Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Floresan Proteinleri kullanarak Afrika tripanosom içinde Glycosome Dynamics Monitör

doi: 10.3791/51647 Published: August 19, 2014

Abstract

Trypanosoma brucei sığır 1, insan Afrika trypanosomiasis (HAT), ya da uyku hastalığı ve israf hastalığı, nagana neden olan bir kinetoplastida parazittir. Memeli konakçının kan ve çeçe sineği vektörü arasındaki parazit seçim yapar. Pek çok hücresel organellerin bileşimi bu farklı hücre dışı koşullara 2-5 cevaben değişir.

Glycosomes glikoliz katılan enzimlerin çoğu bölmeli olan yüksek seviyede uzmanlaşmış peroksizomlar bulunmaktadır. Gelişimsel ve çevresel düzenlenmiş şekilde 4-11 Glycosome kompozisyon değişir. Şu anda, glycosome dinamiklerini incelemek için kullanılan en yaygın teknikler elektron ve floresan mikroskopisi; pahalı, zaman ve emek yoğun ve yüksek verimlilik analizleri kolayca adapte değildir teknikleri.

Bu sınırlamaları, bir flüoresan raportör sistemi-glycosome üstesinden gelebilmek için,12 glycosomes için, füzyon proteini yönlendiren peroksizom hedefleme dizisi (PTS2) kaynaşır sarı floresan protein (EYFP) geliştirilmiş olan kurulmuştur. PTS2eYFP füzyon proteininin ithalinde, glycosomes floresan olur. Organel bozulması ve akış sitometrisi ile ölçülebilir floresans kaybı geri dönüşüm ile sonuçlanır. Hücrelerin büyük sayılar (5,000 hücre / sn) gibi tespit ve montaj gibi geniş numune hazırlama olmadan gerçek zamanlı olarak analiz edilebilir. Bu yöntem, çevre koşulları dalgalı yanıt olarak bir organel kompozisyonunda değişikliklere tespit hızlı bir yol sunar.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Trypanosoma brucei sığır Afrika insanlarda uyku hastalığından ve israf hastalığı, nagana neden olur. Bu hastalıkların tedavisinde kullanılan ilaçlar, aşılar mevcut değildir, eskimiş ve son derece zehirlidir ve ilaç direnci gelişimi için potansiyel yeni ilaç hedefleri 1 için arama gerektirir.

Ömrünün, T. sırasında brucei, bir böcek vektör ve memeli ev sahibi arasında dönüşümlü; parazit hayatta gerekir hangi çok farklı ortamlarda sergileyen iki ana. Parazit farklı çevre koşullarına maruz gibi metabolik ve morfolojik değişikliklerin bir dizi ortaya çıkar. En dramatik değişikliklerden bazıları tek-zar-sınırlı parazit özgü Mikrocisimler gözlenir, glycosomes 13 adlandırılır.

Glukoz seviyeleri nispeten yüksek (~ 5 mM) kan ve kan parazitler (BSF) glikolisis wh ile sadece ATP üretmekIle mitokondriyal metabolizma 14 bastırılır. Ökaryotlarda farklı olarak, glikoliz, sitoplazma, T. oluşur brucei glycosomes 14,15 glikolitik enzimlerin çoğu compartmentalizes. Parazitler, bir bloodmeal sırasında çeçe sineği tarafından alınır ve sinek tarafından sindirildikten 15 dakika içinde tespit edilemez seviyelere düşer glikozunda bir düşmenin, yaşarlar. Böcek metabolizması, procyclic formu (PCF), parazit daha esnek ve glukoz gibi, prolin gibi amino asitler, ATP, 16-18 sentezinde kullanılabilir olduğunu. Karşılaştırmalı proteomik çalışmalar yaşam döngüsü glycosomal bağımlı değişiklikler ve kan parazitlerin artan glikolitik proteinler ile mitokondriyal proteinler ve TCA döngüsü ve solunum zincirinde 13,19 katılan mitokondriyal proteinleri ortaya. Birçok çalışma BSF ve PCF glycosomes arasındaki farklar odaklanmış olsa da, küçük env tepki olarak ortaya PCF glycosomes değişiklikler hakkında bilinmektedirironmental değişir.

Sineğin hindgut, glukoz düzeyleri bir beslenme 20 sırasında geçici artışlar ile düşüktür. In vitro çalışmalar çoğunda, PCF parazitler glikoz içeren ortamda yetiştirilmektedir. Ancak son çalışmalar önemli ölçüde yanıt PCF metabolizma değişiklikleri durumunu 17 glikoza olduğunu göstermiştir. Glukoz, prolin alım ve prolin dehidrojenaz aktivitesi artışı 18 yokluğunda. Mitokondrial metabolizmanın bu değişiklik muhtemelen glycosome kompozisyon ve morfolojisinde bir değişime de eşlik eder, bununla birlikte, bu direkt olarak değerlendirilmemiştir.

Elektron ve floresan mikroskobu yaygın teknikler T. glycosome dinamiklerini incelemek için kullanılır brucei 2,21-24. Bu protokoller, zaman ve yoğun, pahalı ve gerçek zamanlı çalışma ve yüksek verimli protokollere adapte zor doğum. Bir floresan-organel muhabiri sistemi u bu sınırlamayı aşmak içinmemeli hücreleri ve maya sistemlerinin organellere çalışma sed T. kullanılmak üzere modifiye edilmiştir brucei 12.

Floresan-organel haberci sistemleri yaygın gibi maya, bitki ve memeli hücreleri de 25-27 gibi daha yüksek ökaryotlardaki kullanılmıştır. Bu gibi sistemlerde, bir flüoresan proteini spesifik organellere proteini hedefler bir amino asit sekansına kaynaştırılır. Hedef proteinlerin bozulması veya sentez floresan ölçülmektedir ve organel bileşim değişiklikler hücre flüoresanlıktaki değişikliklerle yansıtılmaktadır.

Geliştirilmiş sarı floresan proteini (EYFP) 'nin açık okuma çerçevesi, bir tip II peroksisomal hedefleme sekansı (PTS2) ve 12 bağlı olduğunda, olgun bir protein PTS2eYFP, ithal yetkin glycosomes ve floresan içine alınır, akış sitometrisi vasıtasıyla izlenebilir. Glycosome bileşim içinde varyasyonlar hücresel flüoresanlıktaki değişikliklerle yansıtılmaktadır. Bu sistem, resol yardımcı olabilirglycosome bileşim içinde çevreden kaynaklanan değişiklikler belirleyen mekanizmaları VING.

Bu yazıda canlı parazitlere gerçek zamanlı glycosome dinamiklerini izlemek için akış sitometrisi ile bağlantılı PCF parazitler bir glycosome raportör sistemin üretimini tarif ve farklı ortamlarda yanıt olarak glycosome bileşim değişimlerin izlenmesi için kullanılmıştır bir örnek sağlamaktadır. Taze ortam glycosome kompozisyonunda değişikliklere tetikler içine Özet olarak, bileşim, glycosome hücre dışı glükoz konsantrasyonu ve log-faz geçişi kültürlerin etkilenir. Bu sistem tripanozomlarına ve diğer parazitlerin diğer organellerin dinamik davranışlarını incelemek için modifiye edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Genel Trypanosome Yetiştiriciliği

  1. SDM79 ortamlarının hazırlanması (Tablo 1), katı madde tartılır.
  2. 4 50 ml konik ° C veya bir plastik torba saklayınız. NOT: Reaktifler, en az 6 ay stabildir.
  3. Çözülme fetal inek, bir 37 ° C su banyosunda serumu (FBS) ve tersine periyodik olarak karıştırın. NOT: FBS steril bir çözelti olarak tedarikçiden alınır. FBS sterilize parazit büyümeyi desteklemek kabiliyetini azaltır.
  4. Tüm şişe çözülmüş sonra, ısı serum bileşenlerinin çökelmesini azaltmak için periyodik karıştırma, 56 ° C su banyosu içinde 30 dakika boyunca serum etkisiz hale getirirler.
  5. Çözülme penisilin / streptomisin solüsyonu (pen / strep), Hemin (50 mM NaOH içinde 2 mg / ml), ve oda sıcaklığında bazal ortam kartal vitamin çözeltisi.
  6. 1.000 ml'lik dereceli bir silindir için, sıvı bileşenler (Tablo 2) SDM79 katı (Tablo 1) 20.2 g 'ını ve bir karıştırma levhası üzerinde iyice karıştırın.
  7. 7,35 pH ayarlayın ve su ile 850 ml hacim getirmek.
  8. Filtre bir filtre şişe altına bir vakum hortumu takarak ortamı sterilize. Çözelti filtre kadar vakum uygulayın.
  9. Biyogüvenlik kabini filtre üst çıkarın ve FBS ısı 150 ml ekleyin. Steril kap ve mühür medya şişe plastik kaplamayı çıkarın.
  10. Aşağıdaki istisnalar dışında SDM79 gibi aynı şekilde SDM80 ortamını hazırlayın; glikoz veya glukozamin ekleyebilir ve glutamin olmadan MEM kullanmayın. FBS, ısı 150 ml yerine, 135 diyalizlenmiş FBS, ısı ml ve FBS, ısı 15 ml ilave ediniz.
  11. 27 ° C de, 10 ml bir uygun ortam ile 25 cm2 şişeye ve% 5 CO2 Kültür PCF parazitleri. Not: Hücreler bir hemositometre sitometresi veya bir akışı kullanılarak günlük olarak kabul edilmelidir (bölüm 6) ve kültürler 1 x 10 5 ve 5 x 10 6 hücre / ml arası bir yoğunlukta muhafaza edilmesi gereklidir.

2. TrFloresan Raportörü Yapısının ile PCF Parazitlerin ansfection

Not: geliştirilmiş sarı floresan proteinine aldolaz peroksisomal hedefleme sekansı (PTS2) ihtiva eden bir raportör proteini parazitler olarak ifade edilir, glycosome dinamikleri izleyin. Füzyon proteini kodlayan sekansı procyclin promotörünü ve tübülin intergenik bölgeleri, genom içerisine doğrudan homolog rekombinasyon ve seçilmesi için blasticidin direnç geni içeren pXS2bla 12 içine klonlanır. T7 polimeraz ve tetrasiklin bastırıcı (PF29-13) kodlayan genleri barındıran Procyclic hücre çizgileri hedefleme konstruktu, pXS2 ile transforme edilmiştir: PTS2eYFP.

  1. Tablo 3'te sıralanan unsurların karıştırılması ile cytomix hazırlayın. Oda sıcaklığında sterilize etmek ve saklamak Filtre.
  2. DNA (1 ug / ml), 5 ul sınırlayıcı enzim tamponu, 33 ul su, 10 ul pipetleme Mlul ile linearize plazmid DNA ve 2 μ, Bir mikrosantrifüj tüpüne Mlul enzim l. 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
  3. Kısıtlama sınırlama enzimi sindirimi ve bağlama tamponu içinde 1 hacim ekleyerek sindirmek saflaştınlır. Vorteks yoluyla bağlayıcı tampon ve sindirilmiş DNA karıştırın. Kısaca tüpün altındaki örnek toplamak için santrifüj.
  4. 2 ml'lik bir toplama tüpü içine sütunu, DNA bağlayıcı bir ekleme, ve transfer sütuna bağlanma tampon çözeltisi / DNA ile sindirilmiş.
  5. 1 dakika 10.000 xg için santrifüj. Santrifüj işleminden sonra toplama tüpünden süzüntü atın ve toplama tüpüne sütun dönmek.
  6. 1 dakika boyunca 10,000 x g'de Dikenlikurt'un yıkama tamponu ve santrifüj 700 ul ilave edin.
  7. Toplama tüpünden atın süzüntü, toplama tüpüne sütun dönmek ve Dikenlikurt'un yıkama adımı ve tekrar santrifüj.
  8. 10,000 x g'de 3 dakika boyunca atın Filtratın, toplama tüpüne geri sütun ve santrifüj boş kolon kalan etanolü atmak üzere.
  9. Bir biyogüvenlik kabini içinde, col atmaksteril mikrosantrifüj tüpü içinde lection boru ve yer kolon.
  10. , DNA elüt sütunu için steril su içinde 25 ul ilave edin ve 2 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe etmek. 1 dakika 10.000 x g'de santrifüj.
  11. Sütun biyo-güvenlik başlığı içinde steril su içinde bir 25 ul ilave edin ve 2 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  12. 1 dakika 10.000 xg hızda santrifüj.
  13. Bir biyogüvenlik kabini içinde yeni bir steril mikrosantrifüj tüp DNA'nın tüm hacim transferi. NOT: Bu adım santrifüj sırasında açık kapaktan kirlenmesini önler.
  14. Filtre ve sterilize edilen cytomix 400 ul steril, saflaştırılmış, linearize DNA (10 ug) ilave edin.
  15. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 800 x g'de santrifüj ile 5 x 10 7 -10 8 hücrelerin bölüm 6'da tarif edilen ve hasat gibi hücre sayımı.
  16. Süpernatantı dökün ve 1 ml'lik bir serolojik bir pipet kullanarak DNA + cytomix 450 ul hücre pelletini.
  17. Ce içeren Transfer çözüm rf, elektroporasyon odasında steril 4 mm boşluk küvet ve yer küvete DNA ve cytomix.
  18. "Üstel çürüme" seçin ve elle aşağıdaki ayarları girin: Gerilim: 1.5 kV, Kapasitans: 25 mF, Resistance: Ω, ve Küvet: 4 mm. Basın darbe. Darbe tamamlandıktan sonra, elektroporasyon odasından küvet kaldırmak ve biyo-güvenlik kabini geri döner.
  19. Yeni bir steril bir şişeye, pipet SDM79, 10 ml. SDM79 10 ml şişeye üzere dönüşmüş hücreleri aktarın.
  20. 27 ° C,% 5 CO2 seviyesinde 24 saat süre ile ilaç seçim olmadan inkübe edin. 24 saat sonra, G418 (15 ug / ml), higromisin (50 ug / ml) ve blastisidin (ug / ml 10 ug) ilave edilir. Ilaç ile SDM79 9 ml ilaç ile dönüştürülmüş hücrelerin 1 ml geçirin.
  21. Bölüm 6 ve 7 hücreleri, floresan içinde tanımlanan, ve x, 10 7/1 mi bir hücre yoğunluğuna ulaşıldığında gibi uzun süreli depolama (3.1-3.3) hale stabilates için, günlük hücreleri analiz edin.
ve_title "> 3. Stabilates Yapımı

  1. Dondurma medya yapmak için sterilize cytomix ve filtre% 100 gliserol eşit hacimde ekleyin.
  2. Kriyotüpe hücre 800 ul (1 x 10 7) benzer şekilde dondurma ortamı 200 ul, iki raf arasında köpük inversiyon ve yerine göre, yavaşça karıştırın ve -80 ° C'de dondurun.
  3. (~ 24 saat) sonra, donmuş sıvı nitrojen transfer hücreleri. NOT: C hücre yaşamı sürdürme kabiliyetinde bir azalmaya yol açmaktadır ° -80 Bu daha uzun depolama gibi, 24 saat sonra 2 LN hücreleri içine taşımak için önemlidir.

4. Çözülme Dondurulmuş Stoklar

  1. Yaklaşık 10 dakika boyunca oda sıcaklığında C ve -80 ° 'den çözülme dondurulmuş şişesinden çıkarın.
  2. Yeni bir steril şişe içine ilaç ile SDM79 Pipet 9 mi. Bu şişeye, çözülmesi hücreleri ekleyin. (1 x 10 5 ug / ml nihai konsantrasyon), yeni bir şişe içinde SDM79 9 ml bu kültürün 1 ml ilave etmek suretiyle hücreleri 01:10 geçirin.
  3. Hücreler, 10 7 / ml 'lik bir yoğunluğa ulaşmadan önce, sitometresi set başlaryukarı ve seyreltme testleri.

5. Cytometer Kur

  1. Sitometrede akış açın ve cflow Artı programını açın. NOT: Herhangi bir örnek çalıştırmadan önce, fluidik adımlar 5,2-5,7 göre akıtmaya ve durulanmalıdır.
  2. SIP boş bir tüp ile depolandığı Nanopure suyun tüp değiştirin.
  3. "Backflush" düğmesini seçin.
  4. Backflush tamamlandıktan sonra, yudum ve ıskarta gelen mikrosantrifüj tüpü çıkarın.
  5. Yudum yeni Nanopure su 1 ml ihtiva eden yeni bir mikrosantrifüj tüpü yerleştirin.
  6. Cflow programda yeni bir kuyu seçin. "Çalıştır Sınırları" altında 2 dakika için zaman ayarlayın. "Fluidics'in" altında "hızlı" ve "Çalıştır" seçeneğini seçin.
  7. 2 dakikalık bir zaman sınırı tamamlandıktan sonra, "Örnek Verileri Sil" düğmesine tıklayın.

Akış Sitometreyi kullanarak 6. Hücre Sayım

  1. Numune su yerine sayılacak. "SetRun Sınırları "30 sn," hızlı "için" Fluidics Çalıştır "" ve sonra seçin ".
  2. 30 sn zaman sınırı cflow, tam artı ul "Son Çalıştır." Her kültür için tekrarlayın sayımı altında olayları / sağlayacaktır sonra. NOT: Hücreler, 1 x 10 7 hücre / ml ulaşmadan önce, seyreltme testi ile devam edin. Bir seyreltme deney tamamlandıktan sonra hücreler kesilmelidir. Uzun süreler boyunca kültüre hücreler çevre koşullarına yanıt yeteneğini kaybeder.

Akış Sitometreyi kullanarak 7. Ölçme Floresan

  1. Floresan değerlendirmek için, 10.000 olaylar "Run Limitleri" ve "yavaş" için "Fluidics" olarak ayarlayın. "Set eşiği" seçeneğini seçin. "Birincil Eşik" altında (kutuda aşağı açılan), "Sürekli olayları ortadan kaldırmak" "FSC-H" seçin ve daha az 30,000 girin. Ardından "kapatmak", "uygulamak" tıklayın.
  2. Seçin220; Histogram "yeni arsa pencerelerden birinde düğmesine basıp" FSC-A FL1-A "" Açılır listeden itibaren, seçin ". NOT: 530 nm dalga boyunda FL1-A önlemler floresan.
  3. "Çalıştır" ı seçin ve tüm kültürler için tekrarlayın.
  4. 2 dakika 2 dakika ve su için fluidik hattı ile çözüme temizleme çalıştırın.

8. Seyreltme Tahliller

  1. 25 cm 2 kültürü şişesinde SDM79 3 ml içinde 1 x 10 5 hücre / ml 'lik bir yoğunluğa hücrelerin Pass ve hemen geçtikten sonra ve daha sonra 3 saat ve 24 saat sonra floresans ölçer.

9. Veri Analizi

  1. Seçin cflow Plus sekmesi "Analiz".
  2. Click "yeni bir komplo yapın." Seç "FSC-A" ve bir damla listesi altında "Histogram" düğmesi belirir. Kanal seç "FL1-A."
  3. Analiz etmek için bir kuyu vurgulayın. "Kapısı" düğmesini seçin, ve elle bir kapı çizmekilgi nüfus için.
  4. Akış Artı hücre bu kapı içinde "Sayısı" ve "Bu Plot%" sağlayacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu sistemde, glycosome bileşim içinde bir glukoza bağımlı bir değişiklik gözlenmemiştir. Hücreleri glikoz içeren ortamda yetiştirildiği zaman, iki nüfus gözlenir; Bir parlak ve bir loş (Şekil 2A). Dim hücreler parlak hücreler olgun ve olgunlaşmamış glycosomes 12 bir karışımını barındıran süre PTS2eYFP ithal değil olgunlaşmamış glycosomes, liman. Glikoz ortamı içinde mevcut olduğunda, protein glycosome mislocalization 15,28 öldürücü ve glycosome protein ekspresyon muhtemelen alma ile yakından bağlıdır. Bu sıkı düzenleme hücrelerin yeterli alma yeteneği olmayan zaman glycosome protein ifadesi baskılandığı loş hücrelerin görülmesi sorumludur. Glycosome alma amaçlı tamamen monte ve fonksiyonel sonra, hücreler daha sonra floresan hücre sağlar, glycosomes içine alınır glycosome proteinleri ifade eder. Glukoz Boyar maddeler içinde glycosome proteinlerin mislocalization tolere olduğuD 15, ve bimodal popülasyonu dağılımının floresan daha geniş bir aralıkta (Şekil 2B) tek bir tepe noktası ile değiştirilir.

Bu sistem glycosome bileşim içinde değişikliğine yol koşullarını tanımlamak için kullanılmıştır. ~% 10 sönük hücreleri (Şekil 3A) içeren yüksek yoğunluklu kültürler taze ortam içine iletildiğinde, loş hücreleri (Şekil 3B) yüzdesinde bir geçici bir artış vardır. 24 saat ile. Orijinal nüfus dağılımı (Şekil 3C) yeniden.

SDM79 Katılar Ağırlık (g / l)
Böcek hücresi ortamı toz süsler 2
Glikoz 1
Hepes 8
MOPS 5
NaHCO3 2
Sodyum piruvat 0.1
L-Alanin 0.2
L-Arginin 0.1
L-Glutamin 0.3
L-Methonine 0.07
L-Fenilalanin 0.08
L-Prolin 0.6
L-Serin 0.06
L-Taurin 0.16
L-treonin 0.35
L-Tirozin 0.1
Adenozin 0.01
Guanozin 0.01
Glukozamin HCl 0.05
Folik asit, 0.004
r-Aminobenzoik asit 0.002
Biotin 0.0002

Tablo 1. SDM79 katı bileşenler. Katı ortam bileşenleri ve miktarı (g / L) verilmiştir.

SDM79
Glutamin MEM 600 mi
Kalem / Strep 10 mi
BME vitamin çözeltisi 10 mi
MEM amino asit çözeltisi 8 mi
MEM gerekli olmayan amino asit çözeltisi 6 mi
Hemin 3.75
Su 162,25 mi

Tablo 2. SDM79 sıvı bileşenler. Birimleri ml verilir.

20 ml
120 mM KCI 1.4 mi (1 M)
0.15 mM CaCl2 3 mi (1 M)
10 mM K 2 HPO 4 400 mi (0.5 M)
25 mM HEPES 500 ml (1 M)
2 mM EDTA 80 mi (0.5 M)
5 mM MgCI2 100 mi (1 M)
Su 16.52

Tablo 3. cytomix tarifi.

Şekil 1
1. Floresan glycosome raportör sistemi Şekil. A), PTS2eYFP ekspresyon yapısı entegrasyonu. PCF tripanozomlar pX ile dönüştürülmüştürS2PTS2eYFP plazmid Mlul kısıtlama enzimi ile linearize. Bu konstrukt, tübülin mahaline (döşeme) ve PARP-dizileri (PARP) içine, homolog rekombinasyon ile entegre PTS2eYFP yapısal ekspresyonunu ve RNA işleme. B için gerekli dizileri) PTS2eYFP alma tahrik promoterini içerir. PTS2eYFP bu glycosomes raportör protein teslim çözünebilir reseptörünü, PEX7 olarak bağlanan sitoplazmada sentezlenir. Glycosome membran teslim sonra protein, ithal edilmektedir. Fonksiyonel ithal makine içermeyen olanlar loş kalırken ithalat makine ithalat PTS2eYFP ve floresan içeren Olgun organeller.

Şekil 2
Şekil 2. Glükoz bağımlı glycosome terkip. PCF hücreleri SDM79 (+ GLC) ya da SDM80 (GLC) gece boyunca yetiştirilmiştir edildi veakış sitometrisi ile analiz edilmiştir. 10.000 olayların histogramlar. SDM79 yetiştirilen hücreler A) Analizi sürekli iki tepe ortaya koymaktadır. Floresan hücreler daha olgun glycosomes sahip yüksek floresan yoğunlukları hücreleri olgun ve olgunlaşmamış organellerin bir karışımını barındırır. SDM79 olarak, protein, mislocalization glycosome öldürücü ve glycosome protein ekspresyonu ve ithalat sıkı bir şekilde kontrol edilmelidir. Bu ara madde, floresan yoğunlukları b.) SDM80 In hücrelerin yokluğunda yansıyan glycosome proteinlerin mislocalization bimodal nüfus dağılımı kaybolur, ve ara floresan hücreleri gözlenir, iyi tolere edilir.

Şekil 3,
Şekil 3. Glycosome yeniden modellenmesi. Glycosomes yeniden modellenmesi, taze ortam içine geçirme ile tetiklenir. 6 / ml). B) sol kapının C giren olgunlaşmamış glycosomes loş hücrelerin oranında bir artış taze SDM79 içine seyreltildikten sonra 3 saat 24 saat sonra seyreltilmiş kültür) Histogram. Olgunlaşmamış glycosomes şimdi floresan proteini almak için gerekli peroksisom proteinleri içeren olarak 24 saat sonra, nüfus dağılımı, normale döndü.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Glycosomes temel, dinamik, parazit özgü organellerdir. Bu organellerin biyogenezi, bakım, çoğalması ve biçimlenme düzenleyen süreçler olası terapötik amaçlar için istismar edilebilir ilaç hedefleri arasındadır. Bu tür ilaç hedefleri potansiyel olarak yüksek bolluğuna rağmen, daha glycosome biyogenez alan baskın nedeniyle, hızlı ve dinamik organel karşılıklarının izlenmesi için olan bir izlenebilir, yüksek hacimli sistem eksikliği, bir başka organizmalarda benzer süreçlerle ilgili çalışmalarda gerisinde kalmış Canlı hücrelerdeki.

Floresan-organel haberci sistemleri, maya, bitki, mantar ve memeli gibi daha yüksek ökaryotlardan 23-25 ​​organel dinamikleri üzerinde çalışmak için kullanılmaktadır. Biz floresan organellere, sonuçta glycosomes olgun hedeflenmektedir PTS2eYFP ifade PCF parazitler bir transgenik gerginlik yarattı. Glycosome kompozisyonunda değişiklikler aşağıdaki hücresel floresan ile izlenebilir. Bu sistemi kullanarak, özellikle glukoz, çevre koşulları, glycosome bileşim 12 düzenleyen bulmuşlardır.

Genellikle kinetoplastida parazitlerde organel dinamikleri üzerinde çalışmak için kullanılan yöntemleri mikroskop aksine, bu raportör sistemi hızla bileşikleri ve genel glycosome dinamikleri etkileyebilecek koşullar taranması için olan bir yöntem sunar. Bununla birlikte, floresanstaki değişimler genel organel bileşimlerinde değişiklikleri yansıtır. Ayrıca biyokimyasal ve mikroskopik deneyler farklı floresan yoğunluklannı gösteren hücre popülasyonları arasındaki spesifik moleküler farklılıkları tanımlamak için gereklidir.

Biz remodeling analizlerde kritik adımlardan bir dizi belirledik. İlginç bir şekilde, hücreler daha uzun bir süre (en fazla iki geçiş) kültürlendi gibi, çevresel değişikliklere tepki olarak davranış tahmin edilemez olduğunu bulduk. Uzun süreli kültürden sonra hücreler taze m içine yüksek yoğunluklarda geçtiedia, onlar hala glycosomes pişmanlık mümkün olduğunu belirten loş nüfus geçici bir artış gösterirler, ancak 24 saat sonra ölür. Biz de hiçbir biçimlenme görülmektedir durumlarla karşı karşıya kalmıştır. Bu davranışın nedeni belirsizdir ama biz burada anlatıldığı gibi hücreleri ele zaman (iki hücre pasajlar sayısının sınırlandırılması ve 1 x 10 7 / ml altında kültürlerini koruyarak) bulduk, glycosome yeniden şekillenme tekrarlanabilir. Hücreleri, bu durum, raportör plazmid-yapısı genellikle ilaçlar hücrelerin yeniden dönüştürülmesiyle, artık çevre şartlarına duyarlı olduğunda.

