Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Analyse av Nephron sammensetning og funksjon i voksen Sebrafisk Nyre

Published: August 9, 2014 doi: 10.3791/51644
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

Summary

Sebrafisk voksen nyre er et utmerket system for nyre regenerering og sykdomsstudier. Et vesentlig aspekt ved slik forskning er vurderingen av nevronet struktur og funksjon. Denne protokollen beskriver flere metoder som kan iverksettes for å vurdere nevronet tubule sammensetning og å vurdere nedsatt reabsorpsjon.

Abstract

Sebrafisk-modellen har dukket opp som et relevant system for å studere nyre utvikling, regenerering og sykdom. Både de embryonale og voksne sebrafisk nyrer er sammensatt av funksjonelle enheter som kalles nefroner, som er høyt konservert med andre virveldyr, inkludert pattedyr. Forskning i sebrafisk har nylig vist at to karakteristiske fenomener svette etter voksne nephrons medføre skade: For det første, det er robust regenerering innenfor eksisterende nephrons som erstatter de ødelagte tubulære epitelceller; andre, er helt nye nephrons produsert fra nyrestamfedre i en prosess som kalles neonephrogenesis. I kontrast til mennesker og andre pattedyr synes å ha bare en begrenset mulighet for nevronet epithelial regenerering. Til dags dato, de mekanismene som er ansvarlig for disse nyre regenerering fenomener forblir dårlig forstått. Siden voksen sebrafisk nyrer gjennomgå både nevronet epithelial regenerering og neonephrogenesis, gir de en enestående eksperimentell paraparadigme å studere disse hendelsene. Videre er det et bredt spekter av genetiske og farmakologiske verktøy tilgjengelig i sebrafisk modell som kan brukes for å avgrense de cellulære og molekylære mekanismene som regulerer nedsatt regenerering. En vesentlig del av slik forskning er evalueringen av nevronet struktur og funksjon. Denne protokollen beskriver et sett av merkingsteknikker som kan brukes for å måle nedsatt sammensetning og prøve nevronet funksjonalitet i den voksne sebrafisk nyre. Således er disse metodene er allment til den fremtidige fenotypisk karakteriseringen av voksne sebrafisk nyreskade paradigmer, som inkluderer, men er ikke begrenset til, nephrotoxicant eksponerings regimer eller genetiske metoder for målrettet celledød som nitroreductase mediert celle ablasjon teknikk. Videre kan disse fremgangsmåter benyttes til å studere genetiske forstyrrelser i voksen nyre dannelse, og kunne også bli anvendt for å vurdere statusen nedsatt under kronisk sykdom modellering.

Introduction

Nyrene er et komplekst organ, som oppfyller en rekke fysiologiske funksjoner i kroppen. Den fremste funksjon av nyrene er metabolsk avfall utskillelse, og denne oppgave er nært knyttet til opprettholdelse av væske homeostase. Nyrene utfører disse stillinger ved å filtrere blod og urin forming, mens samtidig å regulere blodtrykk, elektrolyttnivå, og syre-base-balanse. Høyt spesialiserte epitelceller tubuli kalt nephrons tjene som den grunnleggende funksjonell enhet av nyre 1,2. Hos voksne virveldyr, er nephrons vanligvis organisert i en tett kveilet arrangement rundt en sentralisert dreneringssystemet, og dermed gir for mange tubuli å pakke inn i den ganske lite orgel. For eksempel kan hver menneskelig nyre inneholde over 1 million nefroner tre. Andre pattedyr som mus har i størrelsesorden 8-10000 nephrons per nyre fire. Graden av nedsatt kompleksitet skiller mellom disse pattedyr og andre vertebrates på grunn av variasjoner i nevronet totale antall og deres arkitektoniske utformingen i nyrene. Arter virveldyr danne så mange som tre påfølgende nyre strukturer under utvikling, og hvert skjema viser økende kompleksitet med hensyn til nevronet begavelse og arrangement: de pronephros, mesonephros, og metanephros. Den siste nedsatt struktur beholdes tjener som den voksne nyre-organ typisk en mesonephros eller et metanephros 2. Hver nyre-form, men har en nevronet baserte preparat 2.

Den nevronet er arbeidshesten i nyrene og er ansvarlig for blodfiltrering sammen med metabolitt sekresjon og reabsorpsjon. Nephrons er enkle rørformede strukturer består av epitelceller og har en sekvensiell organisering, der diskrete, høyt spesialiserte domener av differensiert epitel utføre bestemte oppgaver. I den rekkefølge av filtratstrømmen gjennom nevronet, er det vanligvis tre hoveddeler som Comprise hver enhet: (1) den renale blodlegeme, (2) en tubuli med proksimal, mellomliggende, og distale segmenter, og (3) en samlekanal 1.. Proksimale tubuli er ansvarlig for reabsorpsjon av organiske solutes, særlig glukose og aminosyrer en. Det mellomliggende tubuli (eller løkke av Henle) er et stort område av salt og vann regulering 1. Endelig skjer finjustering av salt og andre ioner i distale tubuli og samle duct og er sterkt regulert av det endokrine systemet en. Derfra reiser filtratet gjennom ureter og blære, til slutt avslutter kroppen som et avfallsprodukt ett.

Tapet av nyrefunksjonen kan stamme fra en rekke årsaker som hindrer normal nevronet aktivitet. Disse årsakene kan oppstå under nyre utvikling, for eksempel, medfødte defekter som fører til misdannelse i nephrons 5, eller årsaker fra forskjellige typer skader (som stammer fra både genetisk og environmental opprinnelse). Kjøpte skader er grovt kategoriseres som akutt nyreskade (AKI) eller kronisk nyreskade (CKD). AKI innebærer en brå tap av nyrefunksjon, ofte som følge av iskemi eller toksin eksponering 6,7. I pattedyr, er nevronet epithelial reparasjon mulig etter slike skader åtte, og mange mennesker viser full restaurering av nyrefunksjonen etter AKI. Imidlertid er AKI også forbundet med høy morbiditet og mortalitet som er rapportert over et bredt 30 - 70% forekomst område 6,7. CKD, i kontrast, er assosiert med progressiv tap av nyrefunksjon som resultat av år med langvarig skade, vanligvis assosiert med fibrose 8,9. Videre finnes et samspill mellom AKI og CKD, som begge kan disponere en person til den andre 10-12. For eksempel de som har lidd fra AKI er mer utsatt for CKD og død 13. Forekomsten av nyresykdom, både i USA og på verdensbasis, har nådd epidemic proporsjoner og er spådd å stige etter hvert som alderen befolkningen utvider-og dermed er det et økende behov for å identifisere regenerativ medisin intervensjoner for nyrene 14,15.

Til tross for vissheten om at AKI pasienter kan komme seg, har det lenge vært antatt at nyrene er et organ uten medfødte regenererende krefter. Dette tradisjonelle synet har blitt dramatisk endret de siste årene 16. Studier som undersøker nyreskade hos mus og rotter etter AKI har vist at nevronet tubul epitelceller kan spre seg og gjenoppbygge funksjonelle nephrons 17-20. Selv om pattedyr har denne adaptive evne til å regenerere nephrons, er det bemerkelsesverdige begrensninger og maladaptive reaksjoner kan utløses som fører til nedsatt fibrose og CKD 21. For eksempel, en fersk studie viste at gjentatte epitelcelle ablasjon i murine nephrons var assosiert med redusert regenerering og nyre fibrose-tyder nephrons HAVea begrenset regenerering terskel 22. Det er ingen bevis for at den voksne pattedyr nyre danner nye nephrons å erstatte tapt eller skadet seg, og dermed deres ødeleggelse fører til en permanent nevronet underskudd 8,9. Interessant er det noen virveldyr svare på AKI ved å gjenoppfriske nevronet epitel og ved også å produsere nye nephrons, referert en prosess til som neonephrogenesis eller nevronet -celleregenerering 23. Neonephrogenesis oppstår i fisk etter toksin eksponering eller delvis reseksjon, og skademodeller har historisk tatt gullfisk 24,25, tilapia 26, skate 27, medaka 28, og mer nylig, sebrafisk 29,30. Av disse sebrafisk gi en levedyktig genetisk forskning modell for å oppdage de cellulære og molekylære stier ansvarlige for nedsatt regenerering.

I denne videoen artikkelen viser vi hvordan å merke Nephron segmenter i voksen sebrafisk. Kunnskap om nevronet anatomi, molekylære funksjoner,og funksjonelle egenskaper er avgjørende for vellykket fremtid nyre studier med sebrafisk. Den voksne sebrafisk nyre er en mesonephros struktur og er iboende mindre kompleks i form av nevronet nummer og organisasjon enn metanephros strukturen funnet hos voksne pattedyr, avians og krypdyr 31. Imidlertid er sebrafisk nevronet segment organisasjon analogt til pattedyr, og ble først dokumentert i den embryonale nyre basert på genuttrykk studier 31-35. Sebrafisk embryo nephrons inneholde lineære tubulære segmenter som inkluderer den proksimale del av nyretubuli (PCT), proksimale rett tubulære (PST), distal tidlig (DE), og distal sent (DL) 31-35 (figur 1). Sebrafisk voksne nephrons har lignende rørsegmentene 30,31,36,37 (figur 1). PCT kan også bli identifisert ved en funksjonell fenotype: epitelceller i PCT vil innlemme fluorescensmerkede dekstran forbindelser (10-70 kD i størrelse) som er tilstede isirkulasjon, noe som har vært brukt i både embryonisk og voksen nyre sebrafisk for å vurdere endocytic opptak av disse proksimale tubul-celler 38 til 41 (figur 1). En forskjell i nevronet segmenter mellom sebrafisk og pattedyr er at sebrafisk mangler en mellom tubule, eller sløyfe av Henle 30-37; siden dette segmentet funksjoner hos pattedyr å spare vann, og sebrafisk er en ferskvannsarter uten en trang til å konsentrere urinen, er det ikke overraskende at sebrafisk mangler dette segmentet 32,33. Dermed er den samlede nevronet sammensetning i stor grad bevart mellom sebrafisk og pattedyr nyre 32,33. Disse likheter har aktivert sebrafisk for å være et effektivt verktøy for forskning for å undersøke funksjonene til renal-uttrykte gener under utviklings nephrogenesis 32-35,42 og å modellere flere nyresykdommer 43,44, for derved å legge til den betydelig liste av humane tilstander som kan bli undersøkt ved hjelpsebrafisk 45,46.

I dag er den voksne sebrafisk nyre en attraktiv modell for komparative studier av nedsatt regenerering på grunn av sin genetiske tractability og ekspanderende gane av teknologiske ressurser tilgjengelig for å avhøre gen-funksjon og signalveier i denne arten. Flere studier har brukt sebrafisk mesonephros å undersøke mekanismene for regenerering etter AKI 29,30,37. For fortsatt AKI forskning ved hjelp av den voksne sebrafisk nyre, er det viktig å ha utsøkt metoder å merke ulike Nephron regioner og metoder for å kartlegge nevronet funksjonalitet. Flere metoder for voksen nyre analyse har blitt tilpasset fra embryonale nyre protokoller. Intraperitoneal injeksjon av fluorescensmerkede dekstran i den voksne sebrafisk etiketter PCT epitel i mesonephros nephrons via endocytose 30, som i sebrafisk embryo 38-41 (figur 1). Denne metoden har blitt brukt til visualize når proksimale tubuli gjenvinne sin reabsorbing eiendom etter AKI, som gjør det mulig vurdering av restaurerte fysiologiske funksjon 30 (figur 1). Et annet trekk ved nevronet proksimale tubuli er at epitelcellene i dette segmentet har en børste kant 37 som viser høye nivåer av endogen alkalisk fosfatase-aktivitet. Således kan den proksimale epitel lokaliseres visuelt i den voksne sebrafisk nyre ved hjelp av en fluorescens-basert teknikk kjent som ELF- (Enzyme-Labeled Fluorescence) -97 47.

Her beskriver vi hvordan man utfører fluorescerende dekstran opptaks assays 30,48 i den voksne sebrafisk nyre, for derved å oppnå en funksjonell vurdering av de proksimale tubuli og kartlegge størrelsen og konturene av denne tubuli segmentet. Deretter beskrives teknikker for å merke de proksimale tubuli regioner av voksen nevronet med den fluorescerende markør alkalisk fosfatase. For det tredje viser vi for første gang at Rhodamin-merket lektin Dolichos biflorus agglutinin (DBA), som har vært brukt som en generell markør av oppsamlingskanalene i pattedyrnyre 49, markerer de distale tubuli av den voksne sebrafisk nyre. Som DBA er gjensidig utelukkende til alkalisk fosfatase flekker, disse etikettene gir en måte å grovt skille pan-proksimale versus pan-distale strekninger av den voksne sebrafisk nevronet. Gjennom implementeringen av disse fluorescerende flekker i både hele fjellet og Kryostat histologiske snitt, korrelerer vi disse etikettene med Expression domener av oppløst stoff transporter gener som unikt identifiserer hver nevronet segment. Derfor denne protokollen inneholder også en guide til de modifiserte vev saksbehandlingsregler for voksent vev hele fjellet i situ hybridisering (WISH) analyse basert på vår embryo WISH protokoll 50. Disse fremgangsmåtene kan brukes i forskjellige kombinasjoner (figur 2) for å dokumentere morfologiske og funksjonelle egenskaper of voksen sebrafisk nyre nephrons. Således kan disse protokoller påføres restitusjon studier, den fenotypiske karakteriseringen av andre renale sykdomsmodeller, og til og med anvendes for å studere dannelsen av den voksne nyre.

Protocol

Prosedyrene for å arbeide med sebrafisk som er beskrevet i denne protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Notre Dame. Merk: En guide til nyre og nevronet anatomi i sebrafisk er gitt (figur 1). En oversikt over de metoder som er beskrevet i denne protokollen er gitt som et flytskjema (figur 2) for å illustrere hvordan flere merking prosedyrer kan utføres på samme nyre prøven. For-del 7 på WISH forberedelse for voksne nyre studier, er fremgangsmåten som gis her indikerer hvordan å modifisere behandlingen av sebrafisk embryoer, som nylig publisert 50, for å tilveiebringe en teknisk veiledning for vellykket WISH analyse i nyrene organ.

1. Voksen Sebrafisk intraperitoneal injeksjon med dekstran av interesse

  1. Klargjør det ønskede fluorescensmerkede dekstran lager (e) ved å løse opp den dekstran-pulver i destillert vann ved en konsentrasjonpå 50 mg / ml, og deretter lagre aliquoter i mikrosentrifugerør ved -20 ° C i mørket. Merk: Forskjellige fluorescensmerkede dekstraner er kommersielt tilgjengelige. Velg dekstran for bruk basert på en kombinasjon av andre merker som er ønsket, og sørge for at de riktige fluorescerende filtre er tilgjengelig med mikroskopene som vil bli benyttet. Lysin-fixable dekstraner viser fluorescens uten ytterligere merking skritt i leveprøver, unfixed vevsprøve fra avlives prøver, og faste prøver.
  2. Tine ønsket dekstran lager og lagrer på is i mørket mens du utfører trinn 01.03 til 01.05. Pakk mikrorøret i aluminiumsfolie for å beskytte den mot lys under behandling.
  3. Bedøve en voksen sebrafisk mellom 5-7 måneder i alder ved å plassere fisken i en tallerken som inneholdt enten 0,02% Tricaine eller 0,001% 2-Phenoxyethanol for ca 1 - 2 min. Merk: Det er å foretrekke å bruke voksen sebrafisk av denne aldersgruppen fordi yngre fisk kan ha SMAll nyrer som er vanskelig å dissekere og nyre prøver fra gamle fisk kan inneholde masser av arrvev som ikke kan analyseres. Når den er riktig bedøvet, vil voksen sebrafisk ikke oppvise en respons til trykk på stimulering, som kan bli testet ved hjelp av en skje eller stump sonde til forsiktig berøring halefinnen på fisken.
  4. Ved hjelp av en plastskje, løfte fisken fra fatet, dekanter løsningen og forsiktig plassere dyret på en våt svamp mold, ventral side opp.
  5. Ved å bruke en 31 G 1,0 cc insulinsprøyte, injisere 20 pl opptint dekstran stamløsning inn i den intraperitoneal plass. Orienter nålen slik at innsettingen finner sted ved en spiss vinkel på den ventrale midtlinje av buken. For å unngå punktering organer, før nålen deretter litt heve det slik som å løfte kroppen veggen av fisk og skape et rom der for å injisere dekstran løsning 48. Merk: Alternativt kan dekstran lager fortynnes, f.eks, i et forhold på 1: 2 eller 2: 1 (dekstran: disdestillert vann), for å redusere bakgrunns fluorescens i prøven.
  6. Forsiktig med fisken tilbake til tanken for å tillate gjenvinning fra anestesi. Merk: Opptak av dekstran med proksimale tubuli segment skjer innen 8 - 12 timer og kan påvises i minst opp til 3 dager etter injeksjon (ppt). Analyse på tre dpi gir sterk tubule signal med lav bakgrunn fluorescens i de nyre stromale populasjoner. Fortsett til del 2 for hele fjellet undersøkelse av dekstran opptak alene, hvis ytterligere merking ikke er ønsket. For kombi merking, fortsett til del 3 for å forberede vev for hele fjellet undersøkelse av dekstran opptak, så del 4 til dobbel-label med alkalisk fosfatase og / eller del 5, for å utføre DBA dobbel eller trippel-merking. For forskning ved hjelp av histologiske snitt, fortsett til del 6 for instruksjoner om hvordan du kan lage fine deler av nyrene ved hjelp av en cryostat og hvordan å farge disse med ulike etiketter og / eller immunhistokjemi med primær og sekundær Antibodies.

2. Dissection og Flat Mount Utarbeidelse av Adult Sebrafisk Nyre fra en Ikke fiksert Animal Sample å visualisere Fluorescent Dextran Merking av proksimale tubuli

  1. Avlive dekstran-injisert voksen sebrafisk ved å plassere den i en skål med 0,2% Tricaine pH 7,0 4 - 5 min. Merk: Sørg for at fisken har blitt avlivet før du fortsetter, ved å overvåke nøye om gjellene har opphørt bevegelse og hjertet har sluttet å slå 36.
  2. Ved hjelp av en plastskje, løfte fisken fra Tricaine løsning, dekanter løsningen og plassere dyret på en vev eller papir håndkle.
  3. Bruk en skarp to disseksjon saks for å lage et kutt bak gjelle operculum og fjerne hodet.
  4. Umiddelbart åpne fiskekroppen med disseksjon saks ved å lage en lang ventralt innsnitt fra topp til bunnen av halefinnen.
  5. Fjern de indre organer i fisken ved hjelp av et par fine tang.
  6. Bruk super-fine nåler disseksjon til pin åpen kroppsveggene for å tillate visualisering av nyrene organ, som hefter til ryggveggen av dyret.
  7. Bruk fin pinsett til å løsne nyre fra rygg veggen.
  8. Forsiktig plassere nyrene inn i en 5 ml glassampulle innehold 1X PBS og vask 3 ganger med 3-5 ml frisk 1X PBS i 5 min hver. Merk: Anvendelse av en glassampulle for behandling av voksne nyreprøver muliggjør visualisering av vev og tillater vaskinger med store volumer (i forhold til vevet masse) på ca 3 - 5 ml. Alternativt kan en 12-brønns celledyrkningsskål benyttes. Mens en plast mikrosentrifugerør kunne brukes, kan den standard størrelse rørene (1,5 ml) begrenser vasking.
  9. Fjern nyrene med en overføring pipette og sted på et rent glass lysbilde med 1-2 dråper 1X PBS.
  10. Bruk fin pinsett å flate nyrene på lysbildet, og pass på at ingen vev har krøllet eller på annen måte veltetpå seg selv. Merk: Alternativt kan en tungsten ledning verktøyet brukes til å lage små snitt i bindevevet til rette flat posisjonering av nyre.
  11. Plasser små biter av modelleire på hvert hjørne av en 18 x 18 mm glass dekkglass og sakte sette dekkglass på nyrene. Merk: Litt vinkel dekkglass under plassering for å minimere overlapping luftbobler i løsningen 50. De modellering leire divots er ca 2 mm i diameter (figur 2A). Alternativt kan tribuner av vakuumfett erstattes i stedet for modelleringsleire. Legg til en ytterligere dråpe 1X PBS for å fylle rommet mellom dekkglass og glass-slide om nødvendig.
  12. Observer og / eller bilde nyrene ved å plassere glass-slide i synsfeltet på et stereomikroskop eller sammensatt mikroskop med det passende filter. Merk: Se Figur 2A for makroskopisk utseende på dette lysbildet forberedelse.

3. FIXAsjon, Dissection, Permeabilization og fjerning av pigmentering av Adult Sebrafisk Nyre

  1. Forbered en frisk fiksativ løsning av 4% paraformaldehyde (PFA) / 1X PBS / 0,1% DMSO eller tine en frossen delmengde av 4% PFA / 1 X PBS og tilsett 0,1% DMSO. Forsiktig: PFA er giftig og PFA løsninger skal håndteres på en kjemisk hette mens iført egnet personlig verneutstyr, inkludert hansker og labfrakk. I tillegg bør PFA pulver håndteres med forsiktighet når gjør stamløsning.
  2. Fyll en disseksjon brett med nok fiksativ løsning å senke hele dyret.
  3. Avlive og montere den valgte sebrafisk i fikseringsløsning (se trinn 02.02 til 02.06). Merk: Den valgte fisk kan være en ubehandlet sebrafisk nyre prøven, eller en nyre isolert fra en sebrafisk som tidligere har mottatt en intraperitoneal dekstran injeksjon (del 1).
  4. Fix prøven O / N (12 - 16 timer) ved 4 o C.
  5. Dagen etter, bruker fine tang til omsorgfullt løsne nyre fra rygg kroppen veggen og plassere orgelet i et hetteglass ved hjelp av en overføring pipette. Merk: Alternativt kan en 12-brønn eller 24-brønners dyrkningsskål benyttes. Mens en plast mikrosentrifugerør kunne brukes, kan den standard størrelse rørene (1,5 ml) begrenser vasking.
  6. Vask den dissekerte nyre 3 ganger med 3-5 ml 1X PBS med 0,05% Tween i 5 min hver.
  7. Fjern 1X PBS med 0,05% Tween og skyll nyren med 3 ml av en 5% sukroseløsning (i 1X PBS) i 30 min.
  8. Sett med 3 ml 30% sukrose-løsning (i 1X PBS) og lagre O / N (12 - 16 timer) ved 4 ° C. Merk: sukrose-løsninger permeabilize de cellulære membranene, slik at etterfølgende spesifikk merking av reagenser som de trenger inn i vevet.
  9. Den følgende dag, fjerner 30% sukrose-løsning og vaske nyrene to ganger med 5 ml 1X PBS med 0,05% Tween i 5 min hver.
  10. Sett på 1X PBS med 0,05% Tween med 3 -5 ml blekeløsning for å fjerne melanocytter pigmentering tilstede på nyrene organ.
  11. Plasser hetteglass på en rotator og se nøye som pigmentering forsvinner. Merk: Depigmentering tar vanligvis ca 20 min når utført etter sukrose behandling, men noen ganger kan ta så lenge som 60 min. Hvis blekeløsningen er igjen på nyren for lenge, kan oppløsningen av det organ oppstå; det anbefales å overvåke prøven hvert 10-15 minutt for å sjekke vev integritet.
  12. Når pigmentering har blitt fjernet fra nyrene, vaskes to ganger med 3-5 ml 1X PBS med 0,05% Tween.
  13. Sett på 1X PBS med 0,05% Tween med 3 - 5 ml av 4% PFA-løsning i 1 time ved RT.
  14. Fjern 4% PFA løsningen og vask nyrene 3 ganger med 3-5 ml 1X PBS med 0,05% Tween i 5 min hver. Merk: Når fiksering er fullført, nyrene også kan være montert på et objektglass og undersøkt for dekstran opptaks sans melanocytter pigmning, ved å utføre trinn 02.08 til 02.12.
  15. Fjern 1X PBS med 0,05% Tween og erstatte med 3 - 5 ml blokkeringsløsning, og deretter inkuberes nyrene ved RT i blokken i 2 timer.
  16. Når blokkeringen er fullført, går direkte til det valgte fargings protokollen. Merk: Nyrene kan nå bli behandlet gjennom en eller flere andre prosedyrer for å gjennomføre merking studier med ulike reagenser. For hele fjellet merking av proksimale tubuli med bare alkalisk fosfatase, fortsett til punkt 4. For hele fjellet merking av bare distale tubuli gå § 5. Alternativt kan § 4 og § 5 skal utføres i lineær rekkefølge for dual påvisning i hele fjellet .

4. merking Adult Nyre proksimale tubuli segmenter med alkalisk fosfatase Detection

  1. Fjern blokken og vaske nyrene 3 ganger med 3-5 ml 1X PBS med 0,05% Tween i 5 minutter hver, og deretter erstatte 1X PBS med 0,05% Tween med 3 - 5 ml1X PBS. La nyrene ligge i minst 10 min. Merk: I løpet av denne tiden, overfører nyren til en 12-brønn eller 24-brønners dyrkningsskål hvis vevet er blitt holdt i en glassflaske for tidligere behandlingstrinn.
  2. Sett på 1X PBS med tilstrekkelig arbeids alkalisk fosfatase substratoppløsning (Se deteksjon kit ligger i Table of Materials) for å dekke prøven, og deretter plassere prøven på en rotator i 30 min ved RT. Hold prøven beskyttes mot lys.
  3. Stopp reaksjonen ved å vaske nyrene hos alkalisk fosfatase vaskebufferløsning.
  4. Skyll nyre med tre forandringer av vaskebufferløsning over 10 - 15 min. Merk: Etter dette trinnet, gå direkte til del 5, Step 5.1 (altså midlertidig å utelate trinn 04.05 til 04.06) dersom merking med DBA er også ønskelig. Valgfritt trinn: å merke og visualisere cellekjerner i orgelet, suge nyrene hos propidium iodide løsning. Forbered en propidium iodide lager ved å løse opp pulveret på en konsentrasjosjon av 1 mg / ml (1,5 mm) i destillert vann. Fortynn lager til 500 nM i 2X SSC og inkuber nyrene i denne løsningen i 30 min. Skyll med 1X PBS og fortsett til trinn 4.5.
  5. Fjern vaskebufferløsning og monter nyre på et rent glass lysbilde i fosfatase monteringsmedium inkludert i merking kit (Se trinn 02.09 til 02.12). Merk: monteringsmedium har erstattet 1X PBS fra trinn 2.9.
  6. Visualisere alkalisk fosfatase farget nyre ved hjelp av en stereomikroskop eller sammensatt mikroskop med Hoechst / DAPI filter sett. Merk: Valgfritt trinn: Visualiser propidium iodide ved hjelp av en tetra-rodamin (TRITC) eller Texas rødt filter.

5. demarcating Adult Nyre distale tubuli segmenter med Rhodamine DBA

  1. Tilbered en 200 mL arbeids DBA-løsning ved fortynning av DBA (2 mg / ml) 1: 100 i 1X PBS.
  2. Sett på 1X PBS med 0,05% Tween-løsning med 200 pl DBA løsning.
  3. Plasser på rotator for1 t ved RT.
  4. Fjern DBA løsningen og vask nyrene 3 ganger med 3-5 ml 1X PBS i 5 min hver. Merk: Valgfritt trinn: å merke og visualisere cellekjerner i orgelet sammen med DBA etiketten, suge nyrene i DAPI løsning å oppdage med en Hoechst / DAPI filter (rodamin DBA flekken kan oppdages med en TRITC eller Texas rødt filter). Tilbered en DAPI lager ved oppløsning av pulver i en konsentrasjon på 5 mg / ml (14,3 mM). Fortynn lager til 300 nM i 2X SSC og inkuber nyrene i denne løsningen i 20 min. Skyll med 1X PBS og fortsett til trinn 5.5. Hvis Part 4-prosessering er utført, husk at DAPI og alkalisk fosfatase er begge registrert med en Hoechst / DAPI filter.
  5. Fjern 1X PBS og montere nyre på et rent glass slide (se trinn 02.09 til 02.12).
  6. Visualisere DBA-farget distale segmenter av nyre ved hjelp av en standard TRITC eller Texas rødt filter satt på en fluorescerende stereo eller sammensatt mikroskop. Merk: Tilleggs step: Visualiser DAPI bruker en Hoechst / DAPI filter.

6. Inkludering, Cryosectioning og farging (Vital Fargestoffer og Immunohistokjemi merking) av Adult Sebrafisk nyrevevet

  1. Velg fisk for analyse, deretter avlive, fikse og permeabilize som beskrevet (trinn 3.2 til 3.8). Merk: Fix voksen fisk i 9: 1 etanol: formaldehyd / 0,1% DMSO i stedet for 4% paraformaldehyde / 1X PBS / 0,1% DMSO for cryosection prosedyre for å produsere deler for dekstran, alkalisk fosfatase, og DBA visualisering. Men husk at Paraformaldehyde baserte bindinger kan være kompatibel for noen immunhistokjemi prosedyrer. Videre er bleking av den voksne nyre ikke nødvendig for cryosection analyse, fordi melanocytter er overfladisk og påvirker ikke visualisering av nevronet celler som utgjør den "innsiden" av nyre organ.
  2. Dagen etter, fjerne 30% sukroseløsning og erstatte med 1: 1 vev frysing medium: 30% sucrose i 4 timer ved RT.
  3. Fjern det 1: 1 løsning og legge nyreprøver i 100% vev iskaldt medium i cryomolds og sted ved -80 ° C i minst 1 time.
  4. Transversalt kuttet seriesnitt, omtrent 12 mikrometer tykke, gjennom hele den voksne nyre.
  5. Monter frosne cryosections på selvklebende objektglass og la det lufttørke i 1 time ved 50 o C.
  6. Butikken lysbilder ved -80 o C før bruk.
  7. Når cryosections er klar til å merkes, fjerne objektglass fra -80 o C og legg på lysbildet varmere ved 50 o C i 45 min.
  8. Ved hjelp av en flytende blocker penn, tegne en sirkel rundt cryosections og la tørke i 15 min på lysbildet varmere ved 50 o C.
  9. Fjern lysbilder fra raset varmere og plassere flat i en luftfuktighet kammer ved RT.
  10. Rehydrere cryosections ved tilsetning 1X PBS med 0,05% Tween til den omsluttede del av lysbildene i 20 min. Merk: Omtrent 200-300 &# 956; l er nødvendig for å dekke hver omkranset del på et lysbilde.
  11. Sett på 1X PBS med 0,05% Tween-løsning med frisk 1X PBS og inkuberes i 10 min.
  12. Fjern 1X PBS og inkuberes cryosections i en blokkeringsløsning i 2 timer. Merk: For en 10 ml blokkering løsning, kombinere 8 ml 1X PBS med 0,05% Tween, 2 ml føtalt kalveserum og 150 pl DMSO. For å utføre immunhistokjemi etter blokkeringstrinn, Inkuber objektglasset med det ønskede primære antistoff fortynnet i friskt blokk O / N ved 4 ° C, vaskes en gang ved hjelp av 1X PBS med 0,05% Tween, inkuberes i 2 timer ved RT med sekundært antistoff fortynnet i 1X PBS med 0,05% Tween, vaske en gang ved hjelp av 1X PBS med 0,05% Tween, og montere et dekkglass på lysbildet med monteringsmedium. De nødvendige antistoff-fortynninger vil variere og forsøk bør utføres for å velge de optimale fortynninger. Antigen henting kan også legge til rette immunolabeling, og utføres før blokkering. Umiddelbart etter lysbildene er tint ved 50 o C(Trinn 6.8) inkuber cryosections mellom 95 ° C-100 ° C i 40 min i forvarmet 10 mM natrium-citratbuffer. Kule lysbildene i 30 min, deretter vask to ganger i 1X PBS med 0,05% Tween, og gå videre til trinn 6.11.
  13. Fjern blokkeringsløsningen og vask cryosections 3 ganger med 1X PBS i 5 min hver.
  14. Bytt 1X PBS med DBA flekker løsning og inkuberes i 1 time. Merk: Fortynn 1 pl DBA i 99 mL av 1X PBS for å lage en 100 pl flekker løsning.
  15. Fjern DBA farging løsningen og vask cryosections 3 ganger med 1X PBS i 5 min hver.
  16. Påfør alkalisk fosfatase etiketten og ruge på cryosections for 10 min.
  17. Vask alkalisk fosfatase ved de cryosections med en serie av tre vaskinger med vaskebuffer i 10 minutter hver. Merk: I en 100 ml løsning av vaskebuffer, kombiner 5 ml av 0,5 M EDTA og 120 mg av levamisol i 95 ml 1X PBS. Slik merker kjerner, ruge seksjoner med propidium iodide eller DAPI på dinologi tidligere nevnt (trinn 4.4, 5.4, henholdsvis) i 30 min ved RT. Velg en kjernefysisk flekken kompatibel med kombinasjonen av andre fluorescerende flekker som har blitt valgt.
  18. Fjern all væske fra cryosections og plassere 2 dråper montering medium på objektglass.
  19. Plassere mikro dekkglass forsiktig inn på objektglass. Cryosections er nå klar til bilde med det riktige filter (e).

7. WISH Processing for Adult sebrafisk Nyre Samples

  1. Velg de ønskede sebrafisk prøven (e), avlive, fikse og dissekere nyrene som beskrevet (trinn 3.1 til 3.5). Merk: Det er viktig å bruke en fiksativ løsning på 4% Paraformaldehyde (PFA) / 1X PBS med 0,1% DMSO å permeabilize nyrene. Plasser nyre inn et hetteglass for enkel visualisering under påfølgende behandlingstrinn.
  2. Fjern fiksativ og vaske nyrene to ganger med 5 ml 1X PBST.
  3. Fjern 1X PBS og vaskes to ganger nyre with 100% metanol, og deretter inkubere nyrene ved -20 ° C i minst 20 min for å permeabilize. Note: dissekert nyrer kan lagres på ubestemt tid -20 o C.
  4. Rehydrere nyrene ved å utføre en serie av 5 min vasker med 3 - 5 ml 50% metanol / 1X PBST, 30% metanol / 1X PBST, og to ganger med PBST 1X.
  5. Bleach nyrene å fjerne pigmentering som beskrevet (Steps 03.10 til 03.14).
  6. Unn nyrene med 10 ug / ml proteinase K / 1X PBST med 0,1% DMSO i 20 min, deretter spyles to ganger med PBST 1X og post-fix i 4% PFA / 1X PBST i 20 min i O / N. Merk: alltid klar proteinase K arbeidsløsning umiddelbart før prøven fordøyelse ved å kombinere 50 pl nylig tint proteinase K lager (10 mg / ml), 50 ml PBST 1X, og 50 ul DMSO.
  7. Behandle nyre for enkel eller dobbel WISH følge trinnene for riboprobe syntese, prehybridization, hybridisering, anti-digoxygenin / anti-fluoroscein antistoff inkubasjon og Detecsjon som nylig beskrevet 49. Merk: Antall montere avbildning av nyre flekker skal utføres i løpet av flere dager etter utføring fargingsreaksjonen. Nephron flekker tendens til å falme svært raskt, spesielt røde underlaget etiketter. For nevronet fotografering, flat feste nyreprøve som beskrevet ovenfor i trinn 2,10 til 2,12, og med bruk av en stereo- eller sammensatt mikroskop. Differensial interferens kontrast filtre kan brukes til å bedre visualisere de cellulære konturene av nephrons å forenkle analysen.

Representative Results

Hver av protokollene ble utført på villtype sebrafisk. Eksempler på data innhentet dokument normal strukturelle sammensetning og egenskaper nephrons innenfor den friske voksne sebrafisk nyre. Den voksne sebrafisk besitter en mesonephros, eller andre nyre skjema som ligger på rygg kroppen veggen (figur 1A). Den voksne nyre er relativt flatt og inneholder en såkalt hode, bagasjerommet, og hale regionen med overfladiske melanocytter spredt utover disse regionene (Figur 1a). Den nyrevevet inneholder forgrenet matriser av nefroner som kobler og renne inn i sentrale innsamlingskanaler (Figur 1a). Hver nevronet er polarisert langs sin lengde, med et blodfilter (eller nedsatt blodlegeme) i den ene enden, etterfulgt av en serie av tubulære segmenter, og til slutt ved en terminerende kanalsystem som samler opp-løsning som vil bli utskilt (figur 1A). Hver voksen nevronet tubule inneholder proksimale og distale segmenteringts av celler, avgrenset av uttrykket av spesifikke løse transportører 30,31,36,37, som er konservert med segmental mønster utstilt ved embryonale nephrons 31-35 (Figur 1b). For eksempel cubilin transkripsjoner markere proksimale tubuli 39 (PCT og PST) og clcnk transkripsjoner markere distale tubuli 32 (DE og DL) (figur 1B). Videre er PCT-segmentet utmerker seg ved ekspresjon av slc20a1a, er PST skilles ved ekspresjon av slc13a1 blir DE utmerker seg ved ekspresjon av slc12a1, og DL er kjennetegnet ved ekspresjon av slc12a3 32   (Figur 1B). Forskjeller mellom voksen nevronet tubuli i forhold til embryonale seg er at de distale segmenter viser konvolusjoner (DE, DL) og DL segment grenene i stor utstrekning i den voksne, som er forskjellig fra de lineære, ikke-forgrenet anatomi av disse regionene på embryo 30,31,36,37 (figur 1A). I begge voksen 30 og embryonale 38-41 nevronet tubules, kan PCT epitel skilles på grunn av sin endocytiske egenskaper, og kan visualiseres og vurdert for reabsorptive funksjon basert på evnen til opptak fluorescerende dekstran-konjugater (Figur 1b). Videre, som vist i de etterfølgende tall, den voksne proksimale tubuli (PCT og PST, eller pan-proksimale region) er merket av alkalisk fosfatase, mens distale tubuli (DE og DL, eller den pan-distal region) er merket av DBA (Figur 1B). Metodene som brukes her til etikett voksen sebrafisk Nephron segmenter ved hjelp av dekstran opptak, alkalisk fosfatase, DBA, immunhistokjemi eller ønsker kan utføres i ulike kombinasjoner, i hele fjellet eller med histologiske snitt av nedsatt vev (figur 2). Dette gir stor fleksibilitet og variasjon når nevronet sammensetning skal vurderes (Figur 2).

Den voksne nyre kan monteres flatt på en glass-slide for analyse, med tribuner av modelleringsleire (eller alternativt vakuumfett) som brukes til å suspendere dekkglass over vev (figur 3A). Som den typiske nyre lengde er ca 5-7 mm, den har en størrelse bidrar til bildebehandling på et stereoanlegg eller sammensatt mikroskop (figur 3A). Under lysfelt belysning, kan en overfladisk populasjon av melanocytter med svart pigmentering bli visualisert i forbindelse med nyrevevet, og blodkar som aorta kan sees fordi de sirkulerende erytrocytter har en rød fargetone (Figur 3B). Etter intraperitoneal injeksjon av dekstran-FITC ble PCT domener lokalisert rundt de mesonephros fortsatt merket 3 dager senere, og avbildes ved hjelp av et FITC-filter på en fluorescerende mikroskop (figur 3C). Mens melanocytter delvis tilsløre visualisering av individuelle nyretubuli (Figure 3C '), trenger melanocyttene ikke hindre kvantifisering av nevronet nummer eller evaluering av tubule diameter og lengde. Etter intraperitoneal injeksjon av dekstran-fluor-rubin, bleking av den fikserte prøve eliminert melanocytter pigmentering, og PCT-segmenter ble observert med lyse felt belysning alene (Figur 3D). Lipid dråper fra den abdominale kroppshulrommet kan bli sett i sammenheng med hele nyren organpreparater (figur 3A) .Individual PCT segmenter viser konvolusjoner, spoler (Figur 3d '), men også kan være preget av relativt lineære strekninger (figur 3D ").

Ulike dekstran konjugater gitt ulike nivåer av generell klarhet i proksimale tubuli merking. Spesielt dekstran-FITC eller dekstran fluor-ruby førte til skarp Nephron etiketter med minimal bakgrunns (Tall 3C-D "). Både dekstran kaskade blue og Lucifer gule konjugater viste proksimale tubuli opptaket i voksen nyre (Figur 4A, 4B). Interessant, nyrer som er utsatt for dekstran kaskade blå viste relativt spesifikk PCT fluorescens med noen bakgrunnen (figur 4A 4A '), mens nyrer som er utsatt for dekstran lucifer gul hadde merket PCT segmenter, men viste en merkbar bakgrunnssignalet, med ikke-spesifikke fluorescerende flekker tilstede i hele den renale stroma, eller rommet mellom de nephrons (figur 4B, 4B). Til slutt, ved bruk av dekstran-fluor rubin gitt overlegne proksimale tubuli merking, med minimal eller ingen bakgrunn selv når den vises i en rekke forskjellige forstørrelser (Figur 4C, 4C). I alle tilfeller, den karakteristiske rørformede mønster av dekstran konjugert opptak korrelert med WISH ekspresjon av transkripter som koder slc20a1a, en etablert PCT-spesifikk markør 30-32 (figur 4D). Nephri PCT-segmenter farget med slc20a1a antisens riboprobe vises S-formede PCT-spoler, så vel som mindre kraftig kveilet PCT segmentene (figur 4D '), som observert under merket dekstran-konjugerte analyser (figur 3d', 3d ").

Andre nyre preparater, for eksempel påvisning av den proksimale tubuli alkalisk fosfatase-aktivitet (Figur 5A, 5B, 5C) ble på lignende måte utført etter fjerning av melanocytter pigmentering. Dette åpnet for proksimale tubuli nevronet bildebehandling og analyse uten noen hindring. Endogen alkalisk fosfatase reaktivitet i nevronet er en viktig kjennetegn på proksimale tubuli 1,47. Alkalisk fosfatase farging er meget spesifikt for proksimale nevronet regioner, i forhold til pan-proksimale WISH uttrykksmønster av genet cubilin 39 (figur 5D, 5D). Alkalisk fosfatase reaktivitet var mest intens i granst i den proksimale tubuli som tilsvarer PCT (figur 5B), som ligner mønsteret av cubilin uttrykket (figur 5D, 5D '), som også hadde høyeste relative transkriptnivåene i PCT. PCT ble utmerker seg ved sin litt større diameter, spesifikk ekspresjon av transkripsjonsfaktor mafba (figur 5E, 5E '), og spesifikk ekspresjon av det oppløste stoffet transporter genet slc20a1a (figur 4D, 4D). Alkalisk fosfatase-merket reaktivitet også en strekning av proksimale tubuli med en tynnere diameter som svarer til den PST segment (figur 5B) basert på sammenligning med segmentet spesifikt transkript ekspresjon av det oppløste stoffet transporter genet slc13a1 (figur 5F, 5F). Ønsket uttrykk domener av PCT markør slc20a1a og PST markør slc13a1 er gjensidig utelukkende (figur 5G cubilin (svarte pilspisser i. Figur 5G ', 5G ", 5G"' ).

For ytterligere å bekrefte at forholdet mellom alkalisk fosfatase reaktivitet med proksimale tubuli identitet, hel montere co-merking av alkalisk fosfatase-farging ble utført på nyrer fra sebrafisk som mottok en intraperitoneal injeksjon av dekstran-fluor-rubin 3 dager før (Figur 6A-C). Dextran fluor-rubin viste overlapping med alkalisk fosfatase i bare den større diameter-parti av den proksimale tubuli domenet som svarer til PCT (eksempler i figur 6D-I). Den dekstran-positive domene brått stoppet på det sted hvor diameteren av den proksimale tubuli tynnet, dvs. hvor PCT og PST oppfylt, (hvit pilhoder i figur 6), og bare alkalisk fosfatase reaktivitet ble observert i det etterfølgende PST segment (eksempler i figur 6D-I). Bakgrunn fluorescens fra den alkaliske fosfatase reaksjonen også svakt skissert par parallelle store oppsamlingskanalspor som finnes i den voksne nyre 29,30 -ducts som utmerker seg ved å ha den bredeste diameteren til enhver nyre-assosiert rør (stjerne i figur 6A, 6D, 6E, 6G, 6H). Deretter ble co-merking av Nephron tubuli med alkalisk fosfatase og dekstran opptak observert i cryosection analyse (figur 6J, tubulære utkant skissert med hvite prikker). I tverrsnitt, ble alkalisk fosfatase reaktivitet bemerket i et tykt band på den apikale overflate av den rørformede epitel, i samsvar med børstegrense ultrastructure, mens den tilsvarende rørformede celle cytosoliske plass viste dekstran fluor-rubin reaktivitet (figur 6J). Spesielt, Stained tubuli var enten dobbel positiv for alkalisk fosfatase og dekstran, som fører til deres identifisering som PCT-segmenter eller enkeltvis positivt for alkalisk fosfatase (figur 6J, tubule perimeter skissert i gule prikker), som fører til en identifikasjon som PST segment (merk: annet tubuli stede var negative for begge flekker, ikke data vist) (figur 6J). Videre alkalisk fosfatase farging (Figur 6K) ble vellykket kombinert med et kjernefysisk etikett, propidium iodide (figur 6L), tilrettelegging celle telling (overlay i figur 6M).

Distale tubuli av den voksne sebrafisk nevronet var merket med rodamin-konjugert DBA (figur 7). Hele montere dobbel-merking med DBA og alkalisk fosfatase ble utført på nyrer fra villtype sebrafisk (figur 7A-C). DBA og alkalisk fosfatase reaktivitet viste ingen overlapping i nevronet tubuli ( Figur 7G, 7H, 7J), mens forgrening ble aldri observert i tubulære segmenter farget med alkalisk fosfatase. Nyre cryosections ble samlet inn fra villtype sebrafisk som bærer et transgen der enpep arrangøren driver EGFP (Tg: enpep: EGFP), som GFP etiketter både proksimale og distale Nephron tubuli 51 (figur 7i). Immunhistokjemi ble utført for å detektere GFP, slik som å merke alle de renale tubuli (grønn, fig 7I), etterfulgt av fluorescerende merking med alkalisk fosfatase og DBA (turkis og rødt, henholdsvis fig 7I). Analyse av tubulære seksjoner avdekket at tubuli var enten positive for alkalisk fosfatase eller DBA, men ikke begge etikettene (figur 7i). Bare sjelden karules viste reaktivitet med verken alkalisk fosfatase eller DBA beis, muligens på grunn av vinkelen på tubule delen (hvit pil, figur 7I). Videre DBA farging ble vellykket kombinert i hele mount nyre flekker med atom etiketten DAPI (figur 7J), igjen understreker den karakteristiske forgrenet natur distale tubuli segmenter (hvite pilspisser, figur 7J).

Neste, for ytterligere å sammenligne mønstre av dekstran-FITC opptak, alkalisk fosfatase, og DBA, ble trippel merking undersøkt av intraperitonealt injisere voksen sebrafisk med dekstran-FITC, fulgt av nyre isolasjon tre dager senere etterfulgt av cryosectioning og farging for alkalisk fosfatase og DBA (eksempler som er gitt i figur 8A-E). Nyretubuli viste tre kategorier av label kombinasjoner: tubuli som var dobbelt positivt for alkalisk fosfatase og dekstran betegnet PCT segmenter (hvite stiplede linjer), rørformedees positive for alkalisk fosfatase alene betegnet PST-segmenter (gule stiplede linjer), og distale tubuli ble merket ved bare DBA (rød stiplet skisserer Figur 8A-E). Videre bare DBA positive tubuli utstilt avdelingspoeng (Figur 8E). Etter ønske analyse, dette karakteristiske forgrening mønster av den distale, DBA positive tubuli korrelert med genutrykksmønster av oppløst stoff transporter transkripter som er spesifikke for distale tubuli segmentene (figur 8F-I). Transkripsjoner koder clcnk, som markerer hele distale tubuli (DE og DL) var tynn i diameter, rikelig i nyrene, og inneholdt avdelings poeng (svart pilspiss Figur 8F, 8F '). Til sammenligning tubulære segmenter som viste ekspresjon av slc12a1 eller slc12a3, som er markører for DE og DL, henholdsvis, var mindre rikelig i nyreprøver samlet i forhold til clcnk uttrykket (sammenlign figur 8 G og 8F, 8H). Videre tubulære segmenter som uttrykte slc12a1 var sjelden, om noensinne, forgrenet (figur 8G, 8G '), mens tubulære regioner som uttrykte slc12a3 ble ofte forgrenet i karakteristiske vindmølle-lignende ordninger (figur 8H, 8H', 8H ", 8H" ' , svart pilspisser). Til slutt dobbelt WISH for PCT markør slc20a1a og distal markør clcnk viste at disse flekkene ikke var overlappende (figur 8I). Spesielt ble de strekninger av slc20a1a -expressing PCT segmenter ikke festet til clcnk -expressing tubuli, noe som var forventet siden PST ligger mellom disse regionene (figur 8i). Til sammen analysene av merking nyretubuli med dekstran opptak, alkalisk fosfatase reaktivitet, DBA, og ønsker for spesifikke gentranskriptene, gjør det mulig å skjelne proksimale versus distale segmenter.

t "fo: keep-together.within-page =" alltid "> Figur 1
Figur 1. Nephron anatomi i den voksne sebrafisk nyre. Skjematiske tegninger av (A) voksen sebrafisk nyre og (B) en sammenligning diagram av segment molekylære egenskaper utstilt ved voksen og embryonale sebrafisk nephrons. (A) (øverst til venstre) Den voksne nyre er et flatt organ som befinner seg på dorsal kroppsveggen. (Øverst til høyre), Sett fra en ventral perspektiv har nyrene en særegen buet morfologi, som består av hode, kropp og hale regioner, og har også en overflate befolkning på tilknyttede melanocytter. Utvidelsen (nederst til venstre) viser skjematisk en typisk nevronet treet i den voksne sebrafisk nyre, hvor hver enkelt nevronet besitter et blodfilter (renal blodlegeme) i den ene enden, etterfulgt av en proksimale tubuli, distale tubuli, og kanalsystem. Farget skjematisk (bottom høyre) viser en lineær diagram av en voksen nevronet treet for å sammenligne segmentet egenskaper med de embryonale nephrons (B). Sebrafisk embryo nephrons inneholde tubulære segmenter som inkluderer den proksimale del av nyretubuli (PCT), proksimale rett tubuli (PST), distal tidlig (DE), og distal sent (DL), med respektive genekspresjon domener som er oppført nedenfor. Nefroner i den voksne sebrafisk har en lignende segmental sammensetning og analogt molekylær signatur basert på uttrykket domener av gener som koder løse transportører, selv om en merkbar forskjell i forhold til fosteret er at flere nephrons kan forenes gjennom en forgrenet DL segment. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2 Figur 2. Flytskjema kart som viser forholdet mellom de metoder som er avbildet i denne protokollen, som indikerer hvor metodene kan utføres enkeltvis eller i diverse kombinasjoner. Følge intraperitoneal injeksjon av merket lysin-dekstran festbar inn i den voksne sebrafisk, kan nyren bli visualisert på en Hele monterings preparatet, enten alene eller i kombinasjon med alkalisk fosfatase og / eller DBA flekker. Alternativt kan den valgte sebrafisk nyrene vil bli undersøkt etter histologisk vev seksjonering med en kryostat. Seksjonene kan være farget til å merke en rekke kombinasjoner av attributter, ved hjelp av immunhistokjemi, nukleær farging, DBA flekker, og / eller alkalisk fosfatase reaktivitet. I tillegg, kan renale seksjoner bli visualisert direkte for tilstedeværelse av lysin-festbar dekstran opptak i PCT-segmenter. Endelig kan utvalgte nyrer bli behandlet for den spatiotemporal uttrykk av genuttrykk ved bruk av WISH. Alternative tallene viser til corresponding protokoll deler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Voksen sebrafisk nyre flat mount forberedelse og program for å visualisere konjugert dekstran opptak i PCT segment av nyre nephrons. (A) Lysfelt bilde av en nyre prøven flate montere bearbeiding, hvor organet er anbragt flatt på en glass-slide, med et dekkglass plasseres på toppen av vev som hviler på fire tribuner av modelleringsleire (rosa farge). Her nyre preparatet er avbildet sammen med en metrisk linjal for å gi en skalert sammenligning. Den typiske voksen nyre er ca 5-7 millimeter (mm) fra hode til hale. (B) Lysfelt bilde av en ubleketnyre. Den sort pigmentering tilsvarer den spredte populasjon av melanocytter funnet i forbindelse med nyre, og aorta løper langs midtlinjen av nyre. (C) Visualisering av nevronet PCT segmenter 3 dager etter intraperitoneal injeksjon av 40 kDa dekstran-fluorescein (FITC) , uten bleking av den voksne nyre. PCT segmenter er sett gjennom nyrene, men er delvis skjult på grunn av melanocyttene. (C ') Digital zoom av et enkelt nevronet, med melanocytter (hvit pil). (D) Bilde av en voksen nyre tre dager etter intraperitoneal injeksjon av 10 kDa dekstran fluor-rubin, fiksering av nyre, og bleking. Melanocyte pigmentering ble fjernet og PCT regionene ble visualisert her basert på deres endocytic opptak av dekstran henhold lysfelt belysning. Lipid dråper (pil) fra magen kan noen ganger sees i sammenheng med nyre vevsprøver. (D ', D ") Repretivt bilder skildre små morfologiske variasjoner mellom PCT segmenter. Mens mange Nephron PCT er tett kveilet (D '), andre nephrons inneholder PCT regioner som har minimal coiling (D "). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
. Figur 4. Voksen nyre nevronet PCT tubule segment merking villtype sebrafisk ble injisert intraperitonealt med et enkelt fluorescerende dekstran konjugat; da deres nyre ble undersøkt tre dager etter injeksjon for PCT-visualisering. (A, A ') Dextran kaskade blå, 10 kDa (B, B') dekstran lucifer gul, 10 kDa og (C, C ') f dekstran perfluor-rubin, 10 kDa alle fortrinnsvis merke PCT segmentene i nyre nephrons. Både dekstran kaskade blå og Lucifer gul vis noen ikke-spesifikk merking av stromal cellepopulasjoner som ligger mellom nephrons, med mye høyere bakgrunn observert i Lucifer gule behandlet nyrer. I kontrast, dekstran fluor-rubin viste dramatisk redusert bakgrunn med intens PCT merking. (D, D ') En voksen nyre farget etter ønske for å detektere beliggenheten til transkripter som koder slc20a1a, en spesifikk markør av PCT transporter celletype. Uttrykket domenet slc20a1a matcher karakteristisk mønster av dekstran opptak observert i nyrene, med en fordeling av ulike tvinnede / løkker PCT domener samt mer langstrakte PCT strekninger som viser en konsekvent bredt diameter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figur.

ontent "fo: keep-together.within-page =" alltid "> Figur 5
Figur 5. Representant resultat av farging for alkalisk fosfatase, en pan-proksimale tubuli markør, i den voksne sebrafisk nyre forhold til andre proksimale tubulære markører vurderes med WISH. (AC) alkalisk fosfatase farging (turkis) belyser nevronet proksimale tubuli, fremhever både PCT og PST. (DF ') Enkelt WISH for de nevnte gener (hver i lilla flekker). (D, D') Uttrykket mønster av cubilin , en pan-proksimale (PCT-PST) markør, korrelerer med alkalisk fosfatase (D, D '). Til sammenligning WISH for mafba markerer PCT (E, E ') og slc13a1 markerer PST (F, F'). I (GG "') dobbel WISH for PCT markør slc20a1a </ Em> (rød) og PST markør slc13a1 (lilla) viser at segmentene merket av disse markørene ikke overlapper, og heller at deres uttrykk domener okkupere tilstøtende posisjoner når enkelt nephrons blir nøye undersøkt (G'-G "'). Svart pilspisser indikerer krysset mellom PCT og PST segmenter, som er vanligvis knyttet til en endring i tubule diameter fra store til små, henholdsvis. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. Alkalisk fosfatase og dekstran opptak viser overlapp i PCT-segmentet av voksne nyre nephrons, og alkalisk fosfatase farging er kompatibel med atom co-merking med propidium jodid. (AI) (AC). Sammenslåtte bildet og atskilte bilder av sal-regionen av en enkelt nyre (DF). og (GI) To sett med sammenslåtte bilder og separate bilder i Eksempel nephrons. (I) Cryosection analysen bekrefter co-merking av alkalisk fosfatase og dekstran fluor-rubin i PCT-segmenter (skissert i hvite prikker), mens alkalisk fosfatase alene etiketter PST segment (skissert i gule prikker). (KM) En nyre varmerket med (K) alkalisk fosfatase (turkis) og (L) propidium iodide (lilla), slik at (M) fusjonerte visualisering av proksimale tubulære celler og deres kjerner, henholdsvis. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7. alkalisk fosfatase og DBA er gjensidig eksklusive segment etiketter som markerer pan-proksimale og pan-distal regioner, henholdsvis, til stede i voksen sebrafisk nyre nephrons. (AH) hele fjellet preparater av en sebrafisk nyre farget med alkalisk fosfatase og rodamin-DBA. Alkalisk fosfatase (turkis) og DBA (rød) viser ikke overlapping i nyrene. Bakgrunnsverdier av alkalisk fosfattase belyse paret av store oppsamlingskanalene i hver nyre (stjerne, *), som er særegent på grunn av deres store diameter. DBA positive tubuli er tynnere i diameter, og kjennetegnes ofte ved tilstedeværelse av forgreningspunktene (hvite pilspisser). (AC) sammenslåtte bildet og atskilte bilder av den sal-regionen av en enkelt nyre. (DF) Et sett sammenslåtte bilder og atskilte bilder av eksempel nephrons. (G, H) Andre eksempler, med forgrenede DBA tubuli sammen med alkalisk fosfatase positive tubuli, fusjonerte bilder. (I) Cryosection analysen bekrefter at alkalisk fosfatase og DBA label distinkte tubulære seksjoner, og bare sjelden tubuli viser verken etiketten (hvit pil ), sannsynligvis på grunn av vinkelen på seksjon for at tubuli. For denne analyse, villtype transgen fisk, Tg: enpep: EGFP, ble anvendt, og alle de renale tubuli i nyrene dette ble immunolabeled med et primært antistoff til å detektere GFP (J). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 8
Figur 8. Triple merking av voksne nyre cryosections med dekstran opptak, alkalisk fosfatase, og DBA i forhold til fjerne segmentet WISH analyse. (AE) Voksen nyrer ble injisert intraperitonealt med dekstran-FITC (grønn), og nyrene samlet 3 dager senere for innebygging og cryosectioning. Farging med alkalisk fosfatase (turkis) og DBA (rød) avdekket tre bestander av tubuli: PCT segmenter som var positive for alkalisk fosfatase reaktivitet og dextløp (skissert i hvite prikker), PST-segmenter som var positive bare for alkalisk fosfatase reaktivitet (skissert i gule prikker), og distale tubuli segmenter som var positive for DBA bare (skissert i røde prikker) som også viste karakteristiske distal avdelings poeng. ( AD) sammenslåtte bildet og separate bilder av ett eksempel delen. (E) sammenslåtte bildet av et annet eksempel delen. (FI) Sammenligning av distale tubuli genutrykksmønster av single (FH '") og dobbel (I) WISH. Den (FH ') Enkelt WISH for de nevnte gener (hver i lilla flekker). (F, F') Uttrykket mønster av clcnk, en pan-distal (DE-DL) markør, ble oppdaget i tynne tubuli som inneholdt avdelings poeng (svart pilspiss). (G, G ') Til sammenligning WISH for slc12a1 markerer DE uten grenpunkter oppdaget, og (HH' ") <em> slc12a3 markerer DL, et segment preget av mange avdelingspunkter i hele nyrene organ (svarte pilspisser). (I) Dobbelt WISH for PCT markør slc20a1a (rød) og den pan-distal clcnk (lilla). Segmentene merket av disse markørene ikke overlapper, og heller deres uttrykk domener okkupere ikke tilstøtende posisjoner, slik at de enkelte PCT spoler (nederst til høyre) gjør ikke abut distale tubuli, og sistnevnte okkupere diskrete steder og har kjennetegn avdelings poeng (svart pilspiss ). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Her har vi beskrevet metoder som muliggjør visualisering av nevronet segment komponenter i den voksne sebrafisk. Injeksjon av fluorescerende dekstran konjugater gjør fortrinnsrett PCT merking grunn de endocytiske egenskapene til disse proksimale tubulære celler 30,38. Denne metoden kan utføres med stor fleksibilitet på grunn av eksistensen av dekstraner som kan oppnås med en flokk av ulike fluorescerende konjugater. I tillegg er bruk av lysin-festbar dekstraner en spesielt fordelaktig måte å merke PCT-segmenter, som sekundære merkingsfremgangsmåter ikke er nødvendige. Dette gjør relativt grei signal deteksjon og er kompatibel med mange andre fluorescerende etiketter, immunolabeling, og bruk av transgene reporter linjer. Alkalisk fosfatase merking markerer også proksimale tubuli, med sterk reaktivitet i PCT og litt svakere reaktivitet i PST. Til slutt, gjør at DBA farging merking av distale tubuli segmenter, som viser en lmaracteristic forgrenet morfologi. Ulike lectinet molekyler, som er sukker-bindende proteiner av immune opprinnelse, har vært brukt mye til å skille pattedyr Nephron segmenter 47. Det er interessant at DBA i sebrafisk korrelerer med distale tubuli segmenter, slik det er brukt til å markere samlekanaler i pattedyrnyre 47.

Tatt sammen, kan disse metodene bli anvendt i forskjellige kombinasjoner for å dokumentere nedsatt sammensetning og funksjon. Siden alle disse metodene kan brukes i hele nyre preparater, gir de verktøy for å evaluere nevronet struktur og funksjon i hele organet uten helt å stole på bruken av mer tidkrevende og omstendelige metoder, f.eks cryosection arbeid og immunolabeling. Men flekkene er beskrevet i dette metoder artikkelen er levedyktige i cryosection. Cryosection analyse genererer prøver (sammenlignet med hele fjellet) som er bedre egnet for immunhistokjemi for å påvise spesifikke peptides, skjønt naturligvis denne type analyser krever tilgjengelighet av egnede primære antistoffer. Dessverre en stor begrensning i arbeidet med sebrafisk dyremodell forblir dårlig tilgjengelighet av antistoffer. Dermed ønsker fortsatt den mest brukte, det vil si, 'gå til' prosedyre for analyse av genuttrykk. ØNSKER å bruke BCIP, NBT, og / eller INT substrat reaksjoner å produsere lilla eller rødt bunnfall er ikke kompatibel med fluorescerende flekker på cryosections. Ett alternativ ville være å påberope seg bruk av fluorescerende WISH deteksjon, en prosedyre som er optimalisert for sebrafisk embryonale prøver og kan bli skreddersydd for bruk med den voksne nyre. Beskrivelsen av metodene i denne videoen artikkelen bør gi rom for videre eksperimentering med teknikker som fluorescerende WISH i kombinasjon med transgene sebrafisk linjer der enkelte segmenter er merket med en reporter som EGFP eller mCherry. Alternativt metodene beskrevet her could bli testet i kombinasjon med andre vitale fargestoffer, for eksempel, andre lektiner. Dermed kan ytterligere tilpasning og utvidelse av metodene beskrevet her påberopes som passer forskerens behov for hele fjellet nyre forberedelser og analyser.

Som sådan, disse metodene har bred potensial for gjennomføring med sebrafisk-modellen for pågående regenerering studier og også i genetisk sykdom modellering. Det er et stort behov for innovative forskning og behandling for nyre lidelser. Millioner av mennesker lider av noen form for nyresykdom hvert år at resultatene fra medfødte, akutte og / eller kroniske årsaker. Videre fortsetter forekomsten av nyresykdom å stige over hele verden, noe som gjør disse sykdommene et globalt folkehelseproblem 14,15. Behandlinger som hemodialyse er tilgjengelig der en ekstern dialysemaskinen tjener til å kvitte pasientens blod av metabolske avfall hvis nyrene ikke er i stand til å utføre denne rollen. Dessverre, Har dette inngrep begrensninger, som løpende behandling er nødvendig for å overleve. Videre vil pasientene til slutt krever en nyretransplantasjon, som kan ta mange år for å motta når en pasient ligger på en venteliste. Selv etter å ha innhentet en nyretransplantasjon, mange pasienter lider bivirkninger som følge av inngrepet, og må kjempe slike effekter for resten av livet. Disse vanskelighetene demonstrere alvorlig behov for utvikling av nye behandlinger for å enten forhindre nyresykdom eller kanskje forsterke vev gjenfødelse 8,16,52,53. Gitt de åpenbare etiske begrensninger i bruk av menneskelige forsøkskaniner i biomedisinske laboratorier, dyremodeller er avgjørende for studiet av menneskelig sykdom patogenesen og for testing av nye behandlinger. Som et resultat av dens anatomiske likhet og evolusjonære nærhet, har mus blitt den mest utbredte modell av human sykdom 45. Det er imidlertid visse begrensninger med dette dyret, inkluing manglende evne til å visualisere organutvikling in vivo og praktiske med å fullføre store genetiske skjermer. Sebrafisk er en relevant og nyttig modellorganisme for studier av organutvikling og modellering av menneskelig sykdom 45,46. I forhold til sykdom hos mennesker, funksjonelle homologer i sebrafisk finnes for nesten 70% av alle menneskelige gener 54,55.

Nyere arbeider har fremhevet nytten av sebrafisk for mange områder av nyre forskning 31,37,56. Studier av regenerering og reparasjon i sebrafisk etter AKI tyder på at tubule epithelial regenerering og neonephrogenesis er to prosesser som skjer og overlapper gjennom regenerering tidsforløpet 30,37. Bruken av et aminoglykosid antibiotika kalt gentamicin har blitt brukt som en skade paradigme gjennom å studere resultatene av AKI i voksen sebrafisk 29,30,37. Over en ca to-ukers periode etter skade fra gentamicin, den proksimale rørformedees regenerere, og i mellomtiden nye nephrons danne hele orgelet 29,30,37. Generelt, de mekanismene som regulerer epithelial regenerering er fortsatt svært kontroversielt. I en foreslått mekanisme for reparasjonsprosessen, er den innledende akutt skade hendelse, etterfulgt av en sloughing av døde celler inn i hulrommet. Deretter er det en rekke de-differensiering, spredning, og migrasjonshendelser, etter som nye celler skille, repopulating skadet basalmembran og gjenopprette funksjonen til den skadde området. Alternativt, har andre studier antydet at erstatningsceller oppstår fra stammen / stamceller som bor innenfor Nephron tubuli. Når det gjelder prosessen med neonephrogenesis i sebrafisk, har cellulære aggregater blitt observert følgende AKI av gentamicin injeksjon 29,30. Disse aggregatene senere modne til nye nephrons som lodd i allerede eksisterende tubuli 29,30. Den røde tråden som forener nevronet epithelial regenerering og neonephrogenesis er deres ren mysterium faktor: i dag er det eksponentielt flere spørsmål om hvordan disse regenerative bragder oppstå enn det er ledige innsikt.

Til dags dato, men flere spennende linjer av bevis støtter forestillingen om at nedsatt regenerering forskning ved hjelp av sebrafisk kan faktisk gi relevante komparative innsikt i menneskelig AKI som også kan ha direkte translasjonell potensial 56-58. Kjemisk screening for å identifisere små molekyler som øker proliferasjonen av nyre progenitor-celler i sebrafisk embryoet har nylig ført til identifiseringen av histon-deacetylase inhibitor metyl-4-(fenyltio) butanoat (m4PTB) 56,57. Administrasjon av denne forbindelsen til sebrafisk larver med gentamicin-indusert AKI avdekket at larve overlevelse økt og at nyretubulær spredning ble forbedret 56,58. Når mus med moderat iskemi-indusert AKI ble behandlet med m4PTB, ble deres utvinning akselerert i association med en reduksjon i både tubulær atrofi og cellesyklus arrest av voksende tubulære celler 58. Disse funnene tyder på at de veier som er ansvarlige for normal sebrafisk nedsatt utvikling og / eller regenerativ respons til AKI vil bli konservert med pattedyr 56.

Således, mens ytterligere studier er nødvendig for å erte hverandre mekanismene for regenerering-nemlig å identifisere signalveier som er involvert og forstå deres interaksjoner-sebrafisk gir en lovende avenue å forfølge dette viktige målet i nefrologi feltet. Verktøy som de nevronet celle etiketter som er beskrevet i denne protokollen representerer en gruppe av analyser som kan benyttes for å evaluere renal sammensetning og funksjonalitet i AKI-modeller. Videre kan de bli anvendt for å karakterisere transgene modeller av nyresykdom og kan gi måter å identifisere kjemiske terapeutiske midler som er i stand til å fremme gjenoppretting av nevronet struktur etter renal damalder.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av midler til RAW fra følgende: National Institutes of Health gir K01 DK083512, DP2 OD008470, og R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar stipend award # 5-FY12-75; starte opp midler fra University of Notre Dame College of Science og Institutt for biologi; og en sjenerøs gave til University of Notre Dame fra Elizabeth og Michael Gallagher på vegne av Gallagher Family å fremme stamcelleforskning. De bevilgende myndighet hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Vi takker staber av Department of Biological Sciences for deres støtte, og Center for Sebrafisk Forskning ved Notre Dame for sin enestående engasjement i omsorg og velferd for våre sebrafisk koloni. Til slutt vil vi takke alle medlemmer av vår forskningslaboratorium for sine kommentarer, diskusjoner og innsikt om dette arbeidet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X PBS Made by diluting 10 X PBS in distilled water.
1X PBST 0.1% Tween-20 detergent in 1 X PBS.
1X PBS with 0.05 % Tween 0.05% Tween-20 detergent in 1 X PBS.
Tween 20 American Bioanalytical AB02038
4% PFA/1X PBS Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20°C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. 
Fine Forceps Roboz RS-1050 Dumont Tweezers Pattern #55 
Glass slide Thermo-Fisher 4445 White Frost 
Glass coverslip Thermo-Fisher 12-540A 18 x 18 mm
Modeling clay Hasbro Playdoh Other modeling clays can be substituted and work similarly
Slide holder Thermo-Fisher 12-587 Optional: cardboard tray to store slides flat
Bleaching solution Bleach mix formula (for a 20 ml solution):
1.6 ml of 10% Potassium hydroxide solution
0.6 ml of 30% Hydrogen peroxide solution
100 μl of 20% Tween
Fill to 20 ml with distilled water
Potassium hydroxide Sigma 221473
Hydrogen peroxide Sigma H1009
Blocking solution Blocking Solution (for a 10 ml solution):
8 ml of 1X PBS with 0.05% Tween
2 ml of fetal calf serum
150 μl of DMSO
Alkaline phosphatase activity detection Invitrogen E6601 We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.  To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer's instructions. 
Alkaline phosphatase wash solution Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 ml solution):
5 ml of 0.5 M EDTA
120 mg of Levamisole
95 ml of 1X PBS
Dextran, fluorescein, 40,000 MW Invitrogen D1844 Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, cascade blue, 10,000 MW Invitrogen D1976 Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW Invitrogen D1825 Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW Invitrogen D1817 Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine Vector laboratories RL-10-32 DBA Staining Solution (for a 100 μl solution):
1 μl of DBA
99 μl of 1X PBS
Propidium iodide Invitrogen E6601
DAPI Invitrogen P1304MP
Vectashield hard set mounting medium Vector laboratories H-1400
Micro cover glass VWR 48393081
Dimethyl sulfoxide, DMSO American Bioanalytical 67-68-5
Sucrose Sigma S0289
EDTA, 0.5 M solution, pH 8.0 American Bioanalytical AB00502
Levamisole Sigma L-9756
Tissue freezing medium Triangle Biomedical Sciences, Inc. TFM-C
Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10 x 10x 5 mm Sakura Finetek 4565
TruBond 380 adhesive microscope slides Tru Scientific 0380W
Liquid blocker – super PAP pen Electron Microscopy Sciences 71312
Immuno stain moisture chamber Evergreen Scientific 240-9020-Z10
Cryostat Therm Microm™ HM 525 Cryostat
Stereomicroscope Nikon SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection. 
Compound microscope Nikon 96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reilly, R. F., Bulger, R. E., Kriz, W. Structural-functional relationships in the kidney. Diseases of the Kidney and Urinary Tract. RW, S. chrier , Lippincott Williams Wilkins. Philadelphia, PA. 2-53 (2007).
  2. Dressler, G. R. The cellular basis of kidney development. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 509-529 (2006).
  3. Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. Anat Rec. 232, 194-201 (1992).
  4. Cebrian, C., Borodo, K., Charles, N., Herzlinger, D. A. Morphometric index of the developing murine kidney. Dev Dyn. 231, 601-608 (2004).
  5. Schedl, A. Renal abnormalities and their developmental origin. Nat Rev Genet. 8, 791-802 (2007).
  6. Ricci, Z., Cruz, D. N., Ronco, C. Classification and staging of acute kidney injury: beyond the RIFLE and AKIN criteria. Nat Rev Nephrol. 7, 201-208 (2011).
  7. Faubel, S., et al. Ongoing clinical trials in AKI. Clin J Am Soc Nephrol. 7, 861-873 (2012).
  8. Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospects and challenges. Clin Transl Med. 2, 11 (2013).
  9. Liu, Y. Cellular and molecular mechanisms of renal fibrosis. Nat Rev Nephrol. 7, 684-696 (2011).
  10. Murugan, R., Kellum, J. A. Acute kidney injury: what’s the prognosis. Nat Rev Nephrol. 7, 209-217 (2011).
  11. Palevsky, P. M. Chronic-on-acute kidney injury. Kidney Int. 81, 430-431 (2012).
  12. Chawla, L. S., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease: an integrated clinical syndrome. Kidney Int. 82, 516-524 (2012).
  13. Bucaloiu, I. D., Kirchner, H. L., Norfolk, E. R., Hartle, J. E., Perkins, R. M. Increased risk of death and de novo chronic kidney disease following reversible acute kidney injury. Kidney Int. 81, 477-485 (2012).
  14. Collins, A. J., et al. USRDS 2012 Annual Data Report: Atlas of Chronic Kidney Disease and End-Stage Renal Disease in the United States (2012). Lancet. 365, 331-340 (2012).
  15. El Nahas, M. eguid, Bello, A., K, A. Chronic kidney disease: the global challenge. Lancet. 365, 331-340 (2005).
  16. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction. Biochem J. 444, 153-168 (2012).
  17. Toback, F. G. Regeneration after acute tubular necrosis. Kidney Int. 41, 226-246 (1992).
  18. Thadhani, R., Pascual, M., Bonventre, J. V. Acute renal failure. N Engl J Med. 334, 1448-1460 (1996).
  19. Bonventre, J. V. Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure. J Am Soc Nephrol. 14, S55-S61 (2003).
  20. Romagnani, P., Kalluri, R. Possible mechanisms of kidney repair. Fibrogenesis Tissue Repair. 2, 3 (2009).
  21. Bonventre, J. V., Yang, L. Cellular pathophysiology of ischemic acute kidney injury. J Clin Invest. 121, 4210-4221 (2011).
  22. Grgic, I., et al. Targeted proximal tubule injury triggers interstitial fibrosis and glomerulosclerosis. Kidney Int. 82, 172-183 (2012).
  23. Reimschuessel, R. A fish model of renal regeneration and development. ILAR J. 42, 285-291 (2001).
  24. Reimschuessel, R., Williams, D. Development of new nephrons in adult kidneys following gentamicin-induced nephrotoxicity. Ren Fail. 17, 101-106 (1995).
  25. Salice, C. J., Rokous, J. S., Kane, A. S., Reimschuessel, R. New nephron development in goldfish (Carassius auratus) kidneys following repeated gentamicin-induced nephrotoxicosis. Comp Med. 51, 56-59 (2001).
  26. Augusto, J., Smith, B., Smith, S., Robertson, J., Reimschuessel, R. Gentamicin-induced nephrotoxicity and nephroneogenesis in Oreochromis nilotica, a tilapian fish. Dis Aquatic Org. 26, 49-58 (1996).
  27. Elger, M., et al. Nephrogenesis is induced by partial nephrectomy in the elasmobranch Leucoraja erinacea. J Am Soc Nephrol. 14, 1506-1518 (2003).
  28. Watanabe, N., et al. Kidney regeneration through nephron neogenesis in medaka. Develop Growth Differ. 51, 135-143 (2009).
  29. Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
  30. Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-101 (2011).
  31. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
  32. Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, e189 (2007).
  33. Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-1127 (2008).
  34. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  35. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev Biol. 386, 111-122 (2014).
  36. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. 54, (2011).
  37. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
  38. Drummond, I. A., et al. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125, 4655-4667 (1998).
  39. Anzenberger, U., et al. Elucidation of megalin/LRP2-dependent endocytic transport processes in the zebrafish pronephros. J Cell Sci. 15, 2127-2137 (2006).
  40. Majumdar, A., Drummond, I. A. The zebrafish floating head mutant demonstrates podocytes play an important role in directing glomerular differentiation. Dev Biol. 222, 147-157 (2000).
  41. Kramer-Zucker, A. G., Wiessner, S., Jensen, A. M., Drummond, I. A. Organization of the pronephric filtration apparatus in zebrafish requires Nephrin, Podocin, and the FERM domain protein Mosaic eyes. Dev Biol. 285, 316-329 (2005).
  42. Brien, L. L., Grimaldi, M., Kostun, Z., Wingert, R. A., Selleck, R., Davidson, A. J. Wt1a, Foxc1a, and the Notch mediator Rbpj physically interact and regulate the formation of podocytes in zebrafish. Dev Biol. 358, 318-330 (2011).
  43. Ebarasi, L., Oddsson, A., Hultenby, K., Betsholtz, C., Tryggvason, K. Zebrafish: a model system for the study of vertebrate renal development, function, and pathophysiology. Curr Opin Nephrol Hypertens. 20, 416-424 (2011).
  44. Swanhart, L. M., Cosentino, C. C., Diep, C. Q., Davidson, A. J., de Caestecker, M., Hukriede, N. A. Zebrafish kidney development: basic science to translational research. Birth Defects Res C Embryo Today. 93, 141-156 (2011).
  45. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  46. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
  47. Cox, W. G., Singer, V. L. A high-resolution, fluorescence-based method for localization of endogenous alkaline phosphatase activity. J Histochem Cytochem. 47, 1443-1456 (1999).
  48. Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish kidney development. Methods Cell Biol. 100, 233-260 (2010).
  49. Watson, L., Vassallo, J., Cantor, G., Lehman-McKeeman, L. Lectin histochemistry: an alternative to immunohistochemistry for identify specific structures in rat papillary necrosis. HistoLogic. 41, 28-31 (2008).
  50. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J Vis Exp. , e51604 (2014).
  51. Seiler, C., Pack, M. Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene. Gene Expr Patterns. 11, 118-121 (2011).
  52. Little, M. H. Regrow or repair: potential regenerative therapies for the kidney. J Am Soc Nephrol. 17, 2390-2401 (2006).
  53. Romagnani, P., Lasagni, L., Remuzzi, G. Renal progenitors: an evolutionary conserved strategy for kidney regeneration. Nat Rev Nephrol. 9, 137-146 (2013).
  54. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
  55. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
  56. Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and acute kidney disease: translational research insights from zebrafish chemical genetics. General Med. 1 (3), (2013).
  57. Groh, E. D., et al. Inhibition of histone deacetylase expands the renal progenitor population. J Am Soc Nephrol. 21, 794-802 (2010).
  58. Cosentino, C. C., et al. Histone deacetylase inhibitor enhances recovery after AKI. J Am Soc Nephrol. 24, 943-953 (2013).

Tags

Cellular Biology sebrafisk; nyre; nevronet; nefrologi; nyre; regenerasjon; proksimale tubuli; distale tubuli; segment; mesonephros; fysiologi; akutt nyreskade (AKI)
Analyse av Nephron sammensetning og funksjon i voksen Sebrafisk Nyre
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCampbell, K. K., Springer, K. N.,… More

McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (90), e51644, doi:10.3791/51644 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter