Summary
Statisk adhæsionsassay er et kraftfuldt værktøj, der kan bruges til at modellere interaktioner mellem T-lymfocytter og andre celletyper. Interaktioner genereres ved at injicere mærkede T-celler i brønde overtrukket med adhæsionsmolekyler, mens en pladelæser anvendes til at kvantificere antallet af adhærente celler efter seriel vask.
Abstract
T-lymfocyt-adhæsion kræves for flere T-celle-funktioner, herunder migration til steder med inflammation og dannelse af immunologiske synapser med antigenpræsenterende celler. T-celler opnå reguleret adhæsion ved at styre de adhæsive egenskaber af integriner, en klasse af celleadhæsionsmolekyler, som består af heterodimere par transmembrane proteiner, der interagerer med målmolekylerne på partner celler eller ekstracellulære matrix. Den mest fremtrædende T-celle-integrin lymfocytfunktion-associeret antigen (LFA) -1, sammensat af underenheder αL og β2, hvis mål er det intracellulære adhæsionsmolekyle (ICAM) -1. Evnen af et T-celle til at kontrollere vedhæftning stammer fra evnen til at regulere affinitet stater enkelte integriner. Inside-out signalering beskriver den proces, hvorved signaler inde i en celle forårsage eksterne domæner af integriner til at påtage sig en aktiveret tilstand. Meget af vores viden om disse komplekse fænomener er baseret på mekanistiskeundersøgelser udført i forenklet in vitro modelsystemer. T lymfocytadhæsion assay beskrevet her er et fremragende værktøj, der giver T-celler til at overholde målrette molekyler, der under statiske forhold, og derefter benytter en fluorescenspladelæser at kvantificere klæbeevne. Denne analyse har været nyttigt at definere vedhæftning-stimulerende eller hæmmende stoffer, der reagerer på lymfocytter, samt karakterisering af signaleringshændelser involverede. Selvom beskrevet her for LFA-1 - ICAM-1 medieret friktion; dette assay kan let tilpasses for at tillade undersøgelse af andre adhæsive interaktioner (fx VLA-4 - fibronectin).
Introduction
T-lymfocyt-adhæsion er en fundamental proces i immunresponset 1. Det er nødvendigt for T-celle-interaktion med endotelceller dekoration kapillærvæggene, til scanning antigenpræsenterende celler (APC) i lymfekirtler og til dannelse af immunologiske synapser (IS) med målceller 2. Disse krav er funktionelt og kinetisk tydelig. Processen af lymfocytter ekstravasation består af kemotiltrækning, valsning, fast vedhæftning, og sjælevandring. Overgangen fra ruller til fast vedhæftning kræver T-celler til at reagere på en G-proteinkoblet receptor signal hurtigt. Denne reaktion giver en integrin ligand vekselvirkning, som bremser og anholdelser den rullende celle 3.. En umiddelbar ændring i integrin aviditet medierer denne proces. Migration kræver dynamiske vekselvirkninger betweenTcells og endotelceller med dannelsen af sammenvoksninger på "frontend" og brud på sammenvoksninger på "bagende"med et interval på omkring et minut mellem formning og bryde 4.. IS danner inminutes, men skal forblive intakt i timevis 6.
Interessant, et adhæsionsmolekyle, integrinfamilien medlem lymfocytfunktion associeret antigen (LFA) - 1, er afgørende for alle disse processer 5. LFA-1 medierer adhæsion gennem interaktioner med flere medlemmer af immunglobulin-superfamilien. Den mest omfattende undersøgte ligand med den højeste affinitet til LFA-1 er det intercellulære adhæsionsmolekyle (ICAM) -1. Ikke-aktiverede cirkulerende lymfocytter udtrykker lav affinitet LFA-1 på celleoverfladen og derfor er ude af stand til at klæbe til ICAM-1-overtrukne overflader. LFA-1-affinitet er variabel og reguleret af flere signaling begivenheder såsom G-protein koblet receptor aktivering, cytokinstimulering og signaler medieret af T-cellereceptorer (TCR). Den resulterende høj affinitet form af LFA-1 formidler intracellulær aktivering til det ekstracellulære rum through interaktioner med ICAM-1. Denne vej kaldes inside-out signalering 7.. Ligeledes signalering via LFA-1 fra det ekstracellulære rum kaldes udefra-ind signalering.
Den intracellulære signalering kaskader involveret i inside-out og outside-in signalering er en stor fokus på aktuel forskning. Den lille GTPase RAP1 har for nylig vist sig som den centrale del af inside-out signalerer, at der er fælles for både TCR ligatur og cytokin signalering 8. Den kritiske rolle RAP1 i integrin aktivering er fremhævet af den opdagelse, at overekspression af RAP1 stimulerer integrin-afhængig adhæsion af T-celler, hvorimod T-celle adhæsion er blokeret ved ekspression af dominant negativ RAP1 9. Disse fremskridt i vores forståelse af integrin regulering af RAP1 er blevet gennemført ved hjælp af in vitro-værktøjer. Blandt dem er den statiske adhæsionsassay beskrevet her.
Det overordnede mål med denne metode er at studere Tcelle klæbeevne til ICAM-1-overtrukne overflader. Mere specifikt er det bruges til objektivt at måle og kvantificere LFA-1 affinitet mod sin counter ligander i levende celler på realtid, under forskellige forhold. Denne teknik bruger polystyrenbrønde overtrukket med ICAM-1 til at efterligne de cellulære overflader, som T-celler interagerer med. Mange tidligere beskrevne statiske T-celle adhæsionsassays var eksperimentelt kompleks. Disse assays ofte nødvendige for T-celler til at blive radioaktivt mærket, anvendes dyrkede bovine hornhindeceller at skabe en ekstracellulær matrix som substrat for T-celle-adhæsion eller krævet ikke-fysiologiske T-celle-stimulation over en længere varighed for at fremme T-celleadhæsion 10. Anvendelsen af fluorometrisk måling kvantificere T-celler efter vedhæftningen inkubation er en mere følsom og nøjagtig metode til kvantificering i forhold til flowcytometri og mikroskopi, som er brugt i mange andre assaysystemer 11. Derudover enkelt celle microscopic-analyse af integrin lokalisering ikke giver mulighed for den brede, befolkning baseret analyse på samme måde som den fluorometriske måling. Mens aktivering state-specifikke LFA-1-antistoffer er kommercielt tilgængelige, er disse antistoffer har lav følsomhed i forhold til fremgangsmåden beskrevet her. Den største fordel i forhold til andre teknikker, er dens enkelthed og mulighed for at undersøge flere eksperimentelle betingelser samtidig. Når man overvejer denne metode til en specifik anvendelse, bør man tage hensyn til, at T-celler skal være negativt valgt, frisk isolerede, og mærket med en fluorescerende markør.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Belægning mikropladebrøndene
Bemærk: Målet med dette trin er at belægge polystyrenoverflader med ICAM-1 til at tjene som ligander for T-celle-LFA-1.
- Forbered følgende løsninger:
- Forbered coatingopløsningen ved resuspendering rekombinant ICAM-1 med phosphatbufret saltvand (PBS)-opløsning (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2PO 4, pH 7,4) beriget med calcium (1 mM CaCl2) og magnesium (2 nM MgCl2). Kontroller, at den endelige koncentration af ICAM-1 er 10 ug / ml, fremstillet af en 0,7 mg / ml stamopløsning og opbevares i en -80 ° C fryser.
- Forbered vedhæftning opløsning ved at berige PBS med 0,5% human (eller bovint) serumalbumin (HSA / BSA), 2 mM MgCI2 og 1 mM CaCl2.
- Forbered vaskeopløsningen ved tilsætning af 2 mM MgCl2 og 1 mM CaCl2 til PBS. Varm alle løsninger til 37° C før brug.
- Vask 24 brønde med 50 ul vaskeopløsning. Dette vil omfatte uvaskede brønde, positive (PMA behandlede celler) og negative (ikke-coatede brønde) kontrol. For hver betingelse mindst tre brønde (tredobbelte).
- Der tilsættes 50 ul af coating-opløsning til hver brønd. Må ikke tilføje til de ubelagte kontrolhullerne. Der inkuberes i en time inden 37 ° C inkubator.
- Aspirer coatingopløsningen forsigtigt uden at spidsen at røre bunden af brøndene. Vask en gang med 50 ul vaskeopløsning.
- Der tilsættes 50 ul af vedhæftning opløsning og inkuberes mikropladen i en time inden 37 ° C inkubator.
- Aspirér forsigtigt og vask en gang med 50 ul vaskeopløsning. Brug pladen på samme dag, men det er muligt at holde det ved 4 ° C natten over, og bruge den følgende dag.
2.. T-celle Isolering fra Blood
- Tilføj human T-celle berigelse cocktail på 50 ul / ml of fuldblod (f.eks 3 ml antikoagulant (heparin, EDTA eller citrat) fuldblod, tilsættes 150 ul cocktail). Bland godt.
- Inkuber 20 min ved stuetemperatur.
- Til en 50 ml centrifugeglas tilsættes 3 ml behandlet blod og et lige volumen af PBS (uden calcium og magnesium) beriget med 1% D-glucose ved stuetemperatur. Bland forsigtigt med en Pasteur-pipette.
- Tilsættes 15 ml Ficoll-Paque PLUS til centrifugerør.
- Forsigtigt lag de 6 ml fortyndet blodprøve på lymfocyt isolation medium.
- Centrifugeres ved 400 xg i 20 minutter ved 20 ° C med brække.
- Tegn fra det øvre lag med en ren Pasteur-pipette, forlader lymfocyt lag uforstyrret ved grænsefladen. Det øvre lag af plasma kan gemmes til senere brug. Brug en ren Pasteur-pipette overføre lymfocyt lag til et rent centrifugerør.
- Tilsæt 3 volumener (9 ml) i PBS til lymfocytterne. Hæng cellerne ved forsigtigt drafløj dem ind og ud af en Pasteur-pipette.
- Centrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved 20 ° C.
- Supernatanten fjernes. De lymfocytter bør nu suspenderes i mediet hensigtsmæssigt at ansøgningen. Overfør celler til en T-75 dyrkningskolbe i 20 ml RPMI 1640-medium indeholdende 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin.
3.. Udarbejdelse af cellerne
Bemærk: En forudsætning er, at de celler, der skal mærkes med et fluorescerende reagens. I denne protokol anvender carboxy fluorescein succinimidyl ester (CFSE), men grønt fluorescerende protein (GFP)-udtrykkende celler er et acceptabelt alternativ.
- Tæl 2.4 x 10 6 T-celler (1 x 10 5 for hver brønd) under anvendelse af et hæmocytometer.
- Resuspender cellerne i kultur mangler serum (serumudsultning). Inkubér cellerne i 2 timer i 37 ° C inkubator.
- Centrifuger cellerne i 5 minutter (400 xg). Aspirere medierne ogresuspenderes i 1 ml PBS.
- Tilføj CFSE ved 1:1000 fortynding (lager lavet til 5 mm). Dæk mod lys og inkuberes i 8 minutter ved stuetemperatur.
- Reaktionen standses ved tilsætning af 10 ml 37 ° C PBS og spin ved 400 xg i 5 min.
- Re-suspendere cellepellet med 1,2 ml forvarmet vedhæftning opløsning (1 x 10 5 celler pr 50 ul).
4.. Stimulering af cellerne
Bemærk: For at kunne indlede vedhæftning skal cellerne stimuleres. I det følgende eksperiment celler stimuleres via TCR ved hjælp af anti-CD3 tværbindende antistoffer imidlertid opløseligt SDF-1 kunne anvendes som alternativ. Afhængig af målet af forsøgene, kunne forskellige farmakologiske reagenser tilsættes før eller under stimulation til at studere virkningen på cellulær vedhæftning. Phorbolmyristatacetat (PMA) er en phorbolester, der strukturelt ligner den anden messenger diacylglycerol (DAG), og derfor aktiverer flere kinases nedstrøms TCR (hovedsagelig protein kinase C); her er det anvendt som en positiv kontrol.
- Varm mikropladen til 37 ° C.
- Opdel celler i 8 tomme 1,5 ml rør (150 pi i hvert rør), et rør for hver betingelse.
- Forkæl cellerne i overensstemmelse hermed:
- Stimulere et rør med PMA 10 ng / ml for at tjene som positiv kontrol. Hold tre rør ubehandlet for at tjene som kontrol for stimulering ("ingen stimulation") uvaskede loading kontrol ("ingen vask") og kontrol af ICAM-1-belægning ("ikke-coatet").
- Stimulering fire rør med forskellige koncentrationer af anti-CD3-antistoffer (0,1, 1, 5 og 10 ug / ml). Fortsæt til det næste trin uden forsinkelser.
- Alikvote 50 ul stimuleret celle mix i hver tomme godt. Det endelige antal af celler per brønd er 1 x 10 5.
- Placer mikropladen i 37 ° C inkubator i 15 min.
Bemærk: Nogle T-cellelinjer kræver kortere stimula tion tid. I løbet af denne tid, vil cellerne sig ned til bunden af brøndene, og overholde de målligander.
5.. Vask Away Ikke-klæbende celler
Bemærk: Målet med dette trin er at fjerne celler, der ikke var i stand til at danne tætte kontakter med ligand-coatede overflader. Brug en multikanalpipette til dette trin for at sikre, at de samme fysiske kræfter påføres alle brøndene. Det er vigtigt at holde de angivne kontrolbrønde uvaskede at bistå ved beregning af procentdelen af adhærerende celler.
- Tilføj 150 pi varm vedhæftning løsning til hver enkelt brønde. Ryst pladen forsigtigt i nogle sekunder, før du fjerner mediet fra brøndene. Rør ikke bunden af brøndene med tips.
- Gentag dette trin tre gange. Ændre retningen af pipetten, når pipettering af buffer i og ud.
6.. Fastsættelse af klæbende celler
_content "> Bemærk: I dette trin anvendes en fluorescenspladelæser at måle fluorescensintensiteten i hver brønd Intensiteten er i direkte korrelation med antallet af adhærente celler..- Tænd pladelæser. Åbn pladelæseren software ved at klikke på genvejsikonet på skrivebordet.
- Fra "Task"-menuen skal du klikke på "Ny" for at oprette en ny protokol.
- Fra "Actions" menuen vælge "Læs" valgmulighed. Klik på "Fluorescent intensitet" og klik på "Ok" fanen.
- Fra drop down menuen vælger du "excitationsbølgelængden 485" og "Emission bølgelængde 528". Hit "Ok"-fanen.
- I "Optik" option menuen vælger du "Bottom" og klik på "Ok" fanen. Gå tilbage til "Actions" menuen og sæt temperaturen til 37 ° C og klik på "Ok".
- Sæt mikropladen i pladelæser ogklik på "Kør". Resultatet vil blive eksporteret til Excel regneark.
- Procentdelen af klæbende celler ved hjælp af følgende formel: Andel af adhærente celler = (gennemsnit fluorescerende intensitet læst i de vaskede brønde) / (gennemsnitlig fluorescensintensitet læse i uvaskede celler) x 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nedenfor er et eksempel på adhæsion assay under anvendelse af primære T-celler stimuleret med forskellige koncentrationer af anti-CD3-antistoffer. Det er nyttigt at kende fluorescensen af uvaskede celler (dvs. den samlede belastning). Stimulerede celler tjener som en negativ kontrol og PMA-behandlede celler er den positive kontrol for anti-CD3-antistoffer. Celler udpladet i ikke-overtrukne brønde tjener som en kontrol for ICAM-1. I et typisk eksperiment procentdelen af adhærerende PMA-behandlede celler er mellem 40% til 50%, mens andelen af ikke-stimulerede celler, er mellem 5% til 10%. En alternativ fremgangsmåde til at kvantificere celle klæbeevne er ved beregning fold stigning i fluorescerende intensitet i hver tilstand over det af ikke-stimulerede celler.
Tabel 1 viser fluorescensintensitet CFSE mærkede primære T-celler stimuleret med forskellige doser af opløselige anti-CD3-antistoffer og udpladet på ICAM-1-overtrukne brønde. Figur 1 viser repræsentative imalderen lignende eksperiment. Cellerne blev negativt udvalgt fra perifert blod. Efter serumudsultning i 2 timer blev 2,4 x 10 6 celler mærket med CFSE efterfulgt af stimulering med opløseligt anti-CD3-antistoffer i forskellige koncentrationer. Stimulerede celler blev udpladet i ICAM-1-overtrukne brønde og inkuberet i 15 minutter i mørke. Efter inkubation de ikke-adhærente celler blev vasket tre gange, og fluorescensintensiteten blev målt under anvendelse af en pladelæser ved 485 nm. PMA behandlede og-stimulerede celler blev anvendt som kontroller. Bemærk, at den første kolonne (1A-1C) indeholder celler, som ikke blev vasket (samlet belastning, fx 100%).
Figur 2 viser procentdelen af T-celle-adhæsion, som beregnes på basis af fluorescerende intensiteter angivet i tabel 1. For hver betingelse den gennemsnitlige intensitet af de tre brønde (tredobbelte) blev beregnet og omdannes til relative procentdel af totale celler loaded ( Ingen Wash Uncoated Ustimuleret PMA Anti-CD3 0,1 mg / ml Anti-CD3 1 ug / ml Anti-CD3 5 ug / ml Anti-CD3 10 ug / ml 1 2 3 4. 5. 6 7 8. A 89652 611 5219 45873 8964 20157 37972 37972 B 90248 320 6049 7568 25486 32549 32549 C 88321 409 5456 42697 8542 24568 32892 3289
Tabel 1. Fluorescensintensitet værdier CFSE mærkede primære T-celler stimuleret med forskellige koncentrationer af opløselige anti-CD3-antistoffer. De frisk høstede celler blev serumudsultet i to timer og derefter mærket med CFSE ved en koncentration på 5 uM. Dernæst blev cellerne stimuleret med en lav (0,1 mg / ml), medium (1 ug / ml), høj (5 ug / ml), og meget høj (10 ug / ml) koncentrationer af opløselige anti-CD3-antistoffer og 1 x 10 5-celler blev udpladet i hver brønd (præ-belagt med ICAM-1). Efter 15 minutter blev ikke-adhærente celler blev fjernet ved tre serielle vaske. Antallet af adhærente celler blev målt med en pladelæser som shown i denne tabel. Hul 1A-1C: uvaskede celler; 2A-2C: ubestrøget brønde; 3A-3C: stimulerede celler; 4A-4C: celler stimuleret med 10 ng / ml PMA; 5A-5C: celler stimuleret med lav dosis anti-CD3-antistoffer; 6A-6C: celler stimuleret med medium dosis af anti-CD3-antistoffer; 7A-7C: celler stimuleret med højdosis anti-CD3-antistoffer; 8A-8C: celler stimuleret med meget høj dosis anti-CD3-antistoffer. 
Figur 1. Billeder af primære T-celler stimuleret med forskellige koncentrationer af opløselige anti-CD3-antistoffer. Friskhøstede celler blev serum sultet i to timer og derefter mærket med CFSE ved en koncentration på 5 uM. Dernæst blev cellerne stimuleret med PMA (10 ng / ml) eller forskellige koncentrationer af anti-CD3-antistoffer (0,1, 1, 5 og 10 ug / ml) og udpladet påICAM-1-overtrukne overflader. Repræsentative billeder blev taget med Zeiss 700 konfokal mikroskopi hjælp 20X forstørrelse. Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 2. Stimulering af T-celler med høj dosis anti-CD3-antistoffer resulterer i forøget adhæsion. Afbildet repræsentation af procentdelen af T-celle-adhæsion som beregnet ud fra den vist i tabel 1.. Den gennemsnitlige procentdel af adhærente celler blev beregnet i forhold til uvaskede celler, udgør 100%. Histogrammer præsentere resultaterne (betyder ± SEM) på mindst 3 brønde. venligst Click her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er flere assays for at studere signaler til LFA-1-aktivering og T-celle-adhæsion 12. Flowcytometri anvendes til at måle LFA-1 affinity stater i levende celler under anvendelse af monoklonale antistoffer, der binder selektivt til enten bøjet eller forlænges LFA-1. En af begrænsningerne ved denne metode er, at den ikke tager hensyn til de integriner 'aviditet. Migration assays er nyttige redskaber, men de måler migration, og ikke sølle vedhæftning på et bestemt tidspunkt. Musemodeller at studere T-lymfocyt-migration (f.eks kutan overfølsomhed model) er fysiologisk relevant, men udnyttelsen af disse modeller er multifaktoriel og kompliceret at udføre. Den største styrke af det statiske adhæsionsassay beskrevet her er dens evne til at måle både aviditet og affinitet på en enkel måde. En anden fordel ved denne fremgangsmåde er dens evne til at påvise et lille antal celler, hurtigt og præcist. Når man sammenligner med andre metoder, er det meget lettere at ManipUlate cellerne og behandle dem med forskellige reagenser i et funktionelt assay, som det vi beskrive. Endvidere er de adhærente celler tælles objektivt med en pladelæser, eliminering skævhed forbundet med manuelle tæller. Denne metode kan anvendes til at screene virkningen af flere lægemidler eller gener manipulation på adhæsionsprocessen.
Men denne teknik er ikke fri for begrænsninger. En potentiel svaghed er, at procentdelen af adhærerende celler er et relativt tal, som kan variere fra et eksperiment til en anden. En anden svaghed er, at blast lymfocytter ikke kan anvendes, da disse skal være frisk isoleret. Desuden vedhæftning undersøgelser med celler udvundet fra frosne perifere mononukleære blodceller er ikke sammenhængende. Det er vigtigt at nævne, at PMA bør arbejde konsekvent, og vi anbefaler at bruge det i hvert forsøg. En positiv og en negativ kontrol er de første skridt i fejlfinding mislykkede eksperimenter. I tilfælde af manglendeaugmented adhæsion i stimulerede celler, bør koncentrationen af målliganden dækker brøndene kontrolleres. Desuden er det nødvendigt at kontrollere, at mere end 95% af cellerne er levedygtige, og i tilfælde af en cellelinie bør vækstfasen beregnes. I tilfælde af væsentlig variabilitet i den samme tilstand, anbefales det, at bruge mere end tre identiske brønde (mere end tre eksemplarer).
For at forstå denne analyse er det nyttigt at forstå, at nogle trin i protokollen, såsom inkubationstiden og antallet af seedede celler skal være ensartet blandt alle forhold. Små forskelle i inkubationstiden kan resultere er unøjagtige målinger. Det er også vigtigt at prøve præcis det samme antal celler er hver brønd. Fremtidige anvendelser af denne teknik, ville forbedre sin nøjagtighed være en automatiseret version, der ville indlæse cellerne og udføre vasker på en mere objektiv måde. Desuden vil en automatiseret udgave sætte osat udføre store skærme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Hirschil Trust, Michael Saperstein Medical Scholars forskningsmidler og NYU Whitehead fællesskab støttet dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate reader | BioTek | Synergy H1 Hybrid | |
| Multichannel pipette | Fisher | 21-377-829 | |
| 96-well microplate with optical bottom | Corning Costar | 3603 | |
| Recombinant ICAM-1 | R&D Systems | ADP4-050 | |
| Anti-CD3 antibodies | Ancell | 144-020 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| CFSE | Molecular Probes | C1157 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| DPBS containing calcium and magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Peripheral lymphocytes | e.g. mouse or human | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | |
| Open Gen 5 software | BioTek | Version 2.01 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| 15 and 50 ml centrifuge tubes | Fisher | 352099, 352070 | |
| Disposable plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| T-75 culture flasks | Fisher | 50-754-1366 | |
| RosetteSep T cell enricment kit | StemCell Technologies | 15061 |
References
- Dustin, M. L., et al. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., et al. GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., et al. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
- Dustin, M. L. Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses. Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).
- Springer, T. A., Dustin, M. L. Integrin inside-out signaling and the immunological synapse. Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).
- Mor, A., et al. D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane. Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).
- Bivona, T. G., et al. Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion. J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Bhattacharyya, S. P., et al. Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells. Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).
- Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