Bu sistem, Afrika tripanozomlann glycosome davranışını incelemek için kullanılmış olsa da, aynı zamanda diğer selüler kompartımanlara, doğrudan protein lokalizasyonu amino asit dizilerini floresan proteinleri kaynaştırarak diğer parazitler organellerin çalışma için kabul edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine Avocado Research Chemicals Ltd A10781 SDM79 Ingredient
L-Alanine Avocado Research Chemicals Ltd A15804 SDM79 Ingredient
L-Arginine CalBiochem 1820 SDM79 Ingredient
p-Aminobenzoic acid ICN Biomedicals 102569 SDM79 Ingredient
Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x) Sigma B6891 SDM79 Ingredient
Biotin Fisher BP232-1 SDM79 Ingredient
Calcium chloride VWR BDH0224 Cytomix
EDTA Fisher S311-100 Cytomix ingredient
EZNA Gel Extraction kit Omega Biotek D2500-01 DNA purifiation
Research grade Serum Fisher 03-600-511 SDM79 Ingredient
Folic acid ICN Biomedicals 101725 SDM79 Ingredient
Glucosamine HCl ICN Biomedicals 194671 SDM79 Ingredient
Glucose GIBCO 15023-021 SDM79 Ingredient
L-Glutamine CalBiochem 3520 SDM79 Ingredient
Glycerol Acros Organics Ac15892-0010 Freezing media
Graces insect cell media powder GIBCO 11300-043 SDM79 Ingredient
Hemin MP Biomedicals 194025 SDM79 Ingredient
Guanosine Avocado Research Chemicals Ltd A11328 SDM79 Ingredient
HEPES MP Biomedicals 194025 SDM79 Ingredient
Magnesium chloride Fisher BP214-500 Cytomix ingredient
L-Methionine Fisher BP388-100 SDM79 Ingredient
MEM Amino Acids (50x) Cellgro 25-030-CI SDM79 Ingredient
NEAA Mixture (100x) Lonza 13-114E SDM79 Ingredient
Minimal Essential Medium (1x) with L-glutamine Cellgro 10-010-CM SDM79 Ingredient
MOPS Fisher BP308-500 SDM79 Ingredient
Sodium biocarbonate Fisher S233-500 SDM79 Ingredient
Penicillin-streptomycin Solution Cellgro 30-002-CI SDM79 Ingredient
L-Phenylalanine ICN Biomedicals 102623 SDM79 Ingredient
Potassium chloride Fisher P217-500 Cytomix ingredient
Potassium phosphate dibasic anhydrous Fisheer P290-212 Cytomix ingredient
L-Proline Fisher BP392-100 SDM79 Ingredient
L-Serine Acros Organics 56-45-1 SDM79 Ingredient
Pyruvic acid, sodium salt Acros Organics 113-24-6 SDM79 Ingredient
L-Taurine TCI America A0295 SDM79 Ingredient
L-Threonine Acros Organics 72-19-5 SDM79 Ingredient
L-Tyrosine ICN Biomedicals 103183 SDM79 Ingredient
E.Z.N.A. Cycle Pure kit Omega Biotek D6492-02 DNA purification
Binding buffer Omega Biotek PDR041 DNA purification
SPW wash buffer Omega Biotek PDR045 DNA purification
Gene Pulser Xcell Biorad 165-2660 Trypanosome transformation
4 mm Electroporation cuvettes VWR Trypanosome transformation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stuart, K., et al. Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases. J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).
  2. Herman, M., Perez-Morga, D., Schtickzelle, N., Michels, P. A. Turnover of glycosomes during life-cycle differentiation of Trypanosoma brucei. Autophagy. 4, 294-308 (2008).
  3. Herman, M., Gillies, S., Michels, P. A., Rigden, D. J. Autophagy and related processes in trypanosomatids: insights from genomic and bioinformatic analyses. Autophagy. 2, 107-118 (2006).
  4. Michels, P. A., Bringaud, F., Herman, M., Hannaert, V. Metabolic functions of glycosomes in trypanosomatids. Biochim Biophys Acta. 1763, 1463-1477 (2006).
  5. Michels, P. A., et al. Peroxisomes, glyoxysomes and glycosomes (review). Mol Membr Biol. 22, 133-145 (2005).
  6. Moyersoen, J., Choe, J., Fan, E., Hol, W. G., Michels, P. A. Biogenesis of peroxisomes and glycosomes: trypanosomatid glycosome assembly is a promising new drug target. FEMS Microbiol Rev. 28, 603-643 (2004).
  7. Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes. Molecular and biochemical parasitology. 115, 19-28 (2001).
  8. Parsons, M. Glycosomes: parasites and the divergence of peroxisomal purpose. Mol Microbiol. 53, 717-724 (2004).
  9. Michels, P. A., Hannaert, V., Bringaud, F. Metabolic aspects of glycosomes in trypanosomatidae - new data and views. Parasitol Today. 16, 482-489 (2000).
  10. Michels, P. A., Hannaert, V. The evolution of kinetoplastid glycosomes. J Bioenerg Biomembr. 26, 213-219 (1994).
  11. Hannaert, V., Michels, P. A. Structure function, and biogenesis of glycosomes in kinetoplastida. J Bioenerg Biomembr. 26, 205-212 (1994).
  12. Bauer, S., Morris, J. C., Morris, M. T. Environmentally regulated glycosome protein composition in the african trypanosome. Eukaryot Cell. 12, 1072-1079 (2013).
  13. Colasante, C., Ellis, M., Ruppert, T., Voncken, F. Comparative proteomics of glycosomes from bloodstream form and procyclic culture form Trypanosoma brucei brucei. Proteomics. 6, 3275-3293 (2006).
  14. Opperdoes, F. R. Compartmentation of carbohydrate metabolism in trypanosomes. Annu Rev Microbiol. 41, 127-151 (1987).
  15. Kessler, P. S., Parsons, M. Probing the role of compartmentation of glycolysis in procyclic form Trypanosoma brucei: RNA interference studies of PEX14, hexokinase, and phosphofructokinase. The Journal of biological chemistry. 280, 9030-9036 (2005).
  16. Bringaud, F., Riviere, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and biochemical parasitology. 149, 1-9 (2006).
  17. Coustou, V., et al. Glucose-induced remodeling of intermediary and energy metabolism in procyclic Trypanosoma brucei. The Journal of biological chemistry. 283, 16342-16354 (2008).
  18. Lamour, N., et al. Proline metabolism in procyclic Trypanosoma brucei is down-regulated in the presence of glucose. The Journal of biological chemistry. 280, 11902-11910 (2005).
  19. Vertommen, D., et al. Differential expression of glycosomal and mitochondrial proteins in the two major life-cycle stages of Trypanosoma brucei. Molecular and biochemical parasitology. 158, 189-201 (2008).
  20. Vickerman, K. Developmental cycles and biology of pathogenic trypanosomes. British medical bulletin. 41, 105-114 (1985).
  21. Lorenz, P., Maier, A. G., Baumgart, E., Erdmann, R., Clayton, C. Elongation and clustering of glycosomes in Trypanosoma brucei overexpressing the glycosomal Pex11p. The EMBO journal. 17, 3542-3555 (1998).
  22. Saveria, T., et al. Conservation of PEX19-binding motifs required for protein targeting to mammalian peroxisomal and trypanosome glycosomal membranes. Eukaryot Cell. 6, 1439-1449 (2007).
  23. Banerjee, S. K., Kessler, P. S., Saveria, T., Parsons, M. Identification of trypanosomatid PEX19: functional characterization reveals impact on cell growth and glycosome size and number. Molecular and biochemical parasitology. 142, 47-55 (2005).
  24. Milagros Camara Mde, L., Bouvier, L. A., Miranda, M. R., Pereira, C. A. Identification and validation of Trypanosoma cruzi's glycosomal adenylate kinase containing a peroxisomal targeting signal. Experimental parasitology. 130, 408-411 (2012).
  25. Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. The Journal of cell biology. 136, 71-80 (1997).
  26. Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. The Journal of cell biology. 173, 521-532 (2006).
  27. Hoepfner, D., Schildknegt, D., Braakman, I., Philippsen, P., Tabak, H. F. Contribution of the endoplasmic reticulum to peroxisome formation. Cell. 122, 85-95 (2005).
  28. Furuya, T., et al. Glucose is toxic to glycosome-deficient trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14177-14182 (2002).
Floresan Proteinleri kullanarak Afrika tripanosom içinde Glycosome Dynamics Monitör
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bauer, S., Conlon, M., Morris, M. Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome. J. Vis. Exp. (90), e51647, doi:10.3791/51647 (2014).More

Bauer, S., Conlon, M., Morris, M. Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome. J. Vis. Exp. (90), e51647, doi:10.3791/51647 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter