Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Статический Адгезия Анализ по изучению активации интегрина в Т-лимфоцитов

Published: June 13, 2014 doi: 10.3791/51646

Summary

Статическое испытание адгезии является мощным инструментом, который может быть использован для моделирования взаимодействия между Т-лимфоцитов и других типов клеток. Взаимодействие генерируются путем инъекции меченых Т-клеток в лунках, покрытых молекул адгезии, в то время как планшет-ридера используется для количественной количество прилипших клеток после последовательных промывок.

Abstract

Т адгезии лимфоцитов требуется для множества функций Т-клеток, в том числе перехода на участках воспаления и формирования иммунологических синапсов с антиген представляющих клеток. Т-клетки достижения регулируемой адгезию, контролируя адгезионные свойства интегринов, класса молекул клеточной адгезии, состоящих из гетеродимерных пар трансмембранных белков, которые взаимодействуют с молекулами-мишенями на клетках-партнеров или внеклеточного матрикса. Наиболее ярким Т-клеток интегрину является функция лимфоцитов антиген (МАФ) -1, состоящий из субъединиц αL и β2, чья цель внутриклеточный молекулы адгезии (ICAM) -1. Способность Т-клетке контролировать адгезию происходит от способности регулировать аффинных состояния отдельных интегринов. Наизнанку сигнализации описывает процесс, при котором сигналы внутри клетки вызвать внешние домены интегринам предположить активированном состоянии. Большая часть наших знаний этих сложных явлений основана на механистическойисследования, проведенные в упрощенном в пробирке модельных системах. Т-лимфоцит адгезия анализа, описанного здесь является отличным инструментом, который позволяет Т-клетки придерживаться с молекулами-мишенями, в статических условиях, а затем использует флуоресцентный планшет-ридера для количественного адгезивностью. Этот анализ был полезен при определении стимулирующих адгезию или ингибирующее вещества, которые действуют на лимфоцитах, а также характеризующие сигнальных событий, связанных. Хотя изобретение описано здесь на LFA-1 - ICAM-1 адгезии, опосредованной; Этот анализ может быть легко приспособлены для обеспечения изучении других адгезивных взаимодействий (например, VLA-4 - фибронектина).

Introduction

Т адгезии лимфоцитов является фундаментальным процессом в иммунном ответе 1. Он необходим для T взаимодействия клеток с эндотелиальные клетки украшать стенки капилляров, для сканирования антиген представляющих клеток (АРС) в лимфатические узлы, и для формирования иммунологических синапсов (IS) с клетками-мишенями 2. Эти требования являются функционально и кинетически различны. Процесс лимфоцитов экстравазационным состоит из хемоаттракции, прокат, фирмы адгезии и переселения. Переход от подвижного фирме адгезии требуется Т-клеток реагировать на G-белком сигнала рецепторов быстро. Этот ответ дает интегрину взаимодействие лиганда, который замедляет и аресты качению ячейку 3. Немедленное изменение интегринового жадностью посредником этот процесс. Миграция требует динамического взаимодействия betweenTcells и эндотелиальные клетки с образованием спаек в «переднем конце» и поломки спаек в "задней части"с интервалом около минуты между формирования и разрушения 4. ЕСТЬ формирует inminutes, но должен оставаться нетронутым в течение нескольких часов 6.

Интересно, что одна молекула адгезии, интегрин семья функция-член лимфоцитов антиген (МАФ) - 1, имеет важное значение для всех этих процессов 5. LFA-1 опосредует адгезию через взаимодействие с несколькими членами надсемейства иммуноглобулинов. Наиболее широко изучены лиганд с наибольшим сродством к LFA-1 межклеточной адгезии (ICAM) -1. Неактивированного циркулирующие лимфоциты экспрессируют низкое сродство LFA-1 на поверхности клеток и, следовательно, не могут придерживаться ICAM-1 покрытием поверхности. LFA-1 сродство является переменной и регулируется несколькими сигнальных событий, таких как G активации белком рецептор цитокина, стимуляции и сигналов, опосредуемых Т-клеточных рецепторов (TCR). Полученную высокое сродство форма LFA-1 передает внутриклеточный активации во внеклеточное пространство твозь взаимодействия с ICAM-1. Этот путь называется наизнанку сигнализации 7. Кроме того, передачи сигналов через LFA-1 из внеклеточного пространства называется снаружи внутрь сигнализации.

Внутриклеточный каскады, участвующих в наизнанку и за ее пределами в сигнализации сигнализации являются одним из основных направлений современных исследований. Небольшой ГТФ Rap1 недавно стала ключевой составляющей наизнанку понять, что является общим как для TCR перевязки и цитокина сигнализации 8. Решающая роль Rap1 в активации интегринового выделен в связи с открытием, что избыточная экспрессия Rap1 стимулирует интегринзависимой адгезию Т-клеток, в то время как Т клеточной адгезии заблокирован выражения доминантной негативной Rap1 9. Эти достижения в нашем понимании интегринового регулирования Rap1 были совершены с использованием в инструментах пробирке. Среди них статический адгезия анализа, описанного здесь.

Общая цель этого метода состоит в изучении Tклеток адгезия к ICAM-1 поверхностей, покрытых. Более конкретно, оно используется для объективно оценивать количественно и LFA-1 сродство к его счетчик лигандов в живых клетках в реальном времени, при разных условиях. Этот метод использует полистирола лунки, покрытые ICAM-1, чтобы имитировать клеточные поверхности, что Т-клетки взаимодействуют с. Многие описанные ранее адгезии статическая Т-клеток анализы были экспериментально комплекс. Эти анализы часто требуется для Т-клеток, которые будут радиоактивно метили, используемые культивируемые клетки роговицы крупного рогатого скота, чтобы создать внеклеточный матрикс в качестве субстрата для T клеточной адгезии, или называют для не-физиологической стимуляции Т-клеток в течение длительного срока, чтобы способствовать T клеточную адгезию 10. Использование флуорометрического измерения для количественной оценки Т-клеток после инкубации адгезии является более чувствительным и точным методом количественного по сравнению с проточной цитометрии и микроскопии, как используются во многих других системах анализа 11. Кроме того, один Микроскоп клетокИК анализ локализации интегрина не допускает широкий, населения на основе анализа так же, как флуорометрического измерения. Хотя активации специфичные для состояния LFA-1 антитела являются коммерчески доступными, эти антитела предложить низкую чувствительность по отношению к способу, описанному здесь. Основное преимущество над альтернативными методами является его простота и способность исследовать различные экспериментальные условия одновременно. При рассмотрении этого метода для конкретного приложения, следует принять во внимание, что Т-клетки должны быть негативно выбран, свежевыделенные, и помечены с флуоресцентным маркером.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Покрытие стрипы

Примечание: Цель этого шага заключается в пальто поверхности полистирола с ICAM-1 в качестве лигандов для Т-клеток LFA-1.

  1. Подготовьте следующие решения:
    1. Готовят раствор для покрытия путем ресуспендирования рекомбинантный ICAM-1 забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS) (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na 2 HPO 4, 2 мМ KH 2 PO 4, рН 7,4), обогащенной кальцием (1 мМ CaCl 2) и магний (2 нМ MgCl 2). Убедитесь, что конечная концентрация ICAM-1 10 мкг / мл, изготовленные из 0,7 мг / мл маточного раствора и выдерживают в -80 ° C морозильник.
    2. Готовят раствор адгезии путем обогащения PBS с 0,5% человека (или бычий сывороточный альбумин) (HSA / BSA), 2 мМ MgCl 2 и 1 мМ CaCl 2.
    3. Подготовка промывочного раствора добавлением 2 мМ MgCl2 и 1 мМ CaCl 2 в PBS. Довести все решения до 37° С перед использованием.
  2. Промыть 24 скважин с 50 мкл промывочного раствора. Это будет включать немытые скважин, положительные (PMA обработали клетки), и отрицательные (без покрытия скважин) управляет. Для каждого условие, установленное по крайней мере, три скважины (трех экземплярах).
  3. Добавить 50 мкл раствора для покрытия в каждую лунку. Не добавить в непокрытых скважин управления. Инкубируют в течение одного часа внутри 37 ° С инкубатор.
  4. Аспирируйте раствор для покрытия мягко, не допуская кончик трогать дно лунок. Промывают один раз 50 мкл промывочного раствора.
  5. Добавить 50 мкл адгезии раствора и инкубировать планшет в течение одного часа в 37 ° С инкубатор.
  6. Аспирируйте мягко и мыть один раз 50 решения мкл мыть. Используйте пластины в тот же день, однако можно держать его при 4 ° С в течение ночи, и использовать его на следующий день.

2. Т Выделение клеток из крови

  1. Добавить человеческого T коктейль обогащению клеток при 50 мкл / мл Oе цельной крови (например, для 3 мл антикоагулянта (гепарина, ЭДТА, или цитрат) цельная кровь, добавить 150 мкл коктейля). Все хорошо перемешать.
  2. Инкубировать 20 мин при комнатной температуре.
  3. К 50 мл центрифужную пробирку добавляют 3 мл обработанной крови и равный объем PBS (без кальция и магния), обогащенной 1% D-глюкозы при комнатной температуре. Осторожно перемешать с помощью пипетки Пастера.
  4. Добавьте 15 мл Ficoll-Paque PLUS в центрифужную пробирку.
  5. Осторожно слой на 6 мл разбавленного образца крови на изоляции лимфоцитов среды.
  6. Центрифуга при 400 мкг в течение 20 мин при 20 ° C с обламываются.
  7. Откачать верхний слой с помощью чистой пипетки Пастера, оставляя слой лимфоцитов в покое на границе раздела. Верхний слой плазмы могут быть сохранены для последующего использования. С помощью чистой пипетки Пастера перенести лимфоцитов слой на чистую центрифужную пробирку.
  8. Добавить 3 томов (9 мл) PBS в лимфоцитах. Приостановить клетки, осторожно дракрыло их в и из пипетки Пастера.
  9. Центрифуга при 400 мкг в течение 5 мин при 20 ° C.
  10. Удалить супернатант. Лимфоциты должны теперь быть приостановлено в среде, подходящей к применению. Передача клеток в культуральной колбы T-75 в 20 мл RPMI 1640, содержащей 10% FBS, 1% пенициллина / стрептомицина.

3. Подготовка клеток

Примечание: Необходимым условием для клетки должны быть помечен флуоресцентным реагентом. В этом протоколе использовать карбоксильную флуоресцеина сукцинимидилового эфира (CFSE), однако зеленый флуоресцентный белок (GFP), выражающие клетки приемлемой альтернативой.

  1. Всего 2,4 х 10 6 Т-клетки (1 х 10 5 для каждой скважины) с помощью гемоцитометра.
  2. Ресуспендируют клеток в культуральной среде не хватает сыворотки (сывороточного голодания). Инкубируйте клетки в течение 2 часов в 37 ° С инкубатор.
  3. Центрифуга клетки в течение 5 мин (400 мкг). Аспирируйте СМИ иресуспендируют в 1 мл PBS.
  4. Добавить CFSE в разведении 1:1000 (фондовом сделал до 5 мм). Крышка от света и инкубировали в течение 8 минут при комнатной температуре.
  5. Остановить реакцию, добавив 10 мл 37 ° C PBS и спина при 400 мкг в течение 5 мин.
  6. Повторное приостановить осадок клеток с 1,2 мл подогретого раствора сцепления (1 х 10 5 клеток на 50 мкл).

4. Стимуляции клеток

Примечание: Для того чтобы инициировать адгезию клетки должны быть стимулированы. В следующем эксперименте клетки стимулировали с помощью TCR с использованием анти-CD3 антитела сшивания, однако растворимый SDF-1 может служить в качестве альтернативы. В зависимости от цели эксперимента, различные фармакологические реагенты могут быть добавлены до или во время стимуляции для изучения влияния на клеточной адгезии. Форболмиристатацетата (РМА) является форболовым эфиром, который структурно похожи на второй мессенджер диацилглицерин (DAG) и, следовательно, активирует киназу несколькоы вниз TCR (в основном протеинкиназы С); здесь он используется в качестве положительного контроля.

  1. Теплый планшет до 37 ° C.
  2. Разделить клеток в 8 мл 1,5 пустых трубок (150 мкл в каждую пробирку), одну трубку для каждого состояния.
  3. Лечить клетки соответственно:
    1. Стимулирование одну трубку с PMA в 10 нг / мл в качестве положительного контроля. Держите три пробирки лечить, чтобы служить в качестве контроля для стимуляции ("нет стимуляции"), немытые управления нагрузка ("нет мыть"), и управления для ICAM-1 покрытием ("без покрытия").
    2. Стимулирование четыре трубки с различными концентрациями анти-CD3 антителами (0,1, 1, 5 и 10 мкг / мл). Продолжить на следующей стадии без задержек.
  4. Алиготе 50 мкл вынужденного смеси клеток в каждый пустой хорошо. Окончательное число клеток на лунку 1 х 10 5.
  5. Поместите планшет в 37 ° C инкубаторе в течение 15 мин.
    Примечание: Некоторые клеточные линии T требуют короткий стимуляции время релаксации. В течение этого времени клетки будут осесть на дно лунки и придерживаться целевых лигандов.

5. Стиральная гостях Неприлипающие Клетки

Примечание: цель этого шага для удаления клеток, которые были не способны образовывать тесные контакты с лиганда покрытием поверхностей. С помощью многоканальной пипетки этого шага для того, чтобы гарантировать, что те же физические силы будут применены ко всем лунок. Важно, чтобы сохранить указанные контрольные лунки неумыто, чтобы помочь в расчете процент адгезивных клеток.

  1. Добавить 150 мкл теплой адгезии раствора в каждую скважин. Встряхнуть тарелку мягко в течение нескольких секунд, прежде чем снимать среду из лунок. Не прикасайтесь к нижней части лунки с подсказками.
  2. Повторите этот шаг три раза. Изменить направление пипетки, когда пипетки буфер в и.

6. Определение Процент прилипшие клетки

_content "> Примечание: На этом этапе флуоресцентный планшет-ридере используется для измерения интенсивности флуоресценции в каждой лунке Интенсивность находится в прямой корреляции с числом прилипающих клеток..

  1. Включите ридере. Откройте программное обеспечение для считывания планшетов, нажав на пиктограмму на рабочем столе.
    1. В меню "Задача" нажать "Новый", чтобы создать новый протокол.
    2. В меню "Действия" выберите опцию "Read". Нажмите кнопку "интенсивность флуоресценции" и нажмите "ОК" на вкладке.
    3. Из выпадающего меню выберите "Длина волны возбуждения 485" и "длина волны излучения 528". Хит "Ok" на вкладке.
    4. В "Оптик" меню параметров выберите "Нижний" и нажмите на вкладку "Ok". Вернитесь в меню «Действия» и установить температуру до 37 ° С и нажмите "ОК".
    5. Вставьте планшет в ридере инажмите кнопку "Выполнить". Результат будет экспортировать в таблицу Excel.
  2. Вычислить процент адгезивных клеток, используя следующую формулу: процент от адгезивных клеток = (средний интенсивность флуоресценции читать в промытых скважин) / (среднее интенсивность флуоресценции читать в неумытых клеток) × 100%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ниже приведен пример адгезии методом с использованием первичных Т-клетки стимулировали различными концентрациями анти-CD3 антител. Это полезно знать флуоресценцию немытых клеток (т.е. общая нагрузка). Нестимулированные клетки служат в качестве отрицательного контроля и PMA обработанные клетки положительный контроль за анти-CD3 антител. Клетки высевали в непокрытых скважин служить в качестве контроля для ICAM-1. В типичном эксперименте процент адгезивных клеток, обработанных РМА между 40% до 50%, а доля стимулированных клеток составляет от 5% до 10%. Альтернативный метод количественно клеточную адгезию клея является расчетной кратное увеличение в интенсивности флуоресценции в каждом состоянии за что из стимулированных клеток.

Таблица 1 показывает интенсивность флуоресценции CFSE помечены первичные Т-клетки стимулировали различными дозами растворимых антител анти-CD3 и высевали на ICAM-1 лунки, покрытые. Фигуре 1 показана представительную внутримышечновозраст подобного эксперимента. Клетки отрицательно выбраны из периферической крови. После сывороточного голодания в течение 2 часов, 2,4 х 10 6 клетки метили CFSE последующей стимуляцией с растворимыми антителами анти-CD3 при различных концентрациях. Стимулированных клеток высевали в ICAM-1 лунок и инкубировали в течение 15 мин в темноте. После инкубации неприлипшие клетки промывали три раза и интенсивность флуоресценции измер ли с использованием планшет-ридера на 485 нм. PMA лечению, и нестимулированные клетки использовали в качестве контроля. Отметим, что первый столбец (1A-1C) содержит клетки, которые не были вымыты (общая нагрузка, например, 100%).

Рисунок 2 показывает процент Т клеточной адгезии, рассчитанной на основе флуоресцентных интенсивности представлены в таблице 1. Для каждого состояния средняя интенсивность трех скважин (тройные) была рассчитана и преобразуется в процентном отношении из общего объема клеток, нагруженных (

Нет Вымойте Без покрытия Нестимулированных PMA Анти-CD3 0,1 мкг / мл Анти-CD3 1 мкг / мл Анти-CD3 5 мкг / мл Анти-CD3 10 мкг / мл
1 2 3 4 5 6 7 8
89652 611 5219 45873 8964 20157 37972 37972
B 90248 320 6049 7568 25486 32549 32549
С 88321 409 5456 42697 8542 24568 32892 3289


Таблица 1. Значения интенсивности флуоресценции CFSE помечены первичных Т-клетки стимулировали различными концентрациями растворимых антител анти-CD3. В свежесобранные клетки голодали в сыворотке в течение двух часов, а затем метили CFSE в концентрации 5 мкМ. Далее, клетки стимулировали с низким (0,1 мкг / мл), средние (1 мкг / мл), высокой (5 мкг / мл) и очень высокой (10 мкг / мл) концентрации растворимых антител анти-CD3 и 1 х 10 5 клеток высевали в каждую лунку (предварительно покрытый ICAM-1). Через 15 мин неадгезивные клетки удаляли трех последовательных промывок. Количество прикрепленных клеток измеряли с помощью планшет-ридера как сhown в этой таблице. Уэллс 1A-1C: немытые клетки; 2А-2С: без покрытия скважин; 3А-3С: нестимулированные клетки; 4A-4C: клетки, стимулированные 10 нг / мл РМА; 5А-5С: клетках, стимулированных с низкой дозы анти-CD3 антител; 6A-6C: клетках, стимулированных со средней дозе анти-CD3 антител; 7А-7С: клетки, стимулированные высоких доз анти-CD3 антител; 8A-8C: клетках, стимулированных с очень высокой дозы анти-CD3 антител.

Рисунок 1
Рисунок 1. Изображения первичных Т-клеток, стимулированных различные концентрации растворимого антитела анти-CD3. Свежесобранные клетки голодали в сыворотке в течение двух часов, а затем метили CFSE в концентрации 5 мкМ. Затем клетки стимулировали PMA (10 нг / мл) или различными концентрациями анти-CD3 антителами (0,1, 1, 5 и 10 мкг / мл) и высевали наICAM-1 с покрытием поверхностей. Представитель изображения были взяты с Zeiss 700 конфокальной микроскопии с использованием 20-кратным увеличением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Стимуляция Т-клеток с высокой дозы анти-CD3 антитела приводит к увеличению адгезии. Графически представление процентов T клеточной адгезии, как вычисляется из показанных в таблице 1. Рассчитывали средний процент адгезивных клеток по отношению к невымыты клетки, которые составляет 100%. Гистограммы представить результаты (среднее ± SEM), по крайней мере 3 скважины. Пожалуйста ClicК здесь, чтобы посмотреть увеличенное рисунке.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Есть несколько анализов для изучения сигналы LFA-1 и Т активации клеточной адгезии 12. Проточная цитометрия используется для измерения LFA-1 сродством состояния в живых клеток с использованием моноклональных антител, которые связываются избирательно либо согнут или расширенный LFA-1. Одним из ограничений этого метода является то, что он не принимает во внимание алчность Интегрины. Миграционные анализы являются полезными инструментами, но они измеряют миграции, а не жалкие адгезии в определенной точке времени. Мышиные модели для изучения T миграции лимфоцитов (например кожный модели гиперчувствительность) являются физиологически актуальны, однако использование этих моделей является многофакторной и сложным для выполнения. Основным преимуществом статической адгезии анализа, описанного здесь является его способность измерять как алчность и сродство в простой форме. Еще одним преимуществом этого метода является его способность обнаруживать небольшое количество клеток быстро и точно. По сравнению с другими методами, это намного легче ManipУлате клетки и относиться к ним с различными реагентами в функциональном анализе, как тот, который мы описали. Кроме того, прилипшие клетки подсчитывают объективно с помощью планшет-ридера, устранение смещения, связанные с ручным пунктам. Этот метод может быть использован для скрининга эффект нескольких лекарств или генов манипуляции на процесс адгезии.

Однако этот метод не свободен от ограничений. Один потенциальный недостаток состоит в том, что процент адгезивных клеток является относительным числом, которое может изменяться от одного эксперимента к другому. Другим недостатком является то, что доменные лимфоциты не могут быть использованы, так как они должны быть свежевыделенную. Кроме того, исследования с адгезии клеток, выделенных из замороженных мононуклеарных клеток периферической крови не соответствуют. Важно отметить, что PMA должны работать последовательно, и мы рекомендуем использовать его в каждом эксперименте. Положительный и отрицательный контроль являются первыми шагами в устранении неполадок неудачные эксперименты. В случае отсутствиядополненной адгезию в стимулированных клеток, концентрация целевого лиганда покрывающей лунки должны быть проверены. Кроме того, он необходим для подтверждения того, что более 95% клеток являются жизнеспособными, а в случае клеточной линии, их фазы роста должны быть рассчитаны. В случае значительной изменчивостью в том же состоянии, рекомендуется использовать более трех одинаковых скважин (более трех экземплярах).

Для того чтобы оценить этого анализа было бы полезно, чтобы понять, что некоторые шаги в протоколе, такие как времени инкубации и количество посеянных клеток должно быть однородным среди всех условиях. Небольшие различия в времени инкубации может привести это неточные измерения. Важно также, чтобы аликвоты точно такое же количество клеток в каждую лунку. Будущие приложения этой техники, повышения его точности будет автоматизированная версия, которая будет загружаться клетки и выполнять моет в более объективно. Кроме того, автоматизированная версия позволит намдля выполнения крупномасштабных экранов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Hirschil Доверие, Майкл Саперштейн ученых-медиков исследовательские фонды, и общение NYU Уайтхед поддержала эту работу.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plate reader BioTek Synergy H1 Hybrid
Multichannel pipette Fisher 21-377-829
96-well microplate with optical bottom Corning Costar 3603
Recombinant ICAM-1 R&D Systems ADP4-050
Anti-CD3 antibodies Ancell 144-020
PMA Sigma-Aldrich 79346
BSA Sigma-Aldrich A2058
CFSE Molecular Probes C1157
RPMI Gibco 11875-093
DPBS containing calcium and magnesium Gibco 14190250
Peripheral lymphocytes e.g. mouse or human
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Calcium chloride Sigma-Aldrich 499609
Open Gen 5 software BioTek Version 2.01
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare 71-7167-00
15 and 50 ml centrifuge tubes Fisher 352099, 352070
Disposable plastic Pasteur pipettes Fisher 13-711-7M
T-75 culture flasks Fisher 50-754-1366
RosetteSep T cell enricment kit StemCell Technologies 15061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dustin, M. L., et al. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
  2. Mor, A., et al. GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
  3. Rose, D. M., et al. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
  4. Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
  5. Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
  6. Dustin, M. L. Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses. Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).
  7. Springer, T. A., Dustin, M. L. Integrin inside-out signaling and the immunological synapse. Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).
  8. Mor, A., et al. D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane. Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).
  9. Bivona, T. G., et al. Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion. J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).
  10. Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
  11. Bhattacharyya, S. P., et al. Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells. Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).
  12. Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).

Tags

Иммунологии выпуск 88 иммунная система явления Т-клеток адгезия Rap1 интегрины Т-лимфоциты ICAM-1
Статический Адгезия Анализ по изучению активации интегрина в Т-лимфоцитов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I.,More

Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Pedoeem, A., Mor, A. Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (88), e51646, doi:10.3791/51646 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter