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Immunology and Infection

फ्लोरोसेंट प्रोटीन का प्रयोग अफ्रीकी असिकाय में Glycosome गतिशीलता की निगरानी करने के लिए

Published: August 19, 2014 doi: 10.3791/51647
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Genetics and Biochemistry, Clemson University Eukaryotic Pathogens Innovation Center

Abstract

ट्रायपैनोसोमा brucei मवेशी 1 में, मानव अफ्रीकी trypanosomiasis (टोपी), या सो बीमारी, और एक बर्बाद कर रोग, nagana का कारण बनता है कि एक kinetoplastid परजीवी है. स्तनधारी मेजबान के खून और tsetse मक्खी वेक्टर के बीच परजीवी alternates. कई सेलुलर organelles की रचना इन विभिन्न बाह्य स्थितियों 2-5 के जवाब में बदलता है.

Glycosomes ग्लाइकोलाइसिस में शामिल एंजाइमों के कई बंटे हैं जिसमें अति विशिष्ट peroxisomes हैं. एक विकासात्मक और पर्यावरण की दृष्टि से विनियमित तरीके से 4-11 में Glycosome संरचना में परिवर्तन. वर्तमान में, glycosome गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल सबसे आम तकनीक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और प्रतिदीप्ति हैं; महंगा, समय और श्रम गहन, और उच्च throughput विश्लेषण करने के लिए आसानी से अनुकूलित नहीं कर रहे हैं कि तकनीक.

इन सीमाओं, एक फ्लोरोसेंट glycosome संवाददाता प्रणाली में काबू पाने के लिए12 glycosomes को संलयन प्रोटीन का निर्देशन जो एक peroxisome को लक्षित अनुक्रम (PTS2), से जुड़े हुए है पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EYFP) बढ़ाया है, जो स्थापित किया गया है. PTS2eYFP संलयन प्रोटीन के आयात पर, glycosomes फ्लोरोसेंट बन जाते हैं. Organelle गिरावट और प्रवाह cytometry द्वारा मापा जा सकता है कि प्रतिदीप्ति की हानि में रीसाइक्लिंग का परिणाम है. कोशिकाओं की बड़ी संख्या (5,000 कोशिकाओं / सेक) इस तरह के निर्धारण और बढ़ते के रूप में व्यापक नमूना तैयारी के बिना वास्तविक समय में विश्लेषण किया जा सकता है. इस विधि पर्यावरण की स्थिति अस्थिर करने के लिए प्रतिक्रिया में organelle संरचना में परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक तेजी से रास्ता प्रदान करता है.

Introduction

ट्रायपैनोसोमा brucei मवेशियों में अफ्रीकी मनुष्य में नींद की बीमारी और एक बर्बाद कर रोग, nagana, का कारण बनता है. इन बीमारियों के इलाज में इस्तेमाल दवाओं के टीके उपलब्ध नहीं हैं, पुराने और बेहद विषाक्त कर रहे हैं, और दवा प्रतिरोध के विकास के लिए संभावित नई दवा लक्ष्य 1 के लिए खोज जरूरी.

अपने जीवन चक्र, टी के दौरान ब्रुसे, एक कीट वेक्टर और स्तनधारी मेजबान के बीच alternates; परजीवी बच चाहिए जिसमें बहुत अलग वातावरण है कि वर्तमान दो मेजबान. परजीवी अलग पर्यावरण की स्थिति से अवगत कराया है के रूप में चयापचय और रूपात्मक परिवर्तन का एक नंबर होते हैं. सबसे नाटकीय परिवर्तनों से कुछ एकल झिल्ली घिरा परजीवी विशिष्ट microbodies में मनाया जाता है, glycosomes 13 करार दिया.

ग्लूकोज का स्तर अपेक्षाकृत अधिक हैं (~ 5 मिमी) खून में और खून परजीवी (बीएसएफ) ग्लाइकोलाइसिस क माध्यम से विशेष रूप एटीपी उत्पन्नइले mitochondrial चयापचय 14 दमित है. अन्य यूकैर्योसाइटों के विपरीत है जिसमें ग्लाइकोलाइसिस कोशिका द्रव्य, टी में होता है ब्रुसे glycosomes 14,15 में ग्लाइकोलाइटिक एंजाइमों की सबसे compartmentalizes. परजीवी एक bloodmeal दौरान tsetse मक्खी द्वारा हाथ में लिया और मक्खी द्वारा किया जाता रहा है के 15 मिनट के भीतर undetectable स्तर तक गिर जाता है जो ग्लूकोज में एक बूंद, अनुभव कर रहे हैं. कीट की चयापचय, procyclic फॉर्म (पीसीएफ), परजीवी अधिक लचीला और ग्लूकोज, साथ ही इस तरह के प्रोलाइन के रूप में अमीनो एसिड, एटीपी 16-18 के संश्लेषण में इस्तेमाल किया जा सकता है. तुलनात्मक प्रोटिओमिक पढ़ाई जीवन चक्र glycosomal में निर्भर परिवर्तन और खून परजीवी में वृद्धि हुई ग्लाइकोलाइटिक प्रोटीन के साथ mitochondrial प्रोटीन और TCA चक्र और सांस की श्रृंखला 13,19 में शामिल mitochondrial प्रोटीन प्रकट करते हैं. कई अध्ययनों से सीमा सुरक्षा बल और पीसीएफ glycosomes के बीच मतभेद पर ध्यान केंद्रित किया है, थोड़ा वातावरण के जवाब में होते हैं कि पीसीएफ glycosomes में परिवर्तन के बारे में जाना जाता हैironmental परिवर्तन.

मक्खी के hindgut में शर्करा की मात्रा एक खिला 20 के दौरान क्षणिक वृद्धि के साथ कम कर रहे हैं. इन विट्रो अध्ययन में अधिकांश में, पीसीएफ परजीवी ग्लूकोज युक्त मीडिया में बड़े हो रहे हैं. हालांकि, हाल के अध्ययनों में काफी प्रतिक्रिया में पीसीएफ चयापचय परिवर्तन उपलब्धता 17 ग्लूकोज में दिखा दिया है कि. ग्लूकोज, प्रोलाइन तेज और प्रोलाइन डिहाइड्रोजनेज गतिविधि वृद्धि 18 के अभाव में. माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय में यह परिवर्तन की संभावना glycosome संरचना और आकृति विज्ञान में एक परिवर्तन के साथ है, हालांकि, इस सीधे से मूल्यांकन नहीं किया गया है.

इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और प्रतिदीप्ति आम तकनीकों टी में glycosome गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है ब्रुसे 2,21-24. इन प्रोटोकॉल समय और, गहन महंगा है, और वास्तविक समय पढ़ाई और उच्च throughput प्रोटोकॉल के लिए अनुकूल करने के लिए कठिन परिश्रम कर रहे हैं. एक फ्लोरोसेंट organelle संवाददाता प्रणाली यू इस सीमा को पार करने के लिएस्तनधारी और खमीर सिस्टम में organelles अध्ययन करने के लिए SED टी में उपयोग के लिए संशोधित किया गया है ब्रुसे 12.

फ्लोरोसेंट organelle संवाददाता सिस्टम बड़े पैमाने पर इस तरह के खमीर, संयंत्र, और स्तनधारी कोशिकाओं 25-27 के रूप में उच्च यूकैर्योसाइटों में इस्तेमाल किया गया है. ऐसी व्यवस्था में, एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन विशिष्ट organelles के लिए प्रोटीन है कि लक्ष्य एक एमिनो एसिड अनुक्रम से जुड़े हुए है. लक्षित प्रोटीन की गिरावट या संश्लेषण प्रतिदीप्ति के माध्यम से मापा जाता है और organelle संरचना में परिवर्तन सेल प्रतिदीप्ति में परिवर्तन से परिलक्षित होते हैं.

बढ़ाया पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EYFP) का खुला पढ़ने फ्रेम एक प्रकार द्वितीय peroxisomal लक्ष्यीकरण अनुक्रम (PTS2) 12 से जुड़े हुए है, जब PTS2eYFP प्रोटीन परिपक्व, आयात सक्षम glycosomes और प्रतिदीप्ति में आयात किया जाता प्रवाह cytometry के माध्यम से नजर रखी जा सकती है. Glycosome संरचना में बदलाव सेलुलर प्रतिदीप्ति में परिवर्तन से परिलक्षित होते हैं. इस प्रणाली Resol में सहायता कर सकते हैंglycosome रचना में पर्यावरण परिवर्तन प्रेरित विनियमित तंत्र है कि ving.

यह पांडुलिपि लाइव परजीवी में वास्तविक समय glycosome गतिशीलता पर नजर रखने के फ्लो के साथ संयोजन के रूप में पीसीएफ परजीवी में एक glycosome संवाददाता प्रणाली की पीढ़ी का वर्णन करता है और यह अलग अलग वातावरण के जवाब में glycosome संरचना में परिवर्तन का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि कैसे का एक उदाहरण प्रदान करता है. ताजा मीडिया glycosome संरचना में परिवर्तन से चलाता में संक्षेप में, glycosome रचना कोशिकी ग्लूकोज सांद्रता और लॉग चरण संस्कृतियों के पारित होने से प्रभावित है. इस प्रणाली trypanosomes और अन्य परजीवी के अन्य अंगों के गतिशील व्यवहार का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.

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Protocol

1 जनरल असिकाय पशुपालन

  1. SDM79 मीडिया तैयारी (1 टेबल) के लिए ठोस वजन.
  2. 4 50 मिलीलीटर शंक्वाकार में डिग्री सेल्सियस या एक Ziploc बैग में स्टोर. नोट: अभिकर्मकों कम से कम 6 महीने के लिए स्थिर रहे हैं.
  3. पिघलना भ्रूण गोजातीय एक 37 डिग्री सेल्सियस waterbath में सीरम (FBS), और उलटा द्वारा समय समय पर मिश्रण. नोट: FBS के एक बाँझ समाधान के रूप में आपूर्तिकर्ता से प्राप्त होता है. FBS स्टरलाइज़ फ़िल्टर परजीवी विकास का समर्थन करने की क्षमता कम कर देता है.
  4. पूरी बोतल thawed है एक बार, गर्मी सीरम घटकों की तेज़ी कम करने के लिए समय समय पर मिश्रण, एक 56 डिग्री सेल्सियस waterbath में 30 मिनट के लिए सीरम निष्क्रिय.
  5. पिघलना पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान (कलम / strep), hemin (50 मिमी NaOH में 2 मिलीग्राम / एमएल), और कमरे के तापमान पर बेसल मध्यम ईगल विटामिन समाधान.
  6. एक 1000 मिलीलीटर सिलेंडर स्नातक की उपाधि प्राप्त करने के लिए, तरल घटक (टेबल 2) को SDM79 ठोस (1 टेबल) के 20.2 ग्राम जोड़ने और हलचल प्लेट पर अच्छी तरह से मिश्रण.
  7. 7.35 पीएच को समायोजित करें, और पानी के साथ 850 मिलीलीटर मात्रा लाओ.
  8. फ़िल्टर एक फिल्टर बोतल के नीचे करने के लिए एक वैक्यूम नली संलग्न द्वारा मीडिया बाँझ. समाधान फ़िल्टर किया जाता है जब तक निर्वात लागू करें.
  9. जैव सुरक्षा कैबिनेट में फिल्टर शीर्ष निकालें और FBS निष्क्रिय गर्मी की 150 मिलीलीटर जोड़ें. बाँझ टोपी और मुहर मीडिया बोतल से प्लास्टिक कवर निकालें.
  10. निम्न अपवादों के साथ SDM79 उसी तरह के रूप में SDM80 मीडिया तैयार करें; ग्लूकोज या glucosamine जोड़ने और glutamine बिना सदस्य का उपयोग नहीं करते. FBS निष्क्रिय गर्मी की 150 मिलीलीटर की जगह में, 135 FBS निष्क्रिय dialyzed, गर्मी से मिली, और FBS निष्क्रिय गर्मी की 15 मिलीलीटर जोड़ें.
  11. 27 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिलीलीटर उचित माध्यम के साथ 25 सेमी 2 फ्लास्क और 5% सीओ 2 में संस्कृति पीसीएफ परजीवी. नोट: प्रकोष्ठों कोशिकामापी एक hemocytometer या एक प्रवाह का उपयोग दैनिक गिना जाना चाहिए (धारा 6 देखें) और संस्कृतियों 1 एक्स 10 5 और 5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के बीच घनत्व में बनाए रखा जाना चाहिए.

2 त्रावणकोरफ्लोरोसेंट संवाददाता निर्माण के साथ पीसीएफ परजीवियों की ansfection

नोट: बढ़ाया पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए जुड़े हुए aldolase की peroxisomal लक्ष्यीकरण अनुक्रम (PTS2) युक्त एक संवाददाता प्रोटीन परजीवी में व्यक्त किया है, glycosome गतिशीलता का पालन करें. संलयन प्रोटीन एन्कोडिंग अनुक्रम procyclin प्रमोटर और ट्यूबिलिन intergenic क्षेत्रों, जो जीनोम में प्रत्यक्ष मुताबिक़ पुनर्संयोजन और चयन के लिए blasticidin प्रतिरोध जीन होता है जो pXS2bla 12, में क्लोन है. T7 पोलीमरेज़ और टेट्रासाइक्लिन repressor (PF29-13) एन्कोडिंग जीन को शरण देने Procyclic सेल लाइनों लक्ष्यीकरण निर्माण, pXS2 के साथ बदल रहे हैं: PTS2eYFP.

  1. 3 टेबल में सूचीबद्ध घटकों के मिश्रण से cytomix तैयार करें. आरटी पर बाँझ और दुकान फ़िल्टर.
  2. डीएनए (1 माइक्रोग्राम / μl), 5 μl प्रतिबंध एंजाइम बफर, 33 μl पानी की 10 μl pipetting द्वारा MluI साथ प्लास्मिड डीएनए linearize, और 2 μ; एक microcentrifuge ट्यूब में MluI एंजाइम की एल. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  3. प्रतिबंध प्रतिबंध एंजाइम डाइजेस्ट करने के लिए बाध्यकारी बफर के 1 मात्रा जोड़कर पचा शुद्ध. Vortexing द्वारा बाध्यकारी बफर और पचा डीएनए मिलाएं. संक्षेप में ट्यूब के नीचे नमूना इकट्ठा करने के लिए अपकेंद्रित्र.
  4. एक 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में स्तंभ बाध्यकारी एक डीएनए डालें, और हस्तांतरण स्तंभ के लिए बफर समाधान बाध्यकारी / डीएनए पचता.
  5. 1 मिनट के लिए 10,000 XG के लिए अपकेंद्रित्र. Centrifugation के बाद, संग्रह ट्यूब से छानना त्यागें और संग्रह ट्यूब स्तंभ वापसी.
  6. 1 मिनट के लिए 10,000 XG पर SPW धोने बफर और अपकेंद्रित्र के 700 μl जोड़ें.
  7. संग्रह ट्यूब से त्यागें छानना, संग्रह ट्यूब स्तंभ लौटने और SPW धोने कदम और centrifugation दोहराएँ.
  8. 10,000 XG पर 3 मिनट के लिए छोड़ें छानना, संग्रह ट्यूब वापसी स्तंभ, और अपकेंद्रित्र खाली कॉलम अवशिष्ट इथेनॉल दूर करने के लिए.
  9. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में कर्नल दूर फेंकएक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में रूपांतर ट्यूब और जगह स्तंभ.
  10. डीएनए elute स्तंभ को बाँझ पानी के 25 μl जोड़ने और 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. 1 मिनट के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र.
  11. स्तंभ के लिए जैव सुरक्षा हुड में बाँझ पानी की एक और 25 μl जोड़ें और 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  12. 1 मिनट के लिए 10,000 XG गति पर अपकेंद्रित्र.
  13. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में एक नया बाँझ microcentrifuge ट्यूब डीएनए की पूरी मात्रा हस्तांतरण. नोट: इस कदम centrifugation के दौरान खुले ढक्कन से संक्रमण से बचाता है.
  14. फिल्टर निष्फल cytomix के 400 μl बाँझ, शुद्ध, linearized डीएनए (10 माइक्रोग्राम) जोड़ें.
  15. आरटी पर 15 मिनट के लिए 800 XG पर centrifugation द्वारा 5 X10 7 -10 8 कोशिकाओं धारा 6 में वर्णित है और फसल के रूप में कोशिकाओं की गणना.
  16. सतह पर तैरनेवाला डालो और एक 1 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग डीएनए + cytomix के 450 μl में सेल गोली resuspend.
  17. CE युक्त स्थानांतरण समाधान LLS, electroporation के कक्ष में एक बाँझ 4 मिमी अंतराल क्युवेट और जगह क्युवेट करने के लिए डीएनए, और cytomix.
  18. "घातीय क्षय" का चयन करें और मैन्युअल निम्न सेटिंग्स दर्ज करें: वोल्ट: 1.5 केवी, समाई: 25 एमएफ, प्रतिरोध: Ω, और क्युवेट: 4 मिमी. प्रेस नाड़ी. पल्स पूरा हो गया है एक बार, electroporation कक्ष से क्युवेट हटाने और जैव सुरक्षा कैबिनेट में लौटने.
  19. एक नए बाँझ फ्लास्क, पिपेट SDM79 के 10 एमएल में. SDM79 के 10 एमएल के साथ कुप्पी को बदल कोशिकाओं स्थानांतरण.
  20. 27 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर 24 घंटे के लिए दवा चयन बिना सेते हैं. 24 घंटे के बाद, G418 (15 माइक्रोग्राम / एमएल), hygromycin (50 माइक्रोग्राम / एमएल), और blasticidin (/ एमएल 10 माइक्रोग्राम) जोड़ें. दवा के साथ SDM79 के 9 मिलीलीटर में दवा के साथ बदल कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर से गुजरती हैं.
  21. धारा 6 और 7 कोशिकाओं फ्लोरोसेंट हैं जब में वर्णित है, और 10 x 7 / एमएल 1 के एक सेल घनत्व तक पहुँच चुके हैं के रूप में लंबे समय तक भंडारण (3.1-3.3) के लिए stabilates बनाने, दैनिक कोशिकाओं का विश्लेषण.
ve_title "> 3. Stabilates बनाना

  1. मीडिया ठंड बनाने के लिये बाँझ cytomix और फिल्टर करने के लिए 100% ग्लिसरॉल के एक बराबर मात्रा में जोड़ें.
  2. एक cryovial में कोशिकाओं के 800 μl (1 10 x 7) को ठंड मीडिया के 200 μl जोड़ें, दो स्टायरोफोम रैक के बीच उलटा और जगह से धीरे मिश्रण और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर.
  3. (~ 24 घंटे) जमे हुए एक बार, तरल नाइट्रोजन के लिए स्थानांतरण की कोशिकाओं. नोट: सी सेल व्यवहार्यता में कमी की ओर जाता है ° यह -80 में लंबे समय तक भंडारण के रूप में, 24 घंटे के बाद एलएन 2 में कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए महत्वपूर्ण है.

4 विगलन जमे हुए स्टॉक्स

  1. लगभग 10 मिनट के लिए आरटी पर सी और पिघलना ° से -80 जमे हुए शीशी निकालें.
  2. एक नए बाँझ फ्लास्क में दवा के साथ SDM79 की पिपेट 9 मिलीलीटर. इस फ्लास्क Thawed कोशिकाओं जोड़ें. (1 x 10 5 / एमएल के अंतिम एकाग्रता) एक नई कुप्पी में SDM79 के 9 मिलीलीटर के लिए इस संस्कृति के 1 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं 01:10 गुजरती हैं.
  3. कोशिकाओं 10 7 / मिलीलीटर की एक घनत्व तक पहुँचने से पहले, कोशिकामापी सेट शुरूऊपर और कमजोर पड़ने assays.

5 कोशिकामापी सेटअप

  1. प्रवाह को चालू करें और CFlow प्लस कार्यक्रम खुला. नोट: किसी भी नमूने को चलाने से पहले, fluidics कदम 5.2-5.7 के अनुसार backflushed और rinsed होना चाहिए.
  2. एसआईपी एक खाली ट्यूब के साथ संग्रहीत किया जाता है, जिसमें nanopure पानी की ट्यूब को बदलें.
  3. "Backflush" बटन का चयन करें.
  4. Backflush पूरा हो गया है एक बार, पीएं और त्यागने से microcentrifuge ट्यूब को हटा दें.
  5. एसआईपी पर नए nanopure पानी की 1 मिलीलीटर युक्त एक नया microcentrifuge ट्यूब रखें.
  6. CFlow कार्यक्रम में एक नए तरह का चयन करें. "भागो सीमा" के तहत 2 मिनट के लिए समय निर्धारित किया है. "Fluidics" के तहत "तेज" और "रन" का चयन करें.
  7. 2 मिनट समय सीमा पूरा होने के बाद, "नमूना डेटा हटाएँ" बटन पर क्लिक करें.

फ्लो cytometer का उपयोग कर 6 सेल गिनती

  1. नमूने के साथ पानी की जगह गिना जाएगा. "सेटभागो सीमा "30 सेकंड के लिए," तेजी "के लिए" fluidics भागो "" तब और चुनें ".
  2. 30 सेकंड समय सीमा CFlow, पूरा हो गया है प्लस μl "पिछले भागो." प्रत्येक संस्कृति के लिए दोहराएँ गणना के तहत घटनाओं / प्रदान करेगा करने के बाद. नोट: कोशिकाओं 1 एक्स 10 7 कोशिकाओं / एमएल तक पहुँचने से पहले, कमजोर पड़ने परख के साथ आगे बढ़ना. एक कमजोर पड़ने परख पूरा हो गया है के बाद कोशिकाओं बंद किया जाना चाहिए. लंबी अवधि के लिए संवर्धित कोशिकाओं पर्यावरण की स्थिति का जवाब करने की क्षमता खो देते हैं.

फ्लो cytometer का उपयोग 7 माप प्रतिदीप्ति

  1. प्रतिदीप्ति का आकलन करने के लिए, 10,000 घटनाओं को "भागो सीमा", और "धीमी" के लिए "fluidics" सेट. "सेट दहलीज" का चयन करें. "प्राथमिक थ्रेसहोल्ड" के तहत, (ड्रॉप डाउन बक्से में), "स्थायी रूप से घटनाओं को खत्म" "FSC-एच" का चयन करें और कम से कम 30,000 दर्ज करें. फिर "करीब", "लागू" पर क्लिक करें.
  2. चयन करें220, हिस्टोग्राम "नई साजिश खिड़कियों में से एक में बटन और चुनें" FSC-A FL1 ए "" ड्रॉप डाउन सूची से, चयन ". नोट: 530 एनएम तरंगदैर्ध्य में FL1 एक उपाय प्रतिदीप्ति.
  3. "भागो" का चयन करें और सभी संस्कृतियों के लिए दोहराएँ.
  4. 2 मिनट के लिए 2 मिनट और पानी के लिए fluidics लाइन के माध्यम से समाधान सफाई चलाएँ.

8 कमजोर पड़ने Assays

  1. एक 25 सेमी 2 संस्कृति फ्लास्क में SDM79 के 3 मिलीलीटर में 1 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल के एक घनत्व कोशिकाओं दर्रा और तुरंत पारित होने के बाद और फिर 3 घंटा और 24 घंटे में पुष्पन उपाय.

9 डेटा विश्लेषण

  1. चयन करें CFlow प्लस पर टैब "विश्लेषण".
  2. क्लिक करें "एक नई साजिश बनाओ." चुनें "FSC-ए 'और एक बूंद नीचे सूची के अंतर्गत" हिस्टोग्राम "बटन दिखाई देगा. चुनें चैनल "FL1 ए."
  3. विश्लेषण करने के लिए एक अच्छी तरह से प्रकाश डाला. "गेट" बटन का चयन करें, और स्वयं एक गेट आकर्षितब्याज की आबादी के लिए.
  4. फ्लो प्लस सेल इस गेट के भीतर "गणना" और "इस साजिश का%" प्रदान करेगा.

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Representative Results

इस प्रणाली में, glycosome रचना में एक ग्लूकोज निर्भर परिवर्तन मनाया गया. कोशिकाओं में ग्लूकोज युक्त मीडिया में बड़े हो रहे हैं, दो आबादी मनाया जाता है; एक उज्ज्वल और एक मंद (2A चित्रा). मंद कोशिकाओं उज्ज्वल कोशिकाओं परिपक्व और अपरिपक्व glycosomes 12 का एक मिश्रण बंदरगाह जबकि PTS2eYFP आयातित नहीं है जो अपरिपक्व glycosomes, बंदरगाह. ग्लूकोज मीडिया में मौजूद है, glycosome प्रोटीन की mislocalization 15,28 घातक है और glycosome प्रोटीन अभिव्यक्ति संभावना आयात के साथ मिलकर युग्मित है. इस तंग विनियमन कोशिकाओं पर्याप्त आयात क्षमता की कमी है जब glycosome प्रोटीन अभिव्यक्ति को दबा दिया जाता है जिसमें मंद कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए जिम्मेदार है. Glycosome आयात मशीनरी पूरी तरह से इकट्ठे और कार्यात्मक हो जाने के बाद, कोशिकाओं तो फ्लोरोसेंट कोशिकाओं उपज glycosomes में आयात कर रहे हैं जो glycosome प्रोटीन, व्यक्त करते हैं. ग्लूकोज खलाना मीडिया में, glycosome प्रोटीन की mislocalization बर्दाश्त हैडी 15, और bimodal जनसंख्या वितरण प्रतिदीप्ति की एक व्यापक रेंज (चित्रा 2B) के साथ एक एकल शिखर की जगह है.

इस प्रणाली glycosome संरचना में परिवर्तन ट्रिगर की स्थिति है कि पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. ~ 10% मंद कोशिकाओं (चित्रा 3A) युक्त उच्च घनत्व संस्कृतियों ताजा मीडिया में पारित कर रहे हैं, मंद कोशिकाओं (चित्रा 3 बी) के प्रतिशत में एक क्षणिक वृद्धि हुई है. 24 घंटे तक. मूल जनसंख्या वितरण (चित्रा -3 सी) पुनर्स्थापना है.

SDM79 एसएनएफ वजन (ग्राम / एल)
कीट सेल मीडिया पाउडर गौरव 2
ग्लूकोज 1
HEPES 8
MOPS 5
3 NaHCO 2
सोडियम पाइरूवेट 0.1
एल Alanine 0.2
एल Arginine 0.1
एल Glutamine 0.3
एल Methonine 0.07
एल फेनिलएलनिन 0.08
एल प्रोलाइन 0.6
एल सेरीन 0.06
एल Taurine 0.16
एल Threonine 0.35
एल tyrosine 0.1
Adenosine 0.01
ग्वानोसिन 0.01
Glucosamine एचसीएल 0.05
फोलिक एसिड 0.004
R-aminobenzoic एसिड 0.002
बायोटिन 0.0002

तालिका 1 SDM79 ठोस घटकों. ठोस मीडिया घटकों और राशि (छ / एल) प्रदान की जाती हैं.

SDM79
Glutamine के साथ सदस्य 600 मिलीलीटर
पेन / Strep 10 मिलीलीटर
बीएमई विटामिन समाधान 10 मिलीलीटर
सदस्य अमीनो एसिड समाधान 8 मिलीलीटर
सदस्य गैर आवश्यक अमीनो एसिड समाधान 6 मिलीलीटर
Hemin 3.75
जल 162.25 मिलीलीटर

तालिका 2 SDM79 तरल घटकों. वॉल्यूम मिलीलीटर दिया जाता है.

20 एमएल के लिए
120 मिमी KCl 1.4 मिलीलीटर (1 एम)
0.15 मिमी 2 CaCl 3 मिलीग्राम (1 एम)
10 मिमी कश्मीर 2 4 HPO 400 मिलीलीटर (0.5 एम)
25 मिमी HEPES 500 मिलीलीटर (1 एम)
2 मिमी EDTA 80 मिलीलीटर (0.5 एम)
5 मिमी 2 MgCl 100 मिलीलीटर (1 एम)
जल 16.52

3 तालिका Cytomix नुस्खा.

चित्रा 1
1 फ्लोरोसेंट glycosome संवाददाता प्रणाली चित्रा. ए) PTS2eYFP अभिव्यक्ति का निर्माण एकीकरण. पीसीएफ trypanosomes px के साथ बदल गयाS2PTS2eYFP प्लाज्मिड प्रतिबंध एंजाइम MluI साथ linearized. यह निर्माण ट्यूबिलिन ठिकाना (टब) और PARP दृश्यों (PARP) में मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम से एकीकृत PTS2eYFP के विधान अभिव्यक्ति और आरएनए प्रसंस्करण. बी के लिए आवश्यक दृश्यों) PTS2eYFP आयात ड्राइव कि प्रमोटर भी शामिल है. PTS2eYFP यह glycosomes को संवाददाता प्रोटीन जो उद्धार घुलनशील रिसेप्टर, PEX7, बांध जहां कोशिका द्रव्य में संश्लेषित है. Glycosome झिल्ली के लिए दिया एक बार, प्रोटीन आयात किया जाता है. कार्यात्मक आयात मशीनरी शामिल नहीं है कि उन मंद रहना, जबकि आयात मशीनरी आयात PTS2eYFP और प्रतिदीप्ति युक्त परिपक्व organelles.

चित्रा 2
चित्रा 2 ग्लूकोज निर्भर glycosome रचना. पीसीएफ कोशिकाओं SDM79 (GLC) या SDM80 (-Glc) में बड़े हो रहे थे औरफ्लो द्वारा विश्लेषण किया गया. 10,000 घटनाओं की histograms. SDM79 में विकसित कोशिकाओं की ए) विश्लेषण लगातार दो चोटियों का पता चलता है. फ्लोरोसेंट कोशिकाओं अधिक परिपक्व glycosomes होने उच्च प्रतिदीप्ति तीव्रता की कोशिकाओं के साथ परिपक्व और अपरिपक्व organelles के एक मिश्रण बंदरगाह. SDM79 में, glycosome प्रोटीन की mislocalization घातक है और glycosome प्रोटीन अभिव्यक्ति और आयात कसकर नियंत्रित किया जाना चाहिए. इस मध्यवर्ती प्रतिदीप्ति तीव्रता. बी) SDM80 में साथ कोशिकाओं के अभाव में परिलक्षित होता है, glycosome प्रोटीन की mislocalization bimodal जनसंख्या वितरण खो दिया है, और मध्यवर्ती प्रतिदीप्ति की कोशिकाओं मनाया जाता है, बर्दाश्त है.

चित्रा 3
चित्रा 3 Glycosome remodeling. Glycosomes के पुनर्गठन ताजा मीडिया में पारित होने से शुरू हो रहा है. 6 / एमएल). बी) बाएँ गेट सी के भीतर गिरने अपरिपक्व glycosomes साथ मंद कोशिकाओं के अनुपात में वृद्धि हुई है ताजा SDM79 में कमजोर पड़ने के बाद 3 घंटा 24 घंटे के बाद पतला संस्कृति की) हिस्टोग्राम. अपरिपक्व glycosomes अब फ्लोरोसेंट प्रोटीन आयात करने के लिए आवश्यक peroxisome प्रोटीन होते ही 24 घंटे के बाद, जनसंख्या वितरण, सामान्य स्थिति में आ गया है.

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Discussion

Glycosomes आवश्यक, गतिशील, परजीवी विशिष्ट organelles हैं. इन अंगों की जीवजनन, रखरखाव, प्रसार और remodeling विनियमित प्रक्रियाओं है कि संभावना चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि दवा लक्ष्यों में शामिल हैं. ऐसी दवा लक्ष्य के संभावित उच्च बहुतायत के बावजूद, glycosome जीवजनन के क्षेत्र मुख्यतः की वजह से तेजी से, गतिशील, organelle प्रतिक्रियाओं पर नजर रखने के लिए है जिसके द्वारा एक विनयशील, उच्च throughput प्रणाली की कमी के कारण, अन्य जीवों में इसी तरह की प्रक्रियाओं का अध्ययन पिछड़ गया है जीवित कोशिकाओं में.

फ्लोरोसेंट organelle संवाददाता सिस्टम ऐसे खमीर, पौधों, कवक और स्तनधारियों 23-25 ​​के रूप में उच्च यूकैर्योसाइटों में organelle गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हम फ्लोरोसेंट organelles उपज glycosomes परिपक्व करने के लिए लक्षित है कि PTS2eYFP व्यक्त कि पीसीएफ परजीवी की एक ट्रांसजेनिक तनाव उत्पन्न किया है. Glycosome संरचना में परिवर्तन के बाद सेलुलर प्रतिदीप्ति के माध्यम से नजर रखी जा सकती. इस प्रणाली का उपयोग करना, हम विशेष रूप से ग्लूकोज पर्यावरण की स्थिति, glycosome रचना 12 को विनियमित कि मिल गया है.

अक्सर kinetoplastid परजीवी में organelle गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों माइक्रोस्कोपी के विपरीत, इस संवाददाता प्रणाली तेजी से यौगिकों और समग्र glycosome गतिशीलता को प्रभावित स्थिति है कि स्क्रीन के लिए है जिसके द्वारा एक तरीका प्रदान करता है. हालांकि, प्रतिदीप्ति में परिवर्तन समग्र organelle रचनाओं में बदलाव को प्रतिबिंबित. इसके अलावा जैव रासायनिक और सूक्ष्म प्रयोगों अलग प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रदर्शन सेल आबादी के बीच विशिष्ट आणविक मतभेद को परिभाषित करने के लिए आवश्यक हैं.

हम remodeling assays में महत्वपूर्ण कदम के एक नंबर की पहचान की है. दिलचस्प बात यह है कि हम कोशिकाओं लंबी अवधि (अधिक से अधिक दो गुजरता) के लिए संवर्धित कर रहे हैं, के रूप में पर्यावरण परिवर्तन के जवाब में उनके व्यवहार अप्रत्याशित है कि मिल गया है. लंबे समय तक संवर्धन के बाद, कोशिकाओं ताजा मीटर में उच्च घनत्व से पारितedia, वे अभी भी glycosomes फिर से तैयार करने में सक्षम हैं यह दर्शाता है कि मंद आबादी में एक अस्थायी वृद्धि दिखा रहे हैं, लेकिन 24 घंटे के बाद मर जाते हैं. हम यह भी नहीं remodeling मनाया जाता है जहां स्थितियों का सामना किया है. इस व्यवहार के लिए कारण स्पष्ट नहीं है, लेकिन हम यहाँ वर्णित के रूप में कोशिकाओं को नियंत्रित किया जाता है जब (दो सेल मार्ग की संख्या सीमित करने और 1 एक्स 10 7 / एमएल नीचे संस्कृतियों को बनाए रखने) ने पाया है कि, glycosome remodeling प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है. कोशिकाओं इस स्थिति संवाददाता का निर्माण प्लाज्मिड के साथ आमतौर पर उपचार कोशिकाओं retransforming, अब पर्यावरण की स्थिति के लिए उत्तरदायी हैं जब.

इस प्रणाली अफ्रीकी trypanosomes में glycosome व्यवहार का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, यह भी अन्य सेलुलर डिब्बों को कि प्रत्यक्ष प्रोटीन स्थानीयकरण एसिड दृश्यों एमिनो फ्लोरोसेंट प्रोटीन fusing द्वारा अन्य परजीवी में organelles के अध्ययन के लिए अपनाया जा सकता है.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine Avocado Research Chemicals Ltd A10781 SDM79 Ingredient
L-Alanine Avocado Research Chemicals Ltd A15804 SDM79 Ingredient
L-Arginine CalBiochem 1820 SDM79 Ingredient
p-Aminobenzoic acid ICN Biomedicals 102569 SDM79 Ingredient
Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x) Sigma B6891 SDM79 Ingredient
Biotin Fisher BP232-1 SDM79 Ingredient
Calcium chloride VWR BDH0224 Cytomix
EDTA Fisher S311-100 Cytomix ingredient
EZNA Gel Extraction kit Omega Biotek D2500-01 DNA purifiation
Research grade Serum Fisher 03-600-511 SDM79 Ingredient
Folic acid ICN Biomedicals 101725 SDM79 Ingredient
Glucosamine HCl ICN Biomedicals 194671 SDM79 Ingredient
Glucose GIBCO 15023-021 SDM79 Ingredient
L-Glutamine CalBiochem 3520 SDM79 Ingredient
Glycerol Acros Organics Ac15892-0010 Freezing media
Graces insect cell media powder GIBCO 11300-043 SDM79 Ingredient
Hemin MP Biomedicals 194025 SDM79 Ingredient
Guanosine Avocado Research Chemicals Ltd A11328 SDM79 Ingredient
HEPES MP Biomedicals 194025 SDM79 Ingredient
Magnesium chloride Fisher BP214-500 Cytomix ingredient
L-Methionine Fisher BP388-100 SDM79 Ingredient
MEM Amino Acids (50x) Cellgro 25-030-CI SDM79 Ingredient
NEAA Mixture (100x) Lonza 13-114E SDM79 Ingredient
Minimal Essential Medium (1x) with L-glutamine Cellgro 10-010-CM SDM79 Ingredient
MOPS Fisher BP308-500 SDM79 Ingredient
Sodium biocarbonate Fisher S233-500 SDM79 Ingredient
Penicillin-streptomycin Solution Cellgro 30-002-CI SDM79 Ingredient
L-Phenylalanine ICN Biomedicals 102623 SDM79 Ingredient
Potassium chloride Fisher P217-500 Cytomix ingredient
Potassium phosphate dibasic anhydrous Fisheer P290-212 Cytomix ingredient
L-Proline Fisher BP392-100 SDM79 Ingredient
L-Serine Acros Organics 56-45-1 SDM79 Ingredient
Pyruvic acid, sodium salt Acros Organics 113-24-6 SDM79 Ingredient
L-Taurine TCI America A0295 SDM79 Ingredient
L-Threonine Acros Organics 72-19-5 SDM79 Ingredient
L-Tyrosine ICN Biomedicals 103183 SDM79 Ingredient
E.Z.N.A. Cycle Pure kit Omega Biotek D6492-02 DNA purification
Binding buffer Omega Biotek PDR041 DNA purification
SPW wash buffer Omega Biotek PDR045 DNA purification
Gene Pulser Xcell Biorad 165-2660 Trypanosome transformation
4 mm Electroporation cuvettes VWR Trypanosome transformation

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References

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संक्रामक रोग अंक 90 glycosomes trypanosomes प्रवाह cytometry kinetoplastids फ्लोरोसेंट प्रोटीन peroxisomes
फ्लोरोसेंट प्रोटीन का प्रयोग अफ्रीकी असिकाय में Glycosome गतिशीलता की निगरानी करने के लिए
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Bauer, S., Conlon, M., Morris, M.… More

Bauer, S., Conlon, M., Morris, M. Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome. J. Vis. Exp. (90), e51647, doi:10.3791/51647 (2014).

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