Summary
Statischen Adhäsionsassay ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die Wechselwirkungen zwischen T-Lymphozyten und andere Zelltypen zu modellieren. Interaktionen werden durch Injizieren markierten T-Zellen in Vertiefungen, die mit Adhäsionsmolekülen beschichtet ist, während ein Plattenlesegerät verwendet wird, um die Anzahl der anhaftenden Zellen zu quantifizieren folgenden seriellen Waschungen erzeugt.
Abstract
T-Lymphozyten-Adhäsion wird für mehrere T-Zell-Funktionen, einschließlich der Migration zu Entzündungsstellen und die Bildung von immunologischen Synapsen mit Antigen präsentierenden Zellen erforderlich. T-Zellen zu erreichen geregelte Haftung durch Steuerung der Klebeeigenschaften von Integrinen, einer Klasse von Zelladhäsionsmolekülen aus heterodimeren Paare von Transmembranproteinen, die mit den Zielmolekülen wechselwirken auf Partnerzellen oder extrazelluläre Matrix. Der prominenteste T-Zell-Integrin Lymphozytenfunktion assoziiertes Antigen (LFA) -1, von Untereinheiten &agr; L und β2, deren Ziel die intrazelluläre Adhäsionsmolekül (ICAM) -1 besteht. Die Fähigkeit eines T-Zell-Adhäsion zu steuern leitet sich aus der Möglichkeit, die Affinitätszustände einzelner Integrine regulieren. Inside-Out-Signalisierung beschreibt die Verfahren, bei dem Signale in einer Zelle bewirken, dass die externe Domänen der Integrine in einen aktivierten Zustand übernehmen. Vieles von unserem Wissen über diese komplexen Phänomene auf mechanistische BasisStudien in vitro vereinfachten Modellsystemen durchgeführt. Die hier beschriebene T-Lymphozyten-Adhäsion Assay ist ein hervorragendes Werkzeug, die T-Zellen zu halten, um Moleküle unter statischen Bedingungen zielen, ermöglicht, und nutzt eine Fluoreszenzplattenlesegerät zu Haft dann quantifizieren. Dieser Assay wurde bei der Definition Haft stimulierende oder hemmende Substanzen, die auf Lymphozyten wirken, sowie die Charakterisierung der Signalwege beteiligt nützlich. Obwohl hier für LFA-1 beschrieben - ICAM-1 vermittelte Adhäsion; Dieser Assay kann leicht angepasst werden, um für die Untersuchung von anderen adhäsiven Wechselwirkungen (zB VLA-4 - Fibronektin) zu ermöglichen.
Introduction
T-Lymphozyten-Adhäsion ist ein fundamentaler Prozess der Immunantwort 1. Es ist für die T-Zell-Interaktion mit Endothelzellen, die Dekoration der Gefäßwände erforderlich ist, zum Abtasten Antigen-präsentierenden Zellen (APC) in die Lymphknoten und die für die Bildung von immunologischen Synapsen (IS) mit Zielzellen 2. Diese Anforderungen sind funktionell und kinetisch deutlich. Der Prozess der Lymphozyten-Extravasation besteht aus Chemoattraktion, Rollen, feste Adhäsion und Transmigration. Der Übergang von der rollenden Adhäsion festigen erfordert T-Zellen zu einer G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Signal schnell zu reagieren. Diese Antwort ergibt einen Integrin-Ligand-Wechselwirkung, die Verhaftungen und verlangsamt den Rollzelle 3. Eine sofortige Änderung in der Integrin-Avidität vermittelt diesen Prozess. Migration erfordert dynamischen Wechselwirkungen betweenTcells und Endothelzellen mit der Bildung von Verwachsungen an der "Front-End" und Bruch von Adhäsionen in der "hinteren Ende"mit einem Intervall von etwa einer Minute zwischen Form-und Bruch 4. Der IS bildet inminutes, muss aber für 6 Stunden intakt bleiben.
Interessanterweise, ein Adhäsionsmolekül das Integrin Familienmitglied Lymphozytenfunktion assoziiertes Antigen (LFA) - 1 ist, wichtig für all diese Prozesse 5. LFA-1 vermittelt Adhäsion durch Interaktionen mit mehreren Mitgliedern der Immunglobulin-Superfamilie. Die am besten untersuchten Liganden mit der höchsten Affinität an LFA-1 ist das interzelluläre Adhäsionsmolekül (ICAM) -1. Nicht-aktivierte zirkulierenden Lymphozyten exprimieren geringe Affinität LFA-1 auf der Zelloberfläche und sind daher nicht an ICAM-1-beschichteten Oberflächen anhaften. LFA-1-Affinität ist variabel und von mehreren Signalereignisse wie G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Aktivierung, Zytokin-Stimulation, und Signale, die von T-Zell-Rezeptoren (TCR) vermittelt geregelt. Die daraus resultierende hohe Affinität Form von LFA-1 fördert die intrazelluläre Aktivierung auf den extrazellulären Raum turch Wechselwirkung mit ICAM-1. Dieser Weg wird von innen nach außen bezeichnet Signal 7. Ebenso Signalgebung durch LFA-1 aus dem extrazellulären Raum außerhalb-der Signalisierung genannt.
Die intrazelluläre Signalkaskaden in Inside-out-und Outside-In-Signalübertragung beteiligt sind ein Schwerpunkt der aktuellen Forschung. Die kleine GTPase Rap1 hat vor kurzem als die Schlüsselkomponente der inside-out signalisiert, dass es üblich, sowohl TCR-Ligation und Zytokin-Signal 8. Die kritische Rolle in Rap1 Integrin-Aktivierung wird von der Entdeckung, dass eine Überexpression von Rap1 stimuliert Integrin-abhängige Adhäsion von T-Zellen markiert, während T-Zell-Adhäsion wird durch Expression von dominant-negativen Rap1 9 blockiert. Diese Fortschritte in unserem Verständnis der Integrin-Regulation durch Rap1 wurden mit in vitro-Tools durchgeführt. Unter ihnen ist der hier beschriebene statische Adhäsionsassay.
Das Ziel dieser Methode ist es, T studierenZellhaftfähigkeit an ICAM-1-beschichteten Oberflächen. Genauer gesagt, wird es verwendet, um objektiv zu messen und zu quantifizieren, LFA-1-Affinität zu seinem Gegenliganden in lebenden Zellen in Echtzeit, unter verschiedenen Bedingungen. Diese Technik verwendet Polystyrol Vertiefungen mit ICAM-1 beschichtet, um die Zelloberflächen, die die T-Zellen interagieren mit imitieren. Viele zuvor beschriebenen statischen T-Zell-Adhäsions-Assays wurden experimentell komplex. Diese Assays oft für T-Zellen erforderlich ist, um radioaktiv markiert werden kann, verwendet kultivierten Rinder-Hornhaut-Zellen eine extrazelluläre Matrix, als Substrat für die T-Zell-Adhäsion zu erzeugen, oder für nicht-physiologischen T-Zell-Stimulation über eine längere Dauer, um T-Zell-Adhäsion zu fördern 10 bezeichnet. Die Verwendung von fluorometrischen Messung an T-Zellen zu quantifizieren folgenden Haft Inkubation ist eine empfindliche und genaue Verfahren zur Quantifizierung verglichen mit Durchflusszytometrie und Mikroskopie fließen, wie sie in vielen Assaysystemen 11 verwendet. Zusätzlich einzelnen Zelle mikroskopischIC-Analyse von Integrin Lokalisation nicht für die breite Bevölkerung basierten Analyse in der gleichen Weise wie die fluorometrische Messung zu ermöglichen. Während Aktivierungszustand spezifische LFA-1-Antikörper sind kommerziell erhältlich, bieten diese Antikörper geringe Empfindlichkeit in Bezug auf die Methode, die hier skizziert. Der wesentliche Vorteil gegenüber alternativen Techniken ist die Einfachheit und die Fähigkeit, mehrere Versuchsbedingungen gleichzeitig zu untersuchen. Bei der Betrachtung dieser Verfahren für eine bestimmte Anwendung, sollte man berücksichtigen, dass T-Zellen sollten negativ gewählt werden, frisch isoliert und mit einem fluoreszierenden Marker markiert.
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Protocol
1. Beschichtung der Mikrotiterplatte Wells
Hinweis: Das Ziel dieses Schrittes ist die Beschichtung Polystyroloberflächen mit ICAM-1 als Liganden für die T-Zell-LFA-1 zu dienen.
- Bereiten Sie die folgenden Lösungen:
- Vorbereitung der Beschichtungslösung durch Resuspendieren rekombinantem ICAM-1 mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7,4) mit Calcium (1 mM angereichert CaCl 2) und Magnesium (2 nM MgCl 2). Achten Sie darauf, dass die endgültige Konzentration von ICAM-1 ist 10 ug / ml, von einer 0,7 mg / ml Stammlösung hergestellt und in einem -80 ° C Gefrierschrank aufbewahrt.
- Vorbereitung der Haftlösung durch Anreicherung PBS mit 0,5% menschlichem (oder Rinder-), Serumalbumin (HSA / BSA), 2 mM MgCl 2 und 1 mM CaCl 2.
- Bereiten Sie die Waschlösung durch Zugabe von 2 mM MgCl 2 und 1 mM CaCl 2 bis PBS. Warm alle Lösungen auf 37° C vor dem Gebrauch.
- Wasch 24 Vertiefungen mit 50 &mgr; l Waschlösung. Dazu gehören ungewaschenen Brunnen, positive (PMA behandelten Zellen) und negativ (unbeschichteten Wells) Kontrollen. Für jede Bedingung gesetzt mindestens drei Brunnen (dreifach).
- Dann werden 50 ul Beschichtungslösung in jede Vertiefung. Auf die unbeschichteten Kontrollvertiefungen nicht hinzufügen. Inkubieren für eine Stunde innerhalb 37 ° C Inkubator.
- Saugen Sie den Beschichtungslösung sanft, ohne dass die Spitze auf den Boden der Wells berühren. Einmal mit 50 &mgr; l der Waschlösung waschen.
- In 50 ul Haftlösung und inkubieren Sie die Platte für eine Stunde innerhalb 37 ° C Inkubator.
- Saugen Sie sanft und einmal waschen mit 50 ul Waschlösung. Verwenden Sie die Platte am selben Tag, jedoch ist es möglich, sie bei 4 ° C über Nacht zu halten und ihn am folgenden Tag.
2. T-Zell-Isolierung aus Blut
- In humanen T-Zell-Anreicherung Cocktail in 50 ul / ml of Vollblut (zB für 3 ml Antikoagulans (Heparin, EDTA oder Citrat) Vollblut, fügen Sie 150 ul Cocktail). Gut mischen.
- Inkubieren 20 min bei Raumtemperatur.
- In ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen 3 ml behandeltem Blut und ein gleiches Volumen von PBS (ohne Calcium und Magnesium) mit 1% D-Glucose bei Raumtemperatur angereichert. Mischen Sie vorsichtig mit einer Pasteur-Pipette.
- 15 ml Ficoll-Paque PLUS in das Zentrifugenröhrchen.
- Vorsichtig schichten 6 ml Blutprobe auf der Lymphozytenisolationsmedium verdünnt.
- Zentrifuge bei 400 g für 20 min bei 20 ° C mit Break aus.
- Zeichnen Sie die obere Schicht mit einem sauberen Pasteur-Pipette, so dass die Lymphozyten-Schicht ungestört an der Schnittstelle. Die obere Schicht des Plasma kann für eine spätere Verwendung gespeichert werden. Mit einem sauberen Pasteur-Pipette übertragen Sie die Lymphozytenschicht auf ein sauberes Zentrifugenrohr.
- Add 3 Volumina (9 ml) PBS zu den Lymphozyten. Suspend die Zellen durch leichtes draFlügel sie in eine und aus einer Pasteur-Pipette.
- Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei 20 ° C.
- Entfernen Sie den Überstand. Die Lymphozyten sollte nun in der geeigneten Medium zur Anwendung ausgesetzt. Übertragung der Zellen auf ein T-75 Kulturflasche in 20 ml RPMI 1640-Medium, enthaltend 10% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin.
3. Präparation der Zellen
Hinweis: Voraussetzung ist, dass die Zellen mit einem fluoreszierenden Reagens markiert werden. In diesem Protokoll Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE), aber das grün fluoreszierende Protein (GFP) exprimieren, Zellen sind eine akzeptable Alternative.
- Zählen 2,4 x 10 6 T-Zellen (1 × 10 5 pro Vertiefung) mit einer Zählkammer.
- Resuspendieren der Zellen in Kulturmedium kein Serum (Serumentzug). Die Zellen für 2 Stunden inkubieren bei 37 ° C im Brutschrank.
- Zentrifugieren der Zellen für 5 min (400 × g). Saugen Sie die Medien undResuspendieren in 1 ml PBS.
- In CFSE bei 1:1000 Verdünnung (Lager bis 5 mm). Cover von Licht und Inkubation für 8 min bei Raumtemperatur.
- Die Reaktion durch Zugabe von 10 ml 37 ° C PBS und Spin bei 400 g für 5 min.
- Resuspendieren Zellpellet mit 1,2 ml vorgewärmter Haftlösung (1 × 10 5 Zellen pro 50 ul).
4. Stimulation der Zellen
Hinweis: Um die Adhäsion zu initiieren, müssen Zellen stimuliert werden. Im folgenden Experiment werden die Zellen über die TCR-Verwendung von Anti-CD3-Antikörper stimuliert Vernetzungs jedoch löslich SDF-1 könnte als Alternative dienen. Je nach Ziel der Experimente könnten verschiedene pharmakologische Reagenzien vor oder während der Stimulation zugegeben werden, um die Auswirkungen auf zelluläre Adhäsion zu untersuchen. Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) ist ein Phorbolester, die strukturell ähnlich zu der zweiten Messenger Diacylglycerol (DAG) ist und somit aktiviert mehreren Kinases Downstream der TCR (hauptsächlich Protein Kinase C); Hier ist es als eine positive Kontrolle verwendet wird.
- Wärmen Sie die Mikrotiterplatte bis 37 ° C
- Teilen Sie die Zellen in 1,5 ml 8 leere Rohre (150 ul in jeder Röhre), ein Rohr für jede Bedingung.
- Behandeln Sie die Zellen entsprechend:
- Stimulieren Sie ein Rohr mit PMA bei 10 ng / ml als Positivkontrolle dienen. Halten Sie drei Rohre unbehandelt, als Steuer zur Stimulation ("keine Stimulation"), ungewaschen Ladekontrolle ("no wash") und Steuerung für ICAM-1-Beschichtung ("unbeschichtet") dienen.
- Stimulieren vier Röhren mit verschiedenen Konzentrationen von Anti-CD3-Antikörper (0,1, 1, 5 und 10 ug / ml). Fahren Sie mit dem nächsten Schritt ohne Verzögerungen.
- Aliquot 50 ul stimulierten Zellgemisch in jedem leeren Brunnen. Die endgültige Anzahl der Zellen pro 1 x 10 5.
- Setzen Sie den Mikroplatten im 37 ° C Inkubator für 15 min.
Hinweis: Einige T-Zelllinien erfordern kürzere Stimulation tion der Zeit. Während dieser Zeit werden die Zellen an den Boden der Wells niederzulassen und sich an die Zielliganden.
5. Abwaschen nicht adhärenten Zellen
Hinweis: Das Ziel dieses Schrittes ist es, Zellen, die nicht in der Lage, enge Kontakte mit dem Liganden-beschichteten Oberflächen zu bilden waren zu entfernen. Verwenden einer Mehrkanalpipette zu diesem Schritt, um zu gewährleisten, dass die gleiche physikalische Kräfte in jede Vertiefung aufgetragen. Es ist wichtig, die angegebenen Kontrollvertiefungen ungewaschen, in die Berechnung des Prozentsatzes der adhärenten Zellen behilflich zu halten.
- In 150 ul warmen Haftung Lösung zu jedem Brunnen. Schütteln Sie die Platte vorsichtig für einige Sekunden, bevor Sie das Medium aus den Vertiefungen. Den Boden der Wells Berühren Sie nicht mit den Tipps.
- Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. Ändern Sie die Richtung der Pipette beim Pipettieren der Puffer ein und aus.
6. Bestimmung der Prozentsatz der adhärenten Zellen
_content "> Hinweis: In diesem Schritt wird ein Fluoreszenzplattenlesegerät wird die Fluoreszenzintensität in jedem gut messen Die Intensität ist in direktem Zusammenhang mit der Anzahl der adhärenten Zellen..- Schalten Sie den Plattenlesegerät. Öffnen Sie die Platte-Reader-Software, indem Sie auf das Verknüpfungssymbol auf dem Desktop.
- Wählen Sie im Menü "Task" klicken Sie auf "Neu", um die Einrichtung eines neuen Protokolls.
- Wählen Sie im Menü "Aktionen" wählen Sie die Option "Lesen". Klicken Sie auf "Fluoreszenzintensität" und auf den "Ok"-Registerkarte.
- Wählen Sie im Dropdown-Menü wählen Sie "Anregungswellenlänge 485" und "Emissionswellenlänge 528". Drücken Sie die "OK"-Registerkarte.
- In "Optik" Optionsmenü wählen Sie "Bottom" und auf den "Ok"-Registerkarte. Gehen Sie zurück in das Menü "Aktionen" und die Temperatur auf 37 ° C und klicken Sie auf "Ok".
- Legen Sie die in den Mikroplattenleser undklicken Sie auf "Ausführen". Das Ergebnis wird in Excel-Tabelle exportiert werden.
- Der prozentuale Anteil der adhärenten Zellen unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: Anteil der anhaftenden Zellen = (durchschnittliche Fluoreszenzintensität in der gewaschenen Vertiefungen Lesen) / (durchschnittliche Fluoreszenzintensität in der gewaschenen Zellen gelesen) x 100%.
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Representative Results
Unten ist ein Beispiel der Adhäsion Assay unter Verwendung von primären T-Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von Anti-CD3-Antikörper stimuliert. Es ist nützlich, um die Fluoreszenz des ungewaschenen Zellen (dh die Gesamtbelastung) kennen. Unstimulierte Zellen dienen als negative Kontrolle und PMA-behandelten Zellen die positive Kontrolle für die Anti-CD3-Antikörper. Zellen in unbeschichteten Vertiefungen plattiert dienen als Kontrolle für ICAM-1. In einem typischen Versuch wurde der Anteil der adhärenten PMA behandelten Zellen zwischen 40% bis 50%, während der Prozentsatz der stimulierten Zellen zwischen 5% bis 10%. Eine alternative Methode zur Quantifizierung von Zellhaftfähigkeit durch eine Berechnung fache Zunahme der Fluoreszenzintensität in jedem Zustand über die der nicht-stimulierten Zellen.
Tabelle 1 zeigt die Fluoreszenzintensität von CFSE markierte primäre T-Zellen mit verschiedenen Dosen von löslichem anti-CD3-Antikörper stimuliert und auf ICAM-1-beschichteten Vertiefungen plattiert. Abbildung 1 zeigt repräsentative imAlter ähnliches Experiment. Die Zellen wurden aus dem peripheren Blut negativ selektiert. Nach Serumentzug für 2 Stunden wurden 2,4 × 10 6 Zellen mit CFSE gefolgt von Stimulation mit löslichem anti-CD3-Antikörper in verschiedenen Konzentrationen gekennzeichnet. Stimulierten Zellen wurden in ICAM-1-beschichteten Vertiefungen plattiert und für 15 min im Dunkeln inkubiert. Nach Inkubation wurden die nicht-adhärenten Zellen wurden dreimal gewaschen und die Fluoreszenzintensität wurde unter Verwendung eines Plattenlesegeräts bei 485 nm gemessen. PMA-behandelten und nicht-stimulierten Zellen wurden als Kontrollen verwendet. Beachten Sie, dass die erste Spalte (1A-1C) enthält Zellen, die nicht gewaschen wurden (Gesamtbeladung, z. B. 100%).
Figur 2 zeigt den Prozentsatz der T-Zell-Adhäsion auf der Basis der Fluoreszenz-Intensitäten in Tabelle 1 berechnet. Für jeden Zustand wird die durchschnittliche Intensität der drei Vertiefungen (dreifach) wurde berechnet, und aus der gesamten Zellen geladen in relativen Prozentsatz umgewandelt ( Nicht waschen Unbeschichtete Unstimulierte PMA Anti-CD3 0,1 &mgr; g / ml Anti-CD3 1 &mgr; g / ml Anti-CD3 5 &mgr; g / ml Anti-CD3-10 &mgr; g / ml 1 2 3 4 5 6 7 8 A 89652 611 5219 45873 8964 20157 37972 37972 B 90248 320 6049 7568 25486 32549 32549 C 88321 409 5456 42697 8542 24568 32892 3289
Tabelle 1. Fluoreszenzintensitätswerte der CFSE markierten primären T-Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von löslichem anti-CD3-Antikörper stimuliert. Die frisch geernteten Zellen wurden für zwei Stunden Serum gehungert und anschließend mit CFSE in einer Konzentration von 5 uM gekennzeichnet. Anschließend wurden die Zellen mit einer niedrigen (0,1 ug / ml) stimuliert, Medium (1 ug / ml), hoch (5 ug / ml) und sehr hoch (10 ug / ml) Konzentrationen von löslichem anti-CD3-Antikörper und 1 x 10 5 Zellen wurden in jede Vertiefung plattiert (mit ICAM-1, vorgezogen). Nach 15 min wurden die nicht-adhärenten Zellen durch drei serielle Waschungen entfernt. Die Anzahl der adhärenten Zellen wurde mit einem Plattenlesegerät als s gemessenhown in dieser Tabelle. Wells 1A-1C: ungewaschene Zellen; 2A-2C: unbeschichteten Vertiefungen; 3A bis 3C: unstimulierte Zellen; 4A-4C: Zellen mit 10 ng / ml PMA stimuliert; 5A-5C: Zellen mit niedriger Dosis Anti-CD3-Antikörper stimuliert; 6A-6C: Zellen mit mittleren Dosis von anti-CD3-Antikörper stimuliert; 7A-7C: Zellen mit hohen Dosen von Anti-CD3-Antikörper stimuliert; 8A-8C: Zellen mit sehr hoher Dosis anti-CD3 Antikörper stimuliert. 
Fig. 1 ist. Bilder von primären T-Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von löslichem anti-CD3-Antikörper stimuliert. Frisch geerntete Zellen wurden für zwei Stunden Serum gehungert und anschließend mit CFSE in einer Konzentration von 5 uM gekennzeichnet. Anschließend wurden die Zellen mit PMA (10 ng / ml) oder verschiedene Konzentrationen von Anti-CD3-Antikörper (0,1, 1, 5 und 10 ug / ml) stimuliert und plattiert aufICAM-1-beschichteten Oberflächen. Repräsentative Bilder wurden mit Zeiss 700 konfokalen Mikroskopie mit 20fach Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
2. Stimulation von T-Zellen mit hoher Dosis anti-CD3-Antikörper führt zu einer erhöhten Haftung. Graphisch dargestellte Darstellung der Prozent der T-Zell-Adhäsion, wie aus den in Tabelle 1 gezeigt. Der durchschnittliche Prozentsatz der anhaftenden Zellen berechnet wurde, berechnet relativ zu den Zellen, die ungewaschen 100% darstellen. Die Histogramme zeigen die Ergebnisse (Mittelwert ± SEM) aus mindestens 3 Vertiefungen. Bitte click hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Es gibt verschiedene Tests, um Signale an LFA-1-Aktivierung und T-Zell-Adhäsion 12 studieren. Durchflusszytometrie wird verwendet, um LFA-1-Affinität Zustände in lebenden Zellen messen mit monoklonalen Antikörpern, die selektiv entweder gebogen oder verlängert LFA-1 zu binden. Eine der Einschränkungen dieser Methode ist, dass es nicht auf das Konto der Integrine 'Gier zu nehmen. Migration-Assays sind nützliche Werkzeuge, aber sie mickrige Haftung an einem bestimmten Zeitpunkt zu messen Migration, und nicht. Mausmodelle, um T-Lymphozyten-Migration (zB Hautüberempfindlichkeit Modell) zu studieren sind physiologisch relevant, jedoch Anwendung dieser Modelle ist multifaktoriell und kompliziert auszuführen. Die wesentliche Stärke des hier beschriebenen statischen Adhäsionsassay ist seine Fähigkeit, sowohl die Bindungseigenschaften und Affinitäten auf einfache Weise zu messen. Ein weiterer Vorteil dieses Verfahrens ist seine Fähigkeit, eine kleine Anzahl von Zellen schnell und genau zu erfassen. Im Vergleich zu anderen Methoden ist es viel einfacher, manipulate die Zellen und behandeln sie mit verschiedenen Reagenzien in einem funktionellen Assay als die, die wir beschreiben. Darüber hinaus werden die adhärenten Zellen objektiv mit einem Plattenleser, die Beseitigung Vorspannung mit Hand zählt zugeordnet gezählt. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um die Wirkung mehrerer Medikamente oder Gene Manipulation auf der Klebevorgang zu screenen.
Diese Technik ist jedoch nicht frei von Einschränkungen. Eine potentielle Schwachpunkt ist die Tatsache, dass der Anteil der anhaftenden Zellen ist eine relative Zahl, die von einem Experiment zum anderen variieren kann. Ein weiterer Schwachpunkt ist die Tatsache, dass Hoch Lymphozyten können nicht verwendet werden, da diese stets frisch isoliert werden. Außerdem Haft Studien mit Zellen aus gefrorenen peripheren mononukleären Blutzellen gewonnen sind nicht konsistent. Es ist wichtig zu erwähnen, dass PMA konsequent arbeiten, und wir empfehlen, es in jedem Experiment. Eine positive und eine negative Kontrolle sind die ersten Schritte bei der Fehlersuche erfolglosen Versuchen. Im Falle fehlenderAugmented-Adhäsion in stimulierten Zellen, sollte die Konzentration des Zielliganden für die Vertiefungen überprüft werden. Zusätzlich ist es erforderlich, zu bestätigen, dass mehr als 95% der Zellen lebensfähig sind, und bei einer Zelllinie sollte ihre Wachstumsphase berechnet werden. Bei erheblichen Variabilität innerhalb der gleichen Bedingung, empfiehlt es sich, mehr als drei identischen Brunnen (mehr als dreifacher Ausfertigung) zu verwenden.
Um diesen Test zu schätzen ist es hilfreich, zu verstehen, daß einige Schritte in dem Protokoll wie die Inkubationszeit und die Zahl der ausgesäten Zellen muß gleichmäßig unter allen Bedingungen. Kleine Unterschiede in der Inkubationszeit können die Folge ist ungenauen Messungen. Es ist auch wichtig zu aliquoten genau die gleiche Anzahl von Zellen in jede Vertiefung. Zukünftige Anwendungen dieser Technik, die Verbesserung der Genauigkeit wäre eine automatisierte Version, die die Zellen zu laden und die Waschungen in einer objektiven Weise würde. Außerdem wird eine automatisierte Version uns ermöglichenzu großen Bildschirmen durchzuführen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Hirschil Trust, Michael Saperstein Medical Wissenschaftler Forschungsgelder und die NYU Whitehead Gemeinschaft unterstützt diese Arbeit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate reader | BioTek | Synergy H1 Hybrid | |
| Multichannel pipette | Fisher | 21-377-829 | |
| 96-well microplate with optical bottom | Corning Costar | 3603 | |
| Recombinant ICAM-1 | R&D Systems | ADP4-050 | |
| Anti-CD3 antibodies | Ancell | 144-020 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| CFSE | Molecular Probes | C1157 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| DPBS containing calcium and magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Peripheral lymphocytes | e.g. mouse or human | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | |
| Open Gen 5 software | BioTek | Version 2.01 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| 15 and 50 ml centrifuge tubes | Fisher | 352099, 352070 | |
| Disposable plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| T-75 culture flasks | Fisher | 50-754-1366 | |
| RosetteSep T cell enricment kit | StemCell Technologies | 15061 |
References
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