Summary
स्टेटिक आसंजन परख टी lymphocytes और अन्य प्रकार की कोशिकाओं के बीच बातचीत मॉडल का उपयोग किया जा सकता है कि एक शक्तिशाली उपकरण है. बातचीत एक प्लेट रीडर धारावाहिक washes निम्नलिखित पक्षपाती कोशिकाओं की संख्या यों के लिए प्रयोग किया जाता है, जबकि आसंजन अणुओं के साथ लेपित कुओं में लेबल टी कोशिकाओं को इंजेक्शन लगाने के द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं.
Abstract
टी लिम्फोसाइट आसंजन सूजन और प्रतिजन कोशिकाओं के साथ प्रतिरक्षाविज्ञानी synapses के गठन की साइटों के लिए माइग्रेशन सहित कई टी सेल कार्यों के लिए आवश्यक है. टी कोशिकाओं integrins, साथी कोशिकाओं या बाह्य मैट्रिक्स पर लक्ष्य अणुओं के साथ बातचीत कि transmembrane प्रोटीन की heterodimeric जोड़े से मिलकर सेल आसंजन अणुओं के एक वर्ग के चिपकने वाली संपत्तियों को नियंत्रित द्वारा विनियमित आसंजन पूरा. सबसे प्रमुख टी सेल integrin जिसका लक्ष्य intracellular आसंजन अणु (ICAM) -1 है सब यूनिटों αL और β2, से बना, लिम्फोसाइट समारोह जुड़े प्रतिजन (LFA) -1 है. आसंजन नियंत्रित करने के लिए एक टी सेल की क्षमता व्यक्ति integrins की आत्मीयता राज्यों को विनियमित करने की क्षमता से निकला है. अंदर बाहर संकेतन एक कोशिका के अंदर संकेतों integrins की बाह्य डोमेन एक सक्रिय राज्य ग्रहण करने के लिए प्रेरित जिससे प्रक्रिया का वर्णन करता है. इन जटिल घटना के हमारे ज्ञान के बहुत यंत्रवत पर आधारित हैपढ़ाई के लिए इन विट्रो मॉडल प्रणाली में सरलीकृत में प्रदर्शन किया. यहाँ वर्णित टी लिम्फोसाइट आसंजन परख टी कोशिकाओं स्थिर शर्तों के तहत, अणु लक्ष्य का पालन करने की अनुमति देता है, और फिर चिपचिपाहट यों को एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर का उपयोग एक उत्कृष्ट उपकरण है. यह परख लिम्फोसाइटों पर कार्रवाई कि आसंजन-उत्तेजक या निरोधात्मक पदार्थों को परिभाषित है, साथ ही इसमें शामिल संकेत घटनाओं निस्र्पक में उपयोगी हो गया है. LFA-1 के लिए यहाँ वर्णित है - 1-ICAM मध्यस्थता आसंजन; इस परख आसानी से अन्य चिपकने वाला बातचीत (- फ़ाइब्रोनेक्टिन जैसे VLA-4) के अध्ययन के लिए अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया जा सकता.
Introduction
टी लिम्फोसाइट आसंजन प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 1 में एक मौलिक प्रक्रिया है. यह स्कैनिंग प्रतिजन कोशिकाओं लक्ष्य 2 के साथ लिम्फ नोड्स के भीतर कोशिकाओं (एपीसी) पेश, और प्रतिरक्षाविज्ञानी synapses के गठन के लिए (है) के लिए, endothelial कोशिकाओं केशिका दीवारों को सजाने के साथ टी सेल बातचीत के लिए आवश्यक है. इन जरूरतों को कार्यात्मक और kinetically अलग कर रहे हैं. लिम्फोसाइटों परिस्त्राव की प्रक्रिया chemoattraction, रोलिंग, फर्म आसंजन, और स्थानांतरगमन के होते हैं. आसंजन दृढ़ करने के लिए रोलिंग से संक्रमण तेजी से एक जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर संकेत पर प्रतिक्रिया के लिए टी कोशिकाओं की आवश्यकता है. यह प्रतिक्रिया रोलिंग सेल 3 धीमा कर देती है और गिरफ्तारियां कि एक integrin ligand बातचीत पैदावार. Integrin उत्सुकता में एक तत्काल परिवर्तन इस प्रक्रिया मध्यस्थता करता है. माइग्रेशन 'सामने अंत' पर adhesions के गठन और 'रियर अंत' पर adhesions का टूटना साथ गतिशील बातचीत betweenTcells और endothelial कोशिकाओं की आवश्यकताबनाने और 4 तोड़ने के बीच के बारे में एक मिनट के अंतराल के साथ. IS inminutes रूपों, लेकिन 6 घंटे के लिए बरकरार रहने की जरूरत है.
दिलचस्प है, एक आसंजन अणु, Integrin परिवार के सदस्य लिम्फोसाइट समारोह जुड़े प्रतिजन (LFA) - 1, इन सभी प्रक्रियाओं 5 के लिए आवश्यक है. LFA-1 immunoglobulin superfamily के कई सदस्यों के साथ बातचीत के माध्यम से आसंजन मध्यस्थता करता है. LFA-1 को उच्चतम आत्मीयता के साथ सबसे बड़े पैमाने पर अध्ययन ligand कहनेवाला आसंजन अणु (ICAM) है -1. गैर सक्रिय परिसंचारी लिम्फोसाइटों इसलिए कोशिका की सतह पर LFA-1, और ICAM-1 में लिपटे सतहों का पालन करने में असमर्थ हैं कम आत्मीयता व्यक्त करते हैं. LFA-1 आत्मीयता चर और इस तरह जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर सक्रियण, साइटोकाइन उत्तेजना, और टी सेल रिसेप्टर्स (TCR) द्वारा मध्यस्थता संकेतों के रूप में कई संकेत घटनाओं द्वारा विनियमित है. LFA-1 बाह्य अंतरिक्ष के लिए intracellular सक्रियण बता देते हैं जिसके परिणामस्वरूप उच्च आत्मीयता प्रपत्र टीICAM-1 के साथ hrough बातचीत. इस मार्ग में 7 संकेत अंदर बाहर करार दिया है. इसी तरह, बाह्य अंतरिक्ष से LFA-1 के माध्यम से संकेत बाहर में संकेत कहा जाता है.
अंदर बाहर में और संकेतन बाहर में शामिल Cascades संकेत intracellular वर्तमान शोध का एक प्रमुख ध्यान केंद्रित कर रहे हैं. छोटे GTPase Rap1 कि हाल ही में TCR बंधाव और 8 संकेत साइटोकाइन दोनों के लिए आम है संकेत के अंदर से बाहर की प्रमुख घटक के रूप में उभरा है. टी सेल आसंजन प्रमुख नकारात्मक Rap1 9 की अभिव्यक्ति से बंद है जबकि integrin सक्रियण में Rap1 की महत्वपूर्ण भूमिका है, Rap1 की overexpression टी कोशिकाओं की integrin निर्भर आसंजन को उत्तेजित करता है कि खोज से प्रकाश डाला है. Rap1 द्वारा integrin विनियमन की हमारी समझ में इन अग्रिमों विट्रो उपकरण में उपयोग कर पूरा किया गया है. उनमें से यहाँ वर्णित स्थिर आसंजन परख है.
इस विधि के समग्र लक्ष्य टी अध्ययन करने के लिए हैICAM-1 में लिपटे सतहों को सेल चिपचिपाहट. अधिक विशेष रूप से, यह निष्पक्ष मापने के लिए और अलग अलग परिस्थितियों में, वास्तविक समय में जीवित कोशिकाओं में अपने काउंटर ligands की ओर LFA-1 आत्मीयता यों के लिए प्रयोग किया जाता है. इस तकनीक टी कोशिकाओं के साथ बातचीत कि सेलुलर सतहों की नकल करने ICAM-1 के साथ लेपित polystyrene कुओं का उपयोग करता है. कई पहले से वर्णित स्थिर टी सेल आसंजन assays प्रयोगात्मक जटिल थे. अक्सर टी कोशिकाओं के लिए आवश्यक इन assays radioactively, लेबल टी सेल आसंजन के लिए सब्सट्रेट के रूप में एक बाह्य मैट्रिक्स बनाने के लिए सुसंस्कृत गोजातीय कार्निया कोशिकाओं का उपयोग किया, या टी सेल आसंजन 10 को बढ़ावा देने के लिए एक विस्तारित अवधि के दौरान गैर शारीरिक टी सेल उत्तेजना के लिए बुलाया जाएगा. कई अन्य परख सिस्टम 11 में उपयोग किया जाता है, के रूप में cytometry और माइक्रोस्कोपी प्रवाह की तुलना में आसंजन ऊष्मायन के बाद टी कोशिकाओं यों तो fluorometric माप का उपयोग मात्रा का ठहराव का एक और अधिक संवेदनशील और सही तरीका है. इसके अतिरिक्त, एकल कोशिका microscopintegrin स्थानीयकरण के आईसी विश्लेषण fluorometric माप के रूप में उसी तरह से व्यापक, जनसंख्या आधारित विश्लेषण के लिए अनुमति नहीं है. सक्रियण राज्य विशेष LFA-1 एंटीबॉडी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हो रहे हैं, इन एंटीबॉडी यहाँ उल्लिखित विधि के सापेक्ष कम संवेदनशीलता प्रदान करते हैं. वैकल्पिक तकनीकों पर मुख्य लाभ अपनी सादगी और एक साथ कई प्रयोगात्मक शर्तों की जांच करने की क्षमता है. एक विशिष्ट अनुप्रयोग के लिए इस पद्धति पर विचार कर, एक टी कोशिकाओं नकारात्मक चयनित हौसले से अलग, और एक फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ लेबल किया जाना चाहिए कि ध्यान में रखना चाहिए.
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Protocol
1. Microplate वेल्स कोटिंग
नोट: इस कदम का लक्ष्य टी सेल LFA-1 के लिए ligands के रूप में सेवा करने के लिए ICAM-1 के साथ कोट polystyrene सतहों के लिए है.
- निम्नलिखित समाधान तैयार:
- Resuspending द्वारा कोटिंग समाधान तैयार पुनः संयोजक ICAM-1 कैल्शियम (1 मिमी से समृद्ध फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) समाधान (137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 10 मिमी ना 2 4 HPO, 2 मिमी के.एच. 2 पीओ 4, 7.4 पीएच) के साथ CaCl 2) और मैग्नीशियम (2 एनएम 2 MgCl). ICAM-1 के अंतिम एकाग्रता एक 0.7 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान से बना है और एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखा 10 माइक्रोग्राम / एमएल, सुनिश्चित करें कि.
- 0.5% मानव (या गोजातीय) सीरम albumin (HSA / बीएसए), 2 मिमी 2 MgCl, और 1 मिमी 2 CaCl साथ पीबीएस समृद्ध आसंजन समाधान तैयार करें.
- पीबीएस के लिए 2 मिमी 2 MgCl और 1 मिमी 2 CaCl जोड़कर धोने समाधान तैयार करें. 37 करने के लिए सभी समाधान गर्मउपयोग से पहले सी °.
- धोने के समाधान के 50 μl के साथ 24 कुओं धो लें. यह गंदा कुओं, सकारात्मक (पीएमए इलाज कोशिकाओं), और नकारात्मक (uncoated कुओं) नियंत्रण शामिल होंगे. हर हालत में कम से कम तीन कुओं (तीन प्रतियों) सेट के लिए.
- प्रत्येक अच्छी तरह से कोटिंग समाधान के 50 μl जोड़ें. Uncoated नियंत्रण वेल्स को न जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर अंदर एक घंटे के लिए सेते हैं.
- टिप कुओं के नीचे स्पर्श करने की अनुमति के बिना, धीरे कोटिंग समाधान aspirate. धोने के समाधान के 50 μl के साथ एक बार धोएं.
- आसंजन समाधान के 50 μl जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर अंदर एक घंटा के लिए microplate सेते हैं.
- महाप्राण धीरे और 50 μl धोने के समाधान के साथ एक बार धोने. हालांकि यह रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए यह संभव है, उसी दिन प्लेट का उपयोग करें, और अगले दिन यह प्रयोग करें.
रक्त से 2. टी सेल अलगाव
- 50 μl / एमएल ओ पर मानव टी सेल संवर्धन कॉकटेल जोड़ेंच पूरे रक्त (थक्कारोधी के 3 मिलीलीटर (हेपरिन, EDTA, या साइट्रेट) पूरे रक्त, के लिए जैसे कॉकटेल के 150 μl जोड़ने). अच्छी तरह से मिलाएं.
- कमरे के तापमान पर 20 मिनट सेते हैं.
- एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब 3 इलाज रक्त की मिलीलीटर और कमरे के तापमान पर 1% डी ग्लूकोज के साथ समृद्ध (कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना) पीबीएस के एक बराबर मात्रा में जोड़ें. पाश्चर विंदुक के साथ धीरे मिलाएं.
- अपकेंद्रित्र ट्यूब में 15 मिलीलीटर Ficoll Paque प्लस जोड़ें.
- ध्यान लिम्फोसाइट अलगाव माध्यम पर खून का नमूना पतला 6 मिलीग्राम परत.
- ब्रेक के बंद के साथ 20 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र.
- इंटरफेस में अबाधित लिम्फोसाइट परत छोड़, एक साफ पाश्चर पिपेट का उपयोग ऊपरी परत बंद ड्रा. प्लाज्मा की ऊपरी परत बाद में उपयोग के लिए बचाया जा सकता है. एक स्वच्छ पाश्चर पिपेट एक स्वच्छ अपकेंद्रित्र ट्यूब लिम्फोसाइट परत हस्तांतरण का उपयोग करना.
- लिम्फोसाइटों पीबीएस के 3 खंडों (9 मिलीलीटर) जोड़ें. धीरे से कोशिकाओं को निलंबित नाटकीयविंग उन में और एक पाश्चर विंदुक के बाहर.
- 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र
- सतह पर तैरनेवाला निकालें. लिम्फोसाइटों अब आवेदन करने के लिए मध्यम उपयुक्त में निलंबित कर दिया जाना चाहिए. 20 मिलीलीटर में एक टी -75 संस्कृति फ्लास्क कोशिकाओं स्थानांतरण 10% FBS, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त RPMI 1640 मीडिया.
कोशिकाओं के 3. तैयारी
नोट: कोशिकाओं को एक फ्लोरोसेंट अभिकर्मक के साथ लेबल किया जा के लिए एक शर्त है. इस प्रोटोकॉल में व्यक्त कोशिकाओं एक स्वीकार्य विकल्प हैं carboxy fluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE), हालांकि हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) का उपयोग करें.
- एक hemocytometer का उपयोग 2.4 x 10 6 टी कोशिकाओं (प्रत्येक के लिए अच्छी तरह 1 एक्स 10 5) गणना.
- सीरम (सीरम भुखमरी) की कमी संस्कृति मीडिया में कोशिकाओं Resuspend. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 2 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
- 5 मिनट (400 XG) के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. मीडिया और Aspirate1 मिलीलीटर पीबीएस में resuspend.
- 1:1,000 कमजोर पड़ने (5 मिमी के लिए किए गए शेयर) पर CFSE जोड़ें. प्रकाश से कवर और कमरे के तापमान पर 8 मिनट के लिए सेते हैं.
- 37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो और 5 मिनट के लिए 400 XG पर स्पिन.
- पूर्व गर्म आसंजन समाधान (50 μl प्रति 1 x 10 5 कोशिकाओं) के 1.2 मिलीलीटर के साथ सेल गोली फिर से निलंबित.
प्रकोष्ठों के 4. उत्तेजना
नोट: आसंजन आरंभ करने के लिए, कोशिकाओं को प्रेरित किया जाना चाहिए. निम्न प्रयोग में कोशिकाओं विरोधी CD3 crosslinking एंटीबॉडी का उपयोग TCR के माध्यम से प्रेरित कर रहे हैं, हालांकि घुलनशील एसडीएफ -1 एक विकल्प के रूप में सेवा कर सके. प्रयोगों के लक्ष्य पर निर्भर करता है, विभिन्न औषधीय अभिकर्मकों सेलुलर आसंजन पर प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उत्तेजना से पहले या दौरान जोड़ा जा सकता है. Phorbol myristate एसीटेट (पीएमए) दूसरा दूत diacyl ग्लिसरॉल (डेग) के लिए संरचनात्मक रूप से समान है और इसलिए कई kinase सक्रिय हो जाता है कि एक phorbol एस्टर हैनीचे की ओर TCR (मुख्य रूप से प्रोटीन kinase सी) है; यहाँ यह एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है.
- 37 डिग्री सेल्सियस के microplate गर्म
- 8 खाली 1.5 मिलीलीटर ट्यूब (प्रत्येक ट्यूब में 150 μl), हर हालत के लिए एक ट्यूब में कोशिकाओं के विभाजन.
- तदनुसार कोशिकाओं का इलाज:
- के रूप में सकारात्मक नियंत्रण की सेवा के लिए 10 एनजी / एमएल में पीएमए के साथ एक ट्यूब उत्तेजित. उत्तेजना के लिए नियंत्रण ("कोई उत्तेजना"), मैला लोडिंग नियंत्रण ("कोई धोने"), और ICAM-1 कोटिंग के लिए नियंत्रण ("uncoated") के रूप में सेवा करने के लिए, अनुपचारित तीन ट्यूबों रखें.
- विरोधी CD3 एंटीबॉडी के विभिन्न सांद्रता (0.1, 1, 5, और 10 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ चार ट्यूब उत्तेजित. देरी के बिना अगले कदम के लिए आगे बढ़ें.
- अच्छी तरह से प्रत्येक खाली में प्रेरित सेल मिश्रण की विभाज्य 50 μl. अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं की अंतिम संख्या 1 एक्स 10 5 है.
- 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में microplate रखें.
नोट: कुछ टी सेल लाइनों कम stimula की आवश्यकता tion के समय. इस समय के दौरान, कोशिकाओं कुओं के नीचे का आदी हो जाएगा और लक्ष्य ligands का पालन करें.
5. दूर धोने गैर पक्षपाती कोशिकाओं
नोट: इस कदम का लक्ष्य ligand में लिपटे सतहों के साथ तंग संपर्क बनाने में सक्षम नहीं थे कि कोशिकाओं को दूर करने के लिए है. एक ही भौतिक बलों सभी कुओं के लिए लागू किया जाता है यह सुनिश्चित करने के लिए इस कदम के लिए एक multichannel विंदुक का प्रयोग करें. यह पक्षपाती कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना करने में सहायता करने के लिए मैला संकेत नियंत्रण कुओं रखने के लिए महत्वपूर्ण है.
- प्रत्येक वेल्स को गर्म आसंजन समाधान के 150 μl जोड़ें. कुओं से मध्यम हटाने से पहले कुछ सेकंड के लिए धीरे थाली हिलाएँ. सुझावों के साथ कुओं के नीचे मत छुओ.
- इस चरण में तीन बार दोहराएँ. बफर में और बाहर pipetting जब पिपेट की दिशा बदलते हैं.
6. पक्षपाती कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित
_content "> नोट: इस चरण में एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर प्रत्येक अच्छी तरह से भीतर फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है तीव्रता पक्षपाती कोशिकाओं की संख्या के साथ सीधा संबंध है..- प्लेट रीडर ऑन करें. डेस्कटॉप पर शॉर्टकट आइकन पर क्लिक करके प्लेट रीडर सॉफ्टवेयर खोलें.
- "काम" मेनू से एक नया प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए "नया" पर क्लिक करें.
- "क्रियाएं" मेनू से "पढ़ें" विकल्प चुनें. "फ्लोरोसेंट तीव्रता" पर क्लिक करें और "ठीक" टैब मारा.
- ड्रॉप डाउन मेनू से "उत्तेजना तरंगदैर्ध्य 485" और "उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य 528" का चयन करें. "ठीक है" टैब मारा.
- "ऑप्टिक" विकल्प मेनू में "नीचे" का चयन करें और "ठीक" टैब मारा. वापस "क्रियाएं" मेनू पर जाएँ और 37 डिग्री सेल्सियस तक तापमान सेट और "ठीक" पर क्लिक करें.
- प्लेट रीडर में microplate डालें और"भागो" पर क्लिक करें. परिणाम एक्सेल स्प्रेडशीट में निर्यात किया जाएगा.
- निम्न सूत्र का उपयोग पक्षपाती कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना: पक्षपाती कोशिकाओं का प्रतिशत = (धोया कुओं में पढ़ा औसत फ्लोरोसेंट तीव्रता) / (मैला कोशिकाओं में पढ़ा औसत फ्लोरोसेंट तीव्रता) 100% एक्स.
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Representative Results
नीचे विरोधी CD3 एंटीबॉडी के विभिन्न सांद्रता के साथ प्रेरित प्राथमिक टी कोशिकाओं का उपयोग आसंजन परख का एक उदाहरण है. यह गंदा कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति (यानी कुल लदान) पता करने के लिए उपयोगी है. Unstimulated कोशिकाओं को एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा और पीएमए इलाज कोशिकाओं विरोधी CD3 एंटीबॉडी के लिए सकारात्मक नियंत्रण कर रहे हैं. Uncoated कुओं में मढ़वाया कोशिकाओं ICAM-1 के लिए एक नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं. Unstimulated कोशिकाओं का प्रतिशत% से 10% के बीच 5 है, जबकि एक ठेठ प्रयोग में पक्षपाती पीएमए इलाज कोशिकाओं का प्रतिशत 50% तक 40% के बीच है. सेलुलर चिपचिपाहट यों के लिए एक वैकल्पिक तरीका unstimulated कोशिकाओं के उस पर हर हालत में फ्लोरोसेंट तीव्रता की गणना गुना वृद्धि कर रहा है.
तालिका 1 CFSE की प्रतिदीप्ति तीव्रता प्राथमिक टी कोशिकाओं घुलनशील विरोधी CD3 एंटीबॉडी के विभिन्न खुराक के साथ प्रेरित और ICAM-1 लेपित कुओं पर चढ़ाया लेबल से पता चलता है. चित्रा 1 प्रतिनिधि Im पता चलता हैसमान प्रयोग की उम्र. कोशिकाओं नकारात्मक परिधीय रक्त से चयन किया गया था. 2 घंटे के लिए सीरम भुखमरी के बाद, 2.4 x 10 6 कोशिकाओं विभिन्न सांद्रता में घुलनशील विरोधी CD3 एंटीबॉडी के साथ उत्तेजना के द्वारा पीछा CFSE के साथ लेबल रहे थे. उत्तेजित कोशिकाओं ICAM-1 लेपित कुओं में चढ़ाया और अंधेरे में 15 मिनट के लिए incubated रहे थे. ऊष्मायन के बाद गैर पक्षपाती कोशिकाओं में तीन बार बाहर धोया गया और प्रतिदीप्ति तीव्रता 485 एनएम पर एक प्लेट रीडर का उपयोग कर मापा गया था. पीएमए इलाज और unstimulated कोशिकाओं नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया. पहले कॉलम (1 ए -1 सी) धोया नहीं गया कि कोशिकाओं (कुल लोड हो रहा है, उदाहरण के लिए 100%) शामिल हैं नोट.
चित्रा 2 तालिका 1 में सूचना दी फ्लोरोसेंट तीव्रता के आधार पर गणना के रूप में टी सेल आसंजन के प्रतिशत को दर्शाता है. (भरी हुई कुल कोशिकाओं के बाहर हर हालत के लिए तीन कुओं (तीन प्रतियों) की औसत तीव्रता की गणना की गई और रिश्तेदार प्रतिशत में तब्दील नहीं धो Uncoated Unstimulated पीएमए विरोधी CD3 0.1 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर विरोधी CD3 1 ग्राम / मिलीलीटर विरोधी CD3 5 ग्राम / मिलीलीटर विरोधी CD3 10 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर 1 2 3 4 5 6 7 8 एक 89,652 611 5219 45,873 8964 20157 37,972 37,972 बी 90248 320 6049 7568 25,486 32,549 32,549 सी 88,321 409 5456 42,697 8542 24,568 32,892 3289
CFSE की तालिका 1. प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों घुलनशील विरोधी CD3 एंटीबॉडी के अलग सांद्रता के साथ प्रेरित प्राथमिक टी कोशिकाओं लेबल. हौसले से काटा कोशिकाओं सीरम दो घंटे के लिए भूखे हैं और बाद में 5 माइक्रोन की एकाग्रता पर CFSE के साथ लेबल रहे थे. अगला, कोशिकाओं एक कम (0.1 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ प्रेरित किया गया, मध्यम (1 ग्राम / एमएल), उच्च (5 ग्राम / एमएल), और बहुत अधिक (10 माइक्रोग्राम / एमएल) घुलनशील विरोधी CD3 एंटीबॉडी की सांद्रता और 1 x 10 5 कोशिकाओं (ICAM-1 के साथ पूर्व में लिपटे) प्रत्येक कुएं में चढ़ाया गया. 15 मिनट के बाद गैर पक्षपाती कोशिकाओं तीन धारावाहिक washes के द्वारा हटा दिया गया. पक्षपाती कोशिकाओं की संख्या के रूप में एक थाली पाठक के साथ मापा गया थाइस तालिका में hown. वेल्स 1 ए -1 सी: मैला कोशिकाओं; 2A -2 सी: uncoated कुओं; 3 ए -3 सी: unstimulated कोशिकाओं; 4A-4C: 10 एनजी / एमएल पीएमए के साथ प्रेरित कोशिकाओं; 5A-5C: कम खुराक विरोधी CD3 एंटीबॉडी के साथ प्रेरित कोशिकाओं; 6A-6C: विरोधी CD3 एंटीबॉडी के मध्यम खुराक के साथ प्रेरित कोशिकाओं; 7A-7C: उच्च खुराक विरोधी CD3 एंटीबॉडी के साथ प्रेरित कोशिकाओं; 8A-8C: बहुत उच्च खुराक विरोधी CD3 एंटीबॉडी के साथ प्रेरित कोशिकाओं. 
चित्रा 1. घुलनशील विरोधी CD3 एंटीबॉडी के अलग सांद्रता के साथ प्रेरित प्राथमिक टी कोशिकाओं की छवियाँ. सीरम हौसले से काटा कोशिकाओं दो घंटे के लिए भूखे हैं और बाद में 5 माइक्रोन की एकाग्रता पर CFSE के साथ लेबल रहे थे. अगला, कोशिकाओं पीएमए (10 एनजी / एमएल) या विरोधी CD3 एंटीबॉडी के विभिन्न सांद्रता (0.1, 1, 5, और 10 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ प्रेरित और पर चढ़ाया गयाICAM-1 सतहों लेपित. प्रतिनिधि छवियाँ 20X आवर्धन का उपयोग Zeiss 700 confocal माइक्रोस्कोपी के साथ ले जाया गया. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें. 
चित्रा 2. वृद्धि हुई आसंजन में उच्च खुराक विरोधी CD3 एंटीबॉडी परिणामों के साथ टी कोशिकाओं की उत्तेजना कोशिकाओं मैला करने के लिए तालिका 1 में दिखाया गया है. पक्षपाती कोशिकाओं का औसत प्रतिशत की गणना की गई रिश्तेदार से गणना के रूप में टी सेल आसंजन का प्रतिशत की. रेखांकन प्रतिनिधित्व कि 100% का प्रतिनिधित्व करते हैं. histograms कम से कम 3 कुओं का परिणाम (± SEM) का अर्थ है वर्तमान. CLIC करेंइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कश्मीर.
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Discussion
LFA-1 सक्रियण और टी सेल आसंजन से 12 संकेतों का अध्ययन करने के लिए कई assays कर रहे हैं. प्रवाह cytometry मुड़ा हुआ या LFA-1 बढ़ाया या तो चुनिंदा कि बाँध मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग जीवित कोशिकाओं में LFA-1 आत्मीयता राज्यों को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस विधि की सीमाओं में से एक यह खाते में integrins 'उत्सुकता नहीं ले करता है. प्रवास assays उपयोगी उपकरण हैं, लेकिन वे एक विशिष्ट समय बिंदु पर छोटा आसंजन नहीं प्रवास को मापने, और. टी लिम्फोसाइट प्रवास (जैसे त्वचीय अतिसंवेदनशीलता मॉडल) का अध्ययन करने के लिए माउस मॉडल हालांकि इन मॉडलों का उपयोग multifactorial और निष्पादित करने के लिए जटिल है, physiologically प्रासंगिक हैं. यहाँ वर्णित स्थिर आसंजन परख की मुख्य ताकत एक सरल तरीके से उत्सुकता और आत्मीयता दोनों उपाय करने की क्षमता है. इस पद्धति का एक और लाभ यह है कि जल्दी और सही कोशिकाओं की एक छोटी संख्या का पता लगाने की क्षमता है. अन्य तरीकों की तुलना में, यह Manip बहुत आसान हैulate कोशिकाओं और हम का वर्णन एक के रूप में एक कार्यात्मक परख में विभिन्न अभिकर्मकों के साथ उन्हें इलाज. इसके अलावा, पक्षपाती कोशिकाओं का मार्गदर्शन की गिनती के साथ जुड़े एक प्लेट रीडर, उन्मूलन पूर्वाग्रह के साथ निष्पक्ष गिने जाते हैं. इस विधि आसंजन प्रक्रिया पर कई दवाओं या जीन में गड़बड़ी की प्रभाव स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
हालांकि इस तकनीक सीमाओं से मुक्त नहीं है. एक संभावित कमजोरी पक्षपाती कोशिकाओं का प्रतिशत एक प्रयोग से दूसरे से भिन्न हो सकते हैं जो एक रिश्तेदार संख्या, तथ्य यह है कि है. एक और कमजोरी इन हौसले से अलग किया जाना चाहिए के रूप में विस्फोट लिम्फोसाइटों, नहीं किया जा सकता कि इस तथ्य है. इसके अलावा, जमे हुए परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं से बरामद कोशिकाओं के साथ आसंजन पढ़ाई अनुरूप नहीं हैं. यह पीएमए लगातार काम करना चाहिए कि उल्लेख करना महत्वपूर्ण है, और हम हर प्रयोग में इसका उपयोग करने की सलाह देते हैं. एक सकारात्मक और एक नकारात्मक नियंत्रण असफल प्रयोगों का निवारण करने में पहला कदम है. की कमी के मामले मेंउत्तेजित कोशिकाओं में आसंजन संवर्धित, कुओं को कवर लक्ष्य ligand की एकाग्रता जाँच की जानी चाहिए. इसके अलावा यह कोशिकाओं के 95% से अधिक व्यवहार्य हैं, और एक सेल लाइन के मामले में, उनके विकास के चरण में गणना की जानी चाहिए कि मान्य करने के लिए आवश्यक है. एक ही हालत में महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता के मामले में, यह (तीन प्रतियों से अधिक) से अधिक तीन समान कुओं का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है.
इस परख की सराहना करने के क्रम में यह इस तरह के ऊष्मायन समय और वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या के रूप में प्रोटोकॉल में कुछ कदम सभी शर्तों में एक समान होना चाहिए कि समझने के लिए उपयोगी है. ऊष्मायन समय में छोटे मतभेदों गलत माप है परिणाम हो सकता है. यह वास्तव में कोशिकाओं का एक ही नंबर हर अच्छी तरह से है भी विभाज्य के लिए महत्वपूर्ण है. इस तकनीक का भविष्य अनुप्रयोगों, अपनी सटीकता में सुधार की कोशिकाओं को लोड और एक अधिक उद्देश्य ढंग से washes के प्रदर्शन होगा कि एक स्वचालित संस्करण होगा. इसके अलावा, एक स्वचालित संस्करण सक्षम हो जाएगाबड़े पैमाने पर स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
Hirschil ट्रस्ट, माइकल Saperstein मेडिकल स्कॉलर्स रिसर्च फंड, और NYU व्हाइटहेड फेलोशिप इस काम का समर्थन किया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate reader | BioTek | Synergy H1 Hybrid | |
| Multichannel pipette | Fisher | 21-377-829 | |
| 96-well microplate with optical bottom | Corning Costar | 3603 | |
| Recombinant ICAM-1 | R&D Systems | ADP4-050 | |
| Anti-CD3 antibodies | Ancell | 144-020 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| CFSE | Molecular Probes | C1157 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| DPBS containing calcium and magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Peripheral lymphocytes | e.g. mouse or human | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | |
| Open Gen 5 software | BioTek | Version 2.01 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| 15 and 50 ml centrifuge tubes | Fisher | 352099, 352070 | |
| Disposable plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| T-75 culture flasks | Fisher | 50-754-1366 | |
| RosetteSep T cell enricment kit | StemCell Technologies | 15061 |
References
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- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
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