Summary
Statisk vidhäftningsanalys är ett kraftfullt verktyg som kan användas för att modellera interaktionerna mellan T-lymfocyter och andra celltyper. Interaktioner alstras genom insprutning av märkta T-celler till brunnar belagda med vidhäftningsmolekyler, medan ett plattläsare användes för att kvantifiera antalet vidhäftande celler efter serietvättar.
Abstract
T-lymfocyt adhesion krävs för flera T-cellfunktioner, inklusive migrering till ställen för inflammation och bildning av immunologiska synapser med antigenpresenterande celler. T-celler åstadkomma reglerad vidhäftning genom att styra de vidhäftande egenskaperna hos integriner, en klass av celladhesionsmolekyler består av heterodimera par av transmembranproteiner som interagerar med målmolekyler på partner celler eller extracellulära matrix. De mest framträdande T-cell grin är lymfocytfunktionen antigen (LFA) -1, som består av subenheter αL och β2, vars mål är den intracellulära adhesionsmolekylen (ICAM) -1. Förmågan hos en T-cell för att styra vidhäftningen härrör från förmågan att reglera affinitetstillstånd enskilda integriner. Inifrån-ut signalering beskriver den process där signaler inuti en cell orsaka yttre domäner integriner att anta ett aktiverat tillstånd. Mycket av vår kunskap om dessa komplexa fenomen bygger på mekanistiskstudier som utförts i förenklad i modell vitro-system. Den lymfocytadhesion analysen T beskrivs här är ett utmärkt verktyg som gör att T-celler att hålla sig till målmolekyler under statiska förhållanden, och sedan använder en fluorescerande plattläsare att kvantifiera vidhäftningsförmågan. Denna analys har varit till nytta i att definiera vidhäftnings-stimulerande eller hämmande substanser som verkar på lymfocyter, samt karakterisera de signaleringshändelser inblandade. Fastän beskriven här för LFA-1 - ICAM-1 förmedlad adhesion; denna analys kan lätt anpassas för att möjliggöra för studier av andra adhesiva interaktioner (t.ex. VLA-4 - fibronektin).
Introduction
T-lymfocyter vidhäftning är en grundläggande process i immunsvaret 1. Det krävs för cellinteraktion T med endotelceller dekorera kapillärväggarna, för skanning antigenpresenterande celler (APC) i lymfkörtlar och för bildandet av immunologiska synapser (IS) med målceller 2. Dessa krav är funktionellt och kinetiskt distinkt. Processen av lymfocyter extravasering består av kemoattraktion, rullande, fast adhesion och transmigration. Övergången från att rulla på fast vidhäftning kräver T-celler att svara på en G-proteinkopplad receptor-signal snabbt. Detta ger en grin ligand växelverkan som bromsar och arresteringar av rullande cellen 3. En omedelbar förändring av grin aviditet förmedlar denna process. Migration kräver dynamiska interaktioner betweenTcells och endotelceller med bildningen av adhesioner vid "frontänden" och sönderbrytning av adhesioner vid "bakre änden"med ett intervall på omkring en minut mellan formning och bryta 4. IS bildar inminutes, men måste förbli intakt i timmar 6.
Intressant, en adhesionsmolekyl grinfamiljemedlem lymfocytfunktionen antigen (LFA) - är 1, viktigt för alla dessa processer 5. LFA-1 medierar adhesion genom interaktioner med flera medlemmar av immunoglobulinsuperfamiljen. Den mest omfattande studerat liganden med den högsta affiniteten till LFA-1 är den intercellulära adhesionsmolekylen (ICAM) -1. Icke-aktiverade cirkulerande lymfocyter uttrycker låg affinitet LFA-1 på cellytan, och därför är oförmögna att vidhäfta till ICAM-1-belagda ytor. LFA-1 affinitet varierar och regleras av ett flertal signal evenemang såsom G-proteinkopplade receptoraktivering, cytokinstimulering och signaler som förmedlas av T-cellsreceptorer (TCR). Den resulterande hög affinitet form av LFA-1 förmedlar intracellulär aktivering till det extracellulära rummet through interaktion med ICAM-1. Denna väg kallas ut och in signalering 7. Likaså signalering genom LFA-1 från det extracellulära utrymmet kallas utanför-i signalering.
Den intracellulära signaleringskaskader som deltar i inifrån och ut och utifrån och in signalering är ett stort fokus på aktuell forskning. Den lilla GTPase Rap1 har nyligen dykt upp som en viktig del av inifrån-ut signalerar som är gemensam för både TCR ligation och cytokin signalering 8. Den kritiska rollen för Rap1 i grinaktivering markeras genom upptäckten att överuttryck av Rap1 stimulerar grin-beroende adhesion av T-celler, under det att T-cellvidhäftning är blockerad av uttryck av dominant negativ Rap1 9. Dessa framsteg i vår förståelse av grin reglering genom Rap1 har åstadkommits med hjälp av in vitro-verktyg. Bland dem är den statiska vidhäftningen analysen beskriven här.
Det övergripande målet med denna metod är att studera Tcell vidhäftning till ICAM-1 belagda ytor. Mer specifikt är det som används för att objektivt mäta och kvantifiera LFA-1 affinitet mot sin disk ligander i levande celler i realtid, under olika förhållanden. Denna teknik använder polystyrenbrunnar belagda med ICAM-1 för att efterlikna de cellulära ytor att de T-celler interagera med. Många tidigare beskrivna statiska T celladhesionsanalyser var experimentellt komplex. Dessa analyser ofta som krävs för T-celler att märkas radioaktivt, utnyttjad odlade bovina korneala celler för att skapa en extracellulär matris som substrat för T-cell-adhesion, eller kallas för icke-fysiologiska T-cellstimulering under en förlängd varaktighet för att främja T-cellvidhäftning 10. Användningen av fluorometrisk mätning för att kvantifiera T-celler efter vidhäftning inkubation är en mer känslig och exakt metod för kvantifiering jämfört med flödescytometri och mikroskopi, som utnyttjas i många andra analyssystem 11. Dessutom enda cell microscopIC-analys av grin lokalisering tillåter inte den breda, befolkningsbaserad analys på samma sätt som den fluorometriska mätningen. Medan aktiveringstillstånd-specifika antikroppar LFA-1 är kommersiellt tillgängliga, är dessa antikroppar har låg känslighet i förhållande till den metod som beskrivs här. Den huvudsakliga fördelen över alternativa tekniker är dess enkelhet och möjlighet att undersöka flera experimentella betingelser samtidigt. När man överväger denna metod för ett visst program, bör man ta hänsyn till att T-celler bör negativt väljs, nyligen isolerade, och märkt med en fluorescerande markör.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beläggning brunnarna
Obs: Målet med detta steg är att belägga polystyrenytor med ICAM-1 för att fungera som ligander för T-cell LFA-1.
- Bered följande lösningar:
- Förbered beläggningslösningen genom återsuspendering rekombinant ICAM-1 med fosfatbuffrad salin (PBS)-lösning (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7,4) berikat med kalcium (1 mM CaCl 2) och magnesium (2 nM MgCl2). Se till att den slutliga koncentrationen av ICAM-1 är 10 | ig / ml, tillverkad av en 0,7 mg / ml stamlösning och förvaras i en -80 ° C frys.
- Förbered vidhäftning lösning genom att berika PBS med 0,5% humant (eller bovint) serumalbumin (HSA / BSA), 2 mM MgCl2 och 1 mM CaCl2.
- Bered tvättlösningen genom att tillsätta 2 mM MgCl2 och 1 mM CaCl2 till PBS. Värm alla lösningar till 37° C före användning.
- Tvätta 24 brunnar med 50 pl tvättlösning. Detta kommer att omfatta otvättade brunnar, positiva (PMA behandlade celler) och negativa (ej belagda brunnar) kontroller. För varje villkor som minst tre brunnar (trippel).
- Tillsätt 50 | il beläggningslösning till varje brunn. Lägg inte till de obelagda kontrollbrunnarna. Inkubera under en timme inuti 37 ° C inkubator.
- Aspirera beläggningslösningen försiktigt, utan att tillåta spetsen att röra vid botten av brunnarna. Tvätta en gång med 50 ul av tvättlösningen.
- Addera 50 pl av adhesion lösning och inkubera mikroplattan i en timme inuti 37 ° C inkubator.
- Sug försiktigt och tvätta en gång med 50 pl tvättlösning. Använd plattan på samma dag, men det är möjligt att hålla det vid 4 ° C över natten, och använda den följande dag.
2. T Cell Isolering från Blood
- Lägg human T-cell anrikning cocktail på 50 l / ml of helblod (t.ex. för 3 ml antikoagulantia (heparin, EDTA eller citrat) helblod, lägga 150 l av cocktail). Blanda väl.
- Inkubera 20 minuter vid rumstemperatur.
- Till en 50 ml centrifugrör till 3 ml behandlat blod och en lika stor volym av PBS (utan kalcium och magnesium) berikad med 1% D-glukos vid rumstemperatur. Blanda försiktigt med en Pasteur-pipett.
- Tillsätt 15 ml Ficoll-Paque PLUS till centrifugröret.
- Lagret försiktigt 6 ml utspädda blodprov på lymfocytisolering mediet.
- Centrifugera vid 400 x g under 20 min vid 20 ° C med avbrott av.
- Dra bort det övre lagret med hjälp av en ren Pasteur pipett lämnar lymfocyter lagret ostört i gränssnittet. Det övre skiktet av plasma kan sparas för senare användning. Med hjälp av en ren Pasteur pipett överföra lymfocyter lagret till ett rent centrifugrör.
- Lägg 3 volymer (9 ml) av PBS till lymfocyterna. Suspendera cellerna genom att försiktigt DRAvinge dem in och ut ur en Pasteur-pipett.
- Centrifugera vid 400 xg under 5 min vid 20 ° C.
- Avlägsna supernatanten. Lymfocyterna bör nu avbrytas på medellång lämplig till ansökan. Överför cellerna till en T-75 odlingskolv i 20 ml RPMI 1640-medium innehållande 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin.
3. Beredning av celler
Anmärkning: En förutsättning är att de celler som skall märkas med en fluorescerande reagens. I detta protokoll använder karboxi fluorescein-succinimidylester (CFSE) dock grönt fluorescerande protein (GFP)-uttryckande celler är ett godtagbart alternativ.
- Räkna 2,4 x 10 6 T-celler (1 x 10 5 för varje brunn) med användning av en hemocytometer.
- Resuspendera cellerna i odlingsmedium utan serum (serum starvation). Inkubera cellerna i 2 tim i 37 ° C inkubator.
- Centrifugera cellerna under 5 min (400 xg). Aspirera media ochåtersuspendera i 1 ml PBS.
- Lägg CFSE vid 1:1000 utspädning (lager görs till 5 mM). Täck från ljus och inkubera under 8 min vid rumstemperatur.
- Stoppa reaktionen genom att tillsätta 10 ml av 37 ° C PBS och centrifugera vid 400 xg under 5 min.
- Återsuspendera cellpelleten med 1,2 ml förvärmd vidhäftningslösning (1 x 10 5 celler per 50 pl).
4. Stimulering av celler
OBS: För att initiera vidhäftning, måste cellerna stimuleras. I följande experiment cellerna stimuleras via TCR med användning av anti-CD3-tvärbindande antikroppar emellertid löslig SDF-1 skulle kunna tjäna som ett alternativ. Beroende på målet för experimenten kunde olika farmakologiska reagenser tillsättas före eller under stimulering för att undersöka effekterna på cellulär adhesion. Forbolmyristatacetat (PMA) är en forbolester som strukturellt liknar den andra budbärare diacylglycerol (DAG), och därför aktiverar flertal kinass nedströms TCR (främst Proteinkinas C); här den används som en positiv kontroll.
- Värm mikroplattan till 37 ° C.
- Dela upp celler i 8 tomma 1,5 ml rör (150 il i varje rör), ett rör för varje tillstånd.
- Behandla cellerna därefter:
- Att stimulera ett rör med PMA vid 10 ng / ml för att tjäna som positiv kontroll. Behåll tre rör obehandlat, för att tjäna som kontroll för stimulering ("ingen stimulering"), otvättade lastkontroll ("no wash"), och kontroll av ICAM-1 beläggning ("obestruket").
- Stimulerar fyra tuber med olika koncentrationer av anti-CD3-antikroppar (0,1, 1, 5 och 10 | ig / ml). Fortsätt till nästa steg utan förseningar.
- Alikvotera 50 pl stimulerad cellblandningen i varje tom väl. Det slutliga antalet celler per brunn är 1 x 10 5.
- Placera mikroplatta i 37 ° C inkubator under 15 min.
Obs: Vissa T-cellinjer kräver kortare stimulering tion tid. Under denna tid, kommer cellerna att sedimentera ned till botten av brunnarna och följa de målligander.
5. Borttvättning av icke vidhäftande celler
Obs: Målet med detta steg är att avlägsna celler som inte var i stånd att bilda täta kontakter med liganden belagda ytor. Använd en multikanalpipett för detta steg i syfte att säkerställa att samma fysikaliska krafter appliceras till alla brunnarna. Det är viktigt att hålla de indikerade kontrollbrunnar unwashed att hjälpa till vid beräkningen av den procentuella andelen av adherenta celler.
- Tillsätt 150 l av varma vidhäftningslösning till varje brunn. Skaka plattan försiktigt i några sekunder innan du tar bort mediet från brunnarna. Rör inte botten av brunnarna med tips.
- Upprepa detta steg tre gånger. Ändra riktning på pipetten vid pipettering bufferten in och ut.
6. Fastställer i Vidhäftande Cells
_content "> Anmärkning: I detta steg en fluorescerande plattläsare används för att mäta fluorescensintensiteten i varje brunn Intensiteten är i direkt relation till antalet vidhäftande celler..- Sätt på plattläsare. Öppna plattläsarprogrammet genom att klicka på genvägen på skrivbordet.
- Från menyn "Task" klickar "Ny" för att skapa ett nytt protokoll.
- Från menyn "Åtgärder" välj "Läs" alternativet. Klicka på "Fluorescent intensitet" och tryck på "OK"-fliken.
- Från rullgardinsmenyn väljer du "Excite våglängd 485" och "Emission våglängden 528". Hit "OK"-fliken.
- I "Optic" alternativ-menyn väljer du "Bottom" och tryck på "OK"-fliken. Gå tillbaka till menyn "Åtgärder" och ställ in temperaturen på 37 ° C och klicka på "OK".
- Sätt i mikroplattan i plattläsare ochKlicka på "Kör". Resultatet kommer att exporteras till Excel-ark.
- Beräkna den procentuella andelen av vidhäftande celler med hjälp av följande formel: Procent vidhäftande celler = (genomsnittlig fluorescensintensitet läsas i de tvättade brunnarna) / (genomsnittlig fluorescensintensitet läst i otvättade celler) x 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nedan är ett exempel på vidhäftningsanalys med användning av primära T-celler stimulerade med olika koncentrationer av anti-CD3-antikroppar. Det är bra att känna till fluorescens av otvättade celler (dvs. total belastning). Ostimulerade celler tjänar som en negativ kontroll och PMA-behandlade celler är de positiv kontroll för anti-CD3-antikroppar. Celler pläterade i obelagda brunnar fungera som en kontroll för ICAM-1. Vid ett typiskt försök den procentuella andelen av adherenta PMA-behandlade celler är mellan 40% till 50%, medan den procentuella andelen av icke-stimulerade celler är mellan 5% till 10%. Ett alternativt förfarande för att kvantifiera cellvidhäftningsförmåga är genom beräkning faldig ökning av fluorescensintensitet i varje tillstånd under det att den icke-stimulerade celler.
Tabell 1 visar fluorescensintensiteten hos CFSE märkta primära T-celler stimulerades med olika doser av lösliga anti-CD3-antikroppar och ströks ut på ICAM-1-belagda brunnar. Figur 1 visar representativa imåldrarna av liknande experiment. Cellerna negativt vald från perifert blod. Efter serumsvält under 2 h, var 2,4 x 10 6 celler märktes med CFSE följt av stimulering med lösliga anti-CD3-antikroppar vid olika koncentrationer. Stimulerade celler ströks in i ICAM-1 belagda brunnarna och inkuberades under 15 minuter i mörker. Efter inkubation de icke-adherenta cellerna tvättades tre gånger och fluorescensintensiteten mättes med användning av en plattläsare vid 485 nm. PMA behandlad och ostimulerade celler användes som kontroller. Observera att den första kolumnen (1A-1C) innehåller celler som inte tvättades (total laddning, t.ex. 100%).
Figur 2 visar den procent av T-cell-adhesion som beräknats baserat på de fluorescerande intensiteter som rapporteras i tabell 1. För varje tillstånd den genomsnittliga intensiteten för de tre brunnar (triplikat) beräknades och omvandlades till relativa andelen av de totala celler laddade ( Ingen Wash Obelagd Ostimulerad PMA Anti-CD3 0,1 | ig / ml Anti-CD3-1 | ig / ml Anti-CD3-5 | ig / ml Anti-CD3-10 | ig / ml 1 2 3 4 5 6 7 8 ETT 89652 611 5219 45873 8964 20157 37972 37972 B 90248 320 6049 7568 25486 32549 32549 C 88321 409 5456 42697 8542 24568 32892 3289
Tabell 1. Fluorescensintensitetsvärdena för CFSE märkta primära T-celler stimulerade med varierande koncentrationer av lösliga anti-CD3-antikroppar. De nyskördade celler serum svältes under två timmar och därefter märkt med CFSE i en koncentration av 5 pM. Därefter stimulerades cellerna med en låg (0,1 fig / ml), medium (1 | ig / ml), hög (5 | ig / ml) och mycket hög (10 pg / ml) koncentrationer av lösliga anti-CD3-antikroppar och en x 10 5 celler ströks ut i varje brunn (förbelagda med ICAM-1). Efter 15 min icke-vidhäftande celler bort genom tre serie tvättar. Antalet vidhäftande celler mättes med en plattläsare som shown i denna tabell. Brunn 1A-1C: otvättade celler; 2A-2C: obestruket brunnar; 3A-3C: ostimulerade celler; 4A-4C: celler stimulerade med 10 ng / ml PMA; 5A-5C: celler stimulerade med låg dos av anti-CD3-antikroppar; 6A-6C: celler stimulerade med medelhög dos av anti-CD3-antikroppar; 7A-7C: celler stimulerade med hög dos anti-CD3-antikroppar; 8A-8C: celler stimulerade med mycket hög dos anti-CD3-antikroppar. 
Figur 1. Bilder av primära T-celler stimulerade med varierande koncentrationer av lösliga anti-CD3-antikroppar. Nyskördade celler serum svältes under två timmar och därefter märkt med CFSE i en koncentration av 5 pM. Därefter stimulerades cellerna med PMA (10 ng / ml) eller olika koncentrationer av anti-CD3-antikroppar (0,1, 1, 5 och 10 | ig / ml) och ströks ut påICAM-1 belagda ytor. Bilderna är tagna med Zeiss 700 konfokalmikroskopi med hjälp av 20x förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 2. Stimulering av T-celler med hög dos anti-CD3-antikroppar resulterar i ökad vidhäftning. Plottas representation av den procentuella T-cell-adhesion som beräknas från den som visas i tabell 1. Den genomsnittliga procentandelen vidhäftande celler beräknades i förhållande till otvättade celler som utgör 100%. Histogrammen presentera resultaten (medelvärden ± SEM) av minst tre brunnar. Vänligen CLICk här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns flera analyser för att studera signaler till LFA-1-aktivering och T-cell-adhesion 12. Flödescytometri används för att mäta LFA-1-affinitetstillstånd i levande celler med användning av monoklonala antikroppar som binder selektivt till antingen böjda eller förlängas LFA-1. En av begränsningarna med denna metod är att den inte tar hänsyn till grin "aviditet. Migration analyser är användbara verktyg, men de mäter migration, och inte ynka vidhäftning vid en viss tidpunkt. Musmodeller för att studera T-lymfocyter migration (t.ex. kutan överkänslighetsmodell) är fysiologiskt relevant, men användningen av dessa modeller är multifaktoriell och komplicerat att utföra. Den huvudsakliga styrkan av statisk vidhäftningsanalys som beskrivs här är dess förmåga att mäta både aviditet och affinitet på ett enkelt sätt. En annan fördel med denna metod är dess förmåga att detektera ett litet antal celler snabbt och exakt. I jämförelse med andra metoder, är det mycket lättare att manipUlate cellerna och behandla dem med olika reagenser i en funktionell analys som den som vi beskriver. Dessutom är de vidhäftande celler räknades objektivt med en plattläsare, eliminering förspänning associerad med manuella räkningar. Denna metod kan användas för att screena effekten av flera läkemedel eller gener manipulation på adhesion process.
Men denna teknik är inte fri från begränsningar. En potentiell svaghet är det faktum att den procentuella andelen av adherenta celler är ett relativt tal, som kan variera från ett experiment till ett annat. En annan svaghet är att spränga lymfocyter inte kan användas, eftersom dessa måste nyligen isolerade. Dessutom vidhäftningsstudier med celler som återvunnits från frusna perifera blodmononukleära celler är inte konsekvent. Det är viktigt att nämna att PMA konsekvent bör fungera, och vi rekommenderar att du använder det i varje experiment. En positiv och en negativ kontroll är de första stegen i felsökning av misslyckade försök. Vid brist påförstärkt adhesion i stimulerade celler, bör kontrolleras koncentrationen av målligand som omfattar de brunnar. Dessutom är det ett krav att validera att mer än 95% av cellerna är livsdugliga, och i fallet med en cell-linje bör deras tillväxtfas beräknas. Vid betydande variation inom samma skick, är det rekommenderat att använda mer än tre identiska brunnar (fler än tre exemplar).
För att uppskatta denna analys är det användbart att förstå att vissa steg i protokollet såsom inkuberingstiden och antalet sådda celler ska vara enhetlig bland alla förhållanden. Små skillnader i inkubationstid kan leda till är felaktiga mätningar. Det är också viktigt att portion exakt samma antal celler är varje brunn. Framtida tillämpningar av denna teknik skulle förbättra noggrannheten vara en automatiserad version som skulle ladda cellerna och utföra de tvättar på ett mer objektivt sätt. Dessutom kommer en automatiserad version gör att viatt utföra storskaliga skärmar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Hirschil Trust, Michael Saperstein Medical Scholars forskningsmedel, och NYU Whitehead gemenskap stött detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate reader | BioTek | Synergy H1 Hybrid | |
| Multichannel pipette | Fisher | 21-377-829 | |
| 96-well microplate with optical bottom | Corning Costar | 3603 | |
| Recombinant ICAM-1 | R&D Systems | ADP4-050 | |
| Anti-CD3 antibodies | Ancell | 144-020 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| CFSE | Molecular Probes | C1157 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| DPBS containing calcium and magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Peripheral lymphocytes | e.g. mouse or human | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | |
| Open Gen 5 software | BioTek | Version 2.01 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| 15 and 50 ml centrifuge tubes | Fisher | 352099, 352070 | |
| Disposable plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| T-75 culture flasks | Fisher | 50-754-1366 | |
| RosetteSep T cell enricment kit | StemCell Technologies | 15061 |
References
- Dustin, M. L., et al. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., et al. GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., et al. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
- Dustin, M. L. Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses. Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).
- Springer, T. A., Dustin, M. L. Integrin inside-out signaling and the immunological synapse. Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).
- Mor, A., et al. D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane. Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).
- Bivona, T. G., et al. Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion. J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Bhattacharyya, S. P., et al. Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells. Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).
- Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
