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Immunology and Infection

Utilizando Proteínas Fluorescentes para monitorar glicossomo Dynamics do Trypanosoma Africano

doi: 10.3791/51647 Published: August 19, 2014

Abstract

Trypanosoma brucei é um parasita que causa cinetoplastida tripanossomíase humana Africano (HAT), ou doença do sono, e uma doença debilitante, nagana, em bovinos 1. Os suplentes do parasita entre na corrente sanguínea do hospedeiro mamífero eo vetor mosca tsé-tsé. A composição de muitas organelas celulares muda em resposta a essas condições extracelulares diferentes 2-5.

Glicossomos peroxissomas são altamente especializados, em que muitas das enzimas envolvidas na glicólise estão compartimentados. Mudanças na composição glicossomo de uma forma de desenvolvimento e regulamentada ambientalmente 4-11. Atualmente, as técnicas mais comuns usadas para estudar glicossomo dinâmicas são microscopia eletrônica e de fluorescência; técnicas que são caros, tempo e mão de obra intensiva, e não é facilmente adaptada para análises de elevado rendimento.

Para superar essas limitações, um sistema repórter fluorescente glicossomo emo que aumentou a proteína fluorescente amarela (EYFP) é fundido a uma sequência de direccionamento de peroxissoma (PTS2), que dirige a proteína de fusão para glicossomos 12, foi estabelecido. Após a importação da proteína de fusão PTS2eYFP, glicossomos se tornar fluorescente. Degradação organelo e reciclagem resulta na perda de fluorescência que pode ser medido por citometria de fluxo. Um grande número de células (5000 células / seg) podem ser analisados ​​em tempo real, sem grande preparação de amostras, tais como a fixação e montagem. Este método oferece uma maneira rápida de detectar mudanças na composição de organelas em resposta às variações das condições ambientais.

Introduction

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Trypanosoma brucei causa a doença do sono Africano em seres humanos e uma doença debilitante, nagana, em bovinos. As drogas utilizadas no tratamento das referidas doenças são antiquado e extremamente tóxico, as vacinas não estão disponíveis, e o potencial para o desenvolvimento de resistência às drogas necessita da busca de novos alvos de medicamentos 1.

Durante seu ciclo de vida, T. brucei, alterna entre um inseto vetor e hospedeiro mamífero; dois hosts que se apresentam muito diferentes ambientes em que o parasita deve sobreviver. Uma série de alterações metabólicas e morfológicas ocorrer como o parasita está exposta a diferentes condições ambientais. Algumas das mudanças mais dramáticas são observadas em microcorpos específicas do parasita único delimitado por membrana, denominado glicossomos 13.

Os níveis de glicose são relativamente elevados (~ 5 mm) na corrente sanguínea e parasitas na corrente sanguínea (BSF) gerar ATP exclusivamente através wh glicólisemetabolismo mitocondrial ile é reprimida 14. Ao contrário de outros eucariotas, em que a glicólise ocorre no citoplasma, T. brucei compartimenta a maioria das enzimas glicolíticas em glicossomos 14,15. Os parasitas são absorvidos pela mosca tsé-tsé durante a farinha de sangue e experimentar uma queda em glicose, que cai para níveis indetectáveis ​​dentro de 15 min de ser ingerido pela mosca. O metabolismo de inseto, forma procíclicos (PCF), parasitas é mais flexível e glicose, bem como aminoácidos, tais como prolina, pode ser usado na síntese de ATP 16-18. Estudos proteômicos comparativos revelam mudanças de ciclo de vida dependentes em glicosomal e proteínas mitocondriais com proteínas glicolíticas aumentou em parasitas na corrente sanguínea e proteínas mitocondriais envolvidos no ciclo TCA e cadeia respiratória 13,19. Enquanto muitos estudos têm-se centrado sobre as diferenças entre BSF e glicossomos PCF, pouco se sabe sobre as mudanças no glicossomos PCF que ocorrem em resposta aos envmudanças ironmental.

No intestino posterior da mosca, os níveis de glicose estão baixos com aumentos transitórios durante uma alimentação 20. Na maioria dos estudos in vitro, parasitas PCF são cultivadas em meios contendo glicose. No entanto, estudos recentes têm demonstrado que mudanças no metabolismo PCF significativamente em resposta à glicose disponibilidade 17. Na ausência da glucose, a absorção de prolina e prolina aumento da actividade de desidrogenase 18. Esta mudança no metabolismo mitocondrial é provavelmente acompanhada por uma alteração na morfologia e composição glicossomo, no entanto, isto não foi avaliado directamente.

Electron e microscopia de fluorescência são técnicas comuns usadas para estudar a dinâmica glicossomo em T. brucei 2,21-24. Estes protocolos são o tempo e trabalho intensivo, caro e difícil de adaptar-se a estudos em tempo real e os protocolos de alto rendimento. Para superar esta limitação, um sistema repórter fluorescente organelo-used para estudar organelos em sistemas de mamífero e de levedura foi modificada para utilização em T. brucei 12.

Sistemas repórter fluorescente-organelas têm sido amplamente utilizados em eucariotos superiores, tais como fungos, plantas e células de mamíferos 25-27. Em tais sistemas, uma proteína fluorescente é fundido com uma sequência de aminoácidos que tem como alvo a proteína de organelos específicos. A degradação ou a síntese das proteínas-alvo é medida por meio de fluorescência e as mudanças na composição do organelo são reflectidas pelas alterações na fluorescência celular.

Quando a grelha de leitura aberta de maior proteína fluorescente amarela (EYFP) é fundido a uma sequência de direccionamento peroxissomal tipo II (PTS2) 12, a proteína é importado para PTS2eYFP, glicossomos maduros importação-competente e fluorescência podem ser monitorizadas por meio de citometria de fluxo. As variações na composição glicossomo são refletidas por mudanças na fluorescência celular. Este sistema pode auxiliar no resolVing os mecanismos que regulam as mudanças induzidas pelo ambiente em glicossomo composição.

Este manuscrito descreve a geração de um sistema repórter em glicossomo PCF parasitas em conjunção com citometria de fluxo para controlar a dinâmica glicossomo em tempo real em parasitas vivos e fornece um exemplo de como ele foi usado para seguir alterações na composição glicossomo em resposta a diferentes ambientes. Em resumo, glicossomo composição é influenciada pela concentração de glucose extracelular e a passagem de culturas em fase logarítmica em meio fresco provoca mudanças na composição glicossomo. Este sistema pode ser modificado para estudar o comportamento dinâmico de outros organelos nos tripanossomas e outros parasitas.

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Protocol

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1.-Geral Trypanosoma Pecuária

  1. Pesar sólidos para a preparação dos meios SDM79 (Tabela 1).
  2. Armazenar a 4 ° C em 50 mL cónico ou um saco plástico. NOTA: Os reagentes são estáveis ​​durante pelo menos 6 meses.
  3. Descongelar soro fetal bovino (FBS) em um banho de água a 37 ° C, e misturar periodicamente por inversão. NOTA: FBS é recebida do fornecedor, como uma solução estéril. Filtro de esterilização FBS reduz a sua capacidade para suportar o crescimento do parasita.
  4. Uma vez que toda a garrafa é descongelada, calor inactivar soro durante 30 minutos num banho de água a 56 ° C, a mistura periodicamente para minimizar a precipitação de componentes do soro.
  5. Descongelar a penicilina / estreptomicina (pen / strep), hemina (2 mg / ml em NaOH a 50 mM), e solução basal águia vitamina meio à temperatura ambiente.
  6. Para uma proveta graduada de 1000 ml, adicionar 20,2 g de sólidos SDM79 (Tabela 1) para os componentes líquidos (Tabela 2) e misture bem com uma placa de agitação.
  7. Ajustar o pH a 7,35, e perfazer o volume de 850 ml com água.
  8. Filtrar esterilizar mídia ligando uma mangueira de vácuo para o fundo de uma garrafa de filtro. Aplicar vácuo até que a solução é filtrada.
  9. Remover top filtro no gabinete de biossegurança e adicione 150 ml de inactivado pelo calor FBS. Remover cobertura plástica de tampa estéril e garrafa mídia selo.
  10. Prepare mídia SDM80 da mesma maneira como SDM79 com as seguintes excepções; não adicione açúcar ou glucosamina e usar MEM sem glutamina. Em lugar de 150 ml de FBS inactivado pelo calor, adicionar 135 ml de dialisado, FBS inactivado pelo calor, e 15 mL de FBS inactivado pelo calor.
  11. Cultura parasitas PCF em cada 25 cm2 frasco com 10 ml de meio apropriado a 27 ° C e 5% de CO 2. NOTA: As células devem ser contadas diariamente utilizando um hemocitômetro ou um citômetro de fluxo (ver secção 6) e culturas devem ser mantidas em densidades entre 1 x 10 5 e 5 x 10 6 células / ml.

2 Transfection de PCF Parasitas com a construção repórter fluorescente

NOTA: Para seguir glicossomo dinâmica, uma proteína repórter, contendo a sequência de direccionamento de peroxissomas (PTS2) de aldolase fundido reforçado a proteína fluorescente amarela é expresso nos parasitas. A sequência que codifica a proteína de fusão foi clonado no pXS2bla 12, que contém o promotor procyclin e as regiões intergénicas de tubulina, que a recombinação homóloga no genoma directa e o gene de resistência à blasticidina para selecção. Linhas celulares de pró-cíclicos, contendo os genes que codificam a polimerase de T7 e tetraciclina repressor (PF29-13) são transformadas com a construção de direccionamento, pXS2: PTS2eYFP.

  1. Prepare cytomix misturando os componentes listados na Tabela 3. Filtre esterilizar e armazenar a RT.
  2. DNA de plasmídeo linearizado com Mlu I, pipetando 10 mL de ADN (1 mg / mL), tampão de enzima de restrição de 5 ul, 33 ul de água, e 2 μ; L de enzima Mlu I para um tubo de microcentrífuga. Incubar a 37 ° C durante 1 hora.
  3. Purifica-se a digestão de restrição por adição de um volume de tampão de ligação com a enzima de restrição digest. Misturar tampão de ligação e DNA digerido com vórtex. Resumidamente, centrifugar para recolher a amostra no fundo do tubo.
  4. Inserir uma coluna de ADN de ligação para um tubo de recolha de 2 ml, e a transferência de ADN digerido / ligante solução tampão à coluna.
  5. Centrifugar por 10.000 xg por 1 min. Após a centrifugação, descartar filtrado do tubo de coleta e retornar a coluna para o tubo de coleta.
  6. Adicionar 700 ul de tampão de lavagem SPW e centrifugar a 10000 xg durante 1 min.
  7. Filtrado Descarte de tubo de coleta, retornar a coluna de tubo de coleta e repetir SPW etapa de lavagem e centrifugação.
  8. Descartar filtrado, coluna de retorno ao tubo de recolha, e centrifugar coluna vazio durante 3 minutos a 10000 xg para remover o etanol residual.
  9. Em uma cabine de segurança biológica, jogue fora collection tubo e lugar da coluna em um tubo de microcentrífuga estéril.
  10. Para eluir o ADN, adicionar 25 ul de água estéril para coluna e incuba-se à temperatura ambiente durante 2 min. Centrifuga-se a 10000 xg durante 1 min.
  11. Adicionar mais 25 ul de água estéril na capa de biossegurança coluna e incuba-se à temperatura ambiente durante 2 min.
  12. Centrifugar a 10.000 velocidade xg por 1 min.
  13. Numa câmara de biossegurança transferir todo o volume de ADN para um novo tubo de microcentrifuga estéril. Nota: Esta etapa evita a contaminação da tampa aberta durante a centrifugação.
  14. Adicionar o ADN purificada estéril,, linearizado (10 ng) a 400 ul de cytomix esterilizada por filtração.
  15. Contagem de células, como descrito na seção 6 e colher 5 x10 7 a 10 8 células por centrifugação a 800 xg por 15 minutos em temperatura ambiente.
  16. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 450 ul de ADN + cytomix usando uma pipeta de 1 ml serológico.
  17. Solução de transferência contendo ce lls, ADN, e cytomix para uma cuvete estéril 4 milímetros lacuna e lugar da cuvete na câmara de electroporação.
  18. Selecione "decaimento exponencial" e digitar manualmente as seguintes configurações: Tensão: 1,5 kV, capacitância: 25 mF, Resistance: Ω, e Cuvette: 4 mm. Pressione pulso. Uma vez que o impulso está completa, remover cuvete da câmara de electroporação e retornar para o armário de biossegurança.
  19. Para um novo frasco estéril, pipeta 10 ml de SDM79. Transferência das células transformadas para o balão com 10 ml de SDM79.
  20. Incubar SEM selecção de drogas durante 24 horas a 27 ° C, 5% de CO 2. Após 24 horas, adicionar G418 (15 mg / mL), higromicina (50 ug / ml), e blasticidina (10 ug / ml). Passar 1 ml de células transformadas com droga em 9 ml de SDM79 com droga.
  21. Analise as células diariamente conforme descrito nas seções 6 e 7 Quando as células são fluorescentes, e chegaram a uma densidade celular de 1 x 10 7 / ml, fazer stabilates para armazenamento de longo prazo (3,1-3,3).
ve_title "> 3. Fazer Stabilates

  1. Para fazer com que meios de congelação, adicionar um volume igual de glicerol a 100% e para cytomix filtro de esterilização.
  2. Adicionar 200 ul de meio de congelação a 800 ul de células (1 x 10 7) em um frasco de congelação, misturar suavemente por inversão e lugar entre duas prateleiras de esferovite e congelar a -80 ° C.
  3. Uma vez congelado (~ 24 horas), as células de transferência para nitrogênio líquido. NOTA: É importante mover em células LN 2, após 24 h, como um armazenamento mais longo à temperatura de -80 ° C, leva a uma diminuição da viabilidade celular.

4. Stocks descongelamento congelados

  1. Remover o frasco congelado de -80 ° C e descongelamento à temperatura ambiente durante cerca de 10 min.
  2. Pipetar 9 ml de SDM79 com droga para um novo frasco estéril. Adicionar células descongeladas para este balão. Passa células 1:10, adicionando 1 ml desta cultura a 9 ml de SDM79 em um novo frasco (concentração final de 1 x 10 5 / ml).
  3. Antes de as células atingirem uma densidade de 10 7 / ml, começam citómetro definire ensaios de diluição.

5. Setup Cytometer

  1. Ligue o citômetro de fluxo e abrir o programa cflow Plus. NOTA: Antes de executar quaisquer amostras, os fluidos devem ser backflushed e enxaguado acordo com os passos 5,2-5,7.
  2. Substitua o tubo de água nanopura em que o gole é armazenado com um tubo vazio.
  3. Selecione o botão "fluxo reverso".
  4. Depois de retrolavagem é completa, remova o tubo de microcentrífuga de gole e descarte.
  5. Colocar um novo tubo de microcentrifuga contendo 1 ml de água nova nanopura na sorvo.
  6. Selecione um novo poço no programa cflow. Em "Limites Run" definir o tempo de 2 min. Em "Fluidics", selecione "rápido" e "Run".
  7. Uma vez que o limite de tempo de 2 min é completa, clique no botão "Apagar dados de exemplo".

6. contagem celular usando citômetro de fluxo

  1. Substituir a água com a amostra a ser contadas. Defina "Limites Executar "para 30 segundos," Fluidics "para" rápida "e selecione" Executar ".
  2. Após o prazo de 30 seg é completa, cflow mais irá fornecer os eventos / l em "Last Run". Contagem Repita para cada cultura. NOTA: Antes de células chegar a 1 x 10 7 células / ml, prossiga com ensaio de diluição. As células devem ser interrompido após um ensaio de diluição for concluída. Células cultivadas por períodos mais longos perdem a capacidade de responder às condições ambientais.

7 Fluorescência de medição usando citômetro de fluxo

  1. Para avaliar a fluorescência, definir "limites Run" para 10 mil eventos e "Fluidos" para "lento". Selecione "Definir limite". Em "Threshold Primária", selecione "permanentemente eliminar eventos do", "FSC-H" (na caixa drop-down) e entre menos de 30.000. Clique em "Aplicar" e depois em "fechar".
  2. Selecione o220; "botão em uma das novas janelas de plotagem e selecione" Histograma FSC-A "A partir da lista drop-down, selecione" FL1-A ". NOTA: medidas FL1-A fluorescência no comprimento de onda de 530 nm.
  3. Selecione "Run" e repita para todas as culturas.
  4. Executar a solução de limpeza através da linha de fluidos durante 2 min e água durante 2 min.

8. Diluição Ensaios

  1. Passar as células a uma densidade de 1 x 10 5 células / ml em 3 ml de SDM79 num balão de cultura de 2 25 cm e medir a fluorescência imediatamente após a passagem e, em seguida, em 3 horas e 24 horas.

Análise dos dados do 9

  1. Selecione "Analisar" guia sobre cflow Plus.
  2. Clique no botão "Histograma" em "Fazer uma nova trama." Selecionar "FSC-A" e uma lista drop-down aparecerá. Selecione o canal "FL1-A."
  3. Realce um bem para analisar. Selecione o botão "Gate", e desenhar manualmente uma portapara a população de interesse.
  4. Fluxo Plus fornecerá celular "Contagem" dentro desse portão e "% dessa trama".

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Representative Results

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Neste sistema, uma alteração dependente de glucose em glicossomo composição foi observado. Quando as células são cultivadas em meios contendo glucose, duas populações são observados; um brilhante e uma fraca (Figura 2A). Células Dim abrigar glicossomos imaturas, que não tenham importado a PTS2eYFP enquanto as células vivas abrigam uma mistura de maduros e imaturos glicossomos 12. Quando a glicose está presente na mídia, mislocalization de glicossomo proteínas é letal 15,28 e glicossomo expressão da proteína é provavelmente associada intimamente com importação. Este regulamento apertado é responsável pelo aparecimento de células dim em que glicossomo expressão da proteína é suprimida quando as células não têm capacidade suficiente de importação. Uma vez que a importação de máquinas glicossomo está totalmente montada e funcional, as células expressam glicossomo proteínas, que são importados para glicossomos, produzindo células fluorescentes. Nos meios de comunicação de glicose-esgotar, o mislocalization de glicossomo proteínas é tolerard 15, e a distribuição da população bimodal é substituído por um único pico com uma gama mais ampla de fluorescência (Figura 2B).

Este sistema foi utilizado para identificar as condições que provocam alterações na composição glicossomo. Quando as culturas de alta densidade contendo ~ 10% de células dim (Figura 3A) são passados ​​para meios frescos, existe um aumento transitório na percentagem de células dim (Figura 3B). Por 24 horas. a distribuição da população original for restabelecida (Figura 3C).

SDM79 Sólidos Peso (g / l)
Graças media pó de células de insectos 2
Glicose 1
HEPES 8
MOPS 5
NaHCO3 2
Piruvato de sódio 0,1
L-alanina 0,2
L-Arginina 0,1
L-Glutamina 0,3
L-Methonine 0,07
A L-fenilalanina 0,08
L-prolina 0,6
L-Serina 0.06
L-Taurina 0,16
L-Treonina 0,35
L-tirosina 0,1
A adenosina 0,01
Guanosine 0,01
Glucosamina 0,05
O ácido fólico 0.004
r-aminobenzóico 0.002
Biotina 0,0002

Tabela 1 SDM79 componentes sólidos. Componentes do meio sólido e a quantidade (g / l) são fornecidos.

SDM79
MEM com glutamina 600 ml
Pen / Strep 10 ml
Solução de vitamina BME 10 ml
MEM solução aminoácidos 8 ml
Solução de aminoácidos não essenciais MEM 6 ml
Hemin 3,75
Água 162,25 ml

Tabela 2. SDM79 componentes líquidos. Volumes ml são dadas.

Por 20 ml
KCl 120 mM 1,4 ml (1 M)
0,15 mM de CaCl2 3 ml (1 M)
10 mM de K 2 HPO 4 400 ml (0,5 M)
HEPES 25 mM 500 ml (1 M)
2 mM de EDTA 80 ml (0,5 M)
5 mM de MgCl2 100 ml (1 M)
Água 16.52

Tabela 3 Cytomix receita.

Figura 1
Figura 1 sistema glicossomo fluorescente repórter. A) integração expressão PTS2eYFP construção. Tripanossomas PCF foram transformadas com o PXS2PTS2eYFP plasmídeo linearizado com a enzima de restrição Mlul. Esta construção integra por recombinação homóloga no locus de tubulina (cuba) e sequências de PARP (PARP) inclui o promotor que dirige a expressão constitutiva de PTS2eYFP e as sequências necessárias para o processamento de ARN. B) PTS2eYFP importação. PTS2eYFP é sintetizada no citoplasma, onde se liga o receptor solúvel, PEX7, que proporciona a proteína repórter aos glicossomos. Uma vez entregue à membrana glicossomo, a proteína é importado. Organelas maturos com importação de máquinas PTS2eYFP importação e de fluorescência, enquanto aqueles que não contêm máquinas de importação funcional permanecer fraca.

Figura 2
Figura 2.-glicose dependente glicossomo composição. PCF células foram cultivadas em SDM79 (+ Glc) ou SDM80 (Glc) eanalisadas por citometria de fluxo. Os histogramas de 10.000 eventos. A) Análise de células cultivadas em SDM79 revela de forma consistente dois picos. Células fluorescentes abrigar uma mistura de organelas maduros e imaturos com células de maiores intensidades de fluorescência com glicossomos mais maduros. Em SDM79, mislocalization de glicossomo proteínas é letal e glicossomo expressão de proteínas e de importação deve ser rigidamente controlado. Isso se reflete na ausência de células com intensidades de fluorescência intermediários. B) No SDM80, o mislocalization de glicossomo proteínas é tolerado, a distribuição da população bimodal é perdida, e as células de fluorescência intermediária são observados.

Figura 3
Figura 3 glicossomo remodelação. Remodelação de glicossomos é desencadeada por passagem em meio fresco. 6 / ml). B) três horas após a diluição em SDM79 fresco há um aumento na proporção de células com dim glicossomos imaturas que caem dentro da porta esquerda C ) Histograma da cultura diluída após 24 hr. Após 24 horas, a distribuição da população voltou ao normal, como os glicossomos imaturos agora contêm as proteínas peroxissoma necessário importar a proteína fluorescente.

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Discussion

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Glicossomos são, dinâmico, organelas essenciais específicos do parasita. Os processos que regulam a biogênese, manutenção, proliferação e remodelação dessas organelas provavelmente incluem alvos de medicamentos que poderiam ser exploradas para fins terapêuticos. Apesar do elevado potencial de abundância de tais alvos de drogas, o campo de glicossomo biogênese ficou para trás o estudo de processos similares em outros organismos, predominantemente, devido à falta de um sistema tratável, de alto rendimento para o acompanhamento rápidas dinâmicas, respostas, organelas em células vivas.

Sistemas repórter fluorescentes organelo têm sido utilizados para estudar a dinâmica de organelos nos eucariotas superiores, tais como leveduras, fungos, plantas e mamíferos 23-25. Geramos uma cepa transgênica de parasitas PCF que expressam PTS2eYFP que é direcionado para amadurecer glicossomos, produzindo organelas fluorescentes. Alterações na composição glicossomo pode ser monitorizado através de seguinte fluorescência celular. Usando este sistema, temos verificado que as condições ambientais, nomeadamente glicose, regular glicossomo composição 12.

Em contraste com os métodos de microscopia frequentemente usados ​​para estudar a dinâmica de organelas em parasitas kinetoplastides, este sistema repórter oferece um método pelo qual a tela rapidamente compostos e condições que influenciam a dinâmica global glicossomo. No entanto, as mudanças na fluorescência refletir mudanças nas composições globais de organelas. Outros experimentos bioquímicos e microscópicos são necessários para definir as diferenças moleculares específicas entre populações de células que apresentam diferentes intensidades de fluorescência.

Nós identificamos uma série de etapas críticas nos ensaios de remodelação. Curiosamente, verificou-se que quando as células são cultivadas por períodos mais longos (mais de duas passagens), o seu comportamento em resposta a alterações ambientais é imprevisível. Após a cultura prolongada, as células passaram de alta densidade em fresco mEDIA, exibem um aumento temporário da população fraca, o que indica que eles ainda são capazes de remodelar glicossomos, mas morre após 24 horas. Também encontramos situações em que nenhum remodelação e observado. A razão para este comportamento é completamente conhecida, mas verificou-se que quando as células são tratadas como descrito aqui (que limita o número de transferências para duas culturas e manter abaixo de 1 x 10 7 / ml), glicossomo remodelação é reprodutível. Quando as células não são mais sensíveis às condições ambientais, retransforming células com o plasmídeo repórter-constructo normalmente remédios esta situação.

Embora este sistema foi usado para estudar o comportamento em glicossomo tripanossomas africanos, ele também pode ser adoptada para o estudo de organelos em outros parasitas através da fusão de proteínas fluorescentes a sequências de aminoácidos que a proteína directa localização para outros compartimentos celulares.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine Avocado Research Chemicals Ltd A10781 SDM79 Ingredient
L-Alanine Avocado Research Chemicals Ltd A15804 SDM79 Ingredient
L-Arginine CalBiochem 1820 SDM79 Ingredient
p-Aminobenzoic acid ICN Biomedicals 102569 SDM79 Ingredient
Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x) Sigma B6891 SDM79 Ingredient
Biotin Fisher BP232-1 SDM79 Ingredient
Calcium chloride VWR BDH0224 Cytomix
EDTA Fisher S311-100 Cytomix ingredient
EZNA Gel Extraction kit Omega Biotek D2500-01 DNA purifiation
Research grade Serum Fisher 03-600-511 SDM79 Ingredient
Folic acid ICN Biomedicals 101725 SDM79 Ingredient
Glucosamine HCl ICN Biomedicals 194671 SDM79 Ingredient
Glucose GIBCO 15023-021 SDM79 Ingredient
L-Glutamine CalBiochem 3520 SDM79 Ingredient
Glycerol Acros Organics Ac15892-0010 Freezing media
Graces insect cell media powder GIBCO 11300-043 SDM79 Ingredient
Hemin MP Biomedicals 194025 SDM79 Ingredient
Guanosine Avocado Research Chemicals Ltd A11328 SDM79 Ingredient
HEPES MP Biomedicals 194025 SDM79 Ingredient
Magnesium chloride Fisher BP214-500 Cytomix ingredient
L-Methionine Fisher BP388-100 SDM79 Ingredient
MEM Amino Acids (50x) Cellgro 25-030-CI SDM79 Ingredient
NEAA Mixture (100x) Lonza 13-114E SDM79 Ingredient
Minimal Essential Medium (1x) with L-glutamine Cellgro 10-010-CM SDM79 Ingredient
MOPS Fisher BP308-500 SDM79 Ingredient
Sodium biocarbonate Fisher S233-500 SDM79 Ingredient
Penicillin-streptomycin Solution Cellgro 30-002-CI SDM79 Ingredient
L-Phenylalanine ICN Biomedicals 102623 SDM79 Ingredient
Potassium chloride Fisher P217-500 Cytomix ingredient
Potassium phosphate dibasic anhydrous Fisheer P290-212 Cytomix ingredient
L-Proline Fisher BP392-100 SDM79 Ingredient
L-Serine Acros Organics 56-45-1 SDM79 Ingredient
Pyruvic acid, sodium salt Acros Organics 113-24-6 SDM79 Ingredient
L-Taurine TCI America A0295 SDM79 Ingredient
L-Threonine Acros Organics 72-19-5 SDM79 Ingredient
L-Tyrosine ICN Biomedicals 103183 SDM79 Ingredient
E.Z.N.A. Cycle Pure kit Omega Biotek D6492-02 DNA purification
Binding buffer Omega Biotek PDR041 DNA purification
SPW wash buffer Omega Biotek PDR045 DNA purification
Gene Pulser Xcell Biorad 165-2660 Trypanosome transformation
4 mm Electroporation cuvettes VWR Trypanosome transformation

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References

  1. Stuart, K., et al. Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases. J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).
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Utilizando Proteínas Fluorescentes para monitorar glicossomo Dynamics do Trypanosoma Africano
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Bauer, S., Conlon, M., Morris, M. Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome. J. Vis. Exp. (90), e51647, doi:10.3791/51647 (2014).More

Bauer, S., Conlon, M., Morris, M. Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome. J. Vis. Exp. (90), e51647, doi:10.3791/51647 (2014).

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