Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Yetişkin Zebra balığı Böbrek Nefron Kompozisyon ve Fonksiyon Analizi

doi: 10.3791/51644 Published: August 9, 2014

Summary

Zebra balığı yetişkin böbrek böbrek yenilenmesi ve hastalık çalışmalar için mükemmel bir sistemdir. Böyle bir araştırmanın önemli bir yönü nefron yapısı ve fonksiyonu değerlendirmesidir. Bu protokol nefron borucuk kompozisyonunun ve böbrek geri emiliminin değerlendirilmesi için uygulanabilecek çeşitli yöntemler anlatılmaktadır.

Abstract

Zebra balığı modeli böbrek geliştirme, yenilenme ve hastalığı incelemek için ilgili sistem olarak ortaya çıkmıştır. Hem embriyonik ve yetişkin zebrabalıkları böbrekler yüksek omurgalıların memeliler dahil olmak üzere diğer ile muhafaza edilmektedir nefron olarak bilinen bir işlevsel birimler oluşmaktadır. Zebra balığı Araştırma zamanlarda yetişkin nefron hasar meydana sonra iki farklı fenomen sızmak olduğunu göstermiştir: Birincisi, tahrip tübül epitel hücreleri yerine mevcut nefron içinde sağlam yenilenmesi vardır; ikinci olarak, tamamen yeni nefron neonephrogenesis olarak bilinen bir süreç böbrek öncü hücrelerden üretilmektedir. Bunun aksine, insan ve diğer memeliler nefron epitelyal rejenerasyon için sadece sınırlı bir yeteneği var gibi görünmektedir. Bugüne kadar, bu böbrek rejenerasyon olayların sorumlu mekanizmalar anladım kötü kalır. Yetişkin zebrabalıkları böbrekler hem nefron epitel rejenerasyonu ve neonephrogenesis uğradığından, onlar olağanüstü bir deneysel bıraktı sağlamakBu olayları incelemek digm. Ayrıca, böbrek rejenerasyon düzenleyen hücresel ve moleküler mekanizmaları tanımlamak için kullanılabilir Zebra balığı modelinde mevcut genetik ve farmakolojik araçlar geniş bir yelpazesi var. Bu tür bir araştırma önemli yönü nefron yapısı ve fonksiyonu değerlendirilmesidir. Bu protokol, yetişkin zebrabalıkları böbrek, böbrek ve test bileşimi nefron özelliğe ölçmek için kullanılabilir etiketleme teknikleri yer verilmiştir. Bu durumda, bu yöntemler arasında, ancak bunlarla kısıtlı değildir yetişkin zebrabalıkları böbrek yetmezliği paradigmaların, nephrotoxicant maruz rejimler veya nitroredüktaz aracılı hücre ablasyon tekniği olarak hedef hücre ölümü genetik yöntemler ileride fenotipik nitelendirilmesi için geniş çapta uygulanabilir. Dahası, bu yöntemler, yetişkin böbrek oluşumunda genetik pertübasyonları incelemek için kullanılabilir ve aynı zamanda kronik hastalık modelleme boyunca renal durumunu değerlendirmek için uygulanabilir.

Introduction

Böbrek vücutta fizyolojik fonksiyonları yerine getiren bir çok kompleks bir organdır. Böbreğin en önemli işlevi, metabolik atık atılımı olduğunu ve bu görevi yakından sıvı dengesinin korunması ile iç içedir. Böbrek eş zamanlı kan basıncı, elektrolit düzeyleri ve asit-baz dengesini düzenleyen ederken, kan filtreleme ve idrar oluşturarak bu işleri gerçekleştirir. Nefron denilen çok özel epitel tübülleri böbrek 1,2 temel fonksiyonel birim olarak hizmet vermektedir. Yetişkin omurgalılarda, nefron genellikle birçok tübülleri oldukça küçük organ haline paketi dolayısıyla izin veren bir merkezi drenaj sistemini çevreleyen sıkıca sarılmış bir düzende organize edilmektedir. Örneğin, her bir insan böbrek üstü 1.000.000 nefron 3 içerebilir. Fare gibi diğer memeliler böbrek başına 4 8-10 bin nefron sırasına sahip. Böbrek karmaşıklık derecesi, bu memeliler ve diğer vert arasındaki farklılıktoplam nefron sayısında varyasyonlar ve böbrek içindeki mimari düzeni nedeniyle ebrates. Pronephros, mezonefrostan ve metanephros: Omurgalı türlerin çok üç ardışık gelişim sırasında böbrek yapıları ve nefron bağış ve düzenleme ile ilgili artan karmaşıklık her bir form görüntüler oluştururlar. Muhafaza edilmesi son böbrek yapısı yetişkin böbreğinin organ tipik olarak bir ya da mesonephros metanephros 2 olarak hizmet vermektedir. Her bir böbrek şekilde, ancak, nefron bazlı kompozisyon 2'ye sahiptir.

Nefron böbrek beygir ve metaboliti salgısı ve reabsorption birlikte kan filtrasyon sorumludur. Nefron epitel hücrelerden oluşan basit tübüler yapılardır ve farklılaşmış epitellerinden ayrık, son derece uzmanlaşmış alanları belirli görevleri yerine hangi segmental bir örgüt daha var. Nefron boyunca süzülen madde akış için, tipik haliyle, üç büyük parçaları Compris ki oradaE her birim: (1) renal korpuskül, proksimal, orta ve distal segmentleri ile (2) bir borucuk, ve (3) bir toplama kanalı 1. Proksimal tübül organik çözücüler, özellikle glükoz ve amino asitlerin 1 geri emiliminin sorumludur. Ara tübül (veya Henle loop) tuz ve su Kural 1 önemli bir sitedir. Son olarak, tuz ve diğer iyonlarının ince ayar tübül içinde ve uzak toplama kanalında ortaya çıkar ve son derece endokrin sistemi 1 tarafından düzenlenir. Oradan, süzüntü sonuçta bir atık ürün 1 olarak vücuttan çıkan, üreter ve mesane üzerinden geçecek.

Böbrek fonksiyon kaybı, normal nefron etkinliği önlemek nedenleri çok sayıda kaynaklanıyor olabilir. Bu nedenler böbrek gelişimi, örneğin, yaralanma farklı türde nefron 5 veya nedenleri sakat doğumlara yol konjenital defektler (genetik ve environme hem kaynaklanan sırasında oluşabilirntal kökenleri). Edinsel yaralanmalar geniş akut böbrek hasarı (ABH) veya kronik böbrek hasarı (KBH) olarak kategorize edilir. AKI genellikle iskemi veya toksin maruziyeti 6,7 kaynaklanan böbrek fonksiyonlarında ani bir kaybı içermektedir. Memelilerde, nefron epitel onarım tür yaralanmalarda 8 sonra mümkün olduğunu ve birçok kişi AKI sonra böbrek fonksiyonlarında tam restorasyon sergilerler. % 70 insidans aralığında 6,7 - Ancak, AKI geniş bir 30 arasında rapor edilmiştir, yüksek morbidite ve mortalite ile ilişkilidir. CKD, aksine, tipik olarak 8,9 fibroz ile bağlantılı uzun süreli hasar yıl kaynaklanan böbrek fonksiyon kaybı ile ilişkilidir. Ya bir diğer 10-12 bireyin yatkınlık gibi ayrıca bir etkileşimi, AKI ve KBH arasında var. Örneğin, AKI muzdarip olanlar CKD ve hatta ölüme 13 daha duyarlıdırlar. Böbrek hastalığı görülme sıklığı, ABD'de hem de dünya genelinde, epide ulaşmıştırmikrofon oranlarda ve yaşlı nüfus böbrek 14,15 için rejeneratif tıp müdahaleleri tanımlamak için artan bir ihtiyaç vardır-bu nedenle genişledikçe artacağı tahmin edilmektedir.

AKI hasta kurtarabilirsiniz bu bilgiye rağmen, uzun böbrek doğuştan rejeneratif güçlerine olmayan bir organ olduğu düşünülmektedir. Bu geleneksel görünümünü büyük ölçüde son yıllarda 16 olarak revize edilmiştir. AKI sonra farelerde ve sıçanlarda böbrek hasarı araştıran bir çalışma nefron tübül epitel hücrelerinin çoğalmasını ve fonksiyonel nefron 17-20 yeniden göstermiştir. Memeliler nefron yenilemek için bu adaptif bir yeteneğe sahip olmasına rağmen, böbrek fibrozis ve KBH 21 yol tetiklenebilir önemli sınırlamalar ve uyumsuz tepkiler vardır. Örneğin, yeni bir çalışma kemirgen nefron tekrarlanan epitel hücre ablasyon azalmış rejenerasyon ve hav böbrek fibroz-düşündüren nefron ile ilişkili olduğunu göstermiştiradet rejenerasyon eşik 22 sınırlıdır. Yetişkin memeli böbrek, kayıp ya da hasarlı olanları yerine yeni nefron oluşturan dolayısıyla imha kalıcı bir nefron açığı 8,9 yol açtığına dair kanıt yoktur. İlginçtir, bazı omurgalılar nefron epitelyaya yenileyici tarafından ve aynı zamanda yeni nefron üreterek AKI cevap yok, bir süreç neonephrogenesis veya nefron neojenezi 23 olarak anılacaktır. Neonephrogenesis toksin maruziyeti veya kısmi rezeksiyon sonrası balık oluşur ve yaralanma modelleri tarihsel olarak daha yakın akvaryum balığı 24,25, tilapia 26, paten 27, Medaka'nın 28, ve, Zebra balığı 29,30 dahil ettik. Bunlardan, Zebra balığı böbrek rejenerasyon sorumlu hücresel ve moleküler yollar keşfetmek için uygun bir genetik araştırma modeli sağlar.

Bu video makalede, biz yetişkin zebrabalıkları nefron segmentleri etiketlemek nasıl gösterilmektedir. Nefron anatomi, moleküler özellikleri Bilgi,ve fonksiyonel özellikleri zebrafish kullanarak başarılı bir gelecek böbrek çalışmalar için gereklidir. Yetişkin zebrabalıkları böbrek mezonefron yapıdır ve yetişkin memelilerin, kuşlar, sürüngenler 31 bulunan metanephros yapıdan daha nefron sayısında ve organizasyon açısından doğası gereği daha az karmaşıktır. Bununla birlikte, zebra balığı nefron kademeli bir kurum memelilere benzerdir ve birinci gen ekspresyon çalışmaları 31-35 göre embriyonik böbrek belgelenmiştir. Zebra balığı embriyo nefron proksimal kıvrık tübül (PCT) dahil lineer borucuk kesimleri, proksimal düz tübül (PST), distal erken (DE), ve distal geç (DL) 31-35 (Şekil 1) içerir. Zebra balığı yetişkin nefron benzer tüp şeklindeki segmentleri 30,31,36,37 (Şekil 1) sahip. PCT ayrıca fonksiyonel bir fenotip ile tanımlanabilir: PCT epitel hücreleri içinde mevcut floresan etiketli dekstran bileşikleri (boyut olarak 10-70 kDa) bir araya getirecekembriyonik böbrek ve yetişkin zebrabalıkları iki kullanılmıştır dolaşımı, bu proksimal tübül hücreleri 38-41 (Şekil 1) endositik alımını değerlendirmek. Zebra balığı ve memeliler arasında nefron segmentlerinden biri fark Zebra balığı bir ara tubule veya Henle 30-37 döngü yoksun olduğunu; Memelilerde bu segment fonksiyonları su tasarrufu için, ve zebra balığı kendi idrarı konsantre bir aciliyet olmadan bir tatlı su türü olduğundan, bu zebra balığı Bu segmenti 32,33 yoksun olması şaşırtıcı değildir. Bu nedenle, genel olarak, büyük ölçüde bileşimin nefron zebrabalıkları ve memeli böbrek 32,33 arasında muhafaza edilir. Bu benzerlikler gelişimsel nefrogenezisi 32-35,42 sırasında renal ifade edilen genlerin fonksiyonlarını incelemek ve bu şekilde olabilir, insan koşullarının önemli listesine ilave sayısız böbrek hastalıkları 43,44 modellemek için kullanılan bir araştırma aracı olarak zebrafish sağlamıştır kullanılarak incelenmiştirZebra balığı 45,46.

Bugün, yetişkin zebrabalıkları böbrek nedeniyle genetik tractability ve bu türün gen fonksiyonu ve sinyal yolları sorgulamak için kullanılabilir teknolojik kaynakların genişleyen damak böbrek rejenerasyon karşılaştırmalı çalışmalar için cazip bir modeldir. Çeşitli çalışmalar AKI 29,30,37 sonra rejenerasyon mekanizmalarının araştırılması için Zebrafish mesonephrosun kullandık. Yetişkin zebrabalıkları böbrek kullanmaya devam AKI araştırma için, nefron işlevselliği ankete farklı nefron bölgeleri ve yöntemleri etiketlemek zarif yöntemler olması esastır. Yetişkin böbrek analizi için çeşitli yöntemler embriyonik böbrek protokollerden adapte edilmiştir. Yetişkin Zebrafish floresan işaretli dekstran enjekte edilmesi, zebra balığı embriyolarının 38-41 (Şekil 1) deki gibi, endositoz yoluyla 30 mezonefron nefron olarak PCT epitel etiketler. Bu yöntem, visualiz için kullanılmıştırproksimal tübüller restore fizyolojik fonksiyonu 30 (Şekil 1) bir değerlendirilmesini sağlar AKI, sonrasında kendi reabsorbing mülkünü geri e. Nefron proksimal tübül bir başka özelliği, bu alandaki epitel hücreleri, endojen alkalin fosfataz faaliyetinin yüksek seviyelerini gösteren bir fırça sınır 37 sahip olmasıdır. Bu nedenle, yakın epitel cin çarpmış (Enzimle İşaretlenmiş Floresans) olarak bilinen bir floresan-dayalı bir teknik kullanılarak 47 -97 yetişkin zebrabalıkları böbrekte görsel olarak tespit edilebilir.

Burada, biz proksimal tübül fonksiyonel değerlendirmesini almak ve bu tübül segment boyutu ve konturları harita şekilde, yetişkin zebrabalıkları böbrekte floresan dekstran alımı tayinidir 30,48 gerçekleştirmek için nasıl açıklar. Sonra, fluoresan bir etiket alkalin fosfataz ile erişkin nefron proksimal tübül bölgelerini etiketlemek için teknikleri açıklar. Üçüncü olarak, ilk kez rhod gösterecekamin-etiketli lektin Dolichos memeli böbrek 49 toplama kanalları genel bir işaretleyici olarak kullanılmaktadır aglutinini (DBA), biflorus, yetişkin zebrabalıkları böbrek uzak tübül işaretler. DBA alkalin fosfataz boyama dışlayan olduğu gibi, bu etiketler geniş yetişkin zebrabalıkları nefronun pan-uzak menziller karşı pan-proksimal ayırt etmek için bir yol sağlar. Bütün montaj ve Kriyostaz histolojik bölümlerde hem de bu floresan lekeleri uygulanması boyunca, benzersiz her nefron segmenti tespit çözünen taşıyıcı genlerin ekspresyon alanları ile bu etiketleri ilişkilidir. Bu nedenle bu protokol de bizim embriyo DİLERİZ protokol 50 dayanan in situ hibridizasyon (DİLERİZ) analizlerinde yetişkin doku bütün montaj için modifiye doku işleme prosedürleri için bir rehber içerir. Bu prosedürler, O morfolojik ve fonksiyonel özelliklerini belge çeşitli kombinasyonlarda (Şekil 2) kullanılabilirf yetişkin zebrabalıkları böbrek nefron. Böylece, bu protokol yenileme çalışmaları, diğer renal hastalık modelleri içinde fenotipik karakterizasyonu uygulanabilir ve hatta yetişkin böbreğinin oluşumunu çalışmak için kullanılır.

Protocol

Bu protokol açıklanan zebrabalıkları ile çalışmak için prosedürler Notre Dame Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. Not: Zebra balığı böbrek ve nefron anatomi için bir rehber (Şekil 1) sağlanır. Bu protokol açıklanan metodolojiler bir bakış aynı böbrek numune üzerinde yapılabilir nasıl birden etiketleme prosedürleri göstermek için bir akış şeması (Şekil 2) olarak verilmiştir. Yetişkin böbrek çalışmaları için DİLERİZ hazırlanması Bölüm 7 için, burada sağlanan adımlar son zamanlarda böbrek organın başarılı DİLERİZ analizi için bir teknik kılavuz sağlamak, 50 yayımlanan, zebra balığı embriyolarının işlenmesini nasıl değiştirileceğini göstermektedir.

İlgi dekstran ile 1. Yetişkin Zebra intraperitoneal enjeksiyon

  1. Konsantrasyonda damıtılmış su içinde çözülmesiyle dekstran tozu istenilen floresan etiketli dekstran stokları (lar) hazırlanması50 mg / ml, daha sonra karanlıkta -20 ° C'de mikrosantrifüj tüplerinde alikotları saklayın. Not: Çeşitli floresanla işaretlenmiş dekstranlar ticari olarak temin edilebilir. Istenen diğer tüm etiketlere kombinasyonuna dayalı kullanım için dekstran seçin ve uygun floresan filtreler kullanılacaktır mikroskopları ile kullanılabilir olduğundan emin olun. Lizin-tamir edilebilir dekstranları yaşam örneklerinde başka etiketleme adımlar olmadan floresan, ötenazi örneklerden sabitlenmemiş doku örneği ve sabit örnekleri göstermektedir.
  2. İstediğiniz dekstran stok çözülme ve yaparken 1,3-1,5 adımları karanlıkta buz üzerinde saklayın. Kullanım sırasında ışıktan korumak için aliminyum folyoya mikrosantrifüj tüpü sarın.
  3. 2 dakika - yaklaşık 1 0.02% tricaine veya% 0.001 2-fenoksietanol ya içeren bir çanak içine balık koyarak yaş 5-7 ay arasında bir yetişkin zebrafish anestezisi. Not: Bu küçü küçük balıklar var çünkü bu yaş aralığındaki yetişkin zebrafish kullanılması tercih edilirll incelemek zordur böbrekler ve eski balık böbrek numuneleri analiz edilemez skar dokusu kitleleri içerebilir. Düzgün anestezi yaparken, yetişkin zebrabalıkları yavaşça balığın kuyruk yüzgeci dokunmak için bir kaşık veya künt prob kullanılarak test edilebilir stimülasyon, dokunmak yanıt sergiler değil.
  4. Bir plastik kaşık kullanarak, çanak balık kaldırın çözüm süzün ve dikkatli bir ıslak sünger kalıp, ventral yüzü yukarı hayvan.
  5. Bir 31 G 1.0 cc insülin şırıngası kullanılarak, periton içine eritildi dekstran stok çözeltisinden 20 ul enjekte edilir. Bu ekleme karın ventral orta hatta bir sığ gelme açısında duyulur, böylece iğne döndürün. Organların delinmesiyle önlemek için, biraz sonra iğneyi dekstran çözümü 48 enjekte etmek için bir boşluk balığın vücut duvarı kaldırmak ve oluşturmak şekilde kaldırın. Not: 2 veya 2: 1 (dekstran: Alternatif olarak, dekstran stok 1 arasında bir oranda, örneğin, seyreltilmiş olabilir dissu) sürülmüş, numune içinde arka floresan azaltır.
  6. Yavaşça anestezi kurtarma izin tankına balık dönün. Not: proksimal tübül kesimi tarafından dekstran alımı, içinde meydana 8 - 12 saat ve en az 3 gün kadar sonrası enjeksiyon (dpi) tespit edilebilir. 3 dpi Analizi böbrek stromal toplumlarda düşük eşiğe ile güçlü borucuk sinyali sağlar. Ek etiketleme istenmediği takdirde, tek başına dekstran alımının tüm montaj incelenmesi için Bölüm 2'ye geçin. Kombinatoryel etiketleme için, dekstran alımı, alkalin fosfataz ve / veya Bölüm 5 ile çift etiket sonra Bölüm 4 tüm montaj muayenesi için doku hazırlamak için DBA çift veya üçlü-etiketleme gerçekleştirmek için Bölüm 3'e geçin. Histolojik bölümleri kullanarak araştırma için, bir sirostat kullanılarak böbrek ince bölümleri nasıl ve birincil ve ikincil ANTIB çeşitli etiket ve / veya immünhistokimya ile bu leke nasıl ilgili talimatlar için Bölüm 6 devamOdies.

2. Diseksiyon ve Sabitlenmemiş Hayvan numunesinden Yetişkin Zebra balığı Böbrek Daire Dağı hazırlanması Proksimal tübül Floresan Dextran'ın Etiketleme Visualize'a

  1. 5 dakika - 4% 0.2 Tricaine pH değeri 7.0 olan bir çanak içine yerleştirerek dekstran enjekte yetişkin zebrafish öldürülür. Not: balık solungaçları hareketini durdurdu ve kalp 36 yenerek durmuş olup olmadığını dikkatle izleyerek, devam etmeden önce ötenazi edilmiş olduğundan emin olun.
  2. Plastik bir kaşık kullanılarak, Tricaine çözeltiden balık asansör çözümü süzün ve bir doku ya da bir kağıt havlu üzerine hayvan.
  3. Solungaç operculum'un arkasında bir kesim yapmak ve baş kaldırmak için diseksiyon makas keskin bir çift kullanın.
  4. Hemen kuyruk yüzgecinin tabanına baş uzun ventral kesi yaparak diseksiyon makas ile balık vücut açmak.
  5. Ince forseps bir çift kullanarak balığın iç organları çıkarın.
  6. Hayvanın sırt duvarına yapışık olan böbrek organ görüntülenmesine izin verecek şekilde gövde duvarı, açık pin süper ince iğneler diseksiyon kullanın.
  7. Dorsal duvarından gelen böbrek ayırmak için ince forseps kullanın.
  8. Yavaşça 1X PBS ihtiva eden bir 5 ml bir cam şişe içine böbrek yerleştirin ve 3 ile 3 kez yıkayın - 5 dakika her biri için taze 1X PBS, 5 ml. Not: yetişkin böbrek numunelerin çalışma için bir cam şişeye kullanılması doku görüntülenmesini kolaylaştırır ve yaklaşık 3 arasında (doku kütlesine bağlı olarak) büyük hacimli yıkama sağlar - 5 ml. Seçenek olarak ise, bir 12-yuvalı hücre kültürü çanağı kullanılabilir. Plastik bir mikrosantrifüj tüpü kullanılabilir olmakla birlikte, standart boyutlu borular (1.5 mi) yıkama kısıtlayabilir.
  9. 1X PBS 1-2 damla temiz bir cam slayt üzerine bir transfer pipet ve yer ile böbrek çıkarın.
  10. Emin hiçbir doku kıvrılmış veya başka türlü devrik olan yapım, slayt üzerinde böbrek düzleştirmek için ince forseps kullanınkendi üzerine. Not: Alternatif olarak, tungsten tel aracı böbrek düz konumlandırılmasını sağlamak için bağ dokusunda küçük kesikler yapmak için kullanılabilir.
  11. 18 x 18 mm cam lamel her köşesinde kil modelleme küçük parçalar yerleştirin ve yavaş yavaş böbrek üzerine lamel ayarlayın. Not: yerleştirme sırasında hafifçe açı lamel çözelti 50 hava kabarcığı en aza indirmek için. Kil modelleme Divots çapı yaklaşık (Şekil 2A) 2 mm. Alternatif olarak, vakum yağ Divots kil modelleme yerine ikame edilebilir. Gerekirse lamel ve cam slayt arasındaki boşluğu doldurmak için 1X PBS ilave damla ekleyin.
  12. Uygun filtre ile bir stereomikroskopta veya bileşik mikroskop görüş alanına cam slayt koyarak böbrek gözlemlemek ve / veya görüntü. Not: Bu slayt hazırlama makroskopik görünüm için 2A Bakınız Şekil.

3. Fixayon, Diseksiyon, Permeabilizasyon ve Yetişkin Zebra balığı Böbrek Pigmentasyon çıkarması

  1. % 4 paraformaldehit (PFA) / 1X PBS /% 0.1 DMSO taze bir sabitleyici çözeltisi hazırlayın ya da% 4 PFA / 1 X PBS içinde donmuş bir kısım çözülme ve% 0.1 DMSO ilave edin. Dikkat: PFA toksik ve eldiven ve laboratuvar önlüğü dahil, uygun kişisel koruyucu ekipman giyerek PFA çözümler kimyasal bir kaput ele alınmalıdır. Stok solüsyonu yaparken ek olarak, PFA tozu dikkatle ele alınmalıdır.
  2. Tüm hayvan daldırın için yeterli fiksatif solüsyonu ile bir diseksiyon tepsi doldurun.
  3. (Adımlar 2.2-2.6 bakınız) Euthanize ve sabitleme çözeltisi seçilen zebrafish monte edin. Not: Seçilen Balık bir muamele edilmemiş numune zebra balığı, böbrek ya da daha önce bir karın içi dekstran enjeksiyon (Bölüm 1) alınan bir zebrabalıkları izole edilmiş bir böbrek olabilir.
  4. 4 o C'de - (16 saat 12) numune O / N Fix
  5. Ertesi gün, bakım için ince forseps kullanıntam olarak dorsal vücut duvarı böbrek ayırmak ve bir transfer pipeti kullanarak bir cam şişe içinde yer organ. Not: Alternatif olarak, 12-çukurlu bir ya da 24 oyuklu kültür çanağı kullanılabilir. Plastik bir mikrosantrifüj tüpü kullanılabilir olmakla birlikte, standart boyutlu borular (1.5 mi) yıkama kısıtlayabilir.
  6. 5 dakika her biri için,% 0.05 Tween ile 1X PBS, 5 ml - 3 kesilen böbrek 3 kez yıkayın.
  7. % 0.05 Tween ile 1X PBS çıkarın ve 30 dakika boyunca (1X PBS),% 5 sukroz çözeltisi 3 ml böbrek yıkayın.
  8. 4 O ° C'de - (16 ila 12 saat) (1X PBS)% 30 sukroz çözeltisi ve mağaza O / N, 3 ml değiştirin Not: sakaroz çözümleri, dokuya nüfuz olarak sonradan reaktifler özel etiketleme izin hücre zarlarını geçirgen.
  9. Ertesi gün,% 30 sukroz çözeltisi kaldırmak ve 5 dakika her biri için,% 0.05 Tween ile 1X PBS, 5 ml böbrek 2 kez yıkayın.
  10. 3 ile% 0.05 Tween ile 1X PBS değiştirin -Ağartıcı çözeltisi 5 mi böbrek organı üzerinde mevcut pigmentasyon melanosit kaldırın.
  11. Rotator cam şişe yerleştirin ve pigmentasyon kaybolur gibi dikkatle izleyin. Sürece 60 olarak dakika sürebilir bazen sakaroz tedavisinden sonra zaman Renksizleşme genellikle yaklaşık 20 dakika sürer, ancak dikkat:. Ağartıcı çözelti, çok uzun süre böbrek üzerinde bırakılırsa, organın parçalanma gerçekleşebilir; Bu doku bütünlüğünü denetlemek için örneklemin her 10-15 dakikada izlemek için tavsiye edilir.
  12. % 0.05 Tween ile 1X PBS, 5 ml - pigmentasyon böbrekten kaldırıldığında, 3 ile iki kez yıkanır.
  13. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle% 4 PFA çözeltisi, 5 ml - 3 ile% 0.05 Tween ile 1X PBS değiştirin.
  14. % 4 PFA çözüm çıkarın ve 3 ile Böbrek 3 kere yıkayın - 5 dakika her biri için,% 0.05 Tween ile 1X PBS, 5 ml. Not: sabitleme işlemi tamamlandıktan sonra, böbrek, aynı zamanda, bir cam slayt üzerine monte edilmiştir ve dekstran alımı sans melanosit PIGM için değerlendirilebilirlimin tarafından Adımları 2,8-2,12 performans.
  15. % 0.05 Tween ile 1X PBS çıkarın ve 3 ile değiştirilmesi - bloklama çözeltisi, 5 ml, daha sonra 2 saat boyunca oda sıcaklığında bloğunda böbrek inkübe edin.
  16. Bloke tamamlandığında, seçilen boyama prosedürü doğrudan devam edin. Not: böbrek artık farklı reaktifler ile etiketleme çalışmaları yürütmek amacıyla, bir veya daha fazla diğer prosedürleri ile işlenebilir. Sadece alkali fosfataz ile proksimal tübül bütün montaj etiketleme için, alternatif olarak, Bölüm 4 ve 5 içinde bütün montaj çift tespiti için doğrusal art arda gerçekleştirilebilir Bölüm 5'e gidin sadece distal tübül bütün montaj işaretleme için madde 4'e geçin .

4. Alkali Fosfataz Algılama ile Yetişkin Böbrek Proksimal Tübül Kesimleri Etiketleme

  1. Blok kaldırılır ve böbrek 3 ile 3 kez yıkayın - 5 dakika her biri için,% 0.05 Tween ile 1X PBS, 5 ml, sonra 3 ile% 0.05 Tween ile 1X PBS yerine -, 5 ml1X PBS. Böbrek, en az 10 dakika boyunca ıslatın. Not: doku önceki işlem adımları için, bir cam şişe içinde muhafaza edilmiştir, bu sırada, bir 12-yuvalı veya 24-çukurlu kültür tabağına böbrek aktarın.
  2. Yeterli çalışma alkalin fosfataz alt-tabaka çözeltisi, sonra, örnek kapak, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir karıştırıcı üzerine numuneyi için (Malzemeler, Tablo l'de yer alan tespit kiti bakın) ile 1X PBS değiştirin. Işıktan korunan örnek tutun.
  3. Alkalin fosfataz yıkama tampon çözeltisi içinde yıkanarak böbrek reaksiyonu durdurun.
  4. 15 dakika - 10 üzerinde yıkama tampon çözeltisi 3 değişiklikler ile böbrek durulayın. Not: DBA ile etiketleme de isteniyorsa, bu adımdan sonra, (böylece geçici Adımlar 4.5-4.6 atlayarak), Bölüm 5 doğrudan devam 5.1 Adım. İsteğe bağlı adım: etiketlemek ve organda hücre çekirdekleri görselleştirmek, propidiyum iyodür çözeltisi içinde böbrek emmek için. Bir konsantrasyon olarak tozunun çözülmesiyle bir propidiyum iyodür stok hazırlayındamıtılmış su içinde 1 mg / ml (1,5 mM) sidir. 2X SSC içinde 500 nM'ye stok seyreltin ve 30 dakika boyunca bu çözelti içinde böbrek inkübe edin. 1X PBS ile durulayın ve 4.5 Adım geçin.
  5. (Adımlar 2,9-2,12 bakın) yıkama tampon çözeltisi kaldırmak ve etiketleme kitine dahil fosfataz montaj orta temiz bir cam slayt üzerine böbreği monte. Not: montaj orta aşama 2,9 1X PBS yerini aldı.
  6. Hoechst / DAPI filtre seti ile bir stereomikroskopta veya bileşik mikroskop kullanılarak böbrek boyandı alkalin fosfataz gözünüzde canlandırın. İsteğe bağlı adım: Not tetrameti rodamin (TRITC) veya Teksas kırmızı filtre kullanarak propidiyum iyodür gözünüzde canlandırın.

5. Rodamin DBA'lı Yetişkin Böbrek distal Tübül Kesimleri demarcating

  1. 1X PBS: 100 (2 mg / ml) 1 DBA seyreltilmesi yolu ile, 200 ul çalışma DBA çözelti hazırlayın.
  2. 200 ul, DBA çözeltisi ile% 0.05 Tween çözeltisi ile 1X PBS değiştirin.
  3. Için turlayıcı yerleştirinOda sıcaklığında 1 saat.
  4. DBA çözeltisini çıkarın ve 3 böbrek 3 kere yıkama - 5 dakika her biri için 1X PBS, 5 ml. Not: İsteğe bağlı adım: etiketlemek ve DBA etiket ile birlikte organ hücre çekirdekleri görselleştirmek, (rodamin DBA leke bir TRITC veya Teksas kırmızı filtre ile tespit edilebilir) bir Hoechst / DAPI filtre ile tespit DAPI çözeltisi içinde böbrek emmek için. 5 mg / mL (14.3 mM) bir konsantrasyonda tozunun çözülmesiyle bir DAPI stok hazırlayın. 2X SSC içinde 300 nM'ye stok seyreltin ve 20 dakika boyunca bu çözelti içinde böbrek inkübe edin. 1X PBS ile durulayın ve 5.5 adıma geçin. Bölüm 4 işleme gerçekleştirilmişse, DAPI ve alkalin fosfataz hem Hoechst / DAPI filtre ile tespit edilir akılda tutmak.
  5. (Adımlar 2,9-2,12 bakınız) 1X PBS çıkarın ve temiz bir cam slayt böbrek monte edin.
  6. Bir veya flöresanlı bir stereomikroskop bileşik mikroskop ayarlanmış standart TRITC veya Texas kırmızısı filtresi kullanılarak böbrek DBA boyalı uzak bölümleri görselleştirme. Not: İsteğe bağlı sdım: Hoechst / DAPI filtre kullanarak DAPI gözünüzde canlandırın.

6. Gömme, Cryosectioning ve Boyama Yetişkin Zebra balığı Böbrek Doku (Vital Boyalar ve İmmünhistokimya Etiketleme)

  1. , Analiz için balık seçin, ardından euthanize, düzeltmek, ve (Adımlar 3.2-3.8) açıklandığı gibi geçirgenleştirmek. Not: 1 etanol: 9, yetişkin balık saptamak% 4 paraformaldehid yerine formaldehid /% 0.1 DMSO / PBS 1X / dekstran, alkalin fosfataz ve DBA görselleştirme için kesitlerin cryosection prosedür için% 0.1 DMSO ilave edin. Ancak, paraformaldehıt tabanlı tespitler bazı immünohistokimyası prosedürleri için uyumlu olabilir unutmayın. Melanosit yüzeyseldir ve böbrek organ "iç" ihtiva nefron hücre görselleştirme etkilemediği için, bundan başka, yetişkin böbreğinin ağartıcı, cryosection analiz için gerekli değildir.
  2. Ertesi gün,% 30 sukroz çözeltisi çıkarın ve 1 ile değiştirin: 1 doku dondurma ortamı:% 30 sucrosoda sıcaklığında 4 saat boyunca örn.
  3. 1 çözüm ve en az 1 saat boyunca -80 o C'de cryomolds içinde orta ve yer dondurma% 100 dokusunda böbrek örnekleri gömün: 1 çıkarın.
  4. Enine bütün yetişkin böbrek yoluyla, yaklaşık 12 um kalınlığında, seri kesitler halinde kesilmiştir.
  5. Yapışkan mikroskop lamı üzerine donmuş cryosections mount ve 50 o C'de 1 saat boyunca kurumaya bırakın
  6. Mağaza kullanılana kadar -80 o C'de slaytlar.
  7. Cryosections etiketli hazır olduğunuzda, mikroskop 45 dakika 50 o C'de sıcak slayt üzerinde -80 ° C ve yerden kayarak çıkarın.
  8. Bir sıvı engelleyici kalemini kullanarak, cryosections etrafında bir daire çizin ve slayt üzerinde 15 dakika boyunca kurumaya bırakın 50 o C'deki sıcak
  9. Sıcak slayt slaytlar çıkartın ve oda sıcaklığında bir nem odası düz yerleştirin.
  10. 20 dakika boyunca slaytlar, dairesel kısmına% 0.05 Tween ile 1X PBS eklenerek cryosections rehidrate. Not: Yaklaşık 200-300 &# 956; l bir slayt her çevirdiği kısmını karşılamak için gereklidir.
  11. Taze 1X PBS ile% 0.05 Tween çözeltisi ile 1X PBS yerine yerleştirin ve 10 dakika boyunca inkübe edilir.
  12. 1X PBS çıkarın ve 2 saat için bir bloklama çözeltisi olarak cryosections inkübe edin. Not: bloke etme çözeltisi 10 ml'lik için,% 0.05 Tween, 2 ml cenin sığır serumu ve 150 ul DMSO ile 8 mi 1X PBS birleştirir. Bloke etme kademesinden sonra, immünohistokimya gerçekleştirmek için,% 0.05 Tween ile 1X PBS ile bir kez yıkayın, 4 oC'de / K taze blok O ile seyreltildi, istenen birincil antikor ile inkübe slayt seyreltilmiş ikincil antikor çözeltisi ile, oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe 1X PBS% 0.05 Tween ile,% 0.05 Tween ile 1X PBS kullanarak bir kez yıkayın ve orta montaj ile slayt üzerinde bir lamel monte. Gerekli antikoru dilüsyonları değişir ve deneme uygun dilüsyonları seçmek için gerçekleştirilmelidir. Antijen alma da immünoyaftalama kolaylaştırabilir, ve engelleme önce gerçekleştirilir. Slaytlar 50 o C sıcaklıkta eritildi hemen sonraÖnceden ısıtılmış, 10 mM sodyum sitrat tamponu içinde 40 dakika boyunca 95 o C-100 oC arasındaki cryosections kuluçkalayın (6.8 adım). Daha sonra% 0.05 Tween ile 1X PBS içinde iki kere yıkanır ve 6,11 Adım devam edin, 30 dakika boyunca slaytlar soğutun.
  13. Engelleme çözüm çıkarın ve 5 dakika her biri için 1X PBS ile kriyokesitler 3 kere yıkayın.
  14. DBA boyama solüsyonu ile 1X PBS yerine ve 1 saat kuluçkada bırakın. Not: 100 ul boyama çözüm yapmak için 1X PBS 99 ul 1 ul DBA seyreltin.
  15. DBA boyama çözüm çıkarın ve 5 dakika her biri için 1X PBS ile kriyokesitler 3 kere yıkayın.
  16. Alkalin fosfataz etiketlemek ve 10 dakika boyunca cryosections üzerinde inkübe edin.
  17. 10 dakika her biri için yıkama tamponu süren 3 yıkama bir dizi kapalı cryosections alkalin fosfataz yıkayın. , Yıkama tamponu, 100 ml solüsyon için 1X PBS içinde 95 ml levamisolün 5 0.5 M EDTA ilave edildi ve 120 mg birleştirir: edin. Di propidium iyodür veya DAPI bölümleri inkübe, çekirdeklerini etiketlemek içinmel çözümler daha önce oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (sırasıyla adımları 4.4, 5.4,) kaydetti. Seçilen diğer floresan boyalar kombinasyonu ile uygun bir nükleer boya seçin.
  18. Cryosections tüm sıvıyı çıkarın ve mikroskop lamı üzerine montaj orta 2 damla yerleştirin.
  19. Dikkatlice mikroskop lamı üzerine mikro cam kapak yerleştirin. Kriyokesitler uygun filtre (ler) ile görüntü artık hazırız.

Yetişkin Zebra balığı Böbrek Örnekleri 7. DİLERİZ İşleme

  1. , Istenen Zebra balığı örnek (ler) seçin euthanize, düzeltmek ve (Adımlar 3,1-3,5) açıklandığı gibi böbrek teşrih. Not: Bu% 4 paraformaldehid (PFA) bir sabitleyici çözümü kullanmak esastır / 1X PBS% 0.1 DMSO ile böbrek geçirgenliği. Sonraki işlem aşamaları esnasında kolay görselleştirme için cam bir şişe içine böbrek yerleştirin.
  2. Sabitleştirici çıkarın ve 1X PBST 5 ml ile iki kez böbrek yıkayın.
  3. 1X PBS çıkarın ve böbrek kez wi yıkayın% 100 metanol, th sonra nüfuz edilebilir kılınması için en az 20 dakika boyunca -20 ° C'de inkübe böbrek. Not: Dissected böbrekler süresiz olarak saklanabilir -20 C o
  4. 1X PBST ile 5% 50 metanol / 1X PBST ile,% 30 metanol / 1X PBST ml ve iki kez - 3 ile 5 dk bir dizi yıkama gerçekleştirerek böbrek rehidrate.
  5. (Adımlar 3,10-3,14) 'de anlatıldığı gibi pigmentasyon kaldırmak için böbrek ağartıcıdır.
  6. Göre O / N 20 dakika boyunca% 4 PFA / 1X PBST içinde 1X PBST ve sonrası düzeltme ile iki kere yıkayın, 20 dakika boyunca,% 0.1 DMSO ile 10 ug / ml proteinaz K / PBST ile 1X böbrek tedavi edin. Not: her zaman taze çözülmüş proteinaz K stoklar 50 ul (10 mg / ml), 1X PBST 50 ml ve 50 ul DMSO birleştirerek örnek sindirim hemen önce çalışma çözeltisi hazırlamak proteinaz-K.
  7. Riboprob sentezi, melezleme, melezleme, anti-dioksijenin / anti-fluoroscein antikor inkübasyon ve algılama aletlerini için adımlar aşağıdaki tek veya çift WISH böbrek işleyinyon olarak son zamanlarda 49 nitelendirdi. Not: Tüm böbrek lekeleri görüntüleme boyama reaksiyonu gerçekleştirerek birkaç gün içinde yapılmalıdır montaj. Nefron lekeleri, çok hızlı bir şekilde özellikle kırmızı tabaka etiketleri solmaya eğilimindedir. Nefron fotoğrafçılığı için, düz bir teybi- veya bileşik mikroskop kullanılarak böbrek 2,12 Adımlar için 2.10 yukarıda anlatıldığı gibi örnek ve görüntü montaj. , Farklılık belirleyici kontrast filtresi iyi örnek analizi kolaylaştırmak için nefron hücre hatlarını görselleştirmek için kullanılabilmektedir.

Representative Results

Protokollerin vahşi tip zebrabalıkları gerçekleştirilmiştir. Veri örnekleri belgeyi sağlıklı yetişkin zebrabalıkları böbrek içinde, normal yapısal bileşimi ve nefron özelliklerini elde. Yetişkin zebrabalıkları dorsal gövde duvarının (Şekil 1A) üzerinde bulunan bir mesonephrosun, böbrek ya da ikinci biçimi sahiptir. Yetişkin böbrek nispeten düz ve bu bölgelerin (Şekil 1A) boyunca dağılmış melanositler ile yüzeysel olarak adlandırılan bir baş, gövde, ve kuyruk bölgesini içerir. Böbrek dokusu merkezi toplayıcı kanallar (Şekil 1A) bağlanabilir ve drenaj nefron dizileri dallı içerir. Her nefron dışkılanır çözeltisi (Şekil 1A) toplayan bir kanal bir borucuk bölümlerinin dizi, ve son olarak sona erdirici ve ardından, bir ucunda bir filtre, kan (ya da renal korpuskül) ile, uzunluğu boyunca polarize edilir. Her yetişkin nefron tübül proksimal ve distal Segmen içerirhücre ts embriyonik nefron 31-35 (Şekil 1B) tarafından sergilenen segmental deseni ile muhafaza edilir belirli çözünen taşıyıcılar 30,31,36,37 ekspresyonu, ile ayrılır. Örneğin, cubilin transkript proksimal tübül 39 (PCT ve PST) işaretlemek ve clcnk transkript uzak tubule 32 (DE ve DL) (Şekil 1B) işaretleyin. Ayrıca, PCT kademeli slc20a1a ekspresyonu ile tanımlanır, PST slc13a1 ekspresyonu ile tanımlanır, DE slc12a1 ekspresyonu ile tanımlanır, ve DL SLC12A3 32 ekspresyonu ile ayırt edilir   (Şekil 1B). Embriyonik olanlarla karşılaştırıldığında yetişkin nefron tübüller arasındaki farklar uzak kesimleri İşlemesi olarak doğrusal, bu bölgelerin dallı olmayan anatomisi farklıdır yetişkin, yoğun convolutions (DE, DL) ve DL bölüm dallarını görüntülemek yönündediryo 30,31,36,37 (Şekil 1A). Her ikisi de yetişkin 30 ve 38-41 embriyonik nefron tübül olarak, PCT epitel tabakası endositik özellikleri nedeniyle ayırt edilebilir ve görsel ve fluoresan dekstran konjugatlar (Şekil 1B) alımı için yeteneğine dayalı reabsorptive fonksiyon için değerlendirilebilir. Ancak daha sonraki şekillerde, yetişkin proksimal tübül (PCT ve PST, veya pan-proksimal bölge) olarak gösterildiği gibi distal tübül (FR ve DL veya pan-uzak bölge) DBA ile işaretlenmiş ise, ayrıca, alkalin fosfataz ile etiketlenmiş (Şekil 1B). Dekstran alımını, alkalin fosfataz, DBA, immünohistokimya veya yapmayı kullanılarak etiket yetişkin zebrabalıkları nefron bölümlere tarifnamede kullanılan yöntemler bütün montaj ya da renal doku (Şekil 2), histolojik bölümler ile, çeşitli kombinasyonlar halinde gerçekleştirilebilir. Nefron kompozisyon değerlendirilecek olduğunda bu büyük esneklik ve çeşitlilik sağlar (Şekil 2).

Yetişkin böbrek kil modelleme divots ile, analiz için bir cam lam üzerine düz monte edilebilir (veya alternatif bir şekilde vakumla yağı) dokusu (Şekil 3A) üzerine lamel askıya almak için kullanılır. Tipik böbrek uzunluğu yaklaşık 5-7 mm olup, bir stereo ya da bileşik mikroskop (Şekil 3A) üzerinde görüntüleme için elverişli bir boyutu vardır. Aydınlık ışıklandırma altında, siyah pigmentli melanosit yüzeysel bir nüfus dolaşan eritrositler kırmızı bir renk (Şekil 3B), çünkü görülebileceği aort gibi böbrek doku ile ilişkili, ve damar görülebilir. Dekstran-FITC intraperitoneal sonra, mesonephros boyunca bulunan, PCT etki yine de 3 gün sonra etiketlenmiş ve floresan mikroskobu (Şekil 3C) üzerine, bir FITC filtresi kullanılarak görüntülendi. Melanosit kısmen (Figu bireysel böbrek tübülleri görselleştirme örter3C ') yeniden, melanosit nefron sayısında ya da borucuk çap ve uzunluk değerlendirilmesi miktarının engellemez. Dekstran floro-yakut intraperitoneal sonra, numunenin sabit ağartma melanosit pigmentasyon elimine ve PCT kesimleri sadece parlak alan aydınlatma (Şekil 3D) ile gözlendi. Karın vücut boşluğundan lipid damlacıkları bazen helezonlar, bobin (Şekil 3D ') gösteren tüm böbrek, organ preparatlar için (Şekil 3A), PCT .Individual bölümleri ile ilişkili olarak da görülebilir, fakat, aynı zamanda, nispeten düz uzanır (Şekil 3D ") ile karakterize edilebilir.

Farklı dekstran Konjügatlar proksimal tübül etiketleme genel netlik farklı düzeylerde sağladı. Özellikle, dekstran veya dekstran gibi FITC-floro yakut en az bir arka plan (Şekiller 3C-D ") ile nefron etiketleri keskin yol açtı. Dekstran kaskad blu HemE ve Lucifer sarı konjugatları yetişkin böbreğinin (Şekil 4A, 4B) proksimal tübül alımı sergilemiştir. Dekstran lucifer sarı maruz böbrekler boyunca non-spesifik floresan boyama varken, PCT kesimleri etiketli ama fark arka plan sinyalini göstermişti ederken İlginçtir, dekstran kaskad mavi maruz böbrekler, bazı arka plan (Şekil 4A, 4A ') ile nispeten belirli PCT flöresanı gösterdi böbrek stroma veya nefron (Şekil 4B, 4B ') arasındaki boşluk. Son olarak, dekstran-floro yakut kullanımı, farklı büyültme (Şekil 4C, 4C ') bir mesafeden bakıldığında bile zaman yok veya minimal arka plan ile, üstün proksimal tübül etiketleme sağladı. Tüm durumlarda, dekstran konjugat alımının ayırt edici boru şekilli model slc20a1a, kurulu bir PCT özel bir markörün 30-32 (Şekil 4D) kodlayan transkriptlerin WISH ifadesi ile ilişkilidir. Nephr'(3D "etiketli dekstran konjugat deneyler Şekil 3D) da görüldüğü üzere, slc20a1a antisens riboprobu ile boyanmış, PCT bölümlerine S-şekilli rulo PCT yanı sıra, daha az sert bir dolaştırılmış PCT kesimleri (Şekil 4D)' gösterilir.

Bu proksimal tübül alkalin fosfataz aktivitesi (Şekil 5A, 5B, 5C) saptanması gibi diğer böbrek preparatlar benzer melanosit pigmentasyon uzaklaştırılmasından sonra yapıldı. Bu, herhangi bir engel olmadan proksimal tübül nefron görüntüleme ve analiz için izin verdi. Nefronda endojen alkalin fosfataz tepkime proksimal tübül 1,47 biridir önemli özelliğidir. 39 (Şekil 5D, 5D ') cubilin genin pan-proksimal MI WISH ifade deseni ile karşılaştırıldığında, alkalin fosfataz boyama, proksimal nefron bölgeler için son derece özeldir. Alkali fosfataz reaktivite Köknar en yoğun olduAyrıca PCT yüksek nispi transkript seviyelerini sahip cubilin ifade desen (Şekil 5D, 5D '), e benzer PCT (Şekil 5B), karşılık gelen proksimal tübül st bölümü. PCT onun biraz daha geniş bir çapı, transkripsiyon faktör mafba (Şekil 5E, 5E ') spesifik ifadesi ve çözünen taşıyıcı gen slc20a1a (Şekil 4D, 4D spesifik ekspresyonu') ile ayırt edilmiştir. Alkalin fosfataz reaktivite çözünen taşıyıcı gen slc13a1 (Şekil 5F, 5F ') ne sahip kademeli bir spesifik transkript ifadesi ile karşılaştırılarak değerlendirilmiştir: PST kısmın (Şekil 5B) karşılık gelen bir çapa sahip ince bir proksimal tübül bir kısım etiketli. PCT işaretleyici slc20a1a ve PST işaretleyici slc13a1 arasında DİLERİZ ifadesi alanları birbirini dışlayan (Şekil 5G vardır cubilin ifadesi alanını özetlemek olduğunu gösterdi. Şekil 5G ', 5G ", 5G"' ).

Ayrıca proksimal tübül kimliği ile alkalin fosfataz reaktivite ilişkisini doğrulamak için bütün dekstran floro-yakut 3 gün önce (Şekil 6A-C) intraperitonal enjeksiyonu yapılıncaya zebrabalıkları böbreklerin gerçekleştirilmiştir alkalin fosfataz boyama eş etiketleme monte edin. Dekstran floro-yakut PCT (Şekil 6D-I örnekler) karşılık gelen proksimal tübül etki sadece daha geniş çaplı bir kısım halinde alkalin fosfataz ile örtüşme saptandı. Dekstran pozitif etki aniden PCT ve PST araya proksimal tübül çapı inceltilmiş site, yani, (beyaz ok durduŞekil 6) ve tek alkalin fosfataz reaktiflikteki kafaları sonraki PDT kesimi Şekil 6D-I (örnekler) gözlenmiştir. Alkalin fosfataz reaksiyon arka floresan da loş yetişkin böbreğinin bulunan paralel başlıca toplayıcı kanal parçaları çifti ana hatlarıyla, Şekil 6A, 6D en geniş ve renal ilişkili borunun çapına (yıldız işareti ile ayırt edilirler 29,30 -ducts, 6E, 6G, 6H). Sonraki, alkalin fosfataz ve dekstran alımı ile nefron tübüller eş-etiketleme cryosection analizinde gözlenmiştir (Şekil 6J, tübül çevreleri beyaz nokta ile özetlenen). Karşılık gelen boru şeklindeki hücre sitosolik alanı dekstran floro-yakut reaktivitesini (Şekil 6J) gösterirken, enine kesitte, alkalin fosfataz reaktivite, fırça kenar ultrastrüktürdeki tutarlı tubular epitelyum, apikal yüzeyinde kalın bir bant tespit edildi. Özellikle, Stained tübüller PCT segmentler ya da alkalin fosfataz için pozitif tek başına (Şekil 6J, sarı noktalar belirtilen çevre borucuk) bir PST segmenti olarak tanımlanmasına yol açan, (not olarak tanımlanmasına yol açan, alkalin fosfataz ve dekstran çift pozitif ya da vardı: Diğer Mevcut tübüller, veri)) (Şekil 6j ikisi de gösterilmemektedir lekeler için negatif idi. Ayrıca, alkalin fosfataz boyama (Şekil 6K) başarılı bir şekilde nükleer etiket, propidyum iyodür (Şekil 6 L), kolaylaştırıcı hücre sayımı (Şekil 6M overlay) ile bir araya getirilmiştir.

Yetişkin zebrabalıkları nefron distal tübül rodamin-konjüge DBA (Şekil 7) ile etiketlenmiştir. Tüm yabani tip Zebrafish (Şekil 7A-C) böbrekler üzerinde yapıldı DBA ve alkalin fosfataz ile çift etiketleme monte edin. DBA ve alkalin fosfataz reaktivite nefron tübüllerinde hiçbir örtüşme (gösterdi Şekil 7G, 7H, 7J) dallı edildi. GFP etiket olarak, yakın ve uzak nefron tübüller 51 (Şekil 7i) her ikisi de (EGFP: enpep Tg) Böbrek halinde kriyoseksiyonlar enpep yükseltici EGFP tahrik eden bir transgen taşıyan yabani tip zebrabalıkları toplanmıştır. İmmünohistokimya, renal tüplerin (yeşil, Şekil 7i) her etiket şekilde alkalin fosfataz ve DBA (sırasıyla turkuaz ve kırmızı, Şekil 7i) ile floresan etiketleme ve ardından, GFP tespit etmek için gerçekleştirilir. Tübül bölümlerin analizi tübüller her iki etiket (Şekil 7I) alkalin fosfataz veya DBA için olumlu, ama ya olduğunu ortaya çıkardı. Sadece nadir küvetModüller, muhtemelen tübül bölümünün açının (beyaz ok, Şekil 7i) ile, alkalin fosfataz veya DBA leke ile de reaksiyon göstermiştir. Ayrıca, DBA boyama başarıyla yeniden distal tübül segmentlerinde karakteristik dallı doğasını (beyaz ok uçları, Şekil 7J) vurgulayarak, nükleer etiket DAPI (Şekil 7J) ile tüm montaj böbrek boyama kombine edilmiştir.

Sonraki, daha dekstran-FITC alımı, alkalin fosfataz ve DBA örnekleri karşılaştırmak için, üçlü etiketleme, dekstran-FITC ile intraperitoneal enjekte yetişkin zebrabalıkları tarafından incelenmiş alkalin fosfataz ve DBA için cryosectioning ve boyama tarafından 3 gün sonra böbrek izolasyonu izledi izledi (Şekil 8A-E sağlanan örnekleri). Alkalin fosfataz ve dekstran gösterilen PCT kesimleri (beyaz noktalı çizgiler), Tubul çift pozitif tübüllerini: Böbrek tübülleri etiket kombinasyonları üç kategoride gösterdiALP pozitif es yalnız PST kesimleri (sarı noktalı çizgiler) ifade ve distal tübülleri sadece DBA tarafından etiketli (kırmızı noktalı Şekil 8A-E özetliyor). Ayrıca, sadece DBA olumlu tübüller sergiledi dallanma noktaları (Şekil 8E). DİLERİZ analiz ederek, distalinde bu farklı dallanma deseni, DBA olumlu tübülleri uzak tübül segmentlerinde (Şekil 8F-I) için spesifik çözünen taşıyıcı transkript gen ekspresyonu ile ilişkilidir. Tüm distal tübül (DE ve DL) işaretleri clcnk kodlayan transkriptleri böbrek, çapı bol ince ve içerdiği dallanma noktaları (siyah ok ucu Şekil 8F, 8F '). Karşılaştırıldığında, tübül kesimleri, sırasıyla, böbrek örneklerinde toplam (Şekil 8 karşılaştırmak ifadesini clcnk oranla daha az bol DE ve DL belirteçler slc12a1 veya SLC12A3, ifadesini gösterdi G ve 8F, 8H). Hiç, (Şekil 8G, 8G ') dallı eğer', 8H ", 8H" SLC12A3 ifade tübül bölgelerde sık sık karakteristik fırıldak gibi düzenlemeler (Şekil 8H, 8H dallı edildi ise, 'Ayrıca, slc12a1 ifade tübül segmentleri, nadiren vardı , siyah ok başları). Son olarak, PCT işaretleyici slc20a1a ve uzak işaretleyici clcnk çift DİLERİZ bu lekeler (Şekil 8i) örtüşmeyen olduğunu gösterdi. Özellikle, slc20a1a -expressing PCT bölümlerinin uzanır PST Bu bölgelerin (Şekil 8I) arasında yer alan yana beklentiler -expressing tübülleri, clcnk bağlı değildi. Birlikte ele alındığında, belirli bir gen transkript için dekstran alımı, alkalin fosfataz reaktivite, DBA ve dilek böbrek tübülleri etiketleme deneyleri, distal segmentler karşı proksimal muhakeme sağlar.

hep ">:" keep-together.within-page = fo "t Şekil 1
Yetişkin zebrabalıkları böbrekte Şekil 1. Nefron anatomi. (A) yetişkin zebrabalıkları böbrek ve (B) yetişkin ve embriyonik zebra balığı nefron tarafından sergilenen bölüm moleküler özelliklerinin karşılaştırılması grafik şematik çizimleri. (A) (En solda) yetişkin böbrek dorsal gövde duvarının üzerinde yer alan bir düz organdır. Ventral açıdan bakıldığında (Sağ üst), böbrek baş, gövde ve kuyruk bölgelerinde oluşan, kendine özgü bir kavisli yapıya sahiptir ve aynı zamanda ilişkili melanosit yüzey nüfusa sahiptir. (Sol alt) Genişleme proksimal tübül, distal tübül ve kanalı tarafından takip tek tek her nefron bir ucunda kan filtre (renal korpuskül) sahip olan yetişkin zebrabalıkları böbrek, tipik bir nefron ağacın, bir şemasını göstermektedir. Renkli şematik (bottom sağ) embriyonik nefron (B) bu segment özelliklerini karşılaştırmak için bir yetişkin nefron ağacın doğrusal bir şemasını göstermektedir. Zebra balığı embriyosu nefron aşağıda listelenen ilgili gen ekspresyon etki ile proksimal dolambaçlı tubule (PCT), proksimal düz tübül (PST), distal erken (DE), ve distal geç (DL) dahil borucuk segmentleri içerir. Embriyo ile karşılaştırıldığında kayda değer bir fark birkaç nefron dallı DL bölümü yoluyla birleşik olmasıdır, ancak erişkin Zebrafish nefron, kısmi bileşim ve solüt taşıyıcıları kodlayan genlerin ekspresyonu alanlarında dayalı benzer moleküler imza benzer sahiptir. burada tıklayın Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.

Şekil 2 Yöntemler tek başına veya çeşitli kombinasyonlar halinde gerçekleştirilebilir işaret eden bu protokolde gösterilen yöntemleri arasındaki ilişkiyi gösteren Şekil 2. Akış Şeması haritası. Yetişkin zebrabalıkları içindeki işaretli lizine sabitlenebilir dekstran intraperitonal enjeksiyonu takiben, böbrek olarak görselleştirilebilir Tüm tek başına veya alkali fosfataz ve / veya DBA lekeleri ile kombinasyon halinde, hazırlık monte edin. Alternatif olarak, seçilen Zebrafish böbrek histolojik doku bir kriostat ile kesit sonra muayene edilebilir. Kesitler, immünohistokimya, nükleer lekeleme DBA boyaması kullanılarak, ürün özellik kombinasyonları çok etiketlemek için, lekeli ve / veya alkalin fosfataz tepkime edilebilir. Buna ek olarak, böbrek bölümler PCT segmentlerinde lizine sabitlenebilir dekstran alımı varlığında doğrudan görselleştirilebilir. Son olarak, seçilen böbrekler İSTEĞİNİ kullanılarak gen tanımının uzaysal ifadesi için işlenebilir. Parantez numaraları correspo bakınızprotokol parça nding. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. Yetişkin Zebra balığı böbrek düz böbrek nefron PCT segmentinde konjuge dekstran alımını görselleştirmek için hazırlık ve uygulama montaj. Organ kil modelleme (pembe renkli) dört divots üzerinde duracak doku üstüne yerleştirilen bir lamel ile bir cam slayt üzerine düz bir konuma edildiği hazırlanmasını monte düz böbrek örnek, (A) aydınlık görüntü. İşte böbrek hazırlık ölçekli bir karşılaştırma sağlamak için bir metrik cetvel yanında görüntülü. Tipik bir yetişkin böbrek baş kuyruk yaklaşık 5-7 milimetre (mm). (B) bir ağartılmamış bir aydınlık görüntüböbrek. Siyah pigmentasyon böbrek ile birlikte bulunan melanosit dağınık popülasyonuna karşılık gelir, ve aorta bir böbreğin orta hat boyunca uzanır. Nefron PCT bölümlerinin (C) görselleştirilmesi 3 gün 40 kDa intraperitonal enjeksiyonu dekstran-floresin (FITC) , yetişkin böbreğinin ağartmaksızın. PCT segmentleri böbrek boyunca görülür ancak kısmen melanosit nedeniyle bozulmalar olur. (C ') tek nefronun Dijital zoom, melanosit (beyaz ok) ile. Bir yetişkin böbreğinin (D) Resmi 3 gün 10 kDa intraperitoneal enjeksiyonu takiben dekstran floro-yakut, böbrek, ve ağartma sabitleme. Melanosit pigmentasyon uzaklaştırılmış ve PCT bölgeler aydınlık aydınlatmasında dekstran kendi endositik çıkışı esas alınarak burada görselleştirilmiştir. Karından, lipid damlalarıyla (ok), bazen böbrek doku örnekleri ile bağlantılı olarak görülebilir. (D ', D "), RepreSorumlunuzu görüntüleri PCT kesimleri arasında hafif morfolojik farklılıklar betimliyor. Birçok nefron PCT'ler sıkıca (D ') sargılı ederken, diğer nefron (D ") kıvrılma az olması PCT bölgeleri içerir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4
. Şekil 4. Yetişkin böbrek nefron PCT borucuk kademeli bir markalama Vahşi tipli zebra balığı periton içine tek bir floresan dekstran konjügat enjekte edilmiştir; daha sonra 3 gün böbrek PCT görselleştirme için enjeksiyondan sonra incelenmiştir. (A, A ') Dekstran çağlayan mavisi, 10 kDa (B, B') san dekstran Lucifer, 10 kDa ve (C, C ') f dekstran flor-yakut, 10 kDa tercihen böbrek nefron olarak PCT kesimleri etiket. Hem dekstran çağlayan mavi ve Lucifer sarı gösteri Lucifer sarı tedavi böbreklerde görülen çok daha yüksek arka plan ile, nefron arasında yer alan stromal hücre popülasyonlarının bazı non-spesifik etiketleme. Bunun aksine, dekstran floro-yakut yoğun PCT etiketi ile birlikte önemli ölçüde azaltılabilir arka planı oldukça gösterdiğinden. (D, D ') slc20a1a, PCT taşıyıcı hücre tipi için spesifik bir markör kodlayan transkriptlerin konumunu tespit etmek için, WISH ile boyanmış bir yetişkin böbrek. Slc20a1a ifadesi etki ile çeşitli sıkıca sarılı / döngüye PCT etki dağıtımı yanı sıra tutarlı bir çapı geniş göstermek daha uzun PCT uzanıyor ile, böbrekte gözlenen dekstran alımının karakteristik desen eşleşen. daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın.

ontent "fo: keep-together.within-page =" her zaman "> Şekil 5,
Şekil alkalin fosfataz için boyama 5. Temsilcisi sonucu, yetişkin zebrabalıkları böbrekte bir pan-proksimal tübül işaretleyici,, WISH ile değerlendirildi diğer proksimal tübül belirteçleri ile karşılaştırıldığında. (AC) Alkali fosfataz boyama (turkuaz) PCT ve PST. (DF ') hem de vurgulayarak, nefron proksimal tübül yanar listelenen genlerin (mor boyama her) Tek İSTEĞİNİ. (D, D') cubilin bir ifade deseni , bir pan-proksimal (PCT-PST) işaretleyici, ('D, D) alkalin fosfataz ile ilişkilidir. Buna karşılık, mafba için DİLERİZ PCT (E, E ') işaretler ve slc13a1 PST (F, F işaret'). (GG "') slc20a1a <PCT işaretleyici için çift dilekle/ Em> (kırmızı) ve (mor) PST işaretleyici slc13a1 bu belirteçler tarafından etiketli kesimleri örtüşmeyen gösteriyor ve tek nefron yakından (G'-G "') incelendiğinde bunların ifade alanları bitişik pozisyonları işgal ziyade bu. Siyah ok uçları genellikle küçük büyükten tübül çapı bir değişiklik ile ilişkili PCT ve PST kesimleri arasında kavşak, işaret, sırasıyla. bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6. Alkalin fosfataz ve yetişkin böbrek nefron PCT segmentinde dekstran yapısına alınma oranı göstermektedirler örtüşme ve alkalin fosfataz boyama propidyum iyodürle birlikte nükleer etiketleme ile uyumludur. (AI) (AC) Birleştirilmiş görüntü ve tek bir böbrek eyer bölgenin ayrı ayrı görüntüler. (DF) alkalin fosfataz yalnız PST etiketler ise ve (Gİ) Birleştirilen görüntülerin ve örnek nefron ayrı görüntü iki set. (I) Cryosection analizi, alkalin fosfataz ve (beyaz noktalar özetlenmiştir) PCT segmentlerinde dekstran floro-yakut eş-etiketleme doğruladı segment (sarı nokta özetlenen). (KM) Bir böbrek oldu(K) alkalin fosfataz (turkuaz) ve (L) propidiyum iyodür (mor), (M) sağlayan etiketli sırasıyla. proksimal tübül hücreleri ve bunların çekirdekleri, görselleştirme birleşti bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7
Şekil 7. Alkali fosfataz ve DBA karşılıklı yetişkin zebrabalıkları böbrek nefron mevcut sırasıyla pan-proksimal ve pan-distal bölgeleri işaretlemek özel bölüm etiketleri vardır. (AH) alkalin fosfataz ve rhodamine-DBA ile boyanmış bir Zebra balığı böbrek Tüm montaj hazırlıkları. Alkali fosfataz (turkuaz) ve DBA (kırmızı) böbrekte örtüşme görünmüyor. Alkalin fosfataz arka plan düzeyleriChristy nedeniyle geniş çaplı ayırt edici her böbreğin (yıldız, *), büyük toplayıcı kanallarda çifti aydınlatmak. DBA pozitif tübüller çapı daha ince olan ve branş noktası (beyaz ok başları) mevcudiyeti ile sık sık karakterize edilir. (AC) görüntü ve tek bir böbreğin sele bölgesi ayrı görüntüler birleştirilmiştir. (DF) birleştirilmiş görüntü ve ayrı görüntü kümesi Örnek nefron. (G, H) ek örnekleri, alkalin fosfataz ile birlikte kollara ayrılmış pozitif tübül DBA tübüller, görüntüler birleşmiştir. (I) 'in Cryosection alkalin fosfataz analizi DBA etiket bölümleri farklı tübül ve sadece nadir tübülleri de etiketi göstermektedir olduğunu göstermektedir (beyaz ok ), bu borucuk bölümün açısına bağlı olarak muhtemel. Bu analiz için, vahşi tipli transgenik balık, Tg: enpep: EGFP, ikinci ve bu böbrek, renal tüplerin her GFP tespit etmek için bir birincil antikor ile imüno edilmiştir (J). , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 8
Distal segment DİLERİZ analize göre dekstran alımı, alkalin fosfataz ve DBA ile erişkin böbrek cryosections Şekil 8. Üç etiketleme. (AO) Yetişkin böbrekler intraperitonal dekstran-FITC (yeşil) ile enjekte edilen, ve böbrekler ve gömme cryosectioning 3 gün sonra toplandı. Alkalin fosfataz reaktivite ve Dext için pozitif PCT kesimleri: alkalin fosfataz (turkuaz) ve DBA (kırmızı) ile boyanarak tübüllerinin üç popülasyonları ortaya(beyaz noktalar özetlenmiştir) koştu, sadece (sarı nokta özetlenen) alkalin fosfataz reaktivite ve aynı zamanda karakteristik uzak dal noktalarını gösterdi (kırmızı noktalar özetlenmiştir) DBA için pozitif distal tübül kesimleri için pozitif PST bölümleri. ( AD) Birleştirilmiş görüntü ve bir örnek bölümünde ayrı görüntüler. (E) Birleştirilmiş başka örnek bölümünde görüntü. tek (FH distal tübül gen ekspresyonu (FI) Karşılaştırma '") ve çift (I) DİLERİZ. (FH ') listelenen genleri için tek MI WISH (mor boyamasında) ekstrakte edildi. (K, K') clcnk salgılama modeli, bir pan-uzak (DE-DL) etiketi, dal noktalarını içeren ince tübüllerde saptandı (siyah ok başı). (G, G ') karşılık, slc12a1 için DİLERİZ tespit hiçbir şube noktaları ile DE işaretler ve (HH' ") <em> SLC12A3 DL, böbrek organ (siyah ok başları) boyunca sayısız şube noktaları ile karakterize bir segment işaretler. PCT işaretleyici slc20a1a (kırmızı) ve pan-uzak clcnk (mor) (I) Çift DİLERİZ. Bu belirteçler tarafından etiketli bölümleri örtüşmeyen ve yerine kendi anlatım alanları gibi bireysel PCT bobinleri (sağ altta) o komşu olmayan pozisyonları, işgal Distal tubulusdaki Abut değil ve ikincisi ayrık yerleri işgal ve (siyah ok başı damgasını şube noktaları sahip ). Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Burada, biz yetişkin zebrabalıkları nefron segmenti bileşenlerin görselleştirme izin yöntemler tarif etmişlerdir. Floresan dekstran konjügatların enjeksiyonu bu proksimal tübül hücrelerinin 30,38 endositik özellikleri nedeniyle tercihli PCT etiketleme sağlar. Bu yöntem, farklı floresan konjugatlarının bir kuş sürüsü ile elde edilebilir dekstranlar varlığından büyük bir esneklik ile yapılabilir. İkinci etiketleme işlemleri gerekli değildir Buna ek olarak, lizin tamir edilebilir dekstranlar kullanımı PCT kesimleri etiketlemek için özellikle uygun bir yoldur. Bu, nispeten basit bir sinyal tespit edilmesini sağlar ve diğer birçok floresan etiketler, immunolabeling ve raportör transgenik çizgiler kullanımı ile uyumludur. Alkalin fosfataz Etiket aynı zamanda, PST PCT güçlü reaktivite ve biraz daha zayıf bir reaktiviteye sahip, proksimal tübül işaretler. Son olarak, DBA boyama bir ch gösterilecek uzak tübül segmentlerinde, etiketleme sağlararacteristic morfolojisi dallıdır. Immün olmayan kökenli, şeker bağlayıcı proteinler olan çeşitli lektin molekülleri, memeli nefron kesimleri 47 ayırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. O memeli böbreklerde 47. toplama kanalları işaretlemek için kullanılır gibi zebrabalıkları DBA, distal tübül kesimleri ile korelasyon olması ilginçtir.

Birlikte ele alındığında, bu yöntemler, böbrek bileşimi ve işlevini belge çeşitli kombinasyonlar halinde kullanılabilir. Bu yöntemlerin hepsi tüm böbrek hazırlıklar kullanılabilir beri, tamamen daha fazla zaman tüketen, sıkıcı yöntemlerle, örneğin, cryosection iş ve immunolabeling kullanımına dayanmadan organın her nefron yapısını ve fonksiyonunu değerlendirmek için araçlar sağlar. Bununla birlikte, bu yöntemler, makalede açıklanan lekeleri cryosection olarak geçerli değildir. Cryosection analizi immünohistokimyası belirli peptidleri algılamak için daha uygundur (bütün montaj kıyasla) örnekleri oluştururDES, ancak elbette bu tip analiz uygun bir birincil antikor kullanılmasını gerektirir. Ne yazık Zebrafish hayvan modeli ile çalışan bir büyük sınırlama antikorların düşük mevcudiyet kalır. Böylece WİSH yani, en yaygın olarak kullanılan kalır 'git, gen ekspresyonunun analizi için prosedür. Mor veya kırmızı çökeltileri üretmek için BCIP NBT ve / veya INT substrat reaksiyonlar kullanarak DİLERİZ cryosections floresan boyama ile uyumlu değildir. Bir seçenek floresan WİSH tespiti, zebra balığı embriyonik örnekler için optimize edilmiş olan ve yetişkin böbreğinin kullanım için uygun olabilir bir prosedürün kullanımı çağırmak olacaktır. Bu video makalede yöntemlerin açıklaması ayrı ayrı bölümler gibi eGFP veya mCherry gibi bir muhabir ile etiketlenmiş edildiği transgenik zebrafish hatları ile birlikte floresan, WISH gibi teknikler ile daha fazla deneyler için izin vermelidir. Alternatif olarak, yöntemler, burada tarif edilen edebildiğidiğer hayati boyalar, örneğin, diğer lektinlerin ile kombinasyon halinde test edilebilir d. Böylece, daha fazla uyum ve burada açıklanan yöntemlerin genişleme bütün montaj böbrek hazırlıkları ve analiz için araştırmacının ihtiyaçlarına göre çağırılacak.

Bu durumda, bu yöntemler, devam eden yenileme çalışmaları için Zebrafish modeli ile birlikte uygulanması için ve genetik hastalığın modelleme geniş bir potansiyele sahiptir. Böbrek hatalarımız için yenilikçi araştırma ve tedaviler için acil bir ihtiyaç vardır. Milyonlarca insan, konjenital akut ve / veya kronik nedenlerden kaynaklanan her yıl böbrek hastalığı çeşit muzdarip. Ayrıca, böbrek hastalığı prevalansı bu hastalıkları küresel bir halk sağlığı sorunu 14,15 yaparak, dünya çapında yükselmeye devam ediyor. Harici bir diyaliz makinesi böbrekler bu rolü gerçekleştirmek mümkün değilse metabolik atıkların bir hastanın kanını kurtulmak için hizmet sayede örneğin hemodiyaliz gibi tedaviler mevcuttur. Ne yazık kiTedavisi devam eden yaşam için gerekli olduğu, bu müdahale, sınırlamaları vardır. Ayrıca, hastalar en sonunda hasta, bekleme üzerine yerleştirildiği zaman almak için yıllar alabilir bir böbrek nakli gerektirecektir. Hatta bir böbrek nakli aldıktan sonra, birçok hasta prosedürü sonucunda olumsuz etkileri acı ve hayatlarının geri kalanı için bu etkileri savaşmak zorundadır. Bu zorluklar, böbrek hastalığı önlemeye ya da belki de, doku rejenerasyonu 8,16,52,53 ek olarak bir yardımcı olmak için ya da yeni tedavilerin geliştirilmesi için ciddi bir ihtiyaç göstermektedir. Biyomedikal laboratuarlarda insan deneğin kullanımının bariz etik kısıtlamaları göz önüne alındığında, hayvan modeller, insan hastalığının patogenezinde çalışma için yeni tedavilerin testleri için gereklidir. Anatomik benzerlik ve evrimsel yakın bir sonucu olarak, fare, insan hastalıklarının 45 en yaygın olarak kullanılan model olmuştur. Ancak, bu hayvanın belirli sınırlamalar dahil olmak üzere, vardıryetersizlik ing in vivo ve büyük ölçekli genetik ekranlar tamamladıktan pratiklik organ gelişimini görselleştirmek için. Zebra balığı insan hastalığı 45,46 organ gelişimi ve modelleme çalışmaları için uygun bir ve faydalı model organizma vardır. Insan hastalığı ile ilgili olarak, zebrabalıkları fonksiyonel homologları ve insan genlerinin tüm 54,55 yaklaşık% 70 mevcuttur.

Son çalışmalar böbrek araştırmalar 31,37,56 birçok alanları için zebrafish programını ortaya koymuştur. AKI sonra Zebrafish yenilenme ve onarım çalışmaları tübül epitel rejenerasyon ve neonephrogenesis oluşur ve 30,37 Timecourse rejenerasyon boyunca üst üste iki süreç olduğunu göstermektedir. Bir aminoglikozid antibiyotik olarak adlandırılan gentamisin kullanımı yetişkin zebrabalıkları 29,30,37 ABH sonuçlarını incelemek için aracılığıyla bir yaralanma paradigması olarak kullanılmıştır. Gentamisin bir yaklaşık olarak iki haftalık bir süre boyunca yaralanmayı takip eden, proksimal tubules yeniden, ve bu arada yeni nefron organı 29,30,37 boyunca oluştururlar. Genel olarak, epitel rejenerasyon düzenleyen mekanizmalar son derece tartışmalı kalır. Tamir işleminin bir önerilen mekanizmasında, lümenine ölü hücre dökülmesi ve ardından başlangıç ​​akut yaralanma olay vardır. Sonra, yeni hücreler ayırt sonra de-farklılaşma, çoğalma ve göç olayları bir dizi, yaralı bazal membran repopulating ve yaralı siteye işlevini geri vardır. Alternatif olarak, diğer çalışmalar yedek hücreler nefron tübüller içinde ikamet kök / progenitör hücrelerden kaynaklanan ileri sürmüşlerdir. Zebrabalıkları neonephrogenesis süreci ile ilgili olarak, hücre agregatları gentamisin enjeksiyon 29,30 tarafından aşağıdaki AKI gözlenmiştir. Bu agregalar sonra zaten mevcut olan tübüllerine 29,30 içine indiğimizde yeni nefron içine olgun. Nefron epitel rejenerasyonu ve neonephr birleştiren ortak konuogenesis onların sırf gizem faktörü: Şu anda bu rejeneratif kahramanlık geçerli anlayışlar vardır daha ortaya nasıl hakkında katlanarak daha sorular vardır.

Ancak bugüne kadar, kanıt birkaç heyecan verici çizgileri zebrafish kullanarak böbrek yenilenmesi araştırması gerçekten de doğrudan öteleme potansiyel 56-58 olabilir insan AKI içine ilgili karşılaştırmalı bilgiler sağlayabilir olduğu fikrini desteklemektedir. Kimyasal tarama son histon deasetilaz inhibitörü metil-4-(feniltio) -butanoat (m4PTB) 56,57 tanımlanmasına yol açan zebrafish embriyo böbrek projenitör hücrelerin çoğalmasını arttırmak küçük molekülleri tanımlamak için. Gentamisin kaynaklı AKI ile zebra balığı larvalarına karşı Bu bileşimin uygulanmasıyla larva yaşama ve artmış renal tübüler çoğalması 56,58 gelişmiş olduğunu göstermektedir. Orta işemi ile uyarılan AKI ile farenin m4PTB ile muamele edildi, geri kazanımlarının Assoc hızlandırıldırenal tübüler hücrelerin 58 çoğalan hem tübüler atrofi ve hücre döngüsü tutuklama bir azalma ile iation. Bu bulgular, normal zebra balığı böbrek gelişimi ve / veya AKI rejeneratif tepki sorumlu yollar memelilerin 56 ile konserve olacağını göstermektedir.

Böylece, ileri çalışmalar söz konusu sinyalizasyon yolları belirlemek ve bunların etkileşimleri-zebrabalıkları nefroloji alanında bu önemli hedef için bir umut cadde sağlar anlamak rejenerasyon-yani mekanizmalarını ayrı kızdırmak için gerekli iken. Bunlar da bu protokolde tarif nefron hücre etiket gibi araçlar, AKI modellerinde böbrek kompozisyon ve özelliğe değerlendirmek için kullanılabilir tahlillerin bir grubunu temsil eder. Dahası, böbrek hastalığı transjenik modelleri karakterize uygulanabilir ve böbrek baraj sonra nefron yapının restorasyon teşvik edebilen kimyasal terapötik durumların belirlenmesinin yol sağlayabiliryaş.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu çalışma aşağıdaki gelen RAW fon tarafından desteklenmiştir: Ulusal Sağlık Enstitüleri K01 DK083512, DP2'deki OD008470, ve R01 DK100237 verir; Dimes Basil O'Connor Başlatan Bilgin hibe # 5-FY12-75 Mart; Bilim ve Biyolojik Bilimler Bölümü Notre Dame Koleji Üniversitesi'nden fon başlatmak; ve Gallagher Ailesi adına Elizabeth ve Michael Gallagher Notre Dame Üniversitesi cömert bir hediye kök hücre araştırmaları teşvik etmek. Maliyeciler çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayımlamak kararı, ya da yazının hazırlanmasında herhangi bir rolü vardı. Biz onların destek için Biyolojik Bilimler Bölümü kurmayları teşekkür ederiz ve bizim zebrabalıkları koloninin bakım ve refah onların üstün özveri için Notre Dame de Zebra Araştırma Merkezi. Son olarak, bu çalışma konusunda yorumlar, tartışmalar ve anlayışlar için bizim araştırma laboratuvarında üyelerine teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X PBS Made by diluting 10 X PBS in distilled water.
1X PBST 0.1% Tween-20 detergent in 1 X PBS.
1X PBS with 0.05 % Tween 0.05% Tween-20 detergent in 1 X PBS.
Tween 20 American Bioanalytical AB02038
4% PFA/1X PBS Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20°C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. 
Fine Forceps Roboz RS-1050 Dumont Tweezers Pattern #55 
Glass slide Thermo-Fisher 4445 White Frost 
Glass coverslip Thermo-Fisher 12-540A 18 x 18 mm
Modeling clay Hasbro Playdoh Other modeling clays can be substituted and work similarly
Slide holder Thermo-Fisher 12-587 Optional: cardboard tray to store slides flat
Bleaching solution Bleach mix formula (for a 20 ml solution):
1.6 ml of 10% Potassium hydroxide solution
0.6 ml of 30% Hydrogen peroxide solution
100 μl of 20% Tween
Fill to 20 ml with distilled water
Potassium hydroxide Sigma 221473
Hydrogen peroxide Sigma H1009
Blocking solution Blocking Solution (for a 10 ml solution):
8 ml of 1X PBS with 0.05% Tween
2 ml of fetal calf serum
150 μl of DMSO
Alkaline phosphatase activity detection Invitrogen E6601 We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.  To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer's instructions. 
Alkaline phosphatase wash solution Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 ml solution):
5 ml of 0.5 M EDTA
120 mg of Levamisole
95 ml of 1X PBS
Dextran, fluorescein, 40,000 MW Invitrogen D1844 Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, cascade blue, 10,000 MW Invitrogen D1976 Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW Invitrogen D1825 Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW Invitrogen D1817 Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine Vector laboratories RL-10-32 DBA Staining Solution (for a 100 μl solution):
1 μl of DBA
99 μl of 1X PBS
Propidium iodide Invitrogen E6601
DAPI Invitrogen P1304MP
Vectashield hard set mounting medium Vector laboratories H-1400
Micro cover glass VWR 48393081
Dimethyl sulfoxide, DMSO American Bioanalytical 67-68-5
Sucrose Sigma S0289
EDTA, 0.5 M solution, pH 8.0 American Bioanalytical AB00502
Levamisole Sigma L-9756
Tissue freezing medium Triangle Biomedical Sciences, Inc. TFM-C
Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10 x 10x 5 mm Sakura Finetek 4565
TruBond 380 adhesive microscope slides Tru Scientific 0380W
Liquid blocker – super PAP pen Electron Microscopy Sciences 71312
Immuno stain moisture chamber Evergreen Scientific 240-9020-Z10
Cryostat Therm Microm™ HM 525 Cryostat
Stereomicroscope Nikon SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection. 
Compound microscope Nikon 96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reilly, R. F., Bulger, R. E., Kriz, W. Structural-functional relationships in the kidney. Diseases of the Kidney and Urinary Tract. RW, S. chrier Lippincott Williams Wilkins. Philadelphia, PA. 2-53 (2007).
  2. Dressler, G. R. The cellular basis of kidney development. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 509-529 (2006).
  3. Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. Anat Rec. 232, 194-201 (1992).
  4. Cebrian, C., Borodo, K., Charles, N., Herzlinger, D. A. Morphometric index of the developing murine kidney. Dev Dyn. 231, 601-608 (2004).
  5. Schedl, A. Renal abnormalities and their developmental origin. Nat Rev Genet. 8, 791-802 (2007).
  6. Ricci, Z., Cruz, D. N., Ronco, C. Classification and staging of acute kidney injury: beyond the RIFLE and AKIN criteria. Nat Rev Nephrol. 7, 201-208 (2011).
  7. Faubel, S., et al. Ongoing clinical trials in AKI. Clin J Am Soc Nephrol. 7, 861-873 (2012).
  8. Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospects and challenges. Clin Transl Med. 2, 11 (2013).
  9. Liu, Y. Cellular and molecular mechanisms of renal fibrosis. Nat Rev Nephrol. 7, 684-696 (2011).
  10. Murugan, R., Kellum, J. A. Acute kidney injury: what’s the prognosis. Nat Rev Nephrol. 7, 209-217 (2011).
  11. Palevsky, P. M. Chronic-on-acute kidney injury. Kidney Int. 81, 430-431 (2012).
  12. Chawla, L. S., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease: an integrated clinical syndrome. Kidney Int. 82, 516-524 (2012).
  13. Bucaloiu, I. D., Kirchner, H. L., Norfolk, E. R., Hartle, J. E., Perkins, R. M. Increased risk of death and de novo chronic kidney disease following reversible acute kidney injury. Kidney Int. 81, 477-485 (2012).
  14. Collins, A. J., et al. USRDS 2012 Annual Data Report: Atlas of Chronic Kidney Disease and End-Stage Renal Disease in the United States (2012). Lancet. 365, 331-340 (2012).
  15. El Nahas, M. eguid, Bello, A., K, A. Chronic kidney disease: the global challenge. Lancet. 365, 331-340 (2005).
  16. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction. Biochem J. 444, 153-168 (2012).
  17. Toback, F. G. Regeneration after acute tubular necrosis. Kidney Int. 41, 226-246 (1992).
  18. Thadhani, R., Pascual, M., Bonventre, J. V. Acute renal failure. N Engl J Med. 334, 1448-1460 (1996).
  19. Bonventre, J. V. Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure. J Am Soc Nephrol. 14, S55-S61 (2003).
  20. Romagnani, P., Kalluri, R. Possible mechanisms of kidney repair. Fibrogenesis Tissue Repair. 2, 3 (2009).
  21. Bonventre, J. V., Yang, L. Cellular pathophysiology of ischemic acute kidney injury. J Clin Invest. 121, 4210-4221 (2011).
  22. Grgic, I., et al. Targeted proximal tubule injury triggers interstitial fibrosis and glomerulosclerosis. Kidney Int. 82, 172-183 (2012).
  23. Reimschuessel, R. A fish model of renal regeneration and development. ILAR J. 42, 285-291 (2001).
  24. Reimschuessel, R., Williams, D. Development of new nephrons in adult kidneys following gentamicin-induced nephrotoxicity. Ren Fail. 17, 101-106 (1995).
  25. Salice, C. J., Rokous, J. S., Kane, A. S., Reimschuessel, R. New nephron development in goldfish (Carassius auratus) kidneys following repeated gentamicin-induced nephrotoxicosis. Comp Med. 51, 56-59 (2001).
  26. Augusto, J., Smith, B., Smith, S., Robertson, J., Reimschuessel, R. Gentamicin-induced nephrotoxicity and nephroneogenesis in Oreochromis nilotica, a tilapian fish. Dis Aquatic Org. 26, 49-58 (1996).
  27. Elger, M., et al. Nephrogenesis is induced by partial nephrectomy in the elasmobranch Leucoraja erinacea. J Am Soc Nephrol. 14, 1506-1518 (2003).
  28. Watanabe, N., et al. Kidney regeneration through nephron neogenesis in medaka. Develop Growth Differ. 51, 135-143 (2009).
  29. Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
  30. Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-101 (2011).
  31. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
  32. Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, e189 (2007).
  33. Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-1127 (2008).
  34. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  35. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev Biol. 386, 111-122 (2014).
  36. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. 54, (2011).
  37. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
  38. Drummond, I. A., et al. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125, 4655-4667 (1998).
  39. Anzenberger, U., et al. Elucidation of megalin/LRP2-dependent endocytic transport processes in the zebrafish pronephros. J Cell Sci. 15, 2127-2137 (2006).
  40. Majumdar, A., Drummond, I. A. The zebrafish floating head mutant demonstrates podocytes play an important role in directing glomerular differentiation. Dev Biol. 222, 147-157 (2000).
  41. Kramer-Zucker, A. G., Wiessner, S., Jensen, A. M., Drummond, I. A. Organization of the pronephric filtration apparatus in zebrafish requires Nephrin, Podocin, and the FERM domain protein Mosaic eyes. Dev Biol. 285, 316-329 (2005).
  42. Brien, L. L., Grimaldi, M., Kostun, Z., Wingert, R. A., Selleck, R., Davidson, A. J. Wt1a, Foxc1a, and the Notch mediator Rbpj physically interact and regulate the formation of podocytes in zebrafish. Dev Biol. 358, 318-330 (2011).
  43. Ebarasi, L., Oddsson, A., Hultenby, K., Betsholtz, C., Tryggvason, K. Zebrafish: a model system for the study of vertebrate renal development, function, and pathophysiology. Curr Opin Nephrol Hypertens. 20, 416-424 (2011).
  44. Swanhart, L. M., Cosentino, C. C., Diep, C. Q., Davidson, A. J., de Caestecker, M., Hukriede, N. A. Zebrafish kidney development: basic science to translational research. Birth Defects Res C Embryo Today. 93, 141-156 (2011).
  45. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  46. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
  47. Cox, W. G., Singer, V. L. A high-resolution, fluorescence-based method for localization of endogenous alkaline phosphatase activity. J Histochem Cytochem. 47, 1443-1456 (1999).
  48. Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish kidney development. Methods Cell Biol. 100, 233-260 (2010).
  49. Watson, L., Vassallo, J., Cantor, G., Lehman-McKeeman, L. Lectin histochemistry: an alternative to immunohistochemistry for identify specific structures in rat papillary necrosis. HistoLogic. 41, 28-31 (2008).
  50. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J Vis Exp. e51604 (2014).
  51. Seiler, C., Pack, M. Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene. Gene Expr Patterns. 11, 118-121 (2011).
  52. Little, M. H. Regrow or repair: potential regenerative therapies for the kidney. J Am Soc Nephrol. 17, 2390-2401 (2006).
  53. Romagnani, P., Lasagni, L., Remuzzi, G. Renal progenitors: an evolutionary conserved strategy for kidney regeneration. Nat Rev Nephrol. 9, 137-146 (2013).
  54. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
  55. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
  56. Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and acute kidney disease: translational research insights from zebrafish chemical genetics. General Med. 1, (3), (2013).
  57. Groh, E. D., et al. Inhibition of histone deacetylase expands the renal progenitor population. J Am Soc Nephrol. 21, 794-802 (2010).
  58. Cosentino, C. C., et al. Histone deacetylase inhibitor enhances recovery after AKI. J Am Soc Nephrol. 24, 943-953 (2013).
Yetişkin Zebra balığı Böbrek Nefron Kompozisyon ve Fonksiyon Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (90), e51644, doi:10.3791/51644 (2014).More

McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (90), e51644, doi:10.3791/51644 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter