionerne i den renale udtrykte gener under udviklingsmæssig nephrogenesis 32-35,42 og at modellere mange nyresygdomme 43,44, hvilket øger den omfattende liste af menneskelige forhold, der kan være undersøgt ved hjælpzebrafisk 45,46.

I dag, den voksne zebrafisk nyre er en attraktiv model for sammenlignende studier af renal regenerering på grund af sin genetiske sporbarhed og det ekspanderende ganen af ​​teknologiske ressourcer til rådighed til at afhøre gen funktion og signalveje i denne art. Flere undersøgelser har brugt zebrafisk mesonephros at undersøge mekanismerne i regenerering efter AKI 29,30,37. For fortsat AKI forskning ved hjælp den voksne zebrafisk nyre, er det vigtigt at have udsøgte metoder til at mærke forskellige nefronenheder regioner og metoder til at overskue nefron funktionalitet. Adskillige metoder til voksen nyre analyse er blevet tilpasset fra fosternyreceller protokoller. Intraperitoneal injektion af fluorescensmærket dextran i den voksne zebrafisk etiketter PCT epitel i mesonephros nefroner via endocytose 30, som i zebrafisk embryoner 38-41 (figur 1). Denne metode er blevet anvendt til visualize når proksimale tubuli genvinde deres reabsorbing ejendom efter AKI, som muliggør en vurdering af restaurerede fysiologiske funktion 30 (figur 1). En anden funktion af nephron proximale tubulus er, at epitelcellerne i dette segment har en børste kant 37, der viser høje niveauer af endogen alkalisk phosphatase-aktivitet. Således kan den proksimale epitel lokaliseres visuelt i den voksne zebrafisk nyre under anvendelse af en fluorescens-baserede teknik kendt som ELF- (Enzyme-Labeled Fluorescence) -97 47.

Her beskriver vi, hvordan man udfører fluorescerende dextran uptake assays 30,48 i den voksne zebrafisk nyre, for således at opnå en funktionel vurdering af den proximale tubulus og kortlægge størrelse og konturer af denne tubulus segment. Dernæst vil vi beskrive teknikker til at mærke de proximale tubulus regioner voksne nefron med fluorescensmærket alkalisk phosphatase. For det tredje viser vi for første gang, at Rhodamin-mærket lektin Dolichos biflorus agglutinin (DBA), som er blevet anvendt som en generel markør for samlekanalerne i pattedyrs nyre 49, markerer de distale tubuli i den voksne zebrafisk nyre. Som DBA er gensidigt udelukkende til alkalisk phosphatase farvning, disse mærker giver en måde at stort set skelne mellem pan-proksimal versus pan-distale strækninger af den voksne zebrafisk nefron. Under hele gennemførelsen af ​​disse fluorescerende pletter i både hele mount og frysemikrotomsnit histologiske snit, vi korrelere disse mærker med udtryk domæner af opløst stof transporter gener, der entydigt identificerer hver nephron segment. Derfor er denne protokol indeholder også en guide til de ændrede væv behandlingsprocedurer for voksent væv hele mount in situ hybridisering (ønske) analyse baseret på vores foster WISH protokol 50. Disse procedurer kan anvendes i forskellige kombinationer (figur 2) at dokumentere morfologiske og funktionelle egenskaber of voksne zebrafisk nyre nefroner. Således kan disse protokoller anvendes til regenerering undersøgelser, den fænotypiske karakterisering af andre renale sygdomsmodeller, og endda bruges til at studere dannelsen af ​​den voksne nyre.

Protocol

Procedurerne for at arbejde med zebrafisk beskrevet i denne protokol blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på University of Notre Dame. Bemærk: En guide til nyre og nephron anatomi i zebrafisk er tilvejebragt (figur 1). En oversigt over de metoder, der beskrives i denne protokol, er tilvejebragt som et rutediagram (figur 2) for at illustrere, hvordan multipel etikettering procedurer kan udføres på samme nyreprøve. Til del 7 om forberedelse ønske om voksne nyre undersøgelser, de trin, der er fastsat her angiver hvordan man kan ændre behandlingen af zebrafisk embryoner, som for nylig blev offentliggjort 50, til at yde en teknisk vejledning for en vellykket WISH analyse af nyre orgel.

1. Voksen Zebrafisk intraperitoneal injektion med Dextran of Interest

  1. Forbered ønskede fluorescensmærket dextran lager (r) ved at opløse dextran pulver i destilleret vand ved en koncentrationpå 50 mg / ml, og opbevar prøver i mikrocentrifugerør ved -20 ° C i mørke. Note: Forskellige fluorescensmærkede dextraner er kommercielt tilgængelige. Vælg dextran til brug baseret på en kombination af andre mærker, der ønskes, og sørg for de relevante fluorescerende filtre fås med mikroskoper, som vil blive udnyttet. Lysin-fixable dextraner viser fluorescens uden yderligere mærkningskrav skridt i levende prøver, fastbundet vævsprøve fra aflivet prøver, og faste prøver.
  2. Optø den ønskede dextran materiel og gemme på is i mørke, mens de udfører trin 1,3-1,5. Pak mikrocentrifugerør i aluminiumfolie for at beskytte det mod lys mens håndtering.
  3. Bedøver en voksen zebrafisk mellem 5-7 måneder i alder ved at placere fisken i en skål indeholdende enten 0,02% tricaine eller 0,001% 2-phenoxyethanol i ca 1 - 2 min. Bemærk: Det er bedst at bruge voksen zebrafisk af denne aldersgruppe, fordi de yngre fisk kan have small nyrer der er vanskelige at dissekere og nyreprøver fra gamle fisk kan indeholde masser af arvæv, som ikke kan analyseres. Ved korrekt bedøvet, vil den voksne zebrafisk ikke udviser en reaktion at røre stimulering, som kan testes ved anvendelse af en ske eller stump sonde til forsigtigt at røre halefinnen af ​​fisken.
  4. Ved hjælp af en plastik ske, løfte fisk fra skålen, dekanteres opløsningen og forsigtigt placere dyret på en våd svamp skimmel, ventrale side op.
  5. Ved hjælp af en 31 G 1,0 cc insulinsprøjte, injiceres 20 ul optøet dextran stamopløsning i intraperitoneal rum. Vend nålen, således at indsættelse forekommer i en flad vinkel på den ventrale midterlinjen af ​​maven. For at undgå at punktere organer, indsætte nålen så lidt hæve den, så at løfte kroppen væg fisk og skabe et rum, hvor at injicere dextranopløsningen 48. Bemærk: Alternativt kan dextran lager fortyndes, fx i et forhold på 1: 2 eller 2: 1 (dextran: disdestilleret vand) for at reducere baggrundsfluorescens i prøven.
  6. Vende forsigtigt fisken til tanken for at kunne gendanne fra anæstesi. Bemærk: Optagelse af dextran af den proximale tubulus segmentet sker indenfor 8 - 12 timer og kan detekteres i mindst op til 3 dage efter injektion (dpi). Analyse ved 3 dpi giver stærke tubulus signal med lav baggrund fluorescens i den renale stromale befolkninger. Fortsæt til del 2 for hele mount undersøgelse af dextran optagelse alene, hvis der ikke ønskes supplerende mærkning. For kombinatorisk mærkning, gå videre til del 3 til at forberede væv til hele mount undersøgelse af dextran optagelse, så del 4 til dobbelt-label med alkalisk phosphatase og / eller del 5, til at udføre DBA dobbelt-eller tredobbelt-mærkning. Til forskning ved hjælp af histologiske snit, gå videre til kapitel 6 for at få instruktioner om, hvordan at gøre fine dele af nyren ved hjælp af en kryostat og hvordan at farve dem med forskellige etiketter og / eller immunhistokemi med primær og sekundær ANTIBodies.

2. Dissektion og Flat Mount Forberedelse af Voksen Zebrafisk Nyre fra En løs Animal Prøve at visualisere Fluorescent Dextran Mærkning af den proximale tubulus

  1. Aflive dextran-indsprøjtning voksen zebrafisk ved at placere det i en skål med 0,2% tricaine pH 7,0 i 4 - 5 min. Bemærk: Sørg for, at fisken er blevet aflivet, før du fortsætter, ved omhyggelig overvågning af, om de gæller er ophørt bevægelse og hjertet er holdt op med at slå 36.
  2. Ved hjælp af en plastik ske, løfte fisk fra tricaine opløsningen dekanteres opløsningen og placere dyret på et væv eller køkkenrulle.
  3. Brug en skarp par dissektion saks til at lave et snit bag gælle Laag og fjern hovedet.
  4. Åbn straks kroppen af ​​fisken med dissektion saks ved at gøre en lang ventral indsnit fra hovedet til bunden af ​​halefinnen.
  5. Fjern de indre organer af fisken ved hjælp af et par fine tænger.
  6. Brug super fine dissektion nåle til pin åbne kroppen vægge, så at tillade visualisering af nyre organ, som er klæbende til den dorsale væg af dyret.
  7. Brug fine pincet til at frigøre nyre fra den dorsale væg.
  8. Anbring forsigtigt nyre i et 5 ml hætteglas indeholdende 1X PBS og vaskes 3 gange med 3 - 5 ml frisk 1X PBS i 5 minutter hver. Bemærk: Brugen af ​​et hætteglas til håndtering af voksne nyreprøver letter visualisering af væv og giver mulighed for vask med store mængder (i forhold til vævsmasse) på cirka 3 - 5 ml. Alternativt kan en 12-brønds celledyrkningsskål anvendes. Mens en plast mikrocentrifugerør kunne anvendes, kunne standard størrelse rør (1,5 ml) begrænse vask.
  9. Fjern nyre med en pipette og sted overførsel på en ren glasplade med 1-2 dråber 1X PBS.
  10. Brug fine tænger til at flade nyren på diaset, og sørg for ingen væv er krøllet eller på anden måde væltetsig selv. Bemærk: Alternativt kan en wolframtråd værktøj bruges til at lave små snit i bindevævet for at lette fast positionering af nyrerne.
  11. Placer små stykker modellervoks på hvert hjørne af en 18 x 18 mm dækglas og langsomt sat dækglasset på nyrerne. Bemærk: Lidt vinkel dækglasset under anbringelsen for at minimere fældefangst luftbobler i opløsningen 50. Modellerleret opslåede er ca 2 mm i diameter (figur 2A). Alternativt kan divots af vakuum fedt erstattes i stedet af modellervoks. Tilføj en yderligere dråbe 1X PBS for at fylde rummet mellem dækglasset og objektglasset, hvis nødvendigt.
  12. Observere og / eller billede nyren ved at anbringe objektglas i synsfeltet på et stereomikroskop eller sammensat mikroskop med passende filter. Bemærk: Der henvises til Figur 2A til makroskopisk udseende dette dias præparat.

3. FIXAtion, dissektion Permeabilisering og affarvning af Voksen Zebrafisk Kidney

  1. Forbered en frisk fiksativ opløsning af 4% paraformaldehyd (PFA) / 1X PBS / 0,1% DMSO eller tø en frossen portion på 4% PFA / 1 X PBS og tilføje 0,1% DMSO. Forsigtig: PFA er giftig og PFA-løsninger skal håndteres på en kemisk hætte, mens iført passende personlige værnemidler, herunder handsker og kittel. Desuden bør PFA pulver håndteres med forsigtighed, når de foretager stamopløsningen.
  2. Fyld en dissektion bakke med nok fikseringsopløsning at oversvømme hele dyret.
  3. Aflive og montere den valgte zebrafisk i fiksering opløsning (se trin 2,2-2,6). Bemærk: Den valgte fisk kan være en ubehandlet zebrafisk nyre prøve, eller en nyre isoleret fra en zebrafisk, der tidligere har modtaget en intraperitoneal dextran injektion (del 1).
  4. Fastgør prøve O / N (12 - 16 timer) ved 4 ° C.
  5. Den følgende dag, anvender fin pincet til at passefuldt frigøre nyre fra ryggens krop væg og placere orglet i et glas hætteglas ved hjælp af en overførsel pipette. Bemærk: Alternativt kan en 12-brønds eller 24-brønds dyrkningsplade anvendes. Mens en plast mikrocentrifugerør kunne anvendes, kunne standard størrelse rør (1,5 ml) begrænse vask.
  6. Vask dissekeret nyre 3 gange med 3 - 5 ml 1X PBS med 0,05% Tween i 5 minutter hver.
  7. Fjern 1X PBS med 0,05% Tween og skyl nyrerne med 3 ml af en saccharoseopløsning 5% (i 1X PBS) i 30 minutter.
  8. Udskift med 3 ml 30% saccharose-opløsning (i 1X PBS), og opbevare O / N-(12 - 16 timer) ved 4 ° C. Bemærk: saccharoseopløsninger permeabilisere cellemembraner, derefter tillade særlig mærkning af reagenser, når de trænger ind i vævet.
  9. Den følgende dag fjernes 30% saccharose-opløsning og vask nyrerne 2 gange med 5 ml 1X PBS med 0,05% Tween i 5 minutter hver.
  10. Udskift 1X PBS med 0,05% Tween med 3 -5 ml af blegende opløsning for at fjerne melanocyt pigmentering stede på nyrerne orgel.
  11. Placer hætteglas på en rotator og se omhyggeligt som pigmentering forsvinder. Bemærk: Depigmentation tager typisk cirka 20 minutter, når den udføres efter saccharose behandling, men til tider kan tage så lang tid som 60 minutter. Hvis blegende opløsning er tilbage på nyrerne for længe, ​​kan opløsningen af ​​organet forekomme; det tilrådes at overvåge prøven hver 10-15 min at tjekke væv integritet.
  12. Når pigmenteringen er blevet fjernet fra nyren, vaskes to gange med 3 - 5 ml 1X PBS med 0,05% Tween.
  13. Udskift 1X PBS med 0,05% Tween med 3 - 5 ml 4% PFA opløsning i 1 time ved stuetemperatur.
  14. Fjern 4% PFA opløsning og vaske nyre 3 gange med 3 - 5 ml 1X PBS med 0,05% Tween i 5 minutter hver. Bemærk: Når fiksering er færdig, nyrerne også kan monteres på en glasplade og vurderet for dextran uptake sans melanocyt pigmtation, ved at udføre trin 2,8-2,12.
  15. Fjern 1X PBS med 0,05% Tween og erstatte med 3 - 5 ml blokerende opløsning, inkubér derefter nyrerne ved stuetemperatur i blokken i 2 timer.
  16. Når blokering er fuldført, gå direkte til den valgte farvningsprotokol. Bemærk: Nyren kan nu behandles gennem en eller flere andre procedurer med henblik på at foretage mærkning af studier med forskellige reagenser. For hele mount mærkning af den proksimale tubulus med kun alkalisk phosphatase, gå videre til punkt 4. hele mount mærkning af kun den distale tubulus gå til afsnit 5. Alternativt kan afsnit 4 og 5 udføres i lineær rækkefølge for dual opdagelse i hele mount .

4. Navngivning af Voksen Nyre proksimale tubule segmenter med alkalisk phosphatase Detection

  1. Fjern blokken og vask nyrerne 3 gange med 3 - 5 ml 1X PBS med 0,05% Tween i 5 minutter hver, og derefter erstatte 1X PBS med 0,05% Tween med 3 - 5 ml1X PBS. Lad nyre ligge i blød i mindst 10 minutter. Bemærk: I dette tidsrum overføre nyre til en 12-brønd eller 24-brønds dyrkningsskål hvis vævet er blevet holdt i et hætteglas for tidligere procestrin.
  2. Udskift 1X PBS med tilstrækkelig bearbejdning alkalisk fosfatasesubstratopløsning (Se afsløring kit placeret i tabel Materialer) til dækning af prøven, hvorefter placere prøven på en rotator i 30 minutter ved stuetemperatur. Hold prøven beskyttet mod lys.
  3. Reaktionen standses ved vaskning af nyrerne alkalisk phosphatase vaskebuffer opløsning.
  4. Skyl nyrerne med 3 ændringer vaskepuffer opløsning end 10 - 15 min. Bemærk: Efter dette trin, gå direkte til del 5, trin 5.1 (og dermed midlertidigt udelade trin 4,5-4,6), hvis også ønskes mærkning med DBA. Valgfrit trin: At mærke og visualisere cellekerner i organet, sættetid nyrerne propidiumiodid løsning. Forbered en propidiumjodid bestand ved at opløse pulveret i en koncentraning af 1 mg / ml (1,5 mM) i destilleret vand. Fortynd bestanden til 500 nM i 2X SSC og inkuber nyrerne i denne opløsning i 30 minutter. Skyl med 1X PBS og gå videre til trin 4.5.
  5. Fjern Vaskebufferopløsning og montere nyre på en ren glasplade i phosphatasen montering medium indgår i mærkningen kit (Se trin 2,9-2,12). Bemærk: montering medie har erstattet 1X PBS fra trin 2.9.
  6. Visualiser alkalisk phosphatase farves nyre anvendelse af et stereomikroskop eller sammensat mikroskop med en Hoechst / DAPI-filter sæt. Bemærk: Valgfrit trin: Visualiser propidiumiodid ved hjælp af en tetramethyl-rhodamin (TRITC) eller Texas rødt filter.

5. afgrænse Voksen Nyre Distal tubulære segmenter med Rhodamin DBA

  1. Forbered en 200 pi arbejder DBA ved fortynding DBA (2 mg / ml) 1: 100 i 1X PBS.
  2. Udskift 1X PBS med 0,05% Tween-opløsning med 200 ul DBA løsning.
  3. Placer om rotator til1 time ved stuetemperatur.
  4. Fjern DBA opløsning og vaske nyre 3 gange med 3 - 5 ml 1X PBS i 5 minutter hver. Bemærk: Valgfrit trin: At mærke og visualisere cellekerner i orglet sammen med DBA etiket, sættetid nyrerne i DAPI løsning til at opdage med en Hoechst / DAPI-filter (rhodamin DBA plet kan detekteres med en TRITC eller Texas rødt filter). Forbered en DAPI lager ved at opløse pulveret i en koncentration på 5 mg / ml (14,3 mm). Fortynd bestanden til 300 nM i 2X SSC og inkuber nyrerne i denne opløsning i 20 minutter. Skyl med 1X PBS og fortsæt til trin 5.5. Hvis del 4 behandling er udført, skal du huske at DAPI og alkalisk fosfatase er begge detekteres med en Hoechst / DAPI-filter.
  5. Fjern 1X PBS og montere nyre på et rent objektglas (se trin 2,9-2,12).
  6. Visualiser DBA bejdset distale segmenter af nyren ved hjælp af en standard TRITC eller Texas rødt filter indstillet på en fluorescerende stereomikroskop eller sammensat mikroskop. Bemærk: valgfri STEP: Visualiser DAPI hjælp af en Hoechst / DAPI-filter.

6. Indlejring Cryosectioning og farvning (Vital Farvestoffer og Immunohistokemi mærkning) af Voksen Zebrafisk nyrevæv

  1. Vælg fisk til analyse, og derefter aflive, fix, og permeabilisere som beskrevet (trin 3,2-3,8). Bemærk: Fix voksne fisk i 9: 1 ethanol: formaldehyd / 0,1% DMSO i stedet for 4% paraformaldehyd / 1X PBS / 0,1% DMSO for kryosektion fremgangsmåde til fremstilling af dele til dextran, alkalisk phosphatase og DBA visualisering. Men husk på, at paraformaldehyd-baserede optagelser kan være forenelig for nogle immunhistokemi procedurer. Endvidere er blegning af den voksne nyre ikke nødvendig for kryosektion analyse, fordi melanocytter er overfladiske og påvirker ikke visualisering af nephron celler, der omfatter "indersiden" af nyre orgel.
  2. Den følgende dag, skal du fjerne saccharoseopløsningen 30% og erstatte med 1: 1 væv frysemedium: 30% Sucrose i 4 timer ved stuetemperatur.
  3. Fjern 1: 1-opløsning og indkapsle nyreprøver i 100% væv frysemedium i cryomolds og sted ved -80 ° C i mindst 1 time.
  4. Skåret tværs serielle sektioner ca. 12 um tyk, gennem hele voksen nyre.
  5. Monter frosne kryosektioner på selvklæbende objektglas og lad det lufttørre i 1 time ved 50 ° C.
  6. Store glider ved -80 ° C indtil anvendelse.
  7. Når kryosektioner er klar til at blive mærket, fjernes objektglas fra -80 ° C og sted på dias varmere ved 50 ° C i 45 min.
  8. Ved hjælp af en flydende blokker pen, tegne en cirkel omkring kryosektionerne og lad tørre i 15 min på diaset varmere ved 50 ° C.
  9. Fjern dias fra slide varmere og læg fladt i et fugtigt kammer ved stuetemperatur.
  10. Rehydrér kryosektionerne ved tilsætning af 1X PBS med 0,05% Tween til det indkredsede del af objektglassene i 20 minutter. Bemærk: Ca. 200-300 &# 956; l er nødvendig for at dække hver omringede del på et dias.
  11. Udskift 1X PBS med 0,05% Tween-opløsning med frisk 1X PBS og inkuberes i 10 min.
  12. Fjern 1X PBS og inkuberes kryosektioner i en blokerende opløsning i 2 timer. Note: For en 10 ml blokerende opløsning, kombinere 8 ml 1X PBS med 0,05% Tween, 2 ml føtalt kalveserum og 150 pi DMSO. For at udføre immunohistokemi efter bloktrinet, inkubere objektglasset med den ønskede primære antistof fortyndet i frisk blok O / N-ved 4 ° C, vaskes én gang med 1X PBS med 0,05% Tween, inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur med sekundært antistof fortyndet i 1X PBS med 0,05% Tween vaskes én gang med 1X PBS med 0,05% Tween, og montere et dækglas på diaset med montering medium. De krævede antistoffortyndinger vil variere og forsøg skal udføres for at vælge de optimale fortyndinger. Antigen hentning kan også lette immunolabeling, og udføres inden blokering. Umiddelbart efter objektglas optøs ved 50 ° C(Trin 6.8) inkuberes kryosektioner mellem 95 ° C-100 ° C i 40 min i forvarmet 10 mM natriumcitrat-buffer. Cool dias i 30 min, og derefter vaskes to gange i 1X PBS med 0,05% Tween, og fortsæt til trin 6.11.
  13. Den blokerende opløsning fjernes og vaskes kryosektioner 3 gange med 1X PBS i 5 minutter hver.
  14. Udskift 1X PBS med DBA farvningsopløsning og inkuberes i 1 time. Bemærk: Fortynd 1 pi DBA i 99 ul 1X PBS for at lave en 100 ul farveopløsning.
  15. Fjern DBA farveopløsning og vask kryosektioner 3 gange med 1X PBS i 5 minutter hver.
  16. Anvend alkalisk phosphatase mærket og inkuberes i kryosektioner i 10 min.
  17. Vask alkalisk phosphatase fra kryosektionerne med en serie på 3 vaske med vaskebuffer i 10 min. Bemærk: Ved en 100 ml opløsning af vaskebuffer, kombinere 5 ml 0,5 M EDTA og 120 mg levamisol i 95 ml 1X PBS. Du navngiver kerner, inkuberes de sektioner med propidiumiodid eller DAPI på dilutions tidligere bemærket (trin 4.4, 5.4, henholdsvis) i 30 minutter ved stuetemperatur. Vælg en nuklear plet forenelig med kombination af andre fluorescerende pletter, der er blevet valgt.
  18. Fjern al væske fra kryosektionerne og placere 2 dråber montering medium på objektglas.
  19. Placer forsigtigt mikro dækglas på mikroskopobjektglasset. Kryosektioner er nu klar til billede med passende filter (s).

7. WISH Behandling for Voksen Zebrafisk nyreprøver

  1. Vælg de ønskede zebrafisk prøve (r), aflive, fix og dissekere nyrerne som beskrevet (trin 3,1-3,5). Bemærk: Det er vigtigt at anvende en fiksativ opløsning af 4% paraformaldehyd (PFA) / 1X PBS med 0,1% DMSO til permeabilisere nyrerne. Placer nyre i et glas hætteglas til nem visualisering under de efterfølgende procestrin.
  2. Fjern fiksativ og vask nyrerne to gange med 5 ml 1X PBST.
  3. Fjern 1X PBS og vaske nyre to gange with 100% methanol og derefter inkuberes nyrerne ved -20 ° C i mindst 20 minutter for at permeabilisere. Bemærk: dissekeret nyrer kan opbevares på ubestemt tid -20 ° C.
  4. Rehydrér nyren ved at udføre en serie på 5 minutters vaske med 3 - 5 ml 50% methanol / 1X PBST 30% methanol / 1X PBST og to gange med 1X PBST.
  5. Blege nyrerne at fjerne pigmentering som beskrevet (trin 3,10-3,14).
  6. Behandl nyre med 10 ug / ml proteinase K / 1X PBST med 0,1% DMSO i 20 minutter, og derefter skylles to gange med 1X PBST og post-fix i 4% PFA / 1X PBST i 20 minutter til O / N. Bemærk: forberede altid proteinase K brugsopløsning umiddelbart før prøveoplukning ved at kombinere 50 pi af frisk optøet proteinase K lager (10 mg / ml), 50 ml 1X PBST, og 50 pi DMSO.
  7. Behandl nyre til enkelt eller dobbelt WISH følge trinene for riboprobe syntese, præhybridisering, hybridisering, anti-digoxygenin / anti-fluorescein antistof inkubering og detektion som for nylig beskrevet 49. Bemærk: Hele mount billeddannelse af nyre pletter bør udføres inden for flere dage på udførelse af farvning reaktion. Nefron pletter tendens til at falme meget hurtigt, især rødt substrat etiketter. For nefron fotografering, flad montere nyreprøve som beskrevet ovenfor i trin 2,10-2,12, og billedet ved hjælp af et stereo eller sammensat mikroskop. Differential interferens kontrast filtre kan anvendes til bedre at visualisere de cellulære konturerne af nefroner at lette analysen prøve.

Representative Results

Hver af de protokoller, der blev udført på vildtype zebrafisk. Eksempler på data indhentet dokument normale strukturelle sammensætning og egenskaber af nefroner i raske voksne zebrafisk nyre. Den voksne zebrafisk besidder en mesonephros eller anden nyre form, der er placeret på den dorsale kropsvæggen (figur 1A). Den voksne nyre er relativt flad, og indeholder en såkaldt hoved, krop og hale region med overfladiske melanocytter spredt ud over disse regioner (figur 1A). Nyrevævet indeholder forgrenede arrays af nefroner, der forbinder og afstrømning til centrale samlekanalerne (figur 1A). Hver nephron er polariseret langs dens længde, med en blod-filter (eller renal blodlegemer) i den ene ende efterfulgt af en række tubulære segmenter, og endelig er afsluttet på en kanal, der opsamler den løsning, der vil blive udskilt (figur 1A). Hver voksen nefron tubulus indeholder proksimale og distale segmentværsnit af celler, afgrænset af ekspressionen af specifikke opløste transportører 30,31,36,37, der er konserveret med segmental mønster udstillet af embryonale nefroner 31-35 (figur 1b). For eksempel cubilin transkripter markerer den proximale tubulus 39 (PCT og PST) og clcnk transkripter markere den distale tubulus 32 (DE og DL) (figur 1B). Endvidere er PCT-segmentet er kendetegnet ved ekspression af slc20a1a, PST er skelnes ved ekspression af slc13a1 er DE kendetegnet ved ekspression af slc12a1 og DL er kendetegnet ved ekspression af slc12a3 32   (Figur 1B). Forskelle mellem voksen nefronenheder tubuli sammenlignet med embryonale dem er, at de distale segmenter viser vindinger (DE, DL) og DL segment grene udstrakt i den voksne, som adskiller sig fra den lineære, ikke-forgrenet anatomi disse regioner i embryo 30,31,36,37 (figur 1A). I begge voksen 30 og embryonale 38-41 nephron tubuli kan PCT epitel skelnes på grund af dets endocytiske egenskaber og kan visualiseres og vurderes for reabsorptive funktion baseret på evnen til optagelse fluorescerende dextrankonjugater (figur 1B). Endvidere, som påvist i de efterfølgende figurer, den voksne proksimale tubulus (PCT og PST, eller pan-proksimale region) er mærket med alkalisk phosphatase, mens den distale tubulus (DE og DL, eller den pan-distale område) er mærket af DBA (Figur 1B). De metoder, der er anvendt heri til etiket voksne zebrafisk nefronenheder segmenter ved hjælp af dextran optagelse, alkalisk fosfatase, DBA, immunhistokemi eller ønsker kan udføres i forskellige kombinationer i hele Mount eller med histologiske snit af nedsat væv (figur 2). Dette giver mulighed for stor fleksibilitet og sort, når nephron sammensætning skal vurderes (Figur 2).

Den voksne nyre kan monteres fladt på en glasplade til analyse, med opslåede af modellervoks (eller alternativt vakuum fedt), der bruges til at suspendere dækglasset over væv (figur 3A). Som typiske nyre længde er cirka 5-7 mm, har en størrelse bidrager til billeddannelse på en stereo eller sammensat mikroskop (figur 3A). Ifølge lysfelt belysning kan en overfladisk population af melanocytter med sort pigmentering visualiseres i forbindelse med nyrevævet og karrene, såsom aorta kan ses, fordi de cirkulerende erythrocytter har en rød nuance (figur 3B). Efter intraperitoneal injektion af dextran-FITC blev PCT domæner placeret hele mesonephros stadig mærket 3 dage senere, og afbildet under anvendelse af et FITC-filter på et fluorescerende mikroskop (figur 3C). Mens melanocytter delvis tilsløre visualisering af individuelle nyretubuli (FiguRe 3C «), må melanocytter ikke forhindre kvantificering af nephron nummer eller vurderingen af tubulus diameter og længde. Efter intraperitoneal injektion af dextran fluor-rubin, blegning af den faste prøve elimineret melanocyt pigmentering og PCT segmenter blev observeret med lysfelt belysning alene (figur 3D). Lipiddråber fra den abdominale kropskavitet kan undertiden ses i sammenhæng med hele nyre orgel præparater (figur 3A) .Individual PCT-segmenter viser vindinger, spoler (figur 3D '), men også kan være præget af relativt lineære strækninger (figur 3D ").

Forskellige dextrankonjugater forudsat forskellige niveauer af klarhed generelt i proksimal tubulus mærkning. Navnlig dextran-FITC eller dextran fluor-rubin førte til skarpe nephron etiketter med minimal baggrund (figur 3C-D "). Både dextran kaskade blue og Lucifer gul konjugater viste proximale tubulus optagelse i den voksne nyre (figur 4A, 4B). Interessant, nyrer udsat for dextran kaskade blå viste relativt specifik PCT fluorescens med nogle baggrund (figur 4A, 4A), mens nyrer udsat for dextran lucifer gul havde mærket PCT segmenter, men viste mærkbar baggrund signal med uspecifik fluorescensfarvede til stede overalt i renal stroma eller mellemrummet mellem nefroner (figur 4B, 4B). Endelig anvendelse af dextran-fluor rubin billede overlegen proximale tubulus mærkning med minimal eller ingen baggrund, selv når de ses i en række forskellige forstørrelser (figur 4C, 4C). I alle tilfælde, den karakteristiske rørformede mønster af dextrankonjugat optagelse korreleret med ønsket udtryk for transkripter koder for slc20a1a, en etableret PCT-specifik markør 30-32 (figur 4D). Nephrom PCT segmenter farvet med slc20a1a antisense riboprobe vises S-formede PCT spoler, samt mindre skarpt coiled PCT segmenter (figur 4D), som observeret under mærket dextrankonjugat assays (figur 3D ', 3D ").

Andre nyre præparater, såsom påvisning af den proximale tubulus alkalisk phosphatase-aktivitet (figur 5A, 5B, 5C) blev ligeledes udført efter fjernelse af melanocyt pigmentering. Dette gav mulighed for proximale tubulus nefron billedbehandling og analyse uden nogen forhindring. Endogen basisk fosfatase reaktivitet i nephron er en vigtig kendetegnende for den proksimale tubulus 1,47. Alkalisk phosphatase-farvning er yderst specifik for proximale nephron regioner sammenlignet med den pan-proximale WISH ekspressionsmønster af genet cubilin 39 (figur 5D, 5D). Alkalisk phosphatase reaktivitet var mest intens i granst afsnit af den proximale tubulus, der svarer til PCT (figur 5B), der svarer til mønstret af cubilin ekspression (figur 5D, 5D), som også havde højeste relative transkriptniveauer i PCT. PCT blev udmærker sig ved sin lidt bredere diameter, konkret udtryk for transskription faktor mafba (figur 5E, 5E), og specifikt udtryk for det opløste transportør genet slc20a1a (figur 4D 4D «). Alkalisk phosphatase-reaktivitet også mærket en strækning af proksimal tubuli med en tyndere diameter, der svarer til PST-segment (figur 5B) baseret på sammenligning med segmentet-specifik transkript ekspression af det opløste transportør genet slc13a1 (figur 5F, 5F). The Wish udtryk domæner af PCT-markør slc20a1a og PST markør slc13a1 gensidigt udelukker hinanden (figur 5G cubilin (sorte pilespidser på. Figur 5G «, 5G," 5G "' ).

For yderligere at bekræfte forholdet af alkalisk phosphatase reaktivitet med proximale tubulus identitet, hele mount co-mærkning af alkalisk phosphatase-farvning blev udført på nyrer fra zebrafisk, der modtog en intraperitoneal injektion af dextran fluor-rubin 3 dage før (figur 6A-C). Dextran fluor-rubin viste overlapning med alkalisk phosphatase i netop den bredere diameter af den proximale tubulus domæne, der svarer til PCT (eksempler i figur 6D-I). Dextranen-positive domæne brat stoppet på stedet, hvor diameteren af den proximale tubulus udtyndet, dvs hvor PCT og PST opfyldt, (hvid pilhoveder i figur 6), og kun alkalisk phosphatase reaktivitet blev observeret i den efterfølgende PST segmentet (eksempler i figur 6D-I). Baggrundsfluorescens fra alkalisk phosphatase reaktionen også svagt skitserede par parallelle større opsamlingskanal spor findes i den voksne nyre 29,30 -ducts som udmærker sig ved at have den bredeste diameter enhver nyre-associeret rør (asterisker i figur 6A, 6D 6E, 6G, 6H). Dernæst blev observeret i kryosektion analyse co-mærkning af nefronenheder tubuli med alkalisk phosphatase og dextran optagelse (Figur 6J, tubulære omkredse skitseret med hvide prikker). I tværsnit blev alkalisk phosphatase reaktivitet bemærket i en tyk bånd ved den apikale overflade af det rørformede epitel, i overensstemmelse med børste kant ultrastruktur, mens den tilsvarende rørformede celle cytosolisk rum viste dextran fluor-rubin reaktivitet (Figur 6J). Især stained tubuli var enten dobbelt positive for alkalisk phosphatase og dextran, der fører til deres identifikation som PCT segmenter, eller enkeltvis positiv for alkalisk phosphatase (figur 6J, tubulus omkreds skitseret i gule prikker), hvilket fører til en identifikation som en PST-segment (Bemærk: andre tubuli tilstedeværende var negative for begge pletter, data ikke vist) (Figur 6J). Endvidere blev alkalisk phosphatase-farvning (figur 6K) succes kombineret med en nuklear etiket, propidiumiodid (figur 6L), lette celletælling (overlay i figur 6M).

Den distale tubulus af den voksne zebrafisk nephron blev mærket med rhodamin-konjugeret DBA (figur 7). Hele mount dobbelt-mærkning med DBA og alkalisk phosphatase blev udført på nyrer fra vildtype zebrafisk (figur 7A-C). DBA og alkalisk phosphatase reaktivitet viste ingen overlapning i nefronenheder tubuli ( Figur 7G, 7H, 7J), mens forgrening aldrig blev observeret i tubulus segmenter farvet med alkalisk phosphatase. Nyrer kryosnit blev indsamlet fra vildtype zebrafisk, der bærer et transgen, hvor enpep promotoren driver eGFP (Tg: enpep: eGFP) som GFP etiketter både de proximale og distale nephron tubuli 51 (figur 7i). Immunhistokemi blev udført til påvisning af GFP, således at mærke alle de renale tubuli (grøn, fig 7I), efterfulgt af fluorescerende mærkning med alkalisk phosphatase og DBA (turkis og rød henholdsvis figur 7I). Analyse af tubulære sektioner viste, at tubuli var enten positive for alkalisk phosphatase eller DBA, men ikke begge mærker (figur 7i). Kun sjælden karbadmodulerne udviste reaktivitet med hverken alkalisk phosphatase eller DBA plet, muligvis på grund af vinklen af tubulus sektion (hvid pil, figur 7I). Endvidere blev DBA farvning succes kombineret i hele mount nyre farvning med det nukleare etiket DAPI (figur 7J), igen at understrege den karakteristiske forgrenede karakter af de distale tubulus segmenter (hvide pilespidser, figur 7J).

Næste yderligere at sammenligne mønstre af dextran-FITC-optagelse, alkalisk phosphatase og DBA, blev tredobbelt mærkning undersøgt ved intraperitonealt at injicere voksen zebrafisk med dextran-FITC, efterfulgt af nyre isoleret 3 dage senere efterfølges af cryosectioning og farvning for alkalisk phosphatase og DBA (eksempler i figur 8A-E). Nyretubuli viste tre kategorier af label kombinationer: tubuli, der var dobbelt positive for alkalisk phosphatase og dextran betegnet PCT segmenter (hvide stiplede linjer), tubules er positive for alkalisk phosphatase alene betegnet PST segmenter (gule stiplede linjer), og distale tubuli blev mærket ved blot DBA (rød stiplet skitserer figur 8A-E). Endvidere kun DBA positiv tubuli udviste forgreningspunkter (figur 8E). Efter ønske analyse, denne særprægede forgrening mønster af den distale, DBA positive tubuli korreleret med gen-ekspressionsmønstre for opløste transporter transkripter, der er specifikke for de distale tubulære segmenter (figur 8F-I). Udskrifter, der koder clcnk, der markerer hele distale tubulus (DE og DL) var tynd i diameter, rigelige i nyrerne, og indeholdt forgreningspunkter (sort pilespids figur 8F, 8F «). Til sammenligning tubulus segmenter, der viste ekspression af slc12a1 eller slc12a3, som er markører for DE og DL henholdsvis var mindre rigeligt i nyreprøver samlet i forhold til clcnk udtryk (sammenlign figur 8 G og 8F, 8H). Endvidere tubulære segmenter, der udtrykte slc12a1 var sjældent, om nogensinde, forgrenet (figur 8G, 8G '), mens tubulære regioner, der udtrykte slc12a3 ofte blev forgrenet i karakteristiske mølle-lignende ordninger (Figur 8H, 8h', 8h ", 8h" ' , sorte pilespidser). Endelig dobbelt ønske om PCT markør slc20a1a og den distale markør clcnk viste, at disse pletter ikke overlappede hinanden (figur 8I). Især blev de strækninger af slc20a1a udtrykkende PCT segmenter ikke er fastgjort til clcnk som udviser tubuli, hvilket var forventet, da PST ligger mellem disse regioner (figur 8i). Samlet set analyser af mærkning nyretubuli med dextran optagelse, alkalisk phosphatase reaktionsevne, DBA, og ønsker til specifikke gentranskripter, gør det muligt dømmekraft af proksimal kontra distale segmenter.

t "FO: keep-together.within-page =" altid "> Figur 1
Figur 1. Nephron anatomi i den voksne zebrafisk nyre. Skematiske tegninger af (A) voksne zebrafisk nyre og (B) en sammenligning diagram af segmentets molekylære kendetegn ved voksne og embryonale zebrafisk nefroner. (A) (øverst til venstre) Den voksne nyre er en flad organ placeret på den dorsale kropsvæggen. (Øverst til højre), når den ses fra en ventral perspektiv nyren har en karakteristisk buet morfologi, som består af hoved, krop og hale regioner og også har en overflade befolkning tilknyttede melanocytter. Udvidelsen (nederst til venstre) viser en skematisk gengivelse af en typisk nephron træ i den voksne zebrafisk nyre, hvor hver enkelt nephron besidder et blodfilter (renal blodlegemer) i den ene ende efterfulgt af en proximal tubulus distale tubulus og kanalen. Farvede skematiske (BOttom højre) viser en lineær diagram af en voksen nephron træ til at sammenligne segment egenskaber med de embryonale nefroner (B). Zebrafisk embryo nefroner indeholder tubulus segmenter, der omfatter den proximale tubulus (PCT), proksimal lige tubulus (PST), distal tidligt (DE), og distal sent (DL), med respektive genekspressionssystemer domæner nedenfor. Nefroner i den voksne zebrafisk har en lignende segmental sammensætning og analog molekylær signatur er baseret på udtrykket domæner af gener, der koder opløste transportører, selv om en bemærkelsesværdig forskel i forhold til fosteret er, at flere nefroner kan forenes gennem en forgrenet DL segment. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2 Figur 2. Rutediagram kort angiver forholdet mellem de afbildet i denne protokol metoder, som angiver, hvorledes metoderne kan udføres enkeltvis eller i forskellige kombinationer. Efter intraperitoneal injektion af mærket lysin-fixable dextran i den voksne zebrafisk, kan nyre visualiseres i en Hele mount præparat, enten alene eller i kombination med alkalisk phosphatase og / eller DBA pletter. Alternativt kan den valgte zebrafisk nyre undersøges efter histologisk væv sektionering med en kryostat. Sektionerne kan farves til at mærke mange kombinationer af egenskaber, ved hjælp af immunhistokemi, kernefarvning DBA farvning og / eller alkalisk phosphatase reaktivitet. Desuden kan renale sektioner visualiseres direkte for tilstedeværelsen af ​​lysin-fixable dextran optagelse i PCT segmenter. Endelig kan udvalgte nyrer behandles for spatiotemporale ekspression af genekspression ved hjælp af lyst. Parentes tal henviser til corresponde protokol dele. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Voksen zebrafisk nyre flad mount tilberedning og anvendelse på visualisere dextran optagelse i PCT-segment af nyre nefroner. (A) Brightfield billede af en nyre prøven flad mount præparat, i hvilken organet er placeret fladt på et objektglas med et dækglas placeres på toppen af det væv, der hviler på fire opslåede af modellervoks (hot pink farve). Her renal fremstilling afbildes sammen med en metrisk lineal at tilvejebringe en skaleret sammenligning. Den typiske voksne nyre er cirka 5-7 millimeter (mm) fra hoved til hale. (B) Brightfield billede af en ublegetnyre. Den sorte pigmentering svarer til den spredte befolkning melanocytter fundet i forbindelse med nyre og aorta løber langs midterlinjen af nyrerne. (C) Visualisering af nephron PCT segmenter 3 dage efter intraperitoneal injektion af 40 kDa dextran-fluorescein (FITC) uden blegning af den voksne nyre. PCT segmenter set hele nyren, men delvist skjult på grund af melanocytter. (C ') digital zoom på en enkelt nephron med melanocytter (hvid pil). (D) Billede af en voksen nyre 3 dage efter intraperitoneal injektion af 10 kDa dextran fluor-rubin, fiksering af nyre og blegning. Melanocyt pigmentering blev fjernet, og PCT-regioner blev visualiseret her baseret på deres endocytisk optagelse af dextran under lysfelt belysning. Lipiddråber (pil) fra maven kan undertiden ses i forbindelse med renale vævsprøver. (D ', D ") Representative billeder skildrer små morfologiske variationer mellem PCT segmenter. Mens mange nefronenheder PCT er stramt oprullet (D '), andre nefroner indeholder PCT regioner, der har minimal coiling (D "). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
. Figur 4. Voksen nyre nephron PCT tubulus segment mærkning vildtypeplanter zebrafisk blev injiceret intraperitonealt med en enkelt fluorescerende dextrankonjugat; så deres nyre blev undersøgt 3 dage efter injektion til PCT visualisering. (A, A ') Dextran kaskade blå, 10 kDa (B, B') dextran lucifer gul, 10 kDa og (C, C ') dextran f luoro-rubin, 10 kDa alle fortrinsvis mærke de PCT segmenter i den renale nefroner. Både dextran kaskade blå og lucifer gul viser nogle ikke-specifik mærkning af stromacellelinier populationer placeret mellem nefroner, med meget højere baggrund observeret i Lucifer gul behandlede nyrer. I modsætning hertil dextran fluor-rubin viste dramatisk reduceret baggrund med intens PCT mærkning. (D, D ') En voksen nyre farves efter ønske at detektere placeringen af transkripter, der koder slc20a1a, en specifik markør af PCT transportør celletype. Udtrykket domæne slc20a1a matcher karakteristisk mønster af dextran optagelse observeret i nyrer, med en fordeling af forskellige tæt sammenrullet / loopede PCT domæner samt mere aflange PCT strækninger, der viser en konsekvent bred diameter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Indholdsproduktion "FO: keep-together.within-page =" altid "> Figur 5
Figur 5. Repræsentant resultat af farvning for alkalisk phosphatase, en pan-proksimal tubulus markør, i den voksne zebrafisk nyre i forhold til andre proksimale tubulære markører vurderes med ønsker. (AC) alkalisk phosphatase farvning (turkis) lyser Nephron proksimale tubulus, fremhæve både PCT og PST. (DF) Enkelt ønske om børsnoterede gener (hver i lilla farvning). (D, D ') Udtrykket mønster af cubilin , en pan-proksimal (PCT-PST) markør, korrelerer med alkalisk phosphatase (D, D '). Til sammenligning ønske om mafba markerer PCT (E, E) og slc13a1 markerer PST (F, F '). I (GG '") dobbelt ønske om PCT markør slc20a1a </ Em> (rød) og PST markør slc13a1 (lilla) viser, at segmenterne mærket af disse markører ikke overlapper hinanden, og snarere, at deres udtryk domæner besætte tilstødende positioner, når enkelte nefroner der undersøges nøje (G 'G' "). Sorte pilespidser angiver krydset mellem PCT og PST-segmenter, som typisk er forbundet med en ændring i tubulus diameter fra store til små, hhv. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. Alkalisk fosfatase og dextran optagelse viser overlap i PCT segment af voksne nyre nefroner, og alkalisk phosphatase farvning er kompatibel med nukleart samarbejde mærkning med propidiumiodid. (AI) (AC) Fusioneret billede og separate billeder af sadlen region i en enkelt nyre. (DF) og (GI) To sæt fusionerede billeder og separate billeder fra eksempel nefroner. (I) kryosektion analyse bekræfter co-mærkning af alkalisk phosphatase og dextran fluor-rubin i PCT segmenter (skitseret i hvide prikker), mens alkalisk fosfatase alene etiketter PST segment (skitseret i gule prikker). (KM) En nyre varmærket med (K) alkalisk phosphatase (turkis) og (L) propidiumiodid (lilla), der gør det muligt (M) fusioneret visualisering af proximale tubulus celler og deres kerner, henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7
Figur 7. alkalisk phosphatase og DBA er gensidigt udelukkende segment etiketter, der markerer den pan-proksimale og pan-distale områder, henholdsvis til stede hos voksne zebrafisk nyre nefroner. (AH) Hele mount præparater af en zebrafisk nyre farves med alkalisk phosphatase og rhodamin-DBA. Alkalisk phosphatase (turkis) og DBA (rød) ikke viser overlap i nyrerne. Baggrundsniveauer af alkalisk phosphatase belyse par store samlekanalerne i hver nyre (asterisker *), som er karakteristisk på grund af deres brede diameter. DBA positive tubuli er tyndere i diameter og karakteriseres ofte ved tilstedeværelsen af forgreningspunkter (hvide pilespidser). (AC) Fusioneret billede og separate billeder af sadlen region i en enkelt nyre. (DF) Et sæt af sammenflettede billeder og separate billeder af eksempel nefroner. (G, H) Yderligere eksempler, med forgrenede DBA tubuli sammen alkalisk fosfatase positive tubuli, fusionerede billeder. (I) kryosektion analyse bekræfter, at alkalisk fosfatase og DBA label særskilte tubulære sektioner, og kun sjældne tubuli viser hverken etiket (hvid pil ), sandsynligvis på grund af vinklen på afsnittet for at tubulus. I denne analyse vildtype transgene fisk, Tg: enpep: eGFP, blev anvendt, og alle de nyretubuli i denne nyre blev immunolabeled med et primært antistof til påvisning af GFP (J). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 8
Figur 8. Tre mærkning af voksne nyre kryosektioner med dextran optagelse, alkalisk phosphatase og DBA forhold til distale segment WISH analyse. (AE) Voksne nyrer blev injiceret intraperitonealt med dextran-FITC (grøn) og nyrerne samlet 3 dage senere for indlejring og cryosectioning. Farvning med alkalisk phosphatase (turkis) og DBA (rød) afslørede tre populationer af tubuli: PCT segmenter, der var positive for alkalisk phosphatase reaktivitet og DEXTløb (skitseret i hvide prikker), PST segmenter, der var positiv kun for alkalisk phosphatase reaktivitet (skitseret i gule prikker), og distale tubulus segmenter, der var positive for DBA kun (skitseret i røde prikker), som også viste karakteristiske distale gren point. ( AD) sammenflettede billede og separate billeder af et eksempel sektion. (Ø) flettede billede af et andet eksempel sektion. (FI) Sammenligning af distale tubulus genekspressionsmønstre ved en enkelt (FH «) og dobbelt (jeg) ønsker det. Den (FH) Enkelt ønske om børsnoterede gener (hver i lilla farvning). (F, F ') Udtrykket mønster af clcnk, en pan-distal (DE-DL) markør blev påvist i tynde tubuli, der indeholdt forgreningspunkter (sort pilespids). (G, G ') Til sammenligning ønske om slc12a1 markerer DE uden forgreningspunkter opdaget, og (HH «) <em> slc12a3 markerer DL, et segment er kendetegnet ved mange forgreningspunkter hele nyre orgel (sorte pilespidser). (I) Dobbelt ønske om PCT markør slc20a1a (rød) og den pan-distale clcnk (lilla). Segmenterne mærket med disse markører ikke overlapper, og snarere deres udtryk domæner besætte ikke-tilgrænsende positioner, således at de enkelte PCT spoler (nederst til højre) ikke fejlregistreringer distale tubuli, og sidstnævnte besætte diskrete placeringer og besidde kendetegnende forgreningspunkter (sort pilespids ). Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Her har vi beskrevet metoder, der muliggør visualisering af nephron segment komponenter i den voksne zebrafisk. Injektion af fluorescerende dextrankonjugater giver præferentiel PCT-mærkning på grund af de endocytiske egenskaber af disse proximale tubuliceller 30,38. Denne metode kan udføres med stor fleksibilitet på grund af eksistensen af ​​dextraner, der kan opnås med en sværm af forskellige fluorescerende konjugater. Hertil kommer, at anvendelse af lysin-fixable dextraner er en særlig bekvem måde til at mærke PCT segmenter, som sekundære etikettering ikke er påkrævet. Dette gør det muligt relativt enkel afsløring signal og er kompatibel med mange andre fluorescerende mærker, immunolabeling og anvendelse af transgene reporter linier. Alkalisk phosphatase mærkning markerer også den proksimale tubulus, med stærk reaktivitet i PCT og lidt svagere reaktivitet i PST. Endelig DBA farvning muliggør mærkning af distale tubulus segmenter, som viser en lmaracteristic forgrenet morfologi. Forskellige lectin-molekyler, som sukker-bindende proteiner af ikke-immun oprindelse, er blevet anvendt i vid udstrækning til at skelne pattedyr nephron segmenter 47. Det er interessant, at DBA i zebrafisk korrelerer med distale tubulus segmenter, som det anvendes til at markere samlekanalerne i mammale nyrer 47.

Tilsammen kan disse metoder anvendes i forskellige kombinationer for at dokumentere nedsat sammensætning og funktion. Da alle disse metoder kan anvendes i hele nyre præparater, de giver redskaber til at vurdere nefron struktur og funktion i hele orglet uden helt at forlade sig på brugen af mere tidskrævende, kedelige metoder, f.eks kryosektion arbejde og immunolabeling. Men pletterne er beskrevet i denne metoder artikel er levedygtige i kryosektion. Kryosektion analyse genererer prøver (sammenlignet med hele mount), der er bedre egnet til immunhistokemi til påvisning af specifikke peptides, selvom naturligvis denne type analyse kræver adgang til passende primære antistoffer. Desværre er en stor begrænsning i at arbejde med zebrafisk dyremodel forbliver den ringe tilgængelighed af antistoffer. Ønsker således fortsat den mest udbredte, dvs 'gå til, «procedure til analyse af genekspression. WISH hjælp BCIP, NBT og / eller INT substratreaktioner at producere lilla eller røde bundfald er ikke kompatibel med fluorescerende farvning på kryosektioner. En mulighed ville være at påberåbe sig brugen af ​​fluorescerende WISH afsløring, en procedure, der er optimeret til zebrafisk embryoner prøver og kunne tilpasses til brug med voksne nyre. Beskrivelsen af ​​de metoder, der i denne video artikel bør give mulighed for yderligere at eksperimentere med teknikker som fluorescerende ØNSKE i kombination med transgene zebrafisk linjer, hvor de enkelte segmenter er mærket med en journalist som eGFP eller mCherry. Alternativt metoderne beskrevet her could testes i kombination med andre vitale farvestoffer, fx andre lektiner. Således kunne en yderligere tilpasning og udbygning af de metoder, der er beskrevet her påberåbes for at passe til forskerens behov for hele mount nyre præparater og analyse.

Som sådan, disse metoder har et bredt potentiale for gennemførelsen med zebrafisk model for løbende restitution undersøgelser og også i genetisk sygdom modellering. Der er et presserende behov for innovativ forskning og behandlinger for nyre lidelser. Millioner af mennesker lider af en form for nyresygdom hvert år, der skyldes medfødte, akutte og / eller kroniske årsager. Endvidere er forekomsten af nyresygdom fortsætter med at stige på verdensplan, hvilket gør disse sygdomme et globalt offentligt sundhedsproblem 14,15. Behandlinger som hæmodialyse er til rådighed, hvorved en ekstern dialyse maskine tjener til at befri en patients blod af metaboliske affald, hvis deres nyrer ikke er i stand til at udføre denne rolle. Desværre, Dette indgreb har sine begrænsninger, da igangværende behandling er nødvendig for at overleve. Desuden vil patienterne i sidste ende kræve en nyretransplantation, der kan tage år at modtage, når en patient er placeret på en venteliste. Selv efter at have fået en nyretransplantation, mange patienter lider bivirkninger som følge af proceduren og må kæmpe disse virkninger for resten af ​​deres liv. Disse vanskeligheder demonstrere det store behov for udvikling af nye behandlinger til enten at hjælpe med at forhindre nyresygdom eller måske forøge vævsregeneration 8,16,52,53. I betragtning af de åbenlyse etiske begrænsninger i anvendelsen af ​​menneskelige forsøgspersoner i biomedicinske laboratorier, dyremodeller er afgørende for studiet af sygdomme hos mennesker patogenese og afprøvning af nye behandlinger. Som et resultat af sin anatomiske lighed og evolutionære nærhed, er musen blevet den mest udbredte model af human sygdom 45. Der er imidlertid visse begrænsninger med dette dyr, including manglende evne til at visualisere udviklingen orgel in vivo og praktiske færdiggøre genetiske skærme store. Zebrafisk er en relevant og brugbar model organisme for studiet af udvikling orgel og modellering af human sygdom 45,46. Med hensyn til sygdom hos mennesker, funktionelle homologer i zebrafisk findes for næsten 70% af alle humane gener 54,55.

Nyligt arbejde har fremhævet anvendeligheden af zebrafisk for mange områder af nyre forskning 31,37,56. Undersøgelser af regenerering og reparation i zebrafisk efter AKI tyder på, at tubulus epitel regenerering og neonephrogenesis er to processer, der foregår, og overlapper hele regenerering tidsforløbet 30,37. Brugen af et aminoglykosid antibiotikum kaldet gentamicin er blevet udnyttet som en skade paradigme, hvorigennem til at studere resultaterne af AKI hos voksne zebrafisk 29,30,37. Over en cirka to-ugers periode efter skaden fra gentamicin, den proksimale tubules regenerere, og i mellemtiden nye nefroner dannes hele orglet 29,30,37. I almindelighed, de mekanismer, der regulerer epitelial regenerering fortsat er yderst kontroversiel. I en foreslåede mekanisme af reparationen, er der den indledende akut skade begivenhed efterfulgt af en hamskifte af døde celler ind i lumen. Dernæst er der en række de-differentiering, proliferation og migration begivenheder, hvorefter nye celler differentiere og befolker den skadede basalmembran og genoprette funktionen til det beskadigede sted. Alternativt har andre undersøgelser foreslået, at udskiftning celler opstår fra stamceller / stamceller, der bor inden for nefronenheder tubuli. For så vidt angår processen neonephrogenesis i zebrafisk, har cellulære aggregater blevet observeret efter AKI af gentamicin injektion 29,30. Disse aggregater senere modnes til nye nefroner der lod ind i allerede eksisterende tubuli 29,30. Den fælles tråd, der forener nefron epitelial regenerering og neonephrogenesis er deres blotte mysterium faktor: på nuværende tidspunkt er eksponentielt flere spørgsmål om, hvordan disse regenerative feats forekomme, end der er ledige indsigt.

Til dato er der imidlertid flere spændende linjer af beviser støtter den opfattelse, at renal regenerering forskning ved hjælp af zebrafisk faktisk kan levere relevante komparative indsigt i menneskelig AKI, der også kan have direkte translationel potentiale 56-58. Kemisk screening for at identificere små molekyler, som øger proliferationen af renale progenitorceller i zebrafisk embryo nylig førte til identifikation af histondeacetylase-inhibitor methyl-4-(phenylthio) butanoat (m4PTB) 56,57. Administrationen af denne forbindelse til zebrafisk larver med gentamicin-induceret AKI afslørede, at larvernes overlevelse steget, og at renal tubulær spredning blev forstærket 56,58. Når mus med moderat iskæmi-induceret AKI blev behandlet med m4PTB blev deres helbredelse accelereret i Association med en reduktion i både tubulær atrofi og cellecyklusstop prolifererende tubulære celler 58. Disse resultater tyder på, at de veje, der er ansvarlige for normal zebrafisk renal udvikling og / eller den regenerative reaktion på AKI vil blive bevaret med pattedyr 56.

Således, mens yderligere undersøgelser er nødvendige for at drille hinanden mekanismerne i regenerering-nemlig at identificere de signalveje, der er involveret, og forstå deres interaktioner-den zebrafisk giver en lovende avenue at forfølge dette vigtige mål i nefrologi området. Værktøjer som nephron celle etiketter, der er beskrevet i denne protokol udgør en gruppe af analyser, der kan bruges til at vurdere nyre sammensætning og funktionalitet i AKI-modeller. Endvidere kan de anvendes til at karakterisere transgene modeller af nyresygdom og kan give måder at identificere kemiske terapi kan fremme genopretning af nephron struktur efter renal dæmningalder.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af finansiering til RAW fra følgende: National Institutes of Health giver K01 DK083512, DP2 OD008470, og R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar tildeling af tilskud # 5-FY12-75; opstart midler fra University of Notre Dame College of Science og Biologisk Institut; og en generøs gave til University of Notre Dame fra Elizabeth og Michael Gallagher på vegne af Gallagher familie til at fremme stamcelleforskning. De finansieringskilderne havde ingen rolle i undersøgelsen design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Vi takker stabe af Biologisk Institut for deres støtte, og Center for zebrafisk Forskning ved Notre Dame for deres enestående engagement i pleje og velfærd i vores zebrafisk koloni. Endelig vil vi takke medlemmerne af vores forskningslaboratorium for deres kommentarer, diskussioner og indsigter om dette arbejde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X PBS Made by diluting 10 X PBS in distilled water.
1X PBST 0.1% Tween-20 detergent in 1 X PBS.
1X PBS with 0.05 % Tween 0.05% Tween-20 detergent in 1 X PBS.
Tween 20 American Bioanalytical AB02038
4% PFA/1X PBS Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20°C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. 
Fine Forceps Roboz RS-1050 Dumont Tweezers Pattern #55 
Glass slide Thermo-Fisher 4445 White Frost 
Glass coverslip Thermo-Fisher 12-540A 18 x 18 mm
Modeling clay Hasbro Playdoh Other modeling clays can be substituted and work similarly
Slide holder Thermo-Fisher 12-587 Optional: cardboard tray to store slides flat
Bleaching solution Bleach mix formula (for a 20 ml solution):
1.6 ml of 10% Potassium hydroxide solution
0.6 ml of 30% Hydrogen peroxide solution
100 μl of 20% Tween
Fill to 20 ml with distilled water
Potassium hydroxide Sigma 221473
Hydrogen peroxide Sigma H1009
Blocking solution Blocking Solution (for a 10 ml solution):
8 ml of 1X PBS with 0.05% Tween
2 ml of fetal calf serum
150 μl of DMSO
Alkaline phosphatase activity detection Invitrogen E6601 We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.  To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer's instructions. 
Alkaline phosphatase wash solution Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 ml solution):
5 ml of 0.5 M EDTA
120 mg of Levamisole
95 ml of 1X PBS
Dextran, fluorescein, 40,000 MW Invitrogen D1844 Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, cascade blue, 10,000 MW Invitrogen D1976 Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW Invitrogen D1825 Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW Invitrogen D1817 Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine Vector laboratories RL-10-32 DBA Staining Solution (for a 100 μl solution):
1 μl of DBA
99 μl of 1X PBS
Propidium iodide Invitrogen E6601
DAPI Invitrogen P1304MP
Vectashield hard set mounting medium Vector laboratories H-1400
Micro cover glass VWR 48393081
Dimethyl sulfoxide, DMSO American Bioanalytical 67-68-5
Sucrose Sigma S0289
EDTA, 0.5 M solution, pH 8.0 American Bioanalytical AB00502
Levamisole Sigma L-9756
Tissue freezing medium Triangle Biomedical Sciences, Inc. TFM-C
Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10 x 10x 5 mm Sakura Finetek 4565
TruBond 380 adhesive microscope slides Tru Scientific 0380W
Liquid blocker – super PAP pen Electron Microscopy Sciences 71312
Immuno stain moisture chamber Evergreen Scientific 240-9020-Z10
Cryostat Therm Microm™ HM 525 Cryostat
Stereomicroscope Nikon SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection. 
Compound microscope Nikon 96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reilly, R. F., Bulger, R. E., Kriz, W. Structural-functional relationships in the kidney. Diseases of the Kidney and Urinary Tract. RW, S. chrier Lippincott Williams Wilkins. Philadelphia, PA. 2-53 (2007).
  2. Dressler, G. R. The cellular basis of kidney development. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 509-529 (2006).
  3. Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. Anat Rec. 232, 194-201 (1992).
  4. Cebrian, C., Borodo, K., Charles, N., Herzlinger, D. A. Morphometric index of the developing murine kidney. Dev Dyn. 231, 601-608 (2004).
  5. Schedl, A. Renal abnormalities and their developmental origin. Nat Rev Genet. 8, 791-802 (2007).
  6. Ricci, Z., Cruz, D. N., Ronco, C. Classification and staging of acute kidney injury: beyond the RIFLE and AKIN criteria. Nat Rev Nephrol. 7, 201-208 (2011).
  7. Faubel, S., et al. Ongoing clinical trials in AKI. Clin J Am Soc Nephrol. 7, 861-873 (2012).
  8. Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospects and challenges. Clin Transl Med. 2, 11 (2013).
  9. Liu, Y. Cellular and molecular mechanisms of renal fibrosis. Nat Rev Nephrol. 7, 684-696 (2011).
  10. Murugan, R., Kellum, J. A. Acute kidney injury: what’s the prognosis. Nat Rev Nephrol. 7, 209-217 (2011).
  11. Palevsky, P. M. Chronic-on-acute kidney injury. Kidney Int. 81, 430-431 (2012).
  12. Chawla, L. S., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease: an integrated clinical syndrome. Kidney Int. 82, 516-524 (2012).
  13. Bucaloiu, I. D., Kirchner, H. L., Norfolk, E. R., Hartle, J. E., Perkins, R. M. Increased risk of death and de novo chronic kidney disease following reversible acute kidney injury. Kidney Int. 81, 477-485 (2012).
  14. Collins, A. J., et al. USRDS 2012 Annual Data Report: Atlas of Chronic Kidney Disease and End-Stage Renal Disease in the United States (2012). Lancet. 365, 331-340 (2012).
  15. El Nahas, M. eguid, Bello, A., K, A. Chronic kidney disease: the global challenge. Lancet. 365, 331-340 (2005).
  16. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction. Biochem J. 444, 153-168 (2012).
  17. Toback, F. G. Regeneration after acute tubular necrosis. Kidney Int. 41, 226-246 (1992).
  18. Thadhani, R., Pascual, M., Bonventre, J. V. Acute renal failure. N Engl J Med. 334, 1448-1460 (1996).
  19. Bonventre, J. V. Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure. J Am Soc Nephrol. 14, S55-S61 (2003).
  20. Romagnani, P., Kalluri, R. Possible mechanisms of kidney repair. Fibrogenesis Tissue Repair. 2, 3 (2009).
  21. Bonventre, J. V., Yang, L. Cellular pathophysiology of ischemic acute kidney injury. J Clin Invest. 121, 4210-4221 (2011).
  22. Grgic, I., et al. Targeted proximal tubule injury triggers interstitial fibrosis and glomerulosclerosis. Kidney Int. 82, 172-183 (2012).
  23. Reimschuessel, R. A fish model of renal regeneration and development. ILAR J. 42, 285-291 (2001).
  24. Reimschuessel, R., Williams, D. Development of new nephrons in adult kidneys following gentamicin-induced nephrotoxicity. Ren Fail. 17, 101-106 (1995).
  25. Salice, C. J., Rokous, J. S., Kane, A. S., Reimschuessel, R. New nephron development in goldfish (Carassius auratus) kidneys following repeated gentamicin-induced nephrotoxicosis. Comp Med. 51, 56-59 (2001).
  26. Augusto, J., Smith, B., Smith, S., Robertson, J., Reimschuessel, R. Gentamicin-induced nephrotoxicity and nephroneogenesis in Oreochromis nilotica, a tilapian fish. Dis Aquatic Org. 26, 49-58 (1996).
  27. Elger, M., et al. Nephrogenesis is induced by partial nephrectomy in the elasmobranch Leucoraja erinacea. J Am Soc Nephrol. 14, 1506-1518 (2003).
  28. Watanabe, N., et al. Kidney regeneration through nephron neogenesis in medaka. Develop Growth Differ. 51, 135-143 (2009).
  29. Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
  30. Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-101 (2011).
  31. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
  32. Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, e189 (2007).
  33. Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-1127 (2008).
  34. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  35. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev Biol. 386, 111-122 (2014).
  36. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. 54, (2011).
  37. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
  38. Drummond, I. A., et al. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125, 4655-4667 (1998).
  39. Anzenberger, U., et al. Elucidation of megalin/LRP2-dependent endocytic transport processes in the zebrafish pronephros. J Cell Sci. 15, 2127-2137 (2006).
  40. Majumdar, A., Drummond, I. A. The zebrafish floating head mutant demonstrates podocytes play an important role in directing glomerular differentiation. Dev Biol. 222, 147-157 (2000).
  41. Kramer-Zucker, A. G., Wiessner, S., Jensen, A. M., Drummond, I. A. Organization of the pronephric filtration apparatus in zebrafish requires Nephrin, Podocin, and the FERM domain protein Mosaic eyes. Dev Biol. 285, 316-329 (2005).
  42. Brien, L. L., Grimaldi, M., Kostun, Z., Wingert, R. A., Selleck, R., Davidson, A. J. Wt1a, Foxc1a, and the Notch mediator Rbpj physically interact and regulate the formation of podocytes in zebrafish. Dev Biol. 358, 318-330 (2011).
  43. Ebarasi, L., Oddsson, A., Hultenby, K., Betsholtz, C., Tryggvason, K. Zebrafish: a model system for the study of vertebrate renal development, function, and pathophysiology. Curr Opin Nephrol Hypertens. 20, 416-424 (2011).
  44. Swanhart, L. M., Cosentino, C. C., Diep, C. Q., Davidson, A. J., de Caestecker, M., Hukriede, N. A. Zebrafish kidney development: basic science to translational research. Birth Defects Res C Embryo Today. 93, 141-156 (2011).
  45. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  46. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
  47. Cox, W. G., Singer, V. L. A high-resolution, fluorescence-based method for localization of endogenous alkaline phosphatase activity. J Histochem Cytochem. 47, 1443-1456 (1999).
  48. Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish kidney development. Methods Cell Biol. 100, 233-260 (2010).
  49. Watson, L., Vassallo, J., Cantor, G., Lehman-McKeeman, L. Lectin histochemistry: an alternative to immunohistochemistry for identify specific structures in rat papillary necrosis. HistoLogic. 41, 28-31 (2008).
  50. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J Vis Exp. e51604 (2014).
  51. Seiler, C., Pack, M. Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene. Gene Expr Patterns. 11, 118-121 (2011).
  52. Little, M. H. Regrow or repair: potential regenerative therapies for the kidney. J Am Soc Nephrol. 17, 2390-2401 (2006).
  53. Romagnani, P., Lasagni, L., Remuzzi, G. Renal progenitors: an evolutionary conserved strategy for kidney regeneration. Nat Rev Nephrol. 9, 137-146 (2013).
  54. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
  55. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
  56. Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and acute kidney disease: translational research insights from zebrafish chemical genetics. General Med. 1, (3), (2013).
  57. Groh, E. D., et al. Inhibition of histone deacetylase expands the renal progenitor population. J Am Soc Nephrol. 21, 794-802 (2010).
  58. Cosentino, C. C., et al. Histone deacetylase inhibitor enhances recovery after AKI. J Am Soc Nephrol. 24, 943-953 (2013).
Analyse af Nephron opbygning og funktion i Voksen Zebrafisk Kidney
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (90), e51644, doi:10.3791/51644 (2014).More

McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (90), e51644, doi:10.3791/51644 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter