Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

שימוש בחלבוני ניאון כדי לפקח Dynamics Glycosome בTrypanosome האפריקאי

doi: 10.3791/51647 Published: August 19, 2014

Abstract

Trypanosoma brucei הוא טפיל kinetoplastid שגורם trypanosomiasis אדם אפריקאי (HAT), או מחלת שינה, ומחלה ממארת, nagana, בבקר 1. חלופות הטפיל בין זרם הדם של המארח של היונקים ווקטור זבוב tsetse. הרכב רב אברונים תאיים משתנה בתגובה לתנאים תאיים השונים אלה 2-5.

Glycosomes הוא peroxisomes מאוד מיוחד שבו רב של האנזימים המעורבים בגליקוליזה הם ממודרים. Glycosome שינויי הרכב באופן התפתחותי ומוסדר לסביבה 4-11. נכון לעכשיו, את הטכניקות הנפוצות ביותר בשימוש ללמוד glycosome דינמיקה הן מיקרוסקופ אלקטרונים וקרינה; טכניקות שאינן יקר, זמן והעבודה אינטנסיבית, ולא בקלות הסתגל לתפוקה גבוהה מנתח.

כדי להתגבר על מגבלות אלה, מערכת כתב ניאון-glycosome בשהגדל חלבון צהוב ניאון (EYFP) הוא התמזגה לרצף peroxisome מיקוד (PTS2), המכוון את חלבון ההיתוך לglycosomes 12, כבר נקבע. על היבוא של חלבון היתוך PTS2eYFP, glycosomes הפך ניאון. השפלה אברון ותוצאות מחזור בהפסד של הקרינה שניתן למדוד על ידי cytometry זרימה. מספר גדול של תאים (5,000 תאים / sec) ניתן לנתח בזמן אמת ללא הכנת מדגם נרחבת כגון קיבעון והרכבה. שיטה זו מציעה דרך מהירה לזיהוי שינויים בהרכב אברון בתגובה לתנודות בתנאים סביבתיים.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Trypanosoma brucei גורם מחלה אפריקה שינה בבני אדם ומחלה ממארת, nagana, בבקר. תרופות המשמשות לטיפול במחלות אלה הן מיושנות ורעילים ביותר, חיסונים אינם זמינים, ואת הפוטנציאל לפיתוח עמידות לתרופה מחייב חיפוש אחר מטרות תרופה חדשות 1.

במהלך מחזור החיים שלה, ט brucei, מתחלף בין וקטור חרקים ומארח של יונקים; שני צבאות המציגים סביבות שונות מאוד שבו הטפיל חייב לשרוד. מספר השינויים מטבוליים ומורפולוגיים להתרחש כטפיל חשוף לתנאים סביבתיים שונים. חלק מהשינויים הדרמטיים ביותר שנצפו בmicrobodies הספציפי טפיל חד-מתוחם קרום, מכונה glycosomes 13.

רמות הגלוקוז גבוהות יחסית (~ 5 מ"מ) בזרם הדם וטפילי דם (BSF) לייצר ATP באופן בלעדי דרך ש"ש גליקוליזהחילוף חומרים במיטוכונדריה ile מודחק 14. בניגוד לאאוקריוטים אחרים בי הגליקוליזה מתרחשת בציטופלסמה, ט brucei ממדר את רוב אנזימי glycolytic בglycosomes 14,15. הטפילים נתפסים על ידי זבוב tsetse במהלך bloodmeal וחווים ירידה ברמת סוכר, שנופלת לרמות בלתי ניתנות לגילוי בתוך 15 דקות מנטילה על ידי הזבוב. חילוף החומרים של חרק, צורת procyclic (PCF), טפילים הוא גמישה יותר וגלוקוז, וכן חומצות אמינו כגון פרולין, ניתן להשתמש בסינתזה של ATP 16-18. מחקרי proteomic השוואתיים לגלות שינויי מחזור חיים תלויים בglycosomal וחלבוני המיטוכונדריה עם חלבוני glycolytic גדלו בטפילי דם וחלבוני המיטוכונדריה מעורבים במחזור TCA ושרשרת הנשימה 13,19. בעוד שמחקרים רבים התמקדו בהבדלים בין BSF וglycosomes PCF, מעט מאוד ידוע על השינויים בglycosomes PCF המתרחשים בתגובה לenvשינויי ironmental.

במעי האחורי של הזבוב, רמות הגלוקוז נמוכות עם עליות חולפות במהלך האכלה 20. ברוב בניסויים במבחנה, טפילי PCF גדלים בתקשורת המכילה גלוקוז. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי שינויי חילוף חומרים PCF באופן משמעותי בתגובה לגלוקוז זמינות 17. בהעדר של גלוקוז, ספיגת פרולין וגידול פעילות dehydrogenase פרולין 18. שינוי בחילוף החומרים במיטוכונדריה זה סביר מלווה בשינוי בהרכב glycosome ומורפולוגיה, עם זאת, זה לא העריך באופן ישיר.

אלקטרונים ומיקרוסקופ פלואורסצנטי הם טכניקות נפוצות בשימוש ללמוד דינמיקת glycosome בט brucei 2,21-24. פרוטוקולים אלה הם זמן ועבודה אינטנסיבית, יקרה, וקשה להסתגל ללימודים בזמן אמת ופרוטוקולי תפוקה גבוהה. כדי להתגבר על מגבלה זו, מערכת כתב ניאון-אברון uSED ללמוד האברונים במערכות יונקים ושמרים כבר שונה לשימוש בט brucei 12.

מערכות כתב הניאון-אברון נעשו שימוש נרחב באאוקריוטים גבוהים יותר כמו שמרים, צמח, ותאי יונקים 25-27. במערכות כאלה, חלבון פלואורסצנטי הוא התמזגו לרצף חומצות אמינו שמכוון את החלבון לאברונים ספציפיים. השפלה או הסינתזה של החלבונים הממוקדים נמדדה באמצעות הקרינה ושינויים בהרכב אברון באים לידי ביטוי בשינויים בקרינה סלולארי.

כאשר מסגרת הקריאה הפתוחה של חלבון משופר צהוב ניאון (EYFP) הוא התמזגה לרצף מיקוד peroxisomal הסוג II (PTS2) 12, חלבון PTS2eYFP מיובא לglycosomes בוגר, יבוא ומוסמך וקרינה יכולה להיות במעקב באמצעות cytometry זרימה. וריאציות בglycosome הרכב באות לידי ביטוי בשינויים בקרינה סלולרית. מערכת זו יכולה לסייע בResolוינג המנגנונים המווסתים את השינויים הנגרמים לסביבה בglycosome הרכב.

כתב יד זה מתאר את הדור של מערכת כתב glycosome בטפילי PCF בשיתוף עם cytometry הזרימה לעקוב אחר דינמיקת glycosome בזמן אמת בטפילים בשידור חיים ומספק דוגמא לאופן שנעשה בו שימוש כדי לעקוב אחר שינויים בglycosome הרכב בתגובה לסביבות שונות. לסיכום, glycosome הרכב מושפע מריכוזי גלוקוז תאיים והמעבר של תרבויות log-שלב לתקשורת טרי מעוררת שינויים בglycosome הרכב. מערכת זו יכולה להיות שונה כדי ללמוד את ההתנהגות הדינמית של אברונים אחרים בtrypanosomes וטפילים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

.1 כללי Trypanosome בעלי

  1. שוקל מוצקים להכנת SDM79 תקשורת (טבלה 1).
  2. חנות ב 4 ° C. ב50 חרוטי מ"ל או שקית ניילון אטומה. הערה: ריאגנטים יציבים במשך לפחות 6 חודשים.
  3. סרום הפשרת שור עוברי (FBS) בwaterbath 37 מעלות צלזיוס, ומערבבים מעת לעת על ידי היפוך. הערה: FBS מתקבל מהספק כפתרון סטרילי. מסנן עיקור FBS מפחית את יכולתה לתמוך בצמיחה טפילה.
  4. ברגע שכל הבקבוק מופשר, חום להשבית סרום ל30 דקות בwaterbath C 56 מעלות, ערבוב מעת לעת כדי למזער משקעים של רכיבים בסרום.
  5. פניצילין הפשרה / פתרון סטרפטומיצין (עט / סטרפטוקוקוס), hemin (2 מ"ג / מ"ל ​​ב50 מ"מ NaOH), ופתרון ויטמין נשר בינוני בסיסי בטמפרטורת חדר.
  6. ל1,000 מ"ל סיים גליל, להוסיף 20.2 גרם של מוצקי SDM79 (טבלה 1) לרכיבים נוזליים (טבלה 2) ומערבבים היטב על צלחת ומערבבים.
  7. כדי להתאים את pH 7.35, ולהביא נפח ל850 מ"ל עם מים.
  8. סנן לעקר תקשורת על ידי הצמדת צינור ואקום לחלק התחתון של בקבוק מסנן. החל ואקום עד הפתרון מסונן.
  9. הסר עליון מסנן בקבינט הבטיחות הביולוגי ולהוסיף 150 מ"ל של החום מומת FBS. מסיר את מכסה פלסטיק מכובע סטרילי ובקבוק תקשורת חותם.
  10. הכן תקשורת SDM80 באותו אופן כמו SDM79 עם החריגים הבאים; לא להוסיף סוכר באו גלוקוזאמין ולהשתמש MEM ללא גלוטמין. במקום של 150 מ"ל של החום מומת FBS, להוסיף 135 מ"ל של דיאליזה, חום מומת FBS, ו15 מ"ל של חום מומת FBS.
  11. טפילי PCF תרבות ב25 סנטימטר בקבוק 2 עם מדיום מתאים 10 מ"ל ב27 ° C ו 5% CO 2. הערה: תאים צריכים להיות נספרים מדי יום באמצעות hemocytometer או cytometer זרימה (ראה סעיף 6) ויש לשמור תרבויות בצפיפויות בין 1 x 10 5 ו 5 x 10 6 תאים / מ"ל.

2 Transfection של טפילי PCF עם Construct כתב הניאון

הערה: כדי לעקוב glycosome דינמיקה, חלבון כתב המכיל את רצף peroxisomal המיקוד (PTS2) של aldolase התמזג חלבון פלואורסצנטי צהוב משופר בא לידי ביטוי בטפילים. הרצף מקודד את חלבון ההיתוך משובט לתוך 12 pXS2bla, המכיל את אמרגן procyclin ואזורים חוץ-טובולין, שרקומבינציה ישירה הומולוגית לתוך הגנום וגן התנגדות blasticidin לבחירה. שורות תאי Procyclic מחסה הגנים המקודדים המדכא פולימראז וטטרציקלין T7 (PF29-13) הופכות עם מבנה המיקוד, pXS2: PTS2eYFP.

  1. הכן cytomix ידי ערבוב הרכיבים המפורטים בטבלה 3. סנן לעקר ולאחסן ב RT.
  2. Linearize פלסמיד דנ"א עם MluI ידי pipetting 10 μl של DNA (1 מיקרוגרם / μl), חיץ אנזים הגבלה 5 μl, מים 33 μl, ו2 μ; L של אנזים MluI לתוך צינור microcentrifuge. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  3. לטהר את ההגבלה לעכל על ידי הוספת נפח של 1 חיץ מחייב לאנזים ההגבלה לעכל. מערבבים חיץ מחייב וDNA מתעכל על ידי vortexing. בקצרה צנטריפוגות לאסוף הדגימה בחלק התחתון של הצינור.
  4. הכנס DNA מחייב עמודה לתוך צינור איסוף 2 מ"ל, והעברה מתעכל DNA / מחייבת פתרון חיץ לעמודה.
  5. צנטריפוגה ל10,000 XG דקות 1. לאחר צנטריפוגה, להשליך תסנין מצינור איסוף ולהחזיר את הטור לצינור האיסוף.
  6. הוסף 700 μl של חיץ לשטוף SPW ו צנטריפוגות ב XG 10,000 דקות 1.
  7. תסנין בטל מצינור איסוף, להחזיר את הטור לצינור האיסוף וחזור SPW שלב לשטוף וצנטריפוגה.
  8. תסנין בטל, טור חזרה לצינור איסוף, ו צנטריפוגות העמודה הריקה במשך 3 דקות ב 10,000 XG כדי להסיר אתנול השיורי.
  9. בארון בטיחות ביולוגי, לזרוק colצינור lection ועמודה מקום בצינור microcentrifuge סטרילי.
  10. לelute DNA, להוסיף 25 μl של מים סטריליים לעמודה ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 2 דקות. צנטריפוגה ב 10,000 XG דקות 1.
  11. הוסף עוד 25 μl של מים סטריליים במכסת מנוע בטיחות ביולוגית לעמודה ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 2 דקות.
  12. צנטריפוגה ב 10,000 מהירות XG דקות 1.
  13. בקבינט בטיחות ביולוגי להעביר נפח שלם של DNA לצינור microcentrifuge סטרילי חדש. הערה: פעולה זו מונעת זיהום מהמכסה הפתוחה במהלך צנטריפוגה.
  14. הוסף את DNA סטרילי, המטוהר, היא לינארית (10 מיקרוגרם) ל400 μl של cytomix פילטר מעוקר.
  15. ספירת תאים כאמור בסעיף 6 ולקצור 5 7 -10 8 תאים x10 על ידי צנטריפוגה ב800 XG במשך 15 דקות ב RT.
  16. יוצקים את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 450 μl של DNA + cytomix באמצעות פיפטה סרולוגית 1 מ"ל.
  17. העברת תמיסה המכילה ce LLS, DNA, וcytomix לקובט קובט הפער והמקום סטרילי 4 מ"מ בתא electroporation.
  18. בחר "דעיכה מעריכית" ולהזין באופן ידני את ההגדרות הבאות: מתח: 1.5 ק, קיבוליות: 25 MF, התנגדות: Ω, וקובט: 4 מ"מ. דופק לחץ. ברגע שהדופק הוא מלא, להסיר את קובט מתא electroporation ולחזור לארון הבטיחות הביולוגי.
  19. לתוך בקבוק סטרילי חדש, פיפטה 10 מ"ל של SDM79. להעביר את התאים הפכו לבקבוק עם 10 מ"ל של SDM79.
  20. דגירה ללא בחירת תרופה ל24 שעות ב27 ° C, 5% CO 2. לאחר 24 שעות, להוסיף G418 (15 מיקרוגרם / מ"ל), hygromycin (50 מיקרוגרם / מ"ל), וblasticidin (10 מיקרוגרם / מ"ל). Pass 1 מ"ל של תאים הפכו עם תרופה ל9 מ"ל של SDM79 עם סמים.
  21. לנתח תאים יומיים כמפורט בסעיפים 6 ו -7 כאשר תאי ניאון, והגיע לצפיפות תאים של 1 x 10 7 / מ"ל, להפוך stabilates לאחסון לטווח ארוך (3.1-3.3).
ve_title "> 3. ביצוע Stabilates

  1. כדי להפוך הקפאת תקשורת, מוסיף נפח שווה של גליצרול 100% לcytomix ומסנן לעקר.
  2. הוסף 200 μl של תקשורת הקפאה ל800 μl של תאים (1 x 10 7) בcryovial, מערבב בעדינות על ידי היפוך ומקום בין שני מדפי קלקר ולהקפיא ב -80 מעלות צלזיוס.
  3. ברגע קפוא (~ שעה 24), תאי העברה לחנקן נוזלי. הערה: חשוב לעבור תאים לתוך LN 2 לאחר 24 שעות, כאחסון ארוך יותר ב -80 ° C גורם לירידה בכדאיויות תא.

.4 מניות הפשרה קפואה

  1. הסר בקבוקון קפוא מ-80 ° C והפשרה על RT כ 10 דקות.
  2. 9 מ"ל פיפטה של ​​SDM79 עם סמים לתוך בקבוק סטרילי חדש. הוספת תאים מופשרים לבקבוק הזה. עובר תאים 01:10 על ידי הוספת 1 ​​מ"ל של תרבות זו עד 9 מ"ל של SDM79 בבקבוק חדש (ריכוז סופי של 1 x 10 5 / מ"ל).
  3. לפני התאים להגיע לצפיפות של 10 7 / מ"ל, להתחיל להגדיר cytometerומבחני דילול.

.5 הגדרת Cytometer

  1. הפעל את הזרימה cytometer ולפתוח תכנית CFlow פלוס. הערה: לפני הפעלת כל דגימות, יש backflushed fluidics ושטף על פי צעדים 5.2-5.7.
  2. החלף את הצינור של המים nanopure בי הלגימה מאוחסנת עם צינור ריק.
  3. בחר בלחצן "backflush".
  4. ברגע שbackflush הוא מלא, להסיר צינור microcentrifuge מלגימה וזורק.
  5. הנח צינור microcentrifuge חדש המכיל 1 מ"ל של המים nanopure חדשים בלגימה.
  6. בחר גם חדש בתכנית CFlow. תחת "מגבלות הפעלה" להגדיר זמן למשך 2 דקות. תחת "fluidics" בחר באפשרות "מהיר" ועל "הפעל".
  7. ברגע שמגבלת הזמן 2 דק 'היא מלאה, לחץ על לחצן "מחיקת נתונים לדוגמא".

.6 ספירת תאים באמצעות Cytometer הזרימה

  1. להחליף מים עם את המדגם כדי לספור. הגדר "גבולות לרוץ "ל30 שניות," fluidics "ל" מהיר "ולאחר מכן בחרו באפשרות" הפעלה ".
  2. לאחר מגבלת זמן 30 שניות היא מלאה, CFlow בתוספת תספק את האירועים / μl תחת "הפעלה האחרונה." ספירה חוזרת לכל תרבות ותרבות. הערה: לפני תאים להגיע 1 x 10 7 תאים / מ"ל, להמשיך עם assay דילול. יש להפסיק את התאים לאחר assay דילול אחד הושלם. תאים בתרבית לתקופות ארוכות יותר לאבד את היכולת שלהם להגיב לתנאי סביבה.

.7 הקרינה מדידה באמצעות Cytometer הזרימה

  1. כדי להעריך הקרינה, להגדיר "גבולות הפעלה" ל10,000 אירועים, ו" fluidics "ל" איטי". בחר באפשרות "סף הגדר". תחת "סף ראשוני", בחר "לצמיתות לחסל אירועים ב"," FSC-H "(בתיבה נפתחת) והזן פחות מ 30,000. לחץ על "החל", ואז "קרוב".
  2. בחר220; "כפתור באחד חלונות העלילה החדשים ובחר באפשרות" היסטוגרמה FSC-"מרשימה הנפתחת, בחר" FL1-". הערה: הקרינה אמצעי FL1-באורך גל 530 ננומטר.
  3. בחר "הפעלה" וחזור על פעולה עבור כל התרבויות.
  4. הפעל ניקוי פתרון דרך קו fluidics למשך 2 דקות ומים למשך 2 דקות.

.8 מבחני דילול

  1. עובר תאים לצפיפות של 1 x 10 5 תאים / מ"ל ב 3 מ"ל של SDM79 בבקבוק 2 תרבות 25 סנטימטר ולמדוד בתפרחת מייד לאחר מעבר ולאחר מכן בשעה 3 ו24 שעות.

ניתוח .9 נתונים

  1. בחר באפשרות "נתח" לשונית בCFlow פלוס.
  2. לחץ על לחצן "היסטוגרמה" תחת "הפוך עלילה חדשה." בחר "FSC-" ורשימה נפתחת יופיע. ערוץ בחר "FL1-."
  3. סמן גם לנתח. בחר כפתור "שער", ולצייר שער באופן ידנילאוכלוסייה של עניין.
  4. זרימת פלוס תספק "רוזן" תא בתוך השער הזה ו"% ממגרש זה ".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

במערכת זו, שינוי גלוקוז תלוי בglycosome הרכב נצפה. כאשר תאים גדלים בתקשורת המכילה גלוקוז, שתי אוכלוסיות הם נצפו; בהיר אחד ועמום אחד (איור 2 א). תאים עמומים נמל glycosomes לא בוגר, אשר אינו מיובאים PTS2eYFP תוך תאים בהירים נמל תערובת של glycosomes הבוגר והבשל 12. כאשר גלוקוז נוכח בתקשורת, mislocalization של glycosome חלבונים הוא קטלני 15,28 וglycosome ביטוי חלבון סביר בשילוב הדוק עם יבוא. רגולציה הדוקה זו אחראית על המראה של תאים עמומים שבי glycosome ביטוי חלבון מדוכא כאשר התאים חסרי יכולת יבוא מספיק. ברגע שמכונה יבוא glycosome מורכב ומתפקד באופן מלא, התאים להביע glycosome חלבונים, אשר לאחר מכן מיובאים לglycosomes, מניב תאי ניאון. בתקשורת גלוקוז-ימוצה, mislocalization של glycosome חלבונים הוא לסבולד 15, והתפלגות אוכלוסיית bimodal הוא הוחלף על ידי שיא יחיד עם מגוון רחב יותר של הקרינה (איור 2).

מערכת זו נעשתה שימוש כדי לזהות תנאים המפעילים שינויים בglycosome הרכב. כאשר תרבויות צפיפות גבוהות המכילות ~ תאים עמומים 10% (איור 3 א) מועברות לתקשורת טריות, יש עלייה חולפת באחוז התאים העמומים (איור 3 ב). על ידי 24 שעות. התפלגות האוכלוסייה המקורית מחדש (איור 3 ג).

SDM79 מוצקים משקל (ג / ליטר)
גינוני אבקת תקשורת סלולארי חרקים 2
גלוקוז 1
HEPES 8
מגבים 5
NaHCO 3 2
פירובט נתרן 0.1
L-אלאנין 0.2
L-ארגינין 0.1
L-גלוטמין 0.3
L-Methonine 0.07
L-פנילאלנין 0.08
L-פרולין 0.6
L-סרין 0.06
L-טאורין 0.16
L-תראונין 0.35
L-טירוזין 0.1
אדנוזין 0.01
Guanosine 0.01
גלוקוזמין HCl 0.05
חומצה פולית 0.004
r-aminobenzoic חומצה 0.002
ביוטין 0.0002

טבלה 1 SDM79 רכיבים מוצקים. רכיבי תקשורת מוצקים וכמות (גר '/ ליטר) מסופקים.

SDM79
ממ עם גלוטמין 600 מ"ל
העט / סטרפטוקוקוס 10 מ"ל
פתרון ויטמין BME 10 מ"ל
פתרון חומצות אמינו MEM 8 מ"ל
פתרון שאינו חיוני MEM חומצת אמינו 6 מ"ל
Hemin 3.75
מים 162.25 מ"ל

ניתנים מ"ל טבלה 2 SDM79 רכיבים נוזליים. כרכים.

ל20 מ"ל
120 מ"מ KCl 1.4 מ"ל (M 1)
0.15 מ"מ CaCl 2 3 מ"ל (M 1)
10 מ"מ K 2 HPO 4 400 מ"ל (0.5 M)
25 HEPES מ"מ 500 מ"ל (M 1)
2 מ"מ EDTA 80 מ"ל (0.5 M)
5 מ"מ MgCl 2 100 מ"ל (M 1)
מים 16.52

לוח 3: מתכון Cytomix.

איור 1
איור 1 מערכת כתב glycosome פלורסנט. ) שילוב מבנה ביטוי PTS2eYFP. trypanosomes PCF הפכו עם PXפלסמיד S2PTS2eYFP ינארית עם אנזים הגבלת MluI. מבנה זה משלב באמצעות רקומבינציה הומולוגית למוקד טובולין (אמבטיה) ורצפי PARP (PARP) כולל אמרגן שמניע את הביטוי המכונן של PTS2eYFP ויבוא PTS2eYFP רצפים נדרשים לRNA עיבוד. B). PTS2eYFP מסונתז בציטופלסמה, שם הוא נקשר לקולטן מסיס, PEX7, אשר מספק חלבון הכתב לglycosomes. ברגע שנמסר לקרום glycosome, החלבון מיובא. אברונים מבוגרים המכילים PTS2eYFP יבוא מכונות יבוא וקרינה ואילו אלה שאינם מכילים מכונות יבוא פונקציונליות יישארו עמומים.

איור 2
תאי PCF איור 2 גלוקוז תלוי glycosome הרכב. גדלו בSDM79 (+ Glc) או SDM80 (-Glc) ונותח על ידי cytometry זרימה. היסטוגרמות של 10,000 אירועים.) ניתוח של תאים שגודלו בSDM79 מגלה באופן עקבי שתי פסגות. תאי ניאון נמל תערובת של האברונים בוגרים ובשלה עם תאים של עוצמות הקרינה גבוהות שיש glycosomes בוגר יותר. בSDM79, mislocalization של glycosome חלבונים הוא קטלני וglycosome ביטוי חלבון ויבוא חייב להיות מבוקר היטב. הדבר בא לידי הביטוי בהעדר תאים עם עוצמות הקרינה ביניים. B) בSDM80, mislocalization של glycosome חלבונים נסבל, התפלגות אוכלוסיית bimodal הולכת לאיבוד, ותאים של הקרינה ביניים הם נצפו.

איור 3
איור 3 Glycosome שיפוץ. שיפוץ של glycosomes מופעל על ידי מעבר לתקשורת טרי. 6 /. B) 3 שעות לאחר הדילול לSDM79 הטרי יש עלייה בחלקם של תאים עמומים עם glycosomes לא בוגר נופל בתוך השער השמאלי C מ"ל) היסטוגרמה) של התרבות בדילול מלא לאחר 24 שעות. לאחר 24 שעות, חלוקת האוכלוסייה חזרה לקדמותו, כפי שglycosomes בשלה כעת מכילה את חלבוני peroxisome צורך לייבא חלבון פלואורסצנטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Glycosomes הם אברונים חיוניים, דינמיים, טפיל ספציפי. התהליכים המסדירים את קיום חיים, תחזוקה, השגשוג והשיפוץ של אברונים אלה צפויים לכלול יעדי תרופה שניתן לנצל למטרות טיפוליות. למרות פוטנציאל גבוה השפע של מטרות תרופה כזו, תחום glycosome biogenesis מפגר אחרי המחקר של תהליכים דומים באורגניזמים אחרים, ברובה בשל היעדרה של מערכת צייתנית, תפוקה גבוהה שבו כדי לפקח על תגובות מהירות, דינמיות, אברון בתאים חיים.

מערכות כתב ניאון-אברון היו בשימוש ללמוד דינמיקת אברון אאוקריוטים גבוהים יותר כמו שמרים, צמחים, פטריות ויונקים 23-25. יש לנו נוצרו מתח מהונדס של טפילי PCF שמבטאים PTS2eYFP כי הוא ממוקד להבשיל glycosomes, מניב אברונים ניאון. שינויים בהרכב glycosome ניתן לנטר באמצעות הקרינה סלולרית הבאה. באמצעות מערכת זו, מצאנו כי תנאים סביבתיים, בעיקר גלוקוז, להסדיר glycosome הרכב 12.

בניגוד למיקרוסקופ שיטות המשמשות לעתים קרובות ללמוד דינמיקת אברון בטפילי kinetoplastid, מערכת הכתב הזה מציעה שיטה שבאמצעותה למסך במהירות תרכובות ותנאים המשפיעים על דינמיקת glycosome כוללת. עם זאת, השינויים בקרינה משקפים את השינויים בהרכבים אברון הכוללים. ניסויים ביוכימיים ומיקרוסקופים נוספים נדרשים כדי להגדיר את ההבדלים מולקולריים הספציפיים בין אוכלוסיות תאים מציגים עוצמות הקרינה שונות.

אנו זיהינו מספר הצעדים קריטיים במבחני שיפוץ. מעניין, מצאנו כי כתאים בתרבית לתקופות ארוכות יותר (יותר משני עוברת), ההתנהגות שלהם בתגובה לשינויים סביבתיים היא בלתי צפויה. לאחר culturing הממושך, תאים עברו מצפיפויות גבוהות למ 'טריעדיה, להציג עלייה זמנית באוכלוסייה העמומה, מצביע על כך שהם עדיין מסוגלים לשפץ glycosomes, אבל למות לאחר 24 שעות. יש לנו גם נתקלו במצבים שבם אין שיפוץ הוא ציין. הסיבה להתנהגות זו היא לא ברורה, אבל יש לנו מצאתי כי כאשר תאי מטופלות כפי שמתואר כאן (הגבלת מספר מעברי תא לשתיים ושמירה על תרבויות מתחת ל -1 x 10 7 / מ"ל), glycosome שיפוץ הוא לשחזור. כאשר תאים כבר אינם מגיבים לתנאי סביבה, retransforming תאים עם פלסמיד כתב-המבנה בדרך כלל תרופות למצב זה.

בעוד מערכת זו נעשתה שימוש כדי ללמוד glycosome התנהגות בtrypanosomes האפריקאי, זה גם יכול להיות מאומץ לחקר האברונים בטפילים אחרים על ידי איחוי חלבוני ניאון לרצף חומצות האמיניות שלוקליזציה חלבון ישיר לתאים סלולריים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine Avocado Research Chemicals Ltd A10781 SDM79 Ingredient
L-Alanine Avocado Research Chemicals Ltd A15804 SDM79 Ingredient
L-Arginine CalBiochem 1820 SDM79 Ingredient
p-Aminobenzoic acid ICN Biomedicals 102569 SDM79 Ingredient
Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x) Sigma B6891 SDM79 Ingredient
Biotin Fisher BP232-1 SDM79 Ingredient
Calcium chloride VWR BDH0224 Cytomix
EDTA Fisher S311-100 Cytomix ingredient
EZNA Gel Extraction kit Omega Biotek D2500-01 DNA purifiation
Research grade Serum Fisher 03-600-511 SDM79 Ingredient
Folic acid ICN Biomedicals 101725 SDM79 Ingredient
Glucosamine HCl ICN Biomedicals 194671 SDM79 Ingredient
Glucose GIBCO 15023-021 SDM79 Ingredient
L-Glutamine CalBiochem 3520 SDM79 Ingredient
Glycerol Acros Organics Ac15892-0010 Freezing media
Graces insect cell media powder GIBCO 11300-043 SDM79 Ingredient
Hemin MP Biomedicals 194025 SDM79 Ingredient
Guanosine Avocado Research Chemicals Ltd A11328 SDM79 Ingredient
HEPES MP Biomedicals 194025 SDM79 Ingredient
Magnesium chloride Fisher BP214-500 Cytomix ingredient
L-Methionine Fisher BP388-100 SDM79 Ingredient
MEM Amino Acids (50x) Cellgro 25-030-CI SDM79 Ingredient
NEAA Mixture (100x) Lonza 13-114E SDM79 Ingredient
Minimal Essential Medium (1x) with L-glutamine Cellgro 10-010-CM SDM79 Ingredient
MOPS Fisher BP308-500 SDM79 Ingredient
Sodium biocarbonate Fisher S233-500 SDM79 Ingredient
Penicillin-streptomycin Solution Cellgro 30-002-CI SDM79 Ingredient
L-Phenylalanine ICN Biomedicals 102623 SDM79 Ingredient
Potassium chloride Fisher P217-500 Cytomix ingredient
Potassium phosphate dibasic anhydrous Fisheer P290-212 Cytomix ingredient
L-Proline Fisher BP392-100 SDM79 Ingredient
L-Serine Acros Organics 56-45-1 SDM79 Ingredient
Pyruvic acid, sodium salt Acros Organics 113-24-6 SDM79 Ingredient
L-Taurine TCI America A0295 SDM79 Ingredient
L-Threonine Acros Organics 72-19-5 SDM79 Ingredient
L-Tyrosine ICN Biomedicals 103183 SDM79 Ingredient
E.Z.N.A. Cycle Pure kit Omega Biotek D6492-02 DNA purification
Binding buffer Omega Biotek PDR041 DNA purification
SPW wash buffer Omega Biotek PDR045 DNA purification
Gene Pulser Xcell Biorad 165-2660 Trypanosome transformation
4 mm Electroporation cuvettes VWR Trypanosome transformation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stuart, K., et al. Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases. J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).
  2. Herman, M., Perez-Morga, D., Schtickzelle, N., Michels, P. A. Turnover of glycosomes during life-cycle differentiation of Trypanosoma brucei. Autophagy. 4, 294-308 (2008).
  3. Herman, M., Gillies, S., Michels, P. A., Rigden, D. J. Autophagy and related processes in trypanosomatids: insights from genomic and bioinformatic analyses. Autophagy. 2, 107-118 (2006).
  4. Michels, P. A., Bringaud, F., Herman, M., Hannaert, V. Metabolic functions of glycosomes in trypanosomatids. Biochim Biophys Acta. 1763, 1463-1477 (2006).
  5. Michels, P. A., et al. Peroxisomes, glyoxysomes and glycosomes (review). Mol Membr Biol. 22, 133-145 (2005).
  6. Moyersoen, J., Choe, J., Fan, E., Hol, W. G., Michels, P. A. Biogenesis of peroxisomes and glycosomes: trypanosomatid glycosome assembly is a promising new drug target. FEMS Microbiol Rev. 28, 603-643 (2004).
  7. Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes. Molecular and biochemical parasitology. 115, 19-28 (2001).
  8. Parsons, M. Glycosomes: parasites and the divergence of peroxisomal purpose. Mol Microbiol. 53, 717-724 (2004).
  9. Michels, P. A., Hannaert, V., Bringaud, F. Metabolic aspects of glycosomes in trypanosomatidae - new data and views. Parasitol Today. 16, 482-489 (2000).
  10. Michels, P. A., Hannaert, V. The evolution of kinetoplastid glycosomes. J Bioenerg Biomembr. 26, 213-219 (1994).
  11. Hannaert, V., Michels, P. A. Structure function, and biogenesis of glycosomes in kinetoplastida. J Bioenerg Biomembr. 26, 205-212 (1994).
  12. Bauer, S., Morris, J. C., Morris, M. T. Environmentally regulated glycosome protein composition in the african trypanosome. Eukaryot Cell. 12, 1072-1079 (2013).
  13. Colasante, C., Ellis, M., Ruppert, T., Voncken, F. Comparative proteomics of glycosomes from bloodstream form and procyclic culture form Trypanosoma brucei brucei. Proteomics. 6, 3275-3293 (2006).
  14. Opperdoes, F. R. Compartmentation of carbohydrate metabolism in trypanosomes. Annu Rev Microbiol. 41, 127-151 (1987).
  15. Kessler, P. S., Parsons, M. Probing the role of compartmentation of glycolysis in procyclic form Trypanosoma brucei: RNA interference studies of PEX14, hexokinase, and phosphofructokinase. The Journal of biological chemistry. 280, 9030-9036 (2005).
  16. Bringaud, F., Riviere, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and biochemical parasitology. 149, 1-9 (2006).
  17. Coustou, V., et al. Glucose-induced remodeling of intermediary and energy metabolism in procyclic Trypanosoma brucei. The Journal of biological chemistry. 283, 16342-16354 (2008).
  18. Lamour, N., et al. Proline metabolism in procyclic Trypanosoma brucei is down-regulated in the presence of glucose. The Journal of biological chemistry. 280, 11902-11910 (2005).
  19. Vertommen, D., et al. Differential expression of glycosomal and mitochondrial proteins in the two major life-cycle stages of Trypanosoma brucei. Molecular and biochemical parasitology. 158, 189-201 (2008).
  20. Vickerman, K. Developmental cycles and biology of pathogenic trypanosomes. British medical bulletin. 41, 105-114 (1985).
  21. Lorenz, P., Maier, A. G., Baumgart, E., Erdmann, R., Clayton, C. Elongation and clustering of glycosomes in Trypanosoma brucei overexpressing the glycosomal Pex11p. The EMBO journal. 17, 3542-3555 (1998).
  22. Saveria, T., et al. Conservation of PEX19-binding motifs required for protein targeting to mammalian peroxisomal and trypanosome glycosomal membranes. Eukaryot Cell. 6, 1439-1449 (2007).
  23. Banerjee, S. K., Kessler, P. S., Saveria, T., Parsons, M. Identification of trypanosomatid PEX19: functional characterization reveals impact on cell growth and glycosome size and number. Molecular and biochemical parasitology. 142, 47-55 (2005).
  24. Milagros Camara Mde, L., Bouvier, L. A., Miranda, M. R., Pereira, C. A. Identification and validation of Trypanosoma cruzi's glycosomal adenylate kinase containing a peroxisomal targeting signal. Experimental parasitology. 130, 408-411 (2012).
  25. Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. The Journal of cell biology. 136, 71-80 (1997).
  26. Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. The Journal of cell biology. 173, 521-532 (2006).
  27. Hoepfner, D., Schildknegt, D., Braakman, I., Philippsen, P., Tabak, H. F. Contribution of the endoplasmic reticulum to peroxisome formation. Cell. 122, 85-95 (2005).
  28. Furuya, T., et al. Glucose is toxic to glycosome-deficient trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14177-14182 (2002).
שימוש בחלבוני ניאון כדי לפקח Dynamics Glycosome בTrypanosome האפריקאי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bauer, S., Conlon, M., Morris, M. Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome. J. Vis. Exp. (90), e51647, doi:10.3791/51647 (2014).More

Bauer, S., Conlon, M., Morris, M. Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome. J. Vis. Exp. (90), e51647, doi:10.3791/51647 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
simple hit counter