Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Brug fluorescerende proteiner til Monitor Glycosome dynamik i det afrikanske trypanosominfektion

doi: 10.3791/51647 Published: August 19, 2014

Abstract

Trypanosoma brucei er en kinetoplastid parasit, der forårsager menneskelig afrikansk trypanosomiasis (HAT), eller sovesyge, og en wasting disease, nagana i kvæg 1. Parasitten veksler mellem blodbane pattedyrsværten og tsetsefluen vektor. Sammensætningen af mange cellulære organeller ændringer som reaktion på disse forskellige ekstracellulære forhold 2-5.

Glycosomes er højt specialiserede peroxisomer, hvor mange af de enzymer, der er involveret i glykolysen er opdelte. Glycosome sammensætning ændringer i en udviklingsmæssig og miljømæssigt reguleret måde 4-11. I øjeblikket er de mest almindelige teknikker, der anvendes til at studere glycosome dynamik er elektron og fluorescens mikroskopi; teknikker, der er dyre, tid og arbejdskrævende, og ikke let tilpasses til højt gennemløb analyser.

For at overvinde disse begrænsninger, en fluorescerende-glycosome reporter systemsom forbedret gul fluorescerende protein (EYFP) er fusioneret til en peroxisome targetingsekvens (PTS2), som dirigerer fusionsproteinet glycosomes 12, er blevet etableret. Ved import af det PTS2eYFP fusionsproteinet glycosomes bliver fluorescerende. Organel nedbrydning og genanvendelse medfører tab af fluorescens, der kan måles ved flowcytometri. Store antal celler (5000 celler / sek) kan analyseres i realtid uden omfattende prøveforberedelse såsom fiksering og montering. Denne metode giver en hurtig måde at detektere ændringer i organel sammensætning som reaktion på svingende miljøforhold.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Trypanosoma brucei forårsager afrikansk sovesyge hos mennesker, og en wasting disease, nagana i kvæg. Lægemidler, der anvendes i behandlingen af disse sygdomme, er forældede og ekstremt giftigt, vacciner ikke er tilgængelige, og potentialet for udvikling af resistens nødvendiggør søgen efter nye lægemiddelkandidater 1.

I løbet af sin livscyklus, T. brucei, veksler mellem et insekt vektor og pattedyrværten; to værter, der præsenterer meget forskellige miljøer, hvor parasitten skal overleve. En række metaboliske og morfologiske ændringer forekomme som parasitten er udsat for forskellige miljøforhold. Nogle af de mest dramatiske ændringer observeres i single-membran-afgrænset parasit specifikke microbodies, kaldet glycosomes 13.

Glucose niveauer er relativt høj (~ 5 mm) i blodbanen og blodbanen parasitter (BSF) generere ATP udelukkende via glycolyse while mitokondrie stofskifte er undertrykt 14. I modsætning til andre eukaryoter, hvor glycolyse forekommer i cytoplasmaet, T. brucei compartmentalizes fleste af de glycolytiske enzymer i glycosomes 14,15. Parasitterne er taget op af tsetsefluen under en blodmel og opleve et fald i glukose, som falder til påviselige niveauer inden for 15 minutter for at blive indtaget af fluen. Metabolismen af insekt, procyklisk formular (PCF), parasitter er mere fleksibel og glucose, samt aminosyrer, såsom prolin, kan anvendes i syntesen af ATP 16-18. Sammenlignende proteom undersøgelser viser livscyklus afhængige ændringer i glycosomal og mitokondrielle proteiner med glycolytiske proteiner steg i blodbanen parasitter og mitokondrielle proteiner involveret i TCA cyklus og respiratoriske kæde 13,19. Mens mange undersøgelser har fokuseret på forskellene mellem BSF og PCF glycosomes vides der kun lidt om ændringerne i PCF glycosomes, der opstår som reaktion på ENVjøområdet ændringer.

I stortarmen af fluen, blodsukkerniveauet er lavt med forbigående stigninger i løbet af en fodring 20. I de fleste in vitro-undersøgelser, der PCF parasitter dyrkes i medier indeholdende glucose. Imidlertid har nyere undersøgelser vist, at PCF metabolisme ændringer betydeligt som reaktion på glucose tilgængelighed 17. I fravær af glucose, prolin optagelse og prolin dehydrogenase-aktivitet stigning på 18. Denne ændring i mitochondriel stofskifte sandsynligvis ledsaget af en ændring i glycosome sammensætning og morfologi, men dette er ikke blevet foretaget en direkte vurdering.

Elektron og fluorescens mikroskopi er almindelige teknikker, der anvendes til at studere glycosome dynamik i T. brucei 2,21-24. Disse protokoller er tid og arbejdskrævende, dyrt og vanskeligt at tilpasse sig til real-time undersøgelser og high throughput protokoller. For at overvinde denne begrænsning, en fluorescerende organel reportersystem used at studere organeller i mammale og gær-systemer er blevet modificeret til brug i T. brucei 12.

Fluorescerende-organel reportersystemer har været udbredt i højere eukaryoter, såsom gær, plante og mammale celler 25-27. I sådanne systemer er et fluorescerende protein, fusioneret til en aminosyresekvens, som målretter proteinet til specifikke organeller. Nedbrydningen eller syntese af de målrettede proteiner måles via fluorescens og ændringer i organel sammensætning afspejles af ændringer i celle fluorescens.

Når den åbne læseramme af et forstærket gult fluorescerende protein (EYFP) er fusioneret til en type II peroxisomal målretning sekvens (PTS2) 12 er PTS2eYFP proteinet importeres til modne, import-kompetent glycosomes og fluorescens kan overvåges via flowcytometri. Variationer i glycosome sammensætning afspejles af ændringer i cellulær fluorescens. Dette system kan hjælpe med resolVing de mekanismer, der regulerer miljømæssigt inducerede ændringer i glycosome sammensætning.

Dette håndskrift beskriver frembringelsen af ​​et glycosome reportersystem i PCF parasitter i forbindelse med flowcytometri til at overvåge realtid glycosome dynamik i levende parasitter, og er et eksempel på, hvordan den er blevet anvendt til at følge ændringer i glycosome præparat som respons på forskellige miljøer. Sammenfattende er glycosome sammensætning påvirkes af ekstracellulære glukosekoncentrationer og passage af log-fase kulturer i frisk medier udløser ændringer i glycosome sammensætning. Dette system kan modificeres til at studere dynamiske adfærd andre organeller i trypanosomer og andre parasitter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Generelt trypanosominfektion Dyrehold

  1. Faststoffer til SDM79 medier forberedelse (tabel 1) afvejes.
  2. Opbevares ved 4 ° C i 50 ml konisk eller en Ziploc pose. BEMÆRK: Reagenserne er stabile i mindst 6 måneder.
  3. Optø føtalt bovint serum (FBS) i en 37 ° C vandbad og blandes periodisk ved inversion. BEMÆRK: FBS modtages fra leverandøren som en steril opløsning. Filtersterilisere FBS reducerer dens evne til at understøtte parasit vækst.
  4. Når hele flasken er optøet, varme inaktivere serum i 30 minutter i et 56 ° C vandbad, blanding periodisk for at minimere udfældning af serumkomponenter.
  5. Tø penicillin / streptomycin-opløsning (pen / strep), hemin (2 mg / ml i 50 mM NaOH) og basale medium ørn vitamin opløsning ved stuetemperatur.
  6. Til en 1000 ml måleglas, tilsættes 20,2 g SDM79 faste stoffer (tabel 1) til de flydende komponenter (tabel 2) og bland godt på en røre plade.
  7. PH justeres til 7,35, og der fortyndes til 850 ml med vand.
  8. Filtersteriliser medier ved at fastgøre en vakuumslange til bunden af ​​et filter flaske. Påfør vakuum, indtil opløsningen filtreres.
  9. Fjern filter top i biosikkerhed kabinet, og der tilsættes 150 ml varmeinaktiveret FBS. Fjern plastovertræk fra steril hætte og forsegling medier flaske.
  10. Forbered SDM80 medier på samme måde som SDM79 med følgende undtagelser; ikke tilføje glucose eller glucosamin og bruge MEM uden glutamin. I stedet for 150 ml varmeinaktiveret FBS, tilsættes 135 ml dialyseret, varmeinaktiveret FBS, og 15 ml varmeinaktiveret FBS.
  11. Kultur PCF parasitter i 25 cm2 kolbe med 10 ml passende medium ved 27 ° C og 5% CO2. Bemærk: Der bør tælles dagligt Celler ved hjælp af et hæmocytometer eller et flowcytometer (se afsnit 6) og kulturer bør holdes ved densiteter på mellem 1 x 10 5 og 5 x 10 6 celler / ml.

2. Transfection af PCF Parasitter med Fluorescent reporterkonstruktion

BEMÆRK: For at følge glycosome dynamik, en reporter protein indeholdende den peroxisomale målretning sekvens (PTS2) i aldolase fusioneret til øget gult fluorescerende protein udtrykkes i parasitterne. Sekvensen koder for fusionsproteinet klones ind pXS2bla 12, som indeholder procyclin promotoren og tubulin intergeniske regioner, hvilket direkte homolog rekombination i genomet og Blasticidin resistens til selektion. Procykliske cellelinjer, der huser de gener, der koder for T7-polymerase og tetracyclin-repressoren (PF29-13) transformeres med targeting-konstruktet, pXS2: PTS2eYFP.

  1. Forbered cytomix ved at blande bestanddelene anført i tabel 3. Filtersteriliser og opbevares ved stuetemperatur.
  2. Linearisering af plasmid-DNA med Mlul ved pipettering 10 ul DNA (1 ug / ul), 5 ul restriktionsenzym-buffer, 33 pi vand og 2 μ; L MluI enzym i et mikrocentrifugerør. Der inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
  3. Renses restriktionsfordøjelse ved tilsætning af 1 volumen af ​​bindingsbuffer til enzymet restriktionsfordøjelse. Bland bindingspuffer og fordøjet DNA ved hvirvelbehandling. Kort fortalt centrifugeres til opsamling af prøven ved bunden af ​​røret.
  4. Indsæt en DNA-bindende kolonne i et 2 ml prøveglas og overførsel fordøjet DNA / bindende bufferopløsning til kolonne.
  5. Centrifuge til 10.000 xg i 1 min. Efter centrifugering kassere filtrat fra indsamling rør og søjlen tilbage til samlingen røret.
  6. Tilføj 700 pi SPW vaskebuffer og centrifugeres ved 10.000 xg i 1 min.
  7. Kassér filtrat fra indsamling rør, kolonnen tilbage til indsamling rør og gentag SPW vasketrin og centrifugering.
  8. Kassér filtratet returkolonne til samling rør og centrifugeres tom kolonne i 3 minutter ved 10.000 x g for at fjerne resterende ethanol.
  9. I en biosikkerhed skab, smider colsamlings rør og sted kolonne i et sterilt mikrocentrifugerør.
  10. For at eluere DNA'et, tilsættes 25 ul sterilt vand til søjlen og inkuberes ved stuetemperatur i 2 minutter. Centrifugeres ved 10.000 x g i 1 min.
  11. Tilføj yderligere 25 ul sterilt vand i biosikkerhed hætte til søjlen og inkuberes ved stuetemperatur i 2 minutter.
  12. Centrifugeres ved 10.000 xg hastighed i 1 min.
  13. I en biosikkerhed kabinet overføre hele mængden af ​​DNA til et nyt sterilt mikrocentrifugerør. BEMÆRK: Dette trin forhindrer forurening fra det åbne låget under centrifugering.
  14. Tilsæt sterilt, renset, lineariseret DNA (10 ug) til 400 ul filtersteriliseret cytomix.
  15. Tæl celler som beskrevet i afsnit 6 og høste 5 x10 7 -10 8 celler ved centrifugering ved 800 xg i 15 minutter ved stuetemperatur.
  16. Hæld supernatanten og resuspender cellepelleten i 450 pi DNA + cytomix under anvendelse af en 1 ml serologisk pipette.
  17. Overførsel opløsning indeholdende ce LLS, DNA og cytomix til en steril 4 mm hul kuvetten og sted kuvetten i elektroporation kammer.
  18. Vælg "Eksponentiel forfald", og angiv følgende indstillinger manuelt: Spænding: 1,5 kV, kapacitet: 25 mF, Resistance: Ω, og Cuvette: 4 mm. Tryk puls. Når pulsen er afsluttet, fjernes kuvette fra elektroporation kammer og vende tilbage til biosikkerhed kabinet.
  19. Ind i en ny steril kolbe afpipetteres 10 ml SDM79. Overfør de transformerede celler til kolben med 10 ml SDM79.
  20. Inkuber UDEN lægemiddel-selektion i 24 timer ved 27 ° C, 5% CO2. Efter 24 timer tilsættes G418 (15 ug / ml), hygromycin (50 ug / ml), og Blasticidin (10 ug / ml). Pass 1 ml transformerede celler med narkotika i 9 ml SDM79 med narkotika.
  21. Analyser celler dagligt som beskrevet i afsnit 6 og 7. Når celler er fluorescerende, og har nået en celletæthed på 1 x 10 7 / ml, gør stabilates til langtidsopbevaring (3,1-3,3).
ve_title "> 3. Making Stabilates

  1. For at gøre frysning medier, tilsættes et lige volumen af ​​100% glycerol til cytomix og filteret steriliseres.
  2. Tilsæt 200 pi frysning medier til 800 ul celler (1 x 10 7) i en cryovial, bland forsigtigt ved inversion og sted mellem to Styrofoam stativer og fryse ved -80 ° C.
  3. Når frosset (~ 24 timer), overføre celler til flydende nitrogen. BEMÆRK: Det er vigtigt at flytte celler i LN2 efter 24 timer, som længere opbevaring ved -80 ° C fører til et fald i cellelevedygtighed.

4. Optøning frosne lagre

  1. Fjern frosne hætteglas fra -80 ° C og optøning ved stuetemperatur i cirka 10 minutter.
  2. Der afpipetteres 9 ml SDM79 med lægemiddel i en ny steril kolbe. Tilføj optøede celler til denne kolbe. Pass celler 1:10 ved tilsætning af 1 ml af denne kultur til 9 ml SDM79 i en ny kolbe (slutkoncentration på 1 x 10 5 / ml).
  3. Inden cellerne når en densitet på 10 7 / ml begynder cytometeret indstillesog fortynding assays.

5. Cytometer Setup

  1. Tænd flowcytometret og åbn BerVBF Plus-programmet. BEMÆRK: Før du kører nogen prøver, bør fluidikken skal returskyllet og skylles efter trin 5,2-5,7.
  2. Udskift rør nanopure vand, hvori tår er lagret med et tomt rør.
  3. Vælg "backflush" knappen.
  4. Når backflush er afsluttet, fjernes mikrocentrifugerør fra sip og udsmid.
  5. Placer en ny mikrocentrifugerør indeholdende 1 ml ny nanopure vand på tår.
  6. Vælg en ny brønd i BerVBF programmet. Under "Run Grænser" sæt tid i 2 min. Under "Fluidik" vælg "hurtig" og "Kør".
  7. Når 2 min frist er færdig, klik på "Slet Sample data" knappen.

6. celletælling hjælp flowcytometret

  1. Sæt vand med prøven, der skal tælles. Indstil "Kør Grænser "til 30 sek," Fluidik "til" hurtig "og derefter vælge" Kør ".
  2. Efter 30 sek fristen er færdig, BerVBF plus vil give hændelser / ul under "Sidste Run". Gentag tæller for hver kultur. BEMÆRK: Før cellerne når 1 x 10 7 celler / ml, fortsæt med fortyndingsassay. Celler bør afbrydes efter en fortyndingsassay er afsluttet. Celler dyrket i længere perioder mister deres evne til at reagere på miljømæssige forhold.

7. måling af fluorescens ved hjælp flowcytometret

  1. For at vurdere fluorescens, sæt "Run Grænser" til 10.000 hændelser, og "Fluidik" til "langsom". Vælg "Indstil tærskel". Under "Primær Threshold", vælg "Permanent fjerne begivenheder på", "FSC-H" (i drop down boks) og indtaster mindre end 30.000. Klik på "Anvend" og derefter på "Luk".
  2. Vælg220; Histogram "knappen i en af ​​de nye plotvindue og vælg" FSC-A "fra drop down listen, skal du vælge" FL1-A ". BEMÆRK: FL1-A Foranstaltninger fluorescens i 530 nm bølgelængde.
  3. Vælg "Kør" og gentag for alle kulturer.
  4. Kør rengøring løsning gennem fluidikhovedet linje i 2 min og vand i 2 min.

8. Udvanding assays

  1. Pass celler til en densitet på 1 x 10 5 celler / ml i 3 ml SDM79 i en 25 cm2 dyrkningskolbe og måle fluorescens umiddelbart efter passage og derefter ved 3 timer og 24 timer.

9. Dataanalyse

  1. Vælg "Analyze" fanen på BerVBF Plus.
  2. Klik på "Histogram" knappen under "Lav en ny plot." Vælg "FSC-A" og en rulleliste vises. Vælg kanal "FL1-A".
  3. Fremhæv et godt at analysere. Vælg "Gate" knappen, og manuelt tegne en portfor befolkningen af ​​interesse.
  4. Flow Plus vil give celle "Count" i denne gate og "% af dette plot".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I dette system blev en glucose-afhængige ændringer i glycosome sammensætning overholdes. Når celler dyrkes i glucoseholdigt medie, bliver to populationer overholdes; en lyse og én dim (figur 2A). Dim celler havnen umodne glycosomes, der ikke har indført den PTS2eYFP mens lyse celler huser en blanding af modne og umodne glycosomes 12. Når glukose er til stede i medierne, mislocalization af glycosome proteiner er dødelig 15,28 og glycosome proteinekspression er sandsynligvis koblet tæt sammen med importen. Denne stramme regulering er ansvarlig for udseendet af dunkle celler, hvori glycosome protein-ekspression undertrykkes når cellerne mangler tilstrækkelig import kapacitet. Når glycosome import af maskiner er helt samlet og funktionelle, cellerne udtrykker glycosome proteiner, som derefter importeres til glycosomes, hvilket giver fluorescerende celler. Glukose-nedbryder medier, mislocalization af glycosome proteiner er tolerered 15 og den bimodale befolkningens fordeling er erstattet af en enkelt top med en bredere vifte af fluorescens (figur 2B).

Dette system er blevet anvendt til at identificere betingelser der udløser ændringer glycosome sammensætning. Når høj densitet kulturer indeholdende ~ 10% dim celler (figur 3A) er gået ind i friske medier, der er en forbigående stigning i procentdelen af dunkle celler (figur 3b). Ved 24 timer. den oprindelige befolkning fordeling genetableres (figur 3C).

SDM79 Tørstof Vægt (g / l)
Graces insekt cellemedier pulver 2
Glukose 1
HEPES 8
MOPS 5
NaHCO3 2
Natriumpyruvat 0.1
L-alanin 0.2
L-Arginin 0.1
L-Glutamin 0,3
L-Methonine 0.07
L-Phenylalanin 0.08
L-prolin 0.6
L-serin 0.06
L-taurin 0.16
L-threonin 0.35
L-Tyrosin 0.1
Adenosin 0.01
Guanosin 0.01
Glucosamin HCl 0.05
Folinsyre 0.004
r-aminobenzoesyre 0.002
Biotin 0,0002

Tabel 1. SDM79 faste komponenter. Solid mediekomponenter og mængden (g / l) er tilvejebragt.

SDM79
MEM med glutamin 600 ml
Pen / Strep 10 ml
BME vitaminopløsning 10 ml
MEM aminosyrer opløsning 8 ml
MEM ikke-væsentlige aminosyrer opløsning 6 ml
Hæmin 3.75
Vand 162,25 ml

Tabel 2. SDM79 flydende komponenter. Volumes ml er givet.

Til 20 ml
120 mM KCI 1,4 ml (1 M)
0,15 mM CaCl2 3 ml (1 M)
10 mM K 2 HPO 4 400 ml (0,5 M)
25 mM HEPES 500 ml (1 M)
2 mM EDTA 80 ml (0,5 M)
5 mM MgCI2 100 ml (1 M)
Vand 16.52

Tabel 3. cytomix opskrift.

Figur 1
Figur 1. Fluorescerende glycosome reportersystem. A) PTS2eYFP ekspressionskonstruktion integration. PCF trypanosomer blev transformeret med PXS2PTS2eYFP plasmid lineariseret med restriktionsenzymet MluI. Denne konstruktion integreres via homolog rekombination i tubulin locus (karbad) og PARP sekvenser (PARP) indeholder promotoren, der driver konstitutiv ekspression af PTS2eYFP og de ​​sekvenser, der kræves for RNA forarbejdning. B) PTS2eYFP import. PTS2eYFP syntetiseres i cytoplasmaet, hvor det binder opløselige receptor, PEX7, som leverer reporter protein til glycosomes. Når leveret til glycosome membran proteinet importeres. Modne organeller indeholder import af maskiner import PTS2eYFP og fluorescens, mens dem, der ikke indeholder funktionelle import af maskiner forblive Dim.

Figur 2
Figur 2. glukoseafhængig glycosome sammensætning. PCF celler blev dyrket i SDM79 (+ Glc) eller SDM80 (Glc), oganalyseret ved flowcytometri. Histogrammer for 10.000 begivenheder. A) analyse af celler dyrket i SDM79 konsekvent afslører to toppe. Fluorescerende celler huser en blanding af modne og umodne organeller med celler af højere fluorescensintensiteter har mere modne glycosomes. I SDM79, mislocalization af glycosome proteiner er dødelig og glycosome proteinekspression og import skal være stramt kontrolleret. Dette afspejles i fravær af celler med mellemliggende fluorescensintensiteter. B) I SDM80 er mislocalization af glycosome proteiner tolereres, den bimodale befolkningens fordeling er tabt, og celler af mellemliggende fluorescens overholdes.

Figur 3
Figur 3. Glycosome remodeling. Remodeling af glycosomes udløses ved passage ind i frisk medie. 6 / ml). B) 3 timer efter fortynding i frisk SDM79 er der en stigning i andelen af dunkle celler med umodne glycosomes henhører under venstre låge C ) Histogram af den fortyndede kultur efter 24 timer. Efter 24 timer er befolkningen fordelingen vendt tilbage til det normale, da de umodne glycosomes indeholder nu peroxisomet proteiner, der er nødvendige for at importere fluorescerende protein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Glycosomes er vigtige, dynamiske, parasit-specifikke organeller. De processer, der regulerer Biogenese, vedligeholdelse, spredning og ombygning af disse organeller sandsynligvis omfatte lægemiddelvirkninger, der kunne udnyttes til terapeutiske formål. På trods af den potentielt høj overflod af disse lægemiddelkandidater, har inden for glycosome biogenese haltet bag studiet af tilsvarende processer i andre organismer, overvejende på grund af manglen på et medgørligt, high-throughput-system ved at overvåge hurtige, dynamiske, organel reaktioner i levende celler.

Fluorescerende-organel reporter systemer er blevet anvendt til at undersøge organel dynamik i højere eukaryoter, såsom gær, planter, svampe og pattedyr 23-25. Vi har genereret en transgen stamme af PCF parasitter, som udtrykker PTS2eYFP, der er målrettet til modne glycosomes, hvilket gav fluorescerende organeller. Ændringer i glycosome sammensætning kan overvåges via følgende cellulær fluorescens. Ved hjælp af dette system, har vi fundet, at miljøforhold, bl.a. glucose, regulere glycosome sammensætning 12.

I modsætning til mikroskopimetoder ofte bruges til at studere organel dynamik i kinetoplastid parasitter denne reporter system tilbyder en metode til at hurtigt at screene forbindelser og forhold, der påvirker den samlede glycosome dynamik. Men ændringerne i fluorescens afspejler ændringer i de generelle organel sammensætninger. Yderligere biokemiske og mikroskopiske eksperimenter er forpligtet til at definere de specifikke molekylære forskelle mellem cellepopulationer udviser forskellige fluorescensintensiteter.

Vi har identificeret en række kritiske trin i ombygningen assays. Interessant nok har vi fundet, at når cellerne dyrkes i længere perioder (mere end to gennemløb), deres adfærd som reaktion på miljømæssige ændringer er uforudsigelig. Efter lang tids dyrkning celler gået fra høje tætheder i frisk medier, udviser en midlertidig stigning i den dunkle befolkning, hvilket indikerer, at de stadig er i stand til at omforme glycosomes, men dør efter 24 timer. Vi har også stødt på situationer, hvor ingen remodeling overholdes. Grunden til denne adfærd er uklar, men vi har fundet, at når celler behandles som beskrevet her (begrænse antallet af cellepassager til to og vedligeholdelse af kulturerne under 1 x 10 7 / ml) glycosome remodellering er reproducerbar. Når celler ikke længere reagerer på miljømæssige forhold, retransforming celler med reporter-konstruktionen plasmid normalt retsmidler denne situation.

Selv om dette system er blevet anvendt til at undersøge glycosome adfærd i afrikanske trypanosomer, kan det også blive benyttet for studiet af organeller i andre parasitter ved at fusionere fluorescerende proteiner til aminosyresekvenser, der direkte proteinlokalisering til andre cellulære rum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine Avocado Research Chemicals Ltd A10781 SDM79 Ingredient
L-Alanine Avocado Research Chemicals Ltd A15804 SDM79 Ingredient
L-Arginine CalBiochem 1820 SDM79 Ingredient
p-Aminobenzoic acid ICN Biomedicals 102569 SDM79 Ingredient
Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x) Sigma B6891 SDM79 Ingredient
Biotin Fisher BP232-1 SDM79 Ingredient
Calcium chloride VWR BDH0224 Cytomix
EDTA Fisher S311-100 Cytomix ingredient
EZNA Gel Extraction kit Omega Biotek D2500-01 DNA purifiation
Research grade Serum Fisher 03-600-511 SDM79 Ingredient
Folic acid ICN Biomedicals 101725 SDM79 Ingredient
Glucosamine HCl ICN Biomedicals 194671 SDM79 Ingredient
Glucose GIBCO 15023-021 SDM79 Ingredient
L-Glutamine CalBiochem 3520 SDM79 Ingredient
Glycerol Acros Organics Ac15892-0010 Freezing media
Graces insect cell media powder GIBCO 11300-043 SDM79 Ingredient
Hemin MP Biomedicals 194025 SDM79 Ingredient
Guanosine Avocado Research Chemicals Ltd A11328 SDM79 Ingredient
HEPES MP Biomedicals 194025 SDM79 Ingredient
Magnesium chloride Fisher BP214-500 Cytomix ingredient
L-Methionine Fisher BP388-100 SDM79 Ingredient
MEM Amino Acids (50x) Cellgro 25-030-CI SDM79 Ingredient
NEAA Mixture (100x) Lonza 13-114E SDM79 Ingredient
Minimal Essential Medium (1x) with L-glutamine Cellgro 10-010-CM SDM79 Ingredient
MOPS Fisher BP308-500 SDM79 Ingredient
Sodium biocarbonate Fisher S233-500 SDM79 Ingredient
Penicillin-streptomycin Solution Cellgro 30-002-CI SDM79 Ingredient
L-Phenylalanine ICN Biomedicals 102623 SDM79 Ingredient
Potassium chloride Fisher P217-500 Cytomix ingredient
Potassium phosphate dibasic anhydrous Fisheer P290-212 Cytomix ingredient
L-Proline Fisher BP392-100 SDM79 Ingredient
L-Serine Acros Organics 56-45-1 SDM79 Ingredient
Pyruvic acid, sodium salt Acros Organics 113-24-6 SDM79 Ingredient
L-Taurine TCI America A0295 SDM79 Ingredient
L-Threonine Acros Organics 72-19-5 SDM79 Ingredient
L-Tyrosine ICN Biomedicals 103183 SDM79 Ingredient
E.Z.N.A. Cycle Pure kit Omega Biotek D6492-02 DNA purification
Binding buffer Omega Biotek PDR041 DNA purification
SPW wash buffer Omega Biotek PDR045 DNA purification
Gene Pulser Xcell Biorad 165-2660 Trypanosome transformation
4 mm Electroporation cuvettes VWR Trypanosome transformation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stuart, K., et al. Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases. J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).
  2. Herman, M., Perez-Morga, D., Schtickzelle, N., Michels, P. A. Turnover of glycosomes during life-cycle differentiation of Trypanosoma brucei. Autophagy. 4, 294-308 (2008).
  3. Herman, M., Gillies, S., Michels, P. A., Rigden, D. J. Autophagy and related processes in trypanosomatids: insights from genomic and bioinformatic analyses. Autophagy. 2, 107-118 (2006).
  4. Michels, P. A., Bringaud, F., Herman, M., Hannaert, V. Metabolic functions of glycosomes in trypanosomatids. Biochim Biophys Acta. 1763, 1463-1477 (2006).
  5. Michels, P. A., et al. Peroxisomes, glyoxysomes and glycosomes (review). Mol Membr Biol. 22, 133-145 (2005).
  6. Moyersoen, J., Choe, J., Fan, E., Hol, W. G., Michels, P. A. Biogenesis of peroxisomes and glycosomes: trypanosomatid glycosome assembly is a promising new drug target. FEMS Microbiol Rev. 28, 603-643 (2004).
  7. Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes. Molecular and biochemical parasitology. 115, 19-28 (2001).
  8. Parsons, M. Glycosomes: parasites and the divergence of peroxisomal purpose. Mol Microbiol. 53, 717-724 (2004).
  9. Michels, P. A., Hannaert, V., Bringaud, F. Metabolic aspects of glycosomes in trypanosomatidae - new data and views. Parasitol Today. 16, 482-489 (2000).
  10. Michels, P. A., Hannaert, V. The evolution of kinetoplastid glycosomes. J Bioenerg Biomembr. 26, 213-219 (1994).
  11. Hannaert, V., Michels, P. A. Structure function, and biogenesis of glycosomes in kinetoplastida. J Bioenerg Biomembr. 26, 205-212 (1994).
  12. Bauer, S., Morris, J. C., Morris, M. T. Environmentally regulated glycosome protein composition in the african trypanosome. Eukaryot Cell. 12, 1072-1079 (2013).
  13. Colasante, C., Ellis, M., Ruppert, T., Voncken, F. Comparative proteomics of glycosomes from bloodstream form and procyclic culture form Trypanosoma brucei brucei. Proteomics. 6, 3275-3293 (2006).
  14. Opperdoes, F. R. Compartmentation of carbohydrate metabolism in trypanosomes. Annu Rev Microbiol. 41, 127-151 (1987).
  15. Kessler, P. S., Parsons, M. Probing the role of compartmentation of glycolysis in procyclic form Trypanosoma brucei: RNA interference studies of PEX14, hexokinase, and phosphofructokinase. The Journal of biological chemistry. 280, 9030-9036 (2005).
  16. Bringaud, F., Riviere, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and biochemical parasitology. 149, 1-9 (2006).
  17. Coustou, V., et al. Glucose-induced remodeling of intermediary and energy metabolism in procyclic Trypanosoma brucei. The Journal of biological chemistry. 283, 16342-16354 (2008).
  18. Lamour, N., et al. Proline metabolism in procyclic Trypanosoma brucei is down-regulated in the presence of glucose. The Journal of biological chemistry. 280, 11902-11910 (2005).
  19. Vertommen, D., et al. Differential expression of glycosomal and mitochondrial proteins in the two major life-cycle stages of Trypanosoma brucei. Molecular and biochemical parasitology. 158, 189-201 (2008).
  20. Vickerman, K. Developmental cycles and biology of pathogenic trypanosomes. British medical bulletin. 41, 105-114 (1985).
  21. Lorenz, P., Maier, A. G., Baumgart, E., Erdmann, R., Clayton, C. Elongation and clustering of glycosomes in Trypanosoma brucei overexpressing the glycosomal Pex11p. The EMBO journal. 17, 3542-3555 (1998).
  22. Saveria, T., et al. Conservation of PEX19-binding motifs required for protein targeting to mammalian peroxisomal and trypanosome glycosomal membranes. Eukaryot Cell. 6, 1439-1449 (2007).
  23. Banerjee, S. K., Kessler, P. S., Saveria, T., Parsons, M. Identification of trypanosomatid PEX19: functional characterization reveals impact on cell growth and glycosome size and number. Molecular and biochemical parasitology. 142, 47-55 (2005).
  24. Milagros Camara Mde, L., Bouvier, L. A., Miranda, M. R., Pereira, C. A. Identification and validation of Trypanosoma cruzi's glycosomal adenylate kinase containing a peroxisomal targeting signal. Experimental parasitology. 130, 408-411 (2012).
  25. Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. The Journal of cell biology. 136, 71-80 (1997).
  26. Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. The Journal of cell biology. 173, 521-532 (2006).
  27. Hoepfner, D., Schildknegt, D., Braakman, I., Philippsen, P., Tabak, H. F. Contribution of the endoplasmic reticulum to peroxisome formation. Cell. 122, 85-95 (2005).
  28. Furuya, T., et al. Glucose is toxic to glycosome-deficient trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14177-14182 (2002).
Brug fluorescerende proteiner til Monitor Glycosome dynamik i det afrikanske trypanosominfektion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bauer, S., Conlon, M., Morris, M. Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome. J. Vis. Exp. (90), e51647, doi:10.3791/51647 (2014).More

Bauer, S., Conlon, M., Morris, M. Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome. J. Vis. Exp. (90), e51647, doi:10.3791/51647 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter