Summary
제브라 피쉬의 성인 신장은 신장 재생과 질병 연구를위한 훌륭한 시스템입니다. 이러한 연구의 중요한 양태는 네프론의 구조와 기능의 평가이다. 이 프로토콜은 네프론의 세뇨관 조성물을 평가하기 위해 신장 재 흡수를 평가하도록 구현 될 수있는 몇 가지 방법론을 설명한다.
Abstract
제브라 피쉬 모델은 신장 개발, 재생과 질병을 연구하는 중요한 시스템으로 떠오르고있다. 모두 배아와 성인 zebrafish의 신장이 높은 포유 동물을 포함한 다른 척추 동물에 보존되어 네프론로 알려진 기능 단위로 구성되어있다. 제브라 피쉬의 연구는 최근 성인 네프론 손상이 발생 후 2 독특한 현상이 발산 것을 증명하고있다 : 첫째, 파괴 세관 상피 세포를 대체 기존의 네프론 내에서 강력한 재생이; 둘째, 완전히 새로운 네프론은 neonephrogenesis으로 알려진 과정에서 신장 전구 세포로부터 생성된다. 대조적으로, 인간과 다른 포유류 네프론 상피 재생을위한 제한된 능력을 가지고있는 것처럼 보인다. 현재까지, 이러한 신장 재생 현상에 대한 책임이 메커니즘은 제대로 이해 남아있다. 성인 zebrafish의 신장이 모두 네프론 상피 재생 및 neonephrogenesis를 받아야하기 때문에, 그들은 뛰어난 실험 항을 제공이러한 이벤트를 공부 다임. 또한, 신 재생을 조절 세포와 분자 메커니즘을 서술하기 위해 사용될 수있다 제브라 피쉬 모델에서 사용할 수있는 약리학 적 및 유전 적 다양한 도구가있다. 이러한 연구의 한 중요한 양태는 네프론의 구조와 기능의 평가이다. 이 프로토콜은 성인 zebrafish의 신장에 신장 조성물 및 테스트 네프론 기능을 측정하는 데 사용할 수있는 표시 기술의 집합을 설명한다. 따라서, 이들 방법은 다음을 포함하지만 이에 한정되지 않는다 성인 지브라 피쉬 신장 손상 패러다임, nephrotoxicant 노광 체제 또는 nitroreductase 매개 세포 어블 레이션 기술로서 표적 세포 사멸 유전자 방법 미래 표현형 특성에 널리 적용 할 수있다. 또한, 이들 방법은 성인의 신장 형성 유전 섭동을 연구하는데 사용될 수 있으며, 만성 질환 모델링시 신장 상태를 평가하기 위해 적용될 수있다.
Introduction
신장은 체내에서 생리 기능의 다수를 만족 복잡한 기관이다. 신장의 가장 중요한 기능은 신진 대사 폐기물 배출하고,이 작업은 밀접하게 유체 항상성의 유지와 얽혀있다. 신장 병용 혈압, 전해질 수준, 산 - 염기 평형을 조절하면서, 혈액을 여과하고 소변을 형성하여 이러한 작업을 수행한다. 네프론이라는 고도의 전문 상피 세관은 신장 1, 2의 기본 기능 단위의 역할을한다. 성인 척추 동물에서 네프론은 일반적으로 많은 세관은 매우 작은 장기로 포장하는, 따라서 수 있도록 중앙 집중식 배수 시스템을 둘러싼 단단히 코일 배열로 구성됩니다. 예를 들어, 각 인간의 신장 이상 1,000,000 네프론 세를 포함 할 수 있습니다. 마우스와 같은 다른 포유류 신장 4 당 8-10000 네프론의 순서에 가지고있다. 신장 복잡성의 정도는이 포유류와 다른 높이 요 사이에 차이가전체 네프론의 수가 변형 및 신장 내에서의 구조적 배치로 인한 ebrates. pronephros, mesonephros 및 metanephros : 척추 동물의 종은 최대 3 개의 연속 개발하는 동안 신장의 구조 및 네프론 자질 및 배치와 관련하여 복잡성을 증가 각 양식에 표시를 형성한다. 유지하는 구조는 최종 신장 성인 신장 장기 전형적 mesonephros 또는 metanephros이 역할을한다. 각 신장 형태는, 그러나, 네프론 계 조성물이있다.
네프론은 신장의 주력이고 대사 분비 및 재 흡수와 함께 혈액 여과를 담당합니다. 네프론은 상피 세포로 구성된 간단한 관상 구조입니다 차별화 된 상피 세포의 분리, 고도의 전문 도메인이 특정 작업을 수행하는 분절 조직을 보유하고 있습니다. 네프론을 통한 여과 유량 위하여, 일반적으로 3 주요 부를 compris 그 존재각 전자 장치 (1) 신장 소체, 기단, 중간 및 원위 세그먼트 (2) 세뇨관, 및 (3) 집합관 1. 근위 세뇨관 유기 용질, 특히 포도당과 아미노산을 하나의 재 흡수에 대한 책임이있다. 중간 가느 다란 관 (또는 헨레 루프)는 소금과 물 규제가 하나의 주요 사이트입니다. 마지막으로, 소금과 다른 이온의 미세 조정은 원위 세뇨관과 집합관에서 발생하는 높은 내분비 시스템 (1)에 의해 조절된다. 거기에서, 여액은 궁극적 노폐물 한 바와 같이 본체를 종료, 및 방광 요관을 통해 여행.
신장 기능의 감소는 정상적인 활동 네프론을 방지 원인 다수 유래 할 수있다. 이러한 원인은 신장 개발, 예를 들면, 부상의 다른 유형에서 네프론 5, 또는 원인의 기형을 초래할 선천성 결함 (유전 및 environme 모두에 따른 중에 발생할 수ntal 기원). 획득 부상은 크게 급성 신장 손상 (AKI) 또는 만성 신장 손상 (CKD)으로 분류됩니다. AKI는 종종 허혈이나 독소에 노출 6,7로 인한 신장 기능의 급격한 손실을 포함한다. 포유 동물에서 상피 수리 네프론은 부상 후 8 가능하고, 많은 사람들은 AKI 후 신장 기능의 완전한 회복을 나타낸다. 70 %의 발생 범위 6,7 - 그러나, AKI는 넓은 (30)를 통해보고 된 높은 이환율과 사망률과 관련이 있습니다. CKD는 대조적으로, 일반적으로 섬유화 8,9과 관련된 장기 손상의 년의 결과 신장 기능의 점진적인 감소와 연관되어 있습니다. 어느 하나가 다른 10 ~ 12에 개인을 걸리기 수 또한, 상호 작용은 AKI와 CKD 사이에 존재합니다. 예를 들어, AKI에서 고통을 사람들은 CKD와 죽음 (13)에 더 민감하다. 신장 질환의 발생률은 미국 및 전 세계적으로 모두 epide에 도달했습니다마이크 비율과는 세 인구는 신장 (14, 15)에 대한 재생 의학의 개입을 식별 할 필요성이있다 - 따라서 확장으로 증가 할 것으로 예상된다.
AKI 환자가 회복 할 수있는 지식에도 불구하고, 긴 신장이 선천적 인 재생 능력이없는 기관이라고 생각하고있다. 이 전통적인보기는 극적으로 최근 16 년에 개정되었다. AKI 후 마우스 및 쥐에서 신장 손상을 조사하는 연구는 네프론의 세뇨관 상피 세포 증식 및 기능 네프론 17-20를 재 구축 할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 포유 동물은 네프론을 다시 생성이 적응 능력을 가지고 있지만, 신장 섬유증 및 CKD 21로 이어질 트리거 할 수 있습니다 주목할만한 한계와 부적응 반응이있다. 예를 들어, 최근의 연구는 쥐의 네프론에서 반복 상피 세포의 박리가 감소 된 재생 및 근래 신장 섬유증 - 제안 네프론와 관련이 있음을 증명EA는 재생 임계 값 (22)을 제한했다. 성인 포유 동물의 신장, 분실 또는 손상된 것들을 대체 할 새로운 네프론을 형성하여 자신의 파괴는 영구적 인 네프론 적자 8,9 리드 있다는 증거는 없습니다. 흥미롭게도, 어떤 척추 동물은 콩팥의 상피를 재생하여도 새로운 네프론을 생산하여 AKI에 응답 마십시오 과정은 neonephrogenesis 또는 네프론 신생 (23)라고 함. Neonephrogenesis 독소에 노출 또는 부분 절제술 후 물고기에서 발생, 부상 모델은 역사적으로 최근에는 금붕어 24, 25, 틸라피아 (26), 스케이트 (27), 송사리 (28), 그리고 제브라 피쉬 (29, 30)을 포함했다. 이들 중, 제브라 피쉬 신장 재생에 책임 세포 및 분자 경로를 발견하도록 가능한 유전자 연구 모델을 제공한다.
이 비디오 문서에서는, 우리는 성인 제브라 피쉬에서 네프론 세그먼트 레이블을하는 방법을 보여줍니다. 네프론의 해부학, 분자 기능에 대한 지식,기능적인 특성은 제브라 피쉬를 사용하여 성공적인 미래 신장 연구에 필수적이다. 성인 zebrafish의 신장은 mesonephros 구조입니다 성인 포유류, avians, 파충류 31에있는 metanephros 구조보다 네프론의 수와 조직의 관점에서 본질적으로 덜 복잡하다. 그러나, 제브라 피쉬 네프론 세그먼트는 포유 동물 조직과 유사하며, 제 유전자 발현 연구에 기초하여 31-35 배아 신장에서 설명 하였다. 제브라 피쉬 배아 네프론은 근위 세뇨관 (PCT)를 포함 선형 세관 세그먼트, 근위 곧은 세관 (PST), 말초 초기 (DE) 및 말초 말 (DL) 31 ~ 35 (그림 1)이 포함되어 있습니다. Zebrafish의 성인 네프론 유사한 관 세그먼트에게 30,31,36,37 (그림 1)를 가지고있다. PCT 또한 기능적 표현형에 의해 식별 될 수있다 : PCT 상피 세포에 존재하는 형광 표지 덱스 트란 화합물 (10-70 kDa의 크기)를 포함한다배아 및 성인 지브라 피쉬 신장 모두에서 사용되어왔다 순환 이러한 근위 세뇨관 세포 38-41 (도 1)에 의해 세포 내 이입 흡수를 평가한다. 제브라 피쉬와 포유류 사이의 네프론 분야에서 한 가지 차이점은 제브라 피쉬는 중간 세관 또는 헨레 30-37의 루프 부족이다; 포유 동물에서이 세그먼트 기능은 물을 절약하고, 제브라 피쉬는 소변을 집중 긴급없는 담수 종 때문에, 제브라 피쉬는이 세그먼트 (32, 33)이 부족한 것은 놀라운 일이 아니다. 따라서, 전체적인 네프론 조성물은 크게 제브라 피쉬 및 포유류 신장 32,33간에 보존된다. 이러한 유사성은 발달 nephrogenesis 32-35,42 중에 신장 발현 유전자의 기능을 조사함으로써, 인간 일 수 조건의 실질적인리스트에 추가하는, 수많은 신장병 43, 44를 모델링하기 위해 효과적인 연구 도구로 지브라 피쉬를 활성화 사용하여 조사제브라 피쉬의 45, 46.
오늘날, 성인 zebrafish의 신장으로 인해 유전 온순함이 종의 유전자 기능과 신호 전달 경로를 심문 할 수 기술 자원의 확대 입맛에 신 재생의 비교 연구를위한 매력적인 모델입니다. 여러 연구 AKI 29,30,37 후 재생의 메커니즘을 조사하기 위해 제브라 피쉬 mesonephros을 사용했다. 성인 zebrafish의 신장을 계속 사용 AKI 연구의 경우, 네프론의 기능을 조사하기 위해 다른 네프론 지역과 방법에 레이블 절묘한 방법이 필수적이다. 성인 신장의 분석을위한 여러 가지 방법이 배아 신장 프로토콜에서 적응하고있다. 성인 제브라 피쉬의 형광 표지 덱스 트란의 복강 내 주사는 제브라 피쉬 배아 38-41 (그림 1)에서와 같이, 엔도 시토 시스 (30)를 통해 mesonephros의 네프론의 PCT 상피 레이블. 이 방법은 visualiz하는 데 사용되었습니다근위 세뇨관 복원 생리 기능 30 (그림 1)의 한 평가를 할 수 AKI을, 다음 자신의 재 흡수 특성을 회복 전자. 네프론 근위 세뇨관의 또 다른 특징은이 분야에서 상피 세포가 내인성 알칼리 포스파타제 활성의 높은 수준을 나타내고 브러시 테두리 (37)를 갖고 있다는 점이다. 따라서, 근위 상피 ELF- (효소 형광 표지)로 알려진 형광 기반 기술 -97 (47)를 사용하여 성인 제브라 신장 시각적 지역화 될 수있다.
여기서는 근위 세뇨관의 기능 평가를 획득하고이 세뇨관 세그먼트의 크기 및 형상을 매핑하도록, 제브라 피쉬 신장 성인 형광 덱스 트란 흡수 분석법 30,48보기를 수행하는 방법을 설명한다. 다음으로는 형광 라벨 알칼리 포스 파타 아제 (alkaline phosphatase)와 성인 네프론의 근위 세뇨관 영역을 레이블 기술을 설명합니다. 셋째, 우리는 처음으로로드 '게재아민 태그 렉틴 Dolichos는 포유류 낭 (49)에 포집 관의 일반적인 마커로 사용되었다 응집소 (DBA) biflorus, 제브라 피쉬 성인 신장의 원위 세관을 표시한다. DBA는 알칼리성 포스 파타 아제 염색에 상호 배타적이기 때문에,이 라벨은 크게 성인 zebrafish의 네프론의 팬 원심 뻗어 대 팬 근위을 구별 할 수있는 방법을 제공합니다. 전체 마운트 및 저온 유지 조직 학적 섹션 모두에서 이러한 형광 얼룩의 구현을 통해, 우리는 고유 각 네프론 세그먼트를 식별 용질 수송 유전자의 발현 도메인과이 라벨의 상관 관계. 따라서이 프로토콜은 또한 우리의 배아 WISH 프로토콜 50을 기반으로 현장 하이브리드 (WISH) 분석에서 성인 조직 전체 마운트에 대한 수정 된 조직 처리 절차에 대한 안내가 포함되어 있습니다. 이러한 절차는 O 형태 학적 및 기능적 특성을 문서화하는 다양한 조합으로 (그림 2)을 사용할 수 있습니다F 성인 zebrafish의 신장 네프론. 따라서,이 프로토콜은 재생 연구, 다른 신장 질환 모델의 표현형 특성에 적용 할 수 있으며, 심지어 신장 성인의 형성을 연구하는 데 사용.
Protocol
이 프로토콜에 설명 된 제브라 피쉬의 작업을위한 절차는 노트르담 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 참고 : 제브라 피쉬의 신장 네프론 해부학에 대한 안내 (그림 1)을 제공한다. 이 프로토콜에 설명 된 방법론의 개요가 동일한 신장 샘플에서 수행 될 수있는 방법을 여러 라벨링 절차 보여주는 흐름도 (도 2)로 제공된다. 성인 신장 연구 WISH 준비에 제 7의 경우, 여기에 나와있는 단계는 최근 신장 기관의 성공적인 WISH 분석을위한 기술적 인 가이드를 제공하기 위해, 50를 발표 한 제브라 피쉬 배아의 처리를 수정하는 방법을 나타냅니다.
관심 덱스 트란과 1 성인 Zebrafish의 복강 내 주입
- 농도로 증류수에 덱스 트란 분말을 용해하여 원하는 형광 표지 덱스 트란 스톡 (S)를 준비50 밀리그램의 / ㎖, 다음 어둠 속에서 -20 ºC에서 마이크로 원심 튜브에 분주을 저장합니다. 참고 : 다양한 형광 표지 덱스 트란은 상업적으로 사용할 수 있습니다. 원하는 다른 레이블의 조합에 따라 사용할 덱스 트란을 선택하고 적절한 형광 필터가 사용되는 현미경을 사용할 수 있습니다 확인하십시오. 라이신 - 고칠 수 덱스 트란 생활 샘플에서 더 라벨링 단계없이 형광, 안락사 표본에서 고정되지 않은 조직 샘플, 고정 표본을 보여줍니다.
- 원하는 덱스 트란 주식을 해동 수행하는 동안 1.3-1.5 단계를 어둠 속에서 얼음에 저장합니다. 처리하는 동안 광으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일에 microcentrifuge 관을 감싸.
- 2 분 - 약 1 0.02 %의 tricaine 또는 0.001 % 2 - 페녹시 에탄올를 포함하는 접시에 물고기를 배치하여 시대에 5-7개월 사이의 성인 제브라 피쉬를 마취. 참고 : SMA 어린 물고기가있을 수 있기 때문에이 연령대의 성인 제브라 피쉬를 사용하는 것이 바람직하다LL 해부하기 어려운 신장, 및 오래 물고기 신장 샘플은 분석 될 수 없다 흉터 조직의 질량을 포함 할 수있다. 제대로 마취 때, 성인 제브라 피쉬 부드럽게 물고기의 꼬리 지느러미를 터치 숟가락이나 무딘 프로브를 사용하여 테스트 할 수 자극을, 터치 응답을 전시하지 않습니다.
- 플라스틱 숟가락을 사용하여, 접시에서 물고기를 들어 솔루션을 가만히 따르다 조심스럽게 젖은 스폰지 금형, 복부 쪽이 위로에 동물을 배치합니다.
- G 31 1.0 cc의 인슐린 주사기를 사용하여, 복강 내 공간으로 해동 덱스 트란 스톡 용액 20 μl를 주입. 그 삽입 복부의 복부 정중선에서 얕은 각도로 발생하지 않도록 바늘의 방향. 장기 천공 방지하기 위해 약간 다음 바늘을 삽입 덱스 트란 용액 (48)을 주입 할 수있는 공간이 물고기의 몸 벽을 들어 올려 만들 수 있도록 그것을 올립니다. 주의 : 2 : 2 : 1 (덱스 트란 : 또는 덱스 트란 재고 1의 비율로, 예를 들면, 희석 수를 DIS) 물을 경작, 샘플의 배경 형광을 감소시킨다.
- 조심스럽게 마취에서 회복 할 수 있도록 탱크에 물고기를 반환합니다. 참고 : 근위 세뇨관의 부문 별 덱스 트란의 통풍 관은 8 내에서 발생 - 12 시간 최소 3까지 일 후 분사 (dpi)로 검출 할 수있다. 3 DPI의 분석은 신장 간질 인구 낮은 배경 형광 강한 세관 신호를 제공한다. 추가 라벨이 요구되지 않는 경우, 단독으로 덱스 트란 흡수의 전체 마운트 검사를 위해 2 부에 진행합니다. 조합 라벨 들어, 덱스 트란 흡수, 알칼리 포스 파타 아제 및 / 또는 제 5 이중 라벨에 다음 제 4의 전체 마운트 검사를 위해 조직을 준비하기 위해 DBA의 더블 또는 트리플 라벨을 수행하기 위해 제 3 부에 진행합니다. 조직 학적 섹션을 사용하여 연구를 들어, 저온 유지 장치를 사용하여 신장의 미세 섹션을 만드는 방법과 기본 및 보조 antib 다양한 라벨 및 / 또는 면역 조직 화학 이러한 얼룩하는 방법에 대한 자세한 내용은 6 부에 계속오디.
2 해부 및 고정되지 않은 동물의 샘플에서 성인 Zebrafish의 신장의 평면 마운트 준비 근위하는 Tubule의 형광 덱스 트란 레이블을 시각화하기
- 5 분 - 4 0.2 % Tricaine의 pH를 7.0 접시에 배치하여 덱스 트란 주입 성인 제브라 피쉬를 안락사. 참고 : 물고기가 아가미 운동을 중단하고 심장이 36 박동 정지 여부를주의 깊게 모니터링하여, 진행하기 전에 안락사되었는지 확인하십시오.
- 플라스틱 숟가락을 사용하여, Tricaine 솔루션에서 물고기를 들어 솔루션을 가만히 따르다 및 조직 또는 종이 수건에 동물을 배치합니다.
- 아가미 아가미 뒤에 상처를하고 머리를 제거하기 위해 해부 가위의 날카로운 쌍을 사용합니다.
- 즉시 꼬리 지느러미의베이스에 머리에서 긴 복부 절개를하여 해부 가위와 물고기의 몸을 엽니 다.
- 미세 겸자의 쌍을 이용하여 생선의 내장을 제거한다.
- 동물의 등 벽에 부착되는 신장 기관의 시각화를 허용 할 수 있도록 신체의 벽을 개방 핀 슈퍼 미세 해부 바늘을 사용합니다.
- 등쪽 벽에서 신장을 떼어 미세 집게를 사용합니다.
- 부드럽게 1X PBS를 함유하는 5 mL 유리 바이알에 신장을 놓고 3로 3 회 씻어 - 5 분마다 신선한 1X PBS 5 ㎖. 주 : 성인 신장 샘플 취급 유리관의 사용은 조직의 시각화를 용이하게하고 약 3의 (조직 덩어리에 상대적인) 대량으로 세척 가능 - 5 ㎖. 대안 적으로, 12 - 웰 세포 배양 접시를 사용할 수있다. 플라스틱 microcentrifuge 관이 사용될 수 있지만, 표준 크기의 튜브 (1.5 ml)을 세척을 제한 할 수있다.
- 1X PBS의 1-2 방울과 깨끗한 유리 슬라이드에 전송 피펫과 장소 신장을 제거합니다.
- 확인 어떤 조직 말려하거나, 그렇지 않으면 전복하고있어, 슬라이드에 신장을 평평하게하는 미세 집게를 사용하여자체. 참고 : 또는 텅스텐 와이어 도구 신장 평면 위치 결정을 용이하게하기 위해 결합 조직의 작은 절개를 만들기 위해 사용될 수있다.
- 18 X 18mm 유리 커버 슬립의 각 모서리에 점토의 작은 조각을 놓고 천천히 신장 상에 커버 슬립을 설정합니다. 참고 : 배치하는 동안 약간의 각도 커버 슬립은 솔루션 (50)에 공기 방울을 트래핑 최소화 할 수 있습니다. 모델링 점토 디 보트는 직경이 약 (그림 2A)에서 2mm이다. 대안 적으로, 진공 그리스의 디봇은 점토 대신에 치환 될 수있다. 필요한 경우 유리 커버 슬립과 슬라이드 사이의 공간을 채우도록 1X PBS의 추가적인 감소를 추가한다.
- 적절한 필터를 가진 화합물 또는 실체 현미경 시야에 유리 슬라이드를 위치시킴으로써 신장을 관찰 및 / 또는 이미지. 참고 :이 슬라이드 준비의 거시적 외관도 2a를 참조하십시오.
3 Fixa기, 해부, Permeabilization과 성인 Zebrafish의 신장의 색소 침착 제거
- 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) / 1X PBS / 0.1 % DMSO의 신선한 정착액 솔루션을 준비 또는 4 % PFA / 1 X PBS의 고정 나누어 해동 및 0.1 % DMSO를 추가합니다. 주의 : PFA는 독성이 장갑 및 실험실 코트를 포함하여 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 동안 PFA 솔루션은 화학 후드에서 처리되어야한다. 원액을 할 때뿐만 아니라, PFA 분말을 조심스럽게 취급되어야한다.
- 전체 동물을 잠수 할 수있는 충분한 정착 솔루션을 해부 트레이를 입력합니다.
- (단계 2.2-2.6 참조) 안락사와 고정 용액 선택된 지브라 피쉬 마운트. 참고 : 선택한 물고기가 치료 제브라 피쉬 신장 표본, 또는 이전에 복강 주사 덱스 트란 (1 부)를받은 제브라 피쉬에서 고립 된 신장 될 수 있습니다.
- 4 O C.에서 - (16 시간 12) 샘플 O / N 수정
- 다음 날, 신경 미세 집게를 사용완전히 지느러미 몸 벽에서 신장을 분리하고 전송 피펫을 사용하여 유리 병에 기관을 배치합니다. 주 : 대안 적으로, 12 - 웰, 24 - 웰 배양 접시를 사용할 수있다. 플라스틱 microcentrifuge 관이 사용될 수 있지만, 표준 크기의 튜브 (1.5 ml)을 세척을 제한 할 수있다.
- 5 분 각각 0.05 % 트윈과 1X PBS 5 ml의 - 3 해부 신장 3 회 반복한다.
- 0.05 % 트윈로 1X PBS를 제거하고 30 분 동안 (1X PBS)에 5 % 자당 용액 3 ㎖로 신장을 헹군다.
- 4 O C.에서 - (16 시간 12) (1X PBS)에 30 % 자당 용액 저장 O / N 3 ㎖로 교체 주 : 수크로오스 해법들이 조직을 관통 시약으로서 이후의 특정 표시를 허용 세포막을 Permeabilize 하시려면.
- 다음 일, 30 % 자당 용액을 제거하고 5 분 각각 0.05 % 트윈과 1X PBS의 5 ㎖의 신장을 2 회 반복한다.
- 3 0.05 % 트윈으로 1X PBS를 교체 -표백 용액을 5 ㎖의 신장 기관에 존재하는 멜라닌 세포의 색소를 제거합니다.
- 회 전자에 유리 병을 놓고 색소가 없어주의 깊게보세요. 한 60 분 걸릴 수 있습니다 가끔 자당 치료 후 수행 할 때 탈색은 일반적으로 약 20 분 걸리지 만 주. 표백 용액을 너무 오래 신장에 남아 있으면, 기관의 분해가 발생할 수있다; 그것은 조직의 무결성을 확인하기 위해 샘플마다 10 ~ 15 분을 모니터링하는 것이 좋습니다.
- 0.05 % 트윈으로 1X PBS 5 ㎖ - 착색이 신장에서 제거 된 경우, 3 회 씻는다.
- 실온에서 1 시간 동안 4 % PFA 용액 5 ㎖ - 3 0.05 % 트윈으로 1X PBS를 교체합니다.
- 4 % PFA 용액을 제거하고 3 신장 3 회 세척 - 5 분마다 0.05 % 트윈로 1X PBS 5 ㎖. 주 : 정착이 완료되면, 신장도 유리 슬라이드 상에 장착 및 덱스 트란 흡수 산세 멜라노 티탄 안료에 대해 평가할 수있다이 정해져는 2.8-2.12 의해 단계를 수행.
- 0.05 % 트윈으로 1X PBS를 제거하고 3로 교체 - 차단 솔루션 5 ㎖, 다음 2 시간 동안 블록에 실온에서 신장을 배양한다.
- 블로킹이 완료되면, 선택된 염색 프로토콜로 직접 진행. 참고 : 신장 지금 다른 시약으로 라벨링 연구를 수행하기 위해 하나 이상의 다른 과정을 통해 처리 될 수있다. 단 알칼리성 포스파타제와 근위 세뇨관의 전체 마운트 라벨링, 또는, 제 4 및도 5는 전체 마운트 듀얼 검출 용 리니어 연속적으로 수행 될 수있다 5 절에 가서 만 원위 세뇨관의 전체 마운트 라벨링 제 4로 진행 .
4 알칼리 포스 파타 아제 탐지와 성인 신장 근위 세뇨관 세그먼트에 레이블
- 블록을 제거하고 신장 3로 3 회 씻어 - 5 분마다 0.05 % 트윈으로 1X PBS 5 ㎖를, 다음 3 0.05 % 트윈로 1X PBS를 교체 - 5 ㎖1X PBS의. 신장은 적어도 10 분 동안 담가하자. 주 : 조직은 이전의 공정 단계를위한 유리 병에 보관되어있는 경우이 시간 동안, 12 웰 또는 24 웰 배양 접시에 신장을 전송.
- 충분한 작업 알칼리성 포스파타제 기질 용액 후, 샘플을 커버 RT에서 30 분 동안 회전기 상에 샘플을 배치 (원료의 표에있는 검출 키트를 참조)로 1X PBS를 장착. 빛으로부터 보호 샘플을 보관하십시오.
- 알칼리성 포스파타제 세척 완충액에서 신장을 세척하여 반응을 정지.
- 15 분 - 10 세척 완충 용액의 3 변경 사항이있는 신장을 씻어. 참고 : DBA와 라벨도 필요한 경우이 단계 후, (따라서 일시적으로 단계 4.5-4.6 생략), 제 5 부에 직접 진행 5.1 단계. 옵션 단계 : 레이블과 장기 세포 핵을 시각화, 요오드화 프로피 듐 솔루션의 신장을 흡수합니다. 집중하고있는 분말을 용해시켜 요오드화 프로피 듐 스톡 준비증류수에 1 ㎎ / ㎖ (1.5 mM)을의 기. 2X SSC 500 ㎚에 스톡을 희석하고 30 분 동안이 용액에 신장 배양. 1X PBS로 세척하여 4.5 단계로 진행합니다.
- (단계 2.9-2.12 참조) 세척 완충 용액을 제거하고 라벨 키트에 포함 된 인산 장착 매체에 깨끗한 유리 슬라이드에 신장을 탑재합니다. 참고 : 설치 매체는 단계 2.9에서 1X PBS를 대체했다.
- 훽스트 (Hoechst) / DAPI 필터 세트와 실체 또는 복합 현미경을 사용하여 신장 스테인드 알칼리 포스 파타 아제를 시각화. 선택 단계 : 주 테트라 메틸 로다 민 (TRITC) 또는 텍사스 레드 필터를 사용하여 요오드화 프로피 듐을 시각화.
5 로다 민 DBA와 성인 신장 원위 세관 세그먼트를 획정
- 1X PBS 100 (2 ㎎ / ㎖) 1 DBA를 희석하여 200 ㎕의 작업 DBA 솔루션을 준비합니다.
- 200 μL의 DBA 솔루션으로 0.05 % 트윈 솔루션 1X PBS를 교체합니다.
- 에 대한 회전에 배치실온에서 1 시간.
- DBA 용액을 제거하고 3 신장 3 회 세척 - 5 분마다 1X PBS 5 ㎖. 참고 : 선택 단계 : 레이블 및 DBA 라벨과 함께 장기 세포 핵을 시각화, (로다 민 DBA 얼룩은 TRITC 또는 텍사스 레드 필터를 검출 할 수있다) 훽스트 (Hoechst) / DAPI 필터를 감지 할 수 DAPI 용액의 신장을 흡수하기 위해. 5 ㎎ / ㎖ (14.3 mM)을 농도로 용해시켜 분말 DAPI 재고를 준비한다. 2X SSC에서 300 nm의 주식을 희석하고 20 분 동안이 솔루션에 신장을 배양한다. 1X PBS로 세척하여 5.5 단계로 진행합니다. 제 4 부 처리를 수행 한 경우, DAPI 및 알칼리 포스 파타 아제 (alkaline phosphatase)가 모두 훽스트 (Hoechst) / DAPI 필터를 감지 명심하십시오.
- (단계 2.9-2.12 참조) 1X PBS를 제거하고 깨끗한 유리 슬라이드에 신장을 탑재합니다.
- 형광 실체 현미경 또는 복합 현미경에 설정된 표준 TRITC 또는 텍사스 레드 필터를 사용하여 신장의 DBA 염색 원위 세그먼트를 시각화. 참고 : 옵션들스탭 : 훽스트 (Hoechst) / DAPI 필터를 사용하여 DAPI를 시각화.
6 임베딩, 저온 절편 및 염색 성인 Zebrafish의 신장 조직의 (생명 염료 및 면역 라벨링)
- , 분석을 위해 물고기를 선택한 다음 안락사, 수정하고, (단계 3.2-3.8)에 설명 된대로 Permeabilize 하시려면. 주 : 1 에탄올 : 9 성어 고쳐 4 % 파라 포름 알데히드 대신에 포름 알데히드 / 0.1 % DMSO / 1X PBS / 덱스 트란, 알칼리 포스파타제, 및 DBA 시각화 섹션을 생성하는 동결 절단 (Cryosections) 절차를위한 0.1 % DMSO. 그러나, 파라 포름 알데히드 기반 고착 일부 면역 조직 화학 염색 절차 호환 될 수 있다는 점에 유의하십시오. 멜라닌 세포가 피상적이고 신장 기관의 "내부"를 구성하는 네프론 세포의 시각화에 영향을주지 않기 때문에 또한, 성인 신장의 표백은 동결 절단 (Cryosections) 분석을 위해 필요하지 않습니다.
- 다음 일, 30 % 자당 용액을 제거하고 1로 교체 : 한 조직 동결 매체 : 30 % sucros을실온에서 4 시간 동안 전자.
- 한 솔루션 적어도 1 시간 동안 -80 ℃로 cryomolds 중간과 장소를 동결 백퍼센트 조직에서 신장 샘플을 포함 : 하나를 제거합니다.
- 가로 전체 성인 신장을 통해 약 12 μm의 두께, 시리얼 부분을 잘라.
- 접착 현미경 슬라이드에 냉동 저온부를 탑재하고 50 O ℃에서 1 시간 동안 공기 건조하도록 허용
- 저장소가 사용할 때까지 -80 ℃로 슬라이드.
- 저온부가 표시 될 준비가되면, 현미경은 45 분 동안 50 ℃에서 따뜻한 슬라이드에 -80 오 C와 장소에서 슬라이드를 제거합니다.
- 액체 차단제 펜을 사용하여, 저온부 주위에 원을 그리고 슬라이드에서 15 분 동안 건조시켜 50 O ℃에서 따뜻한
- 따뜻한 슬라이드에서 슬라이드를 제거하고 실온에서 습도 챔버에 평면 배치합니다.
- 20 분 동안 슬라이드 둘러싸인 부분에 0.05 % 트윈로 1X PBS를 추가하여 저온부를 재수. 참고 : 약 200-300 &를# 956, L은 각각의 슬라이드에 둘러싸인 부분을 커버하기 위해 필요하다.
- 신선한 1X PBS 0.05 % 트윈 솔루션 1X PBS를 교체하고 10 분 동안 배양한다.
- 1X PBS를 제거하고 2 시간 동안 차단 솔루션에서 저온부을 배양한다. 주 : 차단 용액 10 ㎖를 들어, 0.05 % 트윈, 2 ml의 소 태아 혈청을 150 ㎕의 DMSO에 8 ㎖의 1X PBS을 결합한다. 차단 단계 후 면역 조직 화학 염색을 수행하려면, 0.05 % 트윈과 1X PBS를 한 번 씻어 사용, 4 O C에서 / N 신선한 블록 O에 희석 원하는 차 항체와 슬라이드를 품어 희석 차 항체 용액을 실온에서 2 시간 동안 배양 1X PBS는 0.05 % 트윈으로, 0.05 % 트윈과 1X PBS를 사용하여 한 번 세척하고, 매체를 장착와 슬라이드에 커버 슬립을 탑재합니다. 필요한 항체 희석은 다양하고 실험은 최적의 희석을 선택하기 위해 수행해야합니다. 항원 검색도 immunolabeling을 용이하게 할 수 있으며, 차단하기 전에 수행합니다. 슬라이드는 50 O C에서 해동 후 바로예열 된 10 mM 시트르산 나트륨 완충액에서 40 분 동안 95 O C O-100의 C 사이의 저온부를 부화 (6.8 단계). 다음 0.05 % 트윈과 1X PBS로 두 번 세척하고, 6.11 단계로 진행, 30 분 동안 슬라이드를 냉각.
- 차단 솔루션을 제거하고 5 분마다 1X PBS와 저온부 3 회 씻는다.
- DBA 염색 용액으로 1X PBS를 교체하고 1 시간 동안 배양한다. 참고 : 100 ㎕의 염색 솔루션을 만들기 위해 1X PBS의 99 μL에서 1 μL의 DBA를 희석.
- DBA 염색 액을 제거하고 5 분마다 1X PBS와 저온부 3 회 씻는다.
- 알칼리 포스 파타 아제 라벨을 적용하고 10 분 동안 저온부에 품어.
- 10 분마다 세척 버퍼의 3 세척 일련의 저온부 떨어져 알칼리 포스 파타 아제을 씻으십시오. 세척 버퍼의 100 ML 솔루션의 1X PBS의 95 ML로의 levamisole의 5 0.5 M EDTA ml의 120 mg의 결합 : 주. 디에서 요오드화 프로피 듐 또는 DAPI와 섹션을 품어 핵에 레이블을 지정하려면lutions 이전에 RT에서 30 분 동안 (각각 단계 4.4, 5.4 등) 언급. 선정 된 다른 형광 얼룩의 조합과 호환 핵 얼룩을 선택합니다.
- 저온부에서 모든 액체를 제거하고 현미경 슬라이드에 미디어를 장착 2 방울을 배치합니다.
- 조심스럽게 현미경 슬라이드에 마이크로 커버 유리를 배치합니다. 저온부는 적절한 필터 (들)과 이미지 이제 준비가 된 것입니다.
성인 Zebrafish의 신장 샘플에 대한 7 WISH 처리
- 원하는 제브라 피쉬의 표본 (들)을 선택 안락사, 수정하고 (단계 3.1-3.5)에 설명 된대로 신장을 해부하다. 참고 : 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 정착 솔루션을 사용하는 것이 필수적입니다 / 1X PBS 0.1 % DMSO와 함께 신장을 Permeabilize 하시려면합니다. 이후의 처리 단계에서 쉽게 시각화를위한 유리 병에 신장을 놓습니다.
- 정착액을 제거하고 1X PBST 5 ㎖로 두 번 신장을 씻는다.
- 1X PBS를 제거하고 신장을 두 번 WI 씻어100 % 메탄올 번째 다음 Permeabilize 하시려면 적어도 20 분 동안 -20 ℃로 신장 배양. 주 : 해부 신장 무한정 저장할 수 있습니다 -20 C. O를
- 1X PBST 5 50 % 메탄올 / PBST (1X), 30 % 메탄올 / 1X PBST ml의 회 - 3 5 분간 세척의 시리즈를 수행하여 신장을 재수.
- (단계 3.10-3.14)에 설명 된대로 색소 침착을 제거하는 신장 블리치.
- 다음 O / N로 20 분 동안 4 % PFA / 1X PBST에 1X PBST 및 사후 수정으로 두 번 씻어 20 분 동안 0.1 % DMSO와 10 μg / ml의 단백질 분해 효소 K / 1X PBST로 신장을 취급합니다. 참고 : 항상 갓 해동 단백질 분해 효소 K 주식의 50 μL (10 ㎎ / ㎖), 1X PBST 50 ㎖ 및 DMSO의 50 μl를 결합하여 샘플 소화하기 직전 솔루션을 작업 테 K를 준비합니다.
- riboprobe 합성, 예비 혼성화, 하이브리드, 안티 digoxygenin / 안티 fluoroscein 항체 배양 및 detec의 단계에 따라 단일 또는 이중 WISH의 신장을 처리기는 최근 49를 설명했다. 참고 : 전체 신장 얼룩의 영상은 염색 반응을 수행 며칠 내에서 수행해야 합니. 네프론 얼룩은 매우 빠르게 특히 빨간색 기판 레이블을 퇴색하는 경향이있다. 네프론 촬영의 경우, 평면 스테레오 - 또는 복합 현미경을 사용하여 신장 2.12 단계 2.10에서 상술 한 바와 같이 샘플 및 이미지를 마운트합니다. 차동 간섭 콘트라스트 필터는 더 시료 분석을 용이하게하기 위해 셀룰러 네프론의 윤곽선을 시각화하는데 이용 될 수있다.
Representative Results
각 프로토콜은 야생형 제브라 피쉬에서 수행 하였다. 데이터의 예로는 문서에게 건강한 성인 zebrafish의 신장 내에서 정상적인 구조 조성 및 네프론의 특성을 획득했습니다. 성인 제브라 피쉬는 지느러미 체벽 (그림 1A)에있는 mesonephros 또는 초 신장 양식을 보유하고있다. 성인 신장은 비교적 평평하고이 지역 (그림 1A)에 흩어져 표면적 인 멜라닌 세포와 소위 머리, 몸통, 꼬리 영역을 포함하고 있습니다. 신장 조직은 중앙 집진 덕트 (그림 1A)에 연결하고 배수 네프론의 배열을 분기 포함되어 있습니다. 각각의 네프론은 배설된다 용액 (도 1a)을 수집 덕트에서 세뇨관 세그먼트 시리즈, 그리고 마지막으로 종단 하였다 일단 혈액 필터 (또는 신장 소체)와, 그 길이 방향으로 편광된다. 각 성인 네프론의 세뇨관은 근위 및 원위 segmen을 포함세포의 TS는 배아 네프론 31-35 (그림 1B)에 의해 전시 된 분절 패턴으로 보존되어 특정 용질 수송 30,31,36,37의 발현에 의해 경계가. 예를 들어, cubilin 성적은 근위 세뇨관 39 (PCT 및 PST)를 표시하고 clcnk 성적은 원위 세뇨관 32 (DE 및 DL) (그림 1B)를 표시합니다. 또한, PCT 세그먼트 slc20a1a의 식에 의해 구별되고,이 PST slc13a1의 식에 의해 구별된다, DE는 slc12a1의 식에 의해 구별되고, DL은 slc12a3 32의 발현에 의해 구별된다 (그림 1B). 배아들에 비해 성인 네프론의 세뇨관의 차이점은 원위 세그먼트 EMBR의 선형,이 지역의 비 지형 해부학과 구별되는, 성인, 광범위 회선 (DE, DL) 및 DL 세그먼트 지점을 표시한다는 것이다요 30,31,36,37 (그림 1A). 양쪽 성인 (30) 및 배아 38-41 네프론의 세뇨관에서는 PCT 상피 세포 내 이입이 그 특성으로 인해 구별 될 수 있고, 가시 및 형광 덱스 트란의 복합체 (도 1b)으로의 흡수 할 수있는 능력에 기초 reabsorptive 함수에 대해 평가 될 수있다. 이후 그림, 성인 근위 세뇨관 (PCT 및 PST 또는 팬 인접 지역)에 설명 된대로 원위 세뇨관 (DE 및 DL, 또는 팬 - 말단 영역) DBA에 의해 표시되는 동안 또한, 알칼리 포스 파타 아제에 의해 표시된다 (그림 1B). 덱스 트란 흡수, 알칼리 포스 파타 아제, DBA, 면역 조직 화학 염색 또는 WISH를 사용하여 라벨 성인 zebrafish의 네프론 세그먼트 여기에서 사용 된 방법은 전체 마운트 또는 신장 조직 (그림 2)의 조직 학적 섹션으로, 다양한 조합으로 수행 할 수 있습니다. 네프론의 조성물을 평가하는 것입니다 때 유연성과 다양성을 허용 (그림 2).
성인의 신장은 점토의 디봇과, 분석을 위해 유리 슬라이드에 평평한 장착 될 수있다 (또는 대안 적으로, 진공 그리스)는 조직 (도 3A) 위에 커버 슬립을 정지하는 데 사용. 전형적인 신장 길이 약 5-7mm 바와 같이, 그 화합물 또는 스테레오 현미경 (도 3a)에 촬상에 도움이되는 크기를 갖는다. 명 시야 조명 아래 검은 색소와 멜라닌 세포의 표면 인구는 순환하는 적혈구가 붉은 색조 (그림 3B)를 가지고 있기 때문에 볼 수있는 등의 대동맥으로 신장 조직과 관련하여, 그리고 혈관으로 시각화 할 수 있습니다. FITC-덱스 트란의 복강 내 주사에 이어 mesonephros 통하여있는 PCT 도메인은 여전히 삼일 후에 표지 및 형광 현미경 (도 3c)에 FITC 필터를 사용하여 영상화되었다. 멜라닌 세포가 부분적으로 (Figu 개별 신장 세뇨관의 시각화를 모호하지만3C ') 재, 멜라닌 세포는 네프론 번호 또는 가느 다란 관 직경 및 길이의 평가의 정량화를 방지하지 않습니다. 덱스 트란 플루오 루비의 복강 내 주사에 따라, 고정 된 샘플의 표백은 멜라닌 색소를 제거하고, PCT 세그먼트 형 명 시야 조명 (도 3d)으로 관찰 하였다. 복부 체강에서 지질 소적 때때로 회선 코일 (도 3d ')를 보여 전체 신장 장기 제제 (도 3a) .Individual PCT 세그먼트와 관련하여 알 수있는뿐만 아니라, 상대적으로 선형 스트레칭 (도 3D ")에 의해 특징 지어 질 수있다.
다른 덱스 트란 복합체 근위 세뇨관 라벨에 청명의 다른 수준을 제공했다. 특히, 덱스 트란-FITC 또는 덱스 트란 플루오로 - 루비는 최소한의 배경 (그림 3C-D ")와 네프론 레이블을 선명되었다. 덱스 트란 캐스케이드 블루 두전자 및 루시퍼 노란색 접합체는 성인 신장 (그림 4A, 4B)에서 근위 세뇨관의 흡수를 보여 주었다. 덱스 트란 루시퍼 노란색에 노출 신장에 걸쳐 비 특이 형광 염색 존재로, PCT 세그먼트를 표시하지만, 눈에 띄는 배경 신호를 보여 한 동안 흥미롭게도, 덱스 트란 캐스케이드 파란색에 노출 신장, 몇 가지 배경 (그림 4A, 4A ')에 상대적으로 특정 PCT 형광을 보여 주었다 신장 기질, 또는 네프론 (그림 (b), (b) ') 사이의 공간. 마지막으로, 덱스 트란 플루오 루비의 사용은 다른 배율 (그림 4C, 4C ')의 거리에서 볼 때도없이 또는 최소한의 배경으로 뛰어난 근위 세뇨관의 라벨을 제공했다. 모든 경우에, 덱스 트란 복합 흡수의 독특한 관 패턴은 slc20a1a, 설립 된 PCT 특정 마커 30-32 (그림 4D)를 인코딩 성적 증명서의 WISH 식의 상관 관계. Nephr(3 차원 "표지 덱스 트란 공액 분석법도 3d) 동안 관찰로, slc20a1a 안티센스 riboprobe 물들 PCT 세그먼트에서 S 자형 PCT 코일뿐만 아니라 덜 급격 코일 PCT 세그먼트 (도 4d)를 '표시.
예컨대 근위 세뇨관 알칼리 포스 파타 아제 활성 (도 5A, 5B, 5C)의 검출과 같은 다른 신장 제제는 마찬가지로 멜라닌 색소의 제거 후에 수행 하였다. 이 장애물없이 근위 세뇨관의 네프론 이미징 및 분석을 위해 허용했다. 네프론의 내생 알칼리성 포스 파타 아제 반응성은 근위 세뇨관 1,47의 한 가지 중요한 특징이다. 39 (그림 5D, 5D ') cubilin 유전자의 팬 근위 위시 표현 패턴에 비해 알칼리 포스 파타 아제 염색, 근위 네프론의 지역에 대한 매우 구체적인입니다. 알칼리 포스 파타 아제의 반응은 전나무에서 가장 강렬했다또한 PCT에서 가장 높은 상대 성적 수준을했다 cubilin 표현식의 패턴 (그림 5D, 5D ')과 유사한 PCT (그림 5B)에 해당하는 근위 세뇨관의 성 섹션. PCT는 약간 넓은 직경, 전사 인자 mafba (도 5E,도 5e ')의 구체적인 표현 및 용질 수송 체 유전자 slc20a1a (도 4d, 4D의 특정 식')으로 구별되었다. 알칼리 포스 파타 아제의 반응은 용질 수송 유전자 slc13a1 (그림 5 층, 5 층 ')의 부문 별 성적 표현에 대한 비교에 기초하여 PST 세그먼트 (그림 5B)에 해당하는 얇은 직경 근위 세뇨관의 스트레칭을 표시. PCT 마커 slc20a1a 및 PST 마커 slc13a1의 WISH 식 도메인은 상호 배타적 (그림 5 세대 아르 cubilin의 표현 영역을 요점을 되풀이 것으로 나타났다. 그림 5 세대 ', 5G ", 5G"' ).
더 근위 세뇨관의 정체성 알칼리성 포스 파타 아제 반응의 관계를 확인하기 위해, 전체 덱스 트란 플루오로 루비 삼일 전에 (그림 6A-C)의 복강 내 주사를받은 제브라 피쉬에서 신장에서 수행 한 알칼리 포스 파타 아제 염색의 공동 표시를 탑재합니다. 덱스 트란 플루오 루비 PCT (도 6D-I의 예)에 대응하는 근위 세뇨관 도메인의 단지 넓은 경부에서 알칼리성 포스파타제와 함께 오버랩을 보였다. 덱스 트란 양성 도메인은 갑자기 PCT 및 PST이 충족 근위 세뇨관의 직경이 얇아 사이트, 즉, (흰색 화살표에 정지그림 6) 및 알칼라인 포스 파타 아제 반응성 헤드는 후속 PST 세그먼트 그림 6D-I의 (예)에서 관찰되었다. 알칼리 포스파타제의 반응으로부터 배경 형광도 희미 성인 신장에서 발견 병렬 주요 포집 덕트 트랙 쌍 윤곽도 6a,도 6d에 최광 어떠한 신장 관련 관의 직경 (별표를 갖는 특징으로한다 29,30 -ducts, (e), 6G, 6H). 다음으로, 알칼리 포스 파타 아제 및 덱스 트란 흡수와 네프론의 세뇨관의 공동 라벨이 동결 절단 (Cryosections) 분석에서 관찰되었다 (그림 6J는 세관 경계 흰색 점으로 설명). 해당 관상 세포 세포질 공간 덱스 트란 플루오 루비 반응성 (도 6J)을 보였다 단면에, 알칼리성 포스파타제 반응성, 브러시 보더 미세 구조와 일치 관상 상피의 선 단면에 두꺼운 밴드에 주목 하였다. 특히, staineD의 세관은 PCT 세그먼트, 또는 알칼리 포스 파타 아제에 대한 단독 긍정적 (그림 6J, 노란색 점에 명시된 경계 세관) PST 세그먼트로 식별 선도 (참고로 자신의 신분을 선도, 알칼리 포스 파타 아제 (alkaline phosphatase) 및 덱스 트란 더블 긍정적 인 중 하나였다 : 기타 현재 세관은, 데이터)) (그림 6J을 보여 둘 얼룩 부정적이었다. 또한, 알칼리 포스 파타 아제 염색 (그림 6K)이 성공적으로 핵 라벨, 요오드화 프로피 듐 (그림 6L), 용이하게 세포 계수 (그림 6 개월에서 오버레이)와 결합되었다.
성인 zebrafish의 네프론의 원위 세뇨관은 로다 민 - 복합 DBA (그림 7)으로 표시 하였다. 전체 야생형 제브라 피쉬 (그림 7A-C)에서 신장에 수행 된 DBA 및 알칼리 포스 파타 아제와 이중 라벨을 탑재합니다. DBA 및 알칼리 포스 파타 아제 반응은 네프론의 세뇨관에서 중첩을 (보이지 않았다
다음으로, 더 덱스 트란-FITC 흡수, 알칼리 포스 파타 아제, 및 DBA의 패턴을 비교, 트리플 라벨링, 덱스 트란-FITC와 복강 내로 주입 성인 제브라 피쉬에 의해 검사 알칼리 포스 파타 아제 및 DBA를위한 저온 절편과 염색으로 삼일 후에 신장 분리 한 다음 하였다 (그림 8A-E에서 제공 예). 알칼리 포스 파타 아제 및 덱스 트란 표시 PCT 세그먼트 (흰색 점선), tubul 이중 양성이었다 세관 : 신장 세뇨관 라벨 조합의 세 가지 범주를 보여 주었다알칼리 포스 파타 아제에 대한 긍정적 인 ES 단독 PST 세그먼트 (황색 점선)를 표시하고, 원위 세뇨관 단지 DBA에 의해 표시되었다 (빨간색 점선도 8a-E 설명). 또한, 만 DBA 양성 세관이 전시 분기점 (그림 8E). WISH 분석에 의해,이 특유의 원위 분지 패턴은 DBA 양성 세뇨관 원위 세관 세그먼트 (도 8F-I)에 대한 특정 용질 수송 사체의 유전자 발현 패턴의 상관 관계. 전체 원위 세뇨관 (DE 및 DL)을 표시 clcnk을 인코딩 성적 증명서는 신장에, 직경이 풍부한 얇은 있었고, 포함 된 분기점 (블랙 화살촉 그림 8 층, 8 층 '). 비교, 세관 세그먼트는 각각 신장 샘플에서 전체 (그림 8 비교 식을 clcnk에 비해 덜 느끼 DE와 DL의 마커 아르 slc12a1 또는 slc12a3의 발현을 보여 주었다 G 및 8 층, 8H). 지금까지, (그림 8 세대, 8 세대 ')를 분기하는 경우', 8H ", 8H"slc12a3을 표현 세관 영역이 자주 특성 바람개비처럼 배열 (그림 8H, 8H에서 분기 된 반면, '또한, slc12a1을 표현 세관 세그먼트는 거의 없었다 블랙 화살촉). 마지막으로, PCT 마커 slc20a1a 원위 마커 clcnk 더블 위시이 얼룩 (그림 8I)를 중복되지 않은 것으로 나타났다. 특히, slc20a1a 발현 PCT 세그먼트의 뻗기는 PST가이 지역 (그림 8I) 사이에 위치하기 때문에 예상 발현 세관을 clcnk에 부착되지 않았다. 이와 함께, 특정 유전자의 성적 증명서 덱스 트란 흡수, 알칼리 포스 파타 아제의 반응성, DBA, 그리고 소원 신장 세관 레이블의 분석은 말초 세그먼트에 비해 근위부의 분별을 할 수 있습니다.
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성인 zebrafish의 신장에서 그림 1 네프론 해부학. (A) 성인 zebrafish의 신장 및 (B) 성인 및 배아 제브라 피쉬의 네프론에 의해 전시 세그먼트 분자 특성의 비교 차트의 회로도 도면. (A) (왼쪽 위) 성인 신장 등쪽 체벽에있는 평평한 기관이다. 복부의 관점에서 볼 때 (오른쪽 위), 신장은 머리, 몸통과 꼬리 영역으로 구성된 특징적인 곡선의 형태를 가지며, 또한 연관된 멜라노의 표면 인구. (하단 왼쪽) 확대는 근위 세뇨관, 원위 세뇨관 및 덕트 다음 각 단일 네프론 한 끝에 혈액 필터 (신장 소체)를 보유하고있는 성인 zebrafish의 신장, 전형적인 네프론 나무의 개략을 보여줍니다. 컬러 회로도 (보ttom 오른쪽) 배아 네프론 (B)의 제품과 세그먼트의 특성을 비교 한 성인 네프론 트리의 선형도를 나타낸다. 제브라 피쉬 배아 네프론은 아래의 각각의 유전자 발현 도메인과 근위 세뇨관 (PCT), 근위 곧은 세관 (PST), 말초 초기 (DE) 및 말초 말 (DL)을 포함 세관 세그먼트가 포함되어 있습니다. 배아에 비해 주목할만한 차이는 여러 네프론이 분기 DL 세그먼트를 통해 연합 할 수 있다는 것입니다 있지만 성인 제브라 피쉬의 네프론이 분절 조성과 용질 수송을 인코딩 유전자의 발현 도메인을 기반으로 유사한 분자 서명이 유사한 있습니다. 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
방법은 단독으로 또는 모듬 조합에서 수행 될 수있는 방법을 나타내는이 프로토콜에 도시 된 방법 사이의 관계를 나타내는도 2 순서도 맵. 성인 제브라 피쉬로 표지 된 라이신 정착 덱스 트란의 복강 내 주사 후에는 신장을 시각화 할 수있다 전체 단독 또는 알칼리 포스 파타 아제 및 / 또는 DBA 얼룩을 조합하여, 준비를 탑재합니다. 대안 적으로, 선택된 지브라 피쉬 신장 조직은 조직 학적으로 저온 유지 절편 후에 검사 할 수있다. 섹션은 면역 조직 화학, 핵 염색, DBA 염색법을 사용하여 속성의 다양한 조합에 라벨을 염색 및 / 또는 알칼리 포스 파타 아제 반응 할 수 있습니다. 또한, 신장 섹션 PCT 세그먼트에서 라이신 정착 덱스 트란 흡수의 존재를 직접적으로 가시화 될 수있다. 마지막으로, 선택된 신장 WISH을 사용하는 유전자 발현의 발현을위한 시공간 처리 될 수있다. 괄호 숫자는 correspo 참조프로토콜 부분 찾아내는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 성인 zebrafish의 신장은 평면 신장 네프론의 PCT 세그먼트에 결합 된 덱스 트란 흡수를 시각화하기 위해 준비와 응용 프로그램을 설치하십시오. 기관은 점토 (핫 핑크 색상)의 네 디 보트에 쉬고 조직의 상단에 배치 커버 슬립과 함께, 유리 슬라이드에 평평하게 배치되어있는 준비를 탑재 평면 신장 표본의 (A) 명 시야 이미지. 여기에 신장 준비가 축소 된 비교를 제공하는 메트릭 통치자와 함께 이미지화된다. 일반적인 성인 신장은 머리에서 꼬리까지 약 5~7mm (mm)입니다. (B) 표백의 명 시야 이미지신장. 검정색 색소는 신장과 관련하여 발견 된 멜라닌 세포의 산란 인구에 대응하고, 대동맥 신장의 정중선을 따라 실행된다. 네프론의 PCT 세그먼트 (C) 시각화 삼일 40 kDa의 복강 내 주사 다음 덱스 트란 형광 (FITC) , 성인 신장의 표백하지 않고. PCT 세그먼트는 신장을 통해 볼 수 있습니다 만 부분적으로 멜라닌 세포로 인해 가려한다. (C ') 하나의 네프론의 디지털 줌, 멜라닌 세포 (흰색 화살표)로. 성인 신장의 (D) 이미지 삼일 10 kDa의의 복강 내 주사 다음 덱스 트란 플루오로 - 루비, 신장, 표백의 고정. 멜라닌 색소를 제거하고, PCT 영역은 명 시야 조명 하에서 덱스 트란 그들의 세포 내 이입의 흡수에 기초하여 여기를 가시화 하였다. 복부에서 지질 방울 (화살표) 가끔 신장 조직 샘플과 관련하여 볼 수 있습니다. (D ', D ") 파트 :sentative 이미지는 PCT 세그먼트 사이에 약간의 형태 학적 변화를 묘사한다. 많은 네프론의 PCTs 단단히 (D ')를 코일 동안, 다른 네프론이 (D ")를 코일 최소한이 PCT 영역을 포함하고있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
. 그림 4 성인 신장 네프론의 PCT의 가느 다란 관 세그먼트 라벨 야생형 제브라 피쉬 복강 하나의 형광 덱스 트란 복합체를 주사 하였다; 그들의 신장이 삼일 PCT 시각화를위한 주사 후 조사 하였다. (A, A ') 덱스 트란 계단식 블루, 10 kDa의 (B, B') 노란색 덱스 트란 루시퍼, 10 KDA와 (C, C ') 덱스 트란 F luoro 루비, 10 kDa의 모든 우선적으로 신장 네프론의 PCT 세그먼트 레이블을 지정합니다. 두 덱스 트란 계단식 파란색과 루시퍼 노란색 쇼 루시퍼 노란색 처리 신장에서 관찰 훨씬 높은 배경으로 네프론 사이에있는 간질 세포 집단의 일부가 아닌 특정 라벨. 한편, 덱스 트란 플루오 루비 강렬한 PCT 라벨링 획기적 감소 배경을 보였다. (D, D ') slc20a1a, PCT 수송 셀형의 특정 마커를 코딩하는 전 사체의 위치를 검출하기 WISH 스테인드 성인 신장. slc20a1a의 발현 도메인은 다양한 단단히 코일 / 반복 PCT 도메인의 분포뿐만 아니라 일관성있는 넓은 직경을 보여 더 연장 된 PCT 뻗어로, 신장에서 관찰 덱스 트란 흡수의 특성 패턴과 일치합니다. 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의.
그림 알칼리 포스 파타 아제에 대한 염색의 5 대표 결과는 성인 zebrafish의 신장에서 팬 근위 세뇨관 마커, 소원 평가 다른 근위 세뇨관 마커에 비해. (AC) 알칼리 포스 파타 아제 (alkaline phosphatase) 염색 (청록색)는 PCT 및 PST. (DF ') 모두 강조 네프론 근위 세뇨관을 조명 나열된 유전자 (보라색 염색의 각)을위한 단일 WISH합니다. (D, D') cubilin의 발현 패턴을 , 팬 근위 (PCT-PST) 마커 ( 'D, D) 알칼리 포스 파타 아제와 상관 관계. 비교, mafba에 대한 WISH는 PCT (E, E ')을 표시하고 slc13a1는 PST (F, F를 표시합니다.') (GG " ') slc20a1a <PCT 마커 더블 위시에서/ 엠> (빨간색)과 (보라색) PST 마커 slc13a1이 마커가 표시된 세그먼트가 중복되지 않는 것을 보여 주며, 하나의 네프론 밀접 (G'-G " ') 조사 때 발현 도메인은 인접 위치를 차지하지 않고있다. 블랙 화살촉은 일반적으로 대기업에서 중소기업에서 가느 다란 직경의 변화와 관련된 PCT 및 PST 세그먼트 사이의 접합을 표시였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 알칼리 포스 파타 아제 (alkaline phosphatase)와 성인 신장 네프론의 PCT 부문에서 덱스 트란 흡수 쇼 중복 및 알칼리 포스 파타 아제 (alkaline phosphatase) 염색 요오드화 프로피 듐 핵 공동 라벨과 호환됩니다. (AI) (AC) 병합 된 이미지와 단일 신장 안장 영역의 별도 이미지. (DF) 알칼리 포스 파타 아제 혼자 PST 레이블 반면과 (GI)가 병합 된 이미지와 예제 네프론의 별도 이미지의 2 세트. (I)을 동결 절단 (Cryosections) 분석, 알칼리 포스 파타 아제과 (하얀 점에서 설명) PCT 분야에서 덱스 트란 플루오로 - 루비의 공동 라벨을 확인 세그먼트 (노란색 점에서 설명). (KM) 신장했다(K) 알칼리 포스 파타 아제 (청록색) 및 (L) 요오드화 프로피 듐 (보라색), (M)를 가능하게 표지는 각각. 근위 세뇨관 세포와 그들의 핵의 시각화를 합병 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 알칼리 포스 파타 아제 (alkaline phosphatase) 및 DBA는 상호 성인 zebrafish의 신장 네프론에 존재하는 각각 팬 근위 및 팬 말단 영역을 표시 전용 세그먼트 레이블입니다. (AH) 알칼리 포스 파타 아제 (alkaline phosphatase)와 로다 민 - DBA 물들 제브라 피쉬 신장의 전체 마운트 준비. 알칼리 포스 파타 아제 (청록색)와 DBA (빨간색)은 신장에서 중복 표시되지 않습니다. 알칼리 포스의 배경 수준TASE 인해 넓은 직경의 독특한 각각 신장 (별표, *), 주요 수집 덕트의 쌍을 밝히는. DBA 양성 세관 직경 얇고 분기점 (흰색 화살촉)의 존재에 의해 자주 특징으로한다. (AC) 이미지와 하나의 신장의 안장 지역의 별도의 이미지 병합. (DF) 병합 된 이미지와 별도의 이미지를 한 세트 예를 들어 네프론. (G, H) 추가 예, 알칼리 포스 파타 아제 (alkaline phosphatase) 양의 세관과 함께 분기 DBA의 세관과 이미지를 합병했다. (I)을 동결 절단 (Cryosections) 분석 알칼리 포스 파타 아제 및 DBA 라벨 별개의 세관 섹션, 그리고 드문 세관이 모두 라벨을 보일 것을 확인 (흰색 화살표 ), 그 가느 다란 관에 대한 부분의 각도 가능성 때문에. 이 분석을 위해, 야생형 형질 전환 어류, Tg는 : enpep : eGFP는이 사용되었고,이 신장 신장 세관의 모든 GFP를 검출하는 차 항체로 immunolabeled 하였다 (J)를. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
원위 세그먼트 WISH 분석에 비해 덱스 트란 흡수, 알칼리 포스 파타 아제, 및 DBA 성인 신장 저온부의 그림 8 트리플 라벨. (AE) 성인 신장은 복강 덱스 트란-FITC (녹색)를 주입하고, 신장과 포함 저온 절편을 위해 삼일 후에 수집 하였다. 알칼리 포스 파타 아제 (alkaline phosphatase)의 반응성 및 DEXT에 긍정적이었다 PCT 세그먼트 : 알칼리 포스 파타 아제 (청록색)와 DBA (빨간색)와 염색은 세관의 세 인구를 밝혀(하얀 점에서 설명) 실행 만 (노란색 점에서 설명) 알칼리 포스 파타 아제의 반응성, 또한 특성 원위부 분기점을 보여 주었다 만 (빨간색 점에서 설명) DBA 양성했다 원위 세뇨관 세그먼트에 대해 긍정적이었다 PST 세그먼트. ( AD) 병합 된 이미지와 하나의 예 섹션의 별도의 이미지. (E) 병합 된 다른 예 섹션의 이미지. 하나 (FH에 의해 원위 세뇨관의 유전자 발현 패턴 (FI) 비교 ' ")과 더블 (I) WISH. (FH ') 나열된 유전자 단일 WISH (보라색 염색에서 각각). (F, F') clcnk의 발현 패턴, 범 원위부 (DE-DL) 마커, 분기점을 포함 얇은 세관 검출되었다 (블랙 화살촉). (G, G ') 비교는 slc12a1에 대한 소원이 감지 된 분기점으로 DE를 표시하고 (HH' ") <EM> slc12a3는 DL, 신장 기관 (블랙 화살촉)에 걸쳐 수많은 분기점을 특징으로하는 세그먼트를 표시합니다. PCT 마커 slc20a1a (적색) 및 팬 - 원심 clcnk (보라색)에 대한 (I) 더블 위시. 이들 마커로 표시된 부분은 중첩하지 않으며, 오히려 그들의 발현 도메인은 개별 PCT 코일 (오른쪽 하단)이 인접하지 않은 위치를 차지 원위 세관에 접하지 않으며, 후자는 별개의 위치를 점유하고 (블랙 화살촉 각인 분기점을 가지고 ). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기서는 성인 지브라 피쉬의 네프론 세그먼트 성분의 시각화를 가능하게 방법을 설명 하였다. 형광 덱스 트란 복합체의 주입이 근위 세뇨관 세포 30,38의 세포 내 이입 특성으로 인해 특혜 PCT 라벨링을 할 수 있습니다. 이 방법 때문에 다른 형광 결합체 떼 얻을 수있다 덱스 트란의 존재를 매우 유연 수행 될 수있다. 보조 라벨 절차가 요구되지 않기 때문에 또한, 라이신 정착 덱스 트란의 사용은, PCT 세그먼트에 레이블 특히 편리하다. 이것은 비교적 간단한 신호 검출을 가능하게하고 많은 다른 형광 라벨, immunolabeling 및 트랜스 제닉 리포터 라인의 사용과 호환 가능하다. 알카라인 포스파타제는 또한 PST에서 PCT 강한 반응성이 약간 약한 반응성, 근위 세뇨관을 표시합니다. 마지막으로, DBA 염색 채널을 표시 원위 세뇨관 세그먼트의 표시를 할 수 있습니다aracteristic는 형태를 분기. 면역성 원산지 설탕 결합 단백질 아르 다양한 렉틴 분자, 포유 동물 네프론 세그먼트 47을 구별하기 위해 광범위하게 사용되어왔다. 그것은이 포유 동물의 신장 47에서 수집 덕트를 표시하는 데 사용되는 것과 제브라 피쉬의 DBA는 원위 세뇨관 세그먼트와 관련이 있다는 흥미로운 일이다.
종합적으로, 이들 방법은 조성물 및 신장 기능을 문서화하는 다양한 조합으로 사용될 수있다. 이들 방법 모두는 전체 신장 제제에 사용될 수 있기 때문에, 이들은 전적으로 더 시간 소모적 인 지루한 방법, 예를 들면, 동결 절단 (Cryosections) 작업과 immunolabeling의 사용에 의존하지 않고도 장기에 걸쳐 네프론의 구조와 기능을 평가하는 툴을 제공한다. 그러나,이 방법 문서에서 설명 얼룩을 동결 절단 (Cryosections)에서 실행 가능하다. 동결 절단 (Cryosections) 분석은 면역 조직 화학 특정 pepti을 감지하기에 더 적합합니다 (전체 마운트에 비해) 샘플을 생성DES는 물론 비록 이러한 유형의 분석은 적절한 일차 항체의 가용성을 필요로한다. 불행하게도 제브라 피쉬 동물 모델 작업에서 하나의 주요 제한은 항체의 가난한 가용성 남아있다. 따라서 WISH는, 즉, 가장 널리 사용되는 유지 '고우에'유전자 발현 분석을위한 절차. 보라색 또는 적색 침전물을 생성 BCIP, NBT, 및 / 또는 기판 INT 반응을 이용하면 WISH 저온부에 형광 염색법과 호환되지. 하나의 옵션은 형광 검출 WISH, 제브라 피쉬 배아 샘플을 위해 최적화되었으며 성인 신장 함께 사용하도록 맞추어 질 수있는 절차의 사용을 호출하는 것이다. 이 비디오 문서의 방법에 대한 설명은 각각의 세그먼트가 같은 eGFP는 또는 mCherry 등의 기자로 표지 된 형질 전환 제브라 피쉬 라인과 함께 형광 WISH 같은 기술을 추가 실험을 허용해야합니다. 대안 적으로, 방법은 여기에 기재된 coul다른 중요한 염료, 예를 들어, 다른 렉틴와 함께 테스트를 할 거라고. 따라서, 상기 적응 및 여기에 기술 된 방법의 확장은 전체의 마운트 신장 준비 및 분석을위한 연구자의 필요에 따라 호출 될 수있다.
따라서,이 방법은 지속적인 재생 연구 제브라 피쉬 모델 구현 및 유전 적 질병 모델링 광범위한 잠재력을 가지고있다. 신장 고통 혁신적인 연구 및 치료에 대한 필요성이 높아지고있다. 수백만 명의 사람들이, 선천성 급성 및 / 또는 만성 원인의 결과 매년 신장 질환의 일부 양식에서 고통 받고 있습니다. 또한, 신장 질환의 유병률은 이러한 질병 글로벌 공중 보건 문제 (14, 15)을 전 세계적으로 증가하고 있습니다. 외부 투석 기계가 자신의 신장이이 역할을 수행 할 수없는 경우 신진 대사 폐기물의 환자의 혈액을 제거하는 역할을함으로써 이러한 혈액 투석 등의 치료를 사용할 수 있습니다. 불행하게도지속적인 치료가 생존을 위해 필요하므로이 개입, 제한 사항이 있습니다. 또한, 환자는 결국 환자가 대기자 명단에 배치되면받을 수 년이 걸릴 수있는 신장 이식을 필요로 할 것이다. 심지어 신장 이식을 획득 한 후, 많은 환자는 프로 시저의 결과로 부작용을 고통과 그들의 삶의 나머지 부분에 대한 이러한 효과를 전투해야합니다. 이러한 어려움은 신장 질환을 예방 혹은 조직 재생 8,16,52,53을 확대하는 데 도움이 중 하나를 새로운 치료법의 개발에 대한 심각한 필요성을 보여줍니다. 생물 의학 실험실에서 인간 피험자의 사용의 명백한 윤리적 한계를 감안하면, 동물 모델은 인간 질병의 발병 기전 연구를위한 새로운 치료법의 테스트를 위해 필수적이다. 그 해부학 적 유사성 진화 근접성 결과, 마우스는 인간의 질병 (45)의 모델에 가장 널리 사용되고있다. 그러나이 동물과 특정 제한 includ,가무능력을 보내고 것은 생체 내 및 대규모 유전자 스크린을 완성 실용성 장기 개발을 시각화한다. 제브라 피쉬는 인간의 질병 45, 46의 장기 개발 및 모델링 연구를위한 적절하고 유용한 모델 생물이다. 인간의 질병에 관해서는, 제브라 피쉬의 기능 동족체는 인간의 모든 유전자 (54, 55)의 약 70 % 존재한다.
최근 연구는 신장 연구 31,37,56 여러 지역의 제브라 피쉬의 유용성을 강조하고있다. AKI 후 제브라 피쉬의 재생 및 수리의 연구는 세관 상피 재생 및 neonephrogenesis가 발생 30,37 timecourse 재생에 걸쳐 중복이 프로세스가 있음을 시사한다. 아미노 글리코 사이드 항생제라는 겐타 마이신의 사용은 성인 제브라 피쉬 29,30,37에서 AKI의 결과를 연구를 통해 부상 패러다임으로 활용되고있다. 겐타 마이신에서 약 2 주간의 기간에 다음과 같은 부상에 걸쳐, 근위부 tubul에스 다시 생성하고, 그 사이에 새로운 네프론은 장기 29,30,37에 걸쳐 형성한다. 일반적으로, 상피 재생을 조절하는 메커니즘이 매우 논란 남아있다. 복구 프로세스의 일 제안 된기구에서, 루멘으로 사균의 벗기이어서 초기 급성 부상 이벤트가있다. 다음으로, 새로운 세포가 분화 한 후, 역 분화, 증식 및 마이그레이션 일련의 이벤트, 부상 기저막을 다시 채우기 및 부상 사이트에 기능을 복원을있다. 또한, 다른 연구는 대체 세포가 네프론의 세관 내에 상주 줄기 / 전구 세포에서 발생하는 것을 제안했다. 제브라 피쉬에 neonephrogenesis의 프로세스에 관해서는, 세포 응집체 29,30 겐타 마이신 주입하여 다음 AKI 관찰되었다. 이 집계는 나중에 기존 세관 (29, 30)에 연결 (plumb) 새로운 네프론에 성숙. 네프론 상피 재생 및 neonephr을 통합하는 공통점ogenesis는 깎아 지른듯한 미스터리 요소 : 현재이 재생 업적을 사용할 수 통찰력이보다 발생 방법에 대한 기하 급수적으로 더 많은 질문이 있습니다.
그러나 현재까지의 증거 몇 가지 흥미로운 라인은 제브라 피쉬를 사용하여 신 재생 조사 사실도 직접 번역 잠재적 인 56-58가있을 수 있습니다 인간의 AKI에 관련 비교 통찰력을 제공 할 수있는 개념을 지원합니다. 화학적 스크리닝 최근 히스톤 데 아세틸 라제 억제제 메틸 4 - (페닐 티오) -butanoate (m4PTB) 56,57 식별되었다 제브라 피쉬 배아 신장 전구 세포의 증식을 증가 작은 분자의 동정을 행 하였다. 겐타 마이신에 의한 AKI와 제브라 피쉬의 유충이 화합물의 관리 애벌레의 생존이 증가하고 신 세뇨관 증식 (56, 58)를 향상되었습니다 것으로 나타났습니다. 중간 허혈 유발 AKI와 마우스가 m4PTB로 처리되었을 때, 자신의 회복 ASSOC 가속화되었다세뇨관 세포 증식 (58)의 양쪽 관상 위축 및 세포주기 정지에 감소 iation. 이러한 연구 결과는 정상적인 제브라 피쉬의 신장 개발 및 / 또는 AKI에 회생 응답에 책임이있는 경로는 포유류 56과 보존된다는 것을 시사한다.
따라서, 더 많은 연구가 관여하는 신호 전달 경로를 확인하고 상호 작용 - 제브라 피쉬는 신장학 분야에서 중요한 목표를 추구하는 하나의 약속 수단을 제공 이해하는 재생 - 즉의 메커니즘을 떨어져 애타게하는 데 필요한있다. 이와 프로토콜에 설명 네프론 셀 라벨 같은 도구 AKI 모델에서 신장 조성물 및 기능성을 평가하기 위해 이용 될 수 분석법 중 하나기를 나타낸다. 또한, 이들은 신장 질환의 트랜스 제닉 모델을 특성화하기 위해 적용 할 수있는 신장 네프론 후 댐 구조의 복원을 촉진 할 수있는 화학 치료제를 식별하는 방법을 제공 할 수있다연령.
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 다음에서 RAW로 자금에 의해 지원되었다 : 건강의 국립 연구소는 K01 DK083512, DP2 OD008470 및 R01 DK100237을 부여; 십센트 바 오코너 초보 학술 보조금 수상 # 5 - FY12-75 년 3 월; 과학 및 생물 과학학과의 노트르담 대학의 대학에서 기금을 시작; 그리고 갤러거 가족을 대신하여 엘리자베스와 마이클 갤러거에서 노트르담 대학에 관대 한 선물은 줄기 세포 연구를 촉진한다. 자금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비에서 어떤 역할을 없었다. 우리는 그들의 지원을 위해 생명 과학의 부서의 직원을 감사하고, 우리의 제브라 피쉬 식민지의 보호 및 복지에 뛰어난 헌신 노트르담 Zebrafish의 연구 센터. 마지막으로, 우리는이 작품에 대한 자신의 의견, 토론과 통찰력에 대한 우리의 연구 실험실의 구성원을 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X PBS | Made by diluting 10 X PBS in distilled water. | ||
| 1X PBST | 0.1% Tween-20 detergent in 1 X PBS. | ||
| 1X PBS with 0.05 % Tween | 0.05% Tween-20 detergent in 1 X PBS. | ||
| Tween 20 | American Bioanalytical | AB02038 | |
| 4% PFA/1X PBS | Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20°C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. | ||
| Fine Forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
| Glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | White Frost |
| Glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
| Modeling clay | Hasbro | Playdoh | Other modeling clays can be substituted and work similarly |
| Slide holder | Thermo-Fisher | 12-587 | Optional: cardboard tray to store slides flat |
| Bleaching solution | Bleach mix formula (for a 20 ml solution): 1.6 ml of 10% Potassium hydroxide solution 0.6 ml of 30% Hydrogen peroxide solution 100 μl of 20% Tween Fill to 20 ml with distilled water |
||
| Potassium hydroxide | Sigma | 221473 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | H1009 | |
| Blocking solution | Blocking Solution (for a 10 ml solution): 8 ml of 1X PBS with 0.05% Tween 2 ml of fetal calf serum 150 μl of DMSO |
||
| Alkaline phosphatase activity detection | Invitrogen | E6601 | We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit. To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer's instructions. |
| Alkaline phosphatase wash solution | Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 ml solution): 5 ml of 0.5 M EDTA 120 mg of Levamisole 95 ml of 1X PBS |
||
| Dextran, fluorescein, 40,000 MW | Invitrogen | D1844 | Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C. |
| Dextran, cascade blue, 10,000 MW | Invitrogen | D1976 | Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C. |
| Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW | Invitrogen | D1825 | Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C. |
| Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW | Invitrogen | D1817 | Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C. |
| Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine | Vector laboratories | RL-10-32 | DBA Staining Solution (for a 100 μl solution): 1 μl of DBA 99 μl of 1X PBS |
| Propidium iodide | Invitrogen | E6601 | |
| DAPI | Invitrogen | P1304MP | |
| Vectashield hard set mounting medium | Vector laboratories | H-1400 | |
| Micro cover glass | VWR | 48393081 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | American Bioanalytical | 67-68-5 | |
| Sucrose | Sigma | S0289 | |
| EDTA, 0.5 M solution, pH 8.0 | American Bioanalytical | AB00502 | |
| Levamisole | Sigma | L-9756 | |
| Tissue freezing medium | Triangle Biomedical Sciences, Inc. | TFM-C | |
| Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10 x 10x 5 mm | Sakura Finetek | 4565 | |
| TruBond 380 adhesive microscope slides | Tru Scientific | 0380W | |
| Liquid blocker – super PAP pen | Electron Microscopy Sciences | 71312 | |
| Immuno stain moisture chamber | Evergreen Scientific | 240-9020-Z10 | |
| Cryostat | Therm | Microm™ HM 525 Cryostat | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC | Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection. |
| Compound microscope | Nikon | 96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red | Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection. |
References
- Reilly, R. F., Bulger, R. E., Kriz, W. Structural-functional relationships in the kidney. Diseases of the Kidney and Urinary Tract. RW, S. chrier , Lippincott Williams Wilkins. Philadelphia, PA. 2-53 (2007).
- Dressler, G. R. The cellular basis of kidney development. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 509-529 (2006).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. Anat Rec. 232, 194-201 (1992).
- Cebrian, C., Borodo, K., Charles, N., Herzlinger, D. A. Morphometric index of the developing murine kidney. Dev Dyn. 231, 601-608 (2004).
- Schedl, A. Renal abnormalities and their developmental origin. Nat Rev Genet. 8, 791-802 (2007).
- Ricci, Z., Cruz, D. N., Ronco, C. Classification and staging of acute kidney injury: beyond the RIFLE and AKIN criteria. Nat Rev Nephrol. 7, 201-208 (2011).
- Faubel, S., et al. Ongoing clinical trials in AKI. Clin J Am Soc Nephrol. 7, 861-873 (2012).
- Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospects and challenges. Clin Transl Med. 2, 11 (2013).
- Liu, Y. Cellular and molecular mechanisms of renal fibrosis. Nat Rev Nephrol. 7, 684-696 (2011).
- Murugan, R., Kellum, J. A. Acute kidney injury: what’s the prognosis. Nat Rev Nephrol. 7, 209-217 (2011).
- Palevsky, P. M. Chronic-on-acute kidney injury. Kidney Int. 81, 430-431 (2012).
- Chawla, L. S., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease: an integrated clinical syndrome. Kidney Int. 82, 516-524 (2012).
- Bucaloiu, I. D., Kirchner, H. L., Norfolk, E. R., Hartle, J. E., Perkins, R. M. Increased risk of death and de novo chronic kidney disease following reversible acute kidney injury. Kidney Int. 81, 477-485 (2012).
- Collins, A. J., et al. USRDS 2012 Annual Data Report: Atlas of Chronic Kidney Disease and End-Stage Renal Disease in the United States (2012). Lancet. 365, 331-340 (2012).
- El Nahas, M. eguid, Bello, A., K, A. Chronic kidney disease: the global challenge. Lancet. 365, 331-340 (2005).
- McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction. Biochem J. 444, 153-168 (2012).
- Toback, F. G. Regeneration after acute tubular necrosis. Kidney Int. 41, 226-246 (1992).
- Thadhani, R., Pascual, M., Bonventre, J. V. Acute renal failure. N Engl J Med. 334, 1448-1460 (1996).
- Bonventre, J. V. Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure. J Am Soc Nephrol. 14, S55-S61 (2003).
- Romagnani, P., Kalluri, R. Possible mechanisms of kidney repair. Fibrogenesis Tissue Repair. 2, 3 (2009).
- Bonventre, J. V., Yang, L. Cellular pathophysiology of ischemic acute kidney injury. J Clin Invest. 121, 4210-4221 (2011).
- Grgic, I., et al. Targeted proximal tubule injury triggers interstitial fibrosis and glomerulosclerosis. Kidney Int. 82, 172-183 (2012).
- Reimschuessel, R. A fish model of renal regeneration and development. ILAR J. 42, 285-291 (2001).
- Reimschuessel, R., Williams, D. Development of new nephrons in adult kidneys following gentamicin-induced nephrotoxicity. Ren Fail. 17, 101-106 (1995).
- Salice, C. J., Rokous, J. S., Kane, A. S., Reimschuessel, R. New nephron development in goldfish (Carassius auratus) kidneys following repeated gentamicin-induced nephrotoxicosis. Comp Med. 51, 56-59 (2001).
- Augusto, J., Smith, B., Smith, S., Robertson, J., Reimschuessel, R. Gentamicin-induced nephrotoxicity and nephroneogenesis in Oreochromis nilotica, a tilapian fish. Dis Aquatic Org. 26, 49-58 (1996).
- Elger, M., et al. Nephrogenesis is induced by partial nephrectomy in the elasmobranch Leucoraja erinacea. J Am Soc Nephrol. 14, 1506-1518 (2003).
- Watanabe, N., et al. Kidney regeneration through nephron neogenesis in medaka. Develop Growth Differ. 51, 135-143 (2009).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-101 (2011).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, e189 (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-1127 (2008).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
- Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev Biol. 386, 111-122 (2014).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. 54, (2011).
- McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
- Drummond, I. A., et al. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125, 4655-4667 (1998).
- Anzenberger, U., et al. Elucidation of megalin/LRP2-dependent endocytic transport processes in the zebrafish pronephros. J Cell Sci. 15, 2127-2137 (2006).
- Majumdar, A., Drummond, I. A. The zebrafish floating head mutant demonstrates podocytes play an important role in directing glomerular differentiation. Dev Biol. 222, 147-157 (2000).
- Kramer-Zucker, A. G., Wiessner, S., Jensen, A. M., Drummond, I. A. Organization of the pronephric filtration apparatus in zebrafish requires Nephrin, Podocin, and the FERM domain protein Mosaic eyes. Dev Biol. 285, 316-329 (2005).
- Brien, L. L., Grimaldi, M., Kostun, Z., Wingert, R. A., Selleck, R., Davidson, A. J. Wt1a, Foxc1a, and the Notch mediator Rbpj physically interact and regulate the formation of podocytes in zebrafish. Dev Biol. 358, 318-330 (2011).
- Ebarasi, L., Oddsson, A., Hultenby, K., Betsholtz, C., Tryggvason, K. Zebrafish: a model system for the study of vertebrate renal development, function, and pathophysiology. Curr Opin Nephrol Hypertens. 20, 416-424 (2011).
- Swanhart, L. M., Cosentino, C. C., Diep, C. Q., Davidson, A. J., de Caestecker, M., Hukriede, N. A. Zebrafish kidney development: basic science to translational research. Birth Defects Res C Embryo Today. 93, 141-156 (2011).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
- Cox, W. G., Singer, V. L. A high-resolution, fluorescence-based method for localization of endogenous alkaline phosphatase activity. J Histochem Cytochem. 47, 1443-1456 (1999).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish kidney development. Methods Cell Biol. 100, 233-260 (2010).
- Watson, L., Vassallo, J., Cantor, G., Lehman-McKeeman, L. Lectin histochemistry: an alternative to immunohistochemistry for identify specific structures in rat papillary necrosis. HistoLogic. 41, 28-31 (2008).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J Vis Exp. , e51604 (2014).
- Seiler, C., Pack, M. Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene. Gene Expr Patterns. 11, 118-121 (2011).
- Little, M. H. Regrow or repair: potential regenerative therapies for the kidney. J Am Soc Nephrol. 17, 2390-2401 (2006).
- Romagnani, P., Lasagni, L., Remuzzi, G. Renal progenitors: an evolutionary conserved strategy for kidney regeneration. Nat Rev Nephrol. 9, 137-146 (2013).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and acute kidney disease: translational research insights from zebrafish chemical genetics. General Med. 1 (3), (2013).
- Groh, E. D., et al. Inhibition of histone deacetylase expands the renal progenitor population. J Am Soc Nephrol. 21, 794-802 (2010).
- Cosentino, C. C., et al. Histone deacetylase inhibitor enhances recovery after AKI. J Am Soc Nephrol. 24, 943-953 (2013).
