Summary
Meerneunauge verlieren die Gallenblase und der Gallenwege während der Metamorphose, ein Prozess ähnlich dem menschlichen Gallengangsatresie. Eine neue Methode der Fixierung und Klärung (CLARITY) wurde modifiziert, um die Gallenwege mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie visualisieren. Diese Methode bietet ein leistungsstarkes Werkzeug, um Gallen Degeneration zu studieren.
Abstract
Gallengangsatresie ist eine seltene Erkrankung des Kindesalters, mit einem geschätzten 1 in 15000 Frequenz im Südosten der Vereinigten Staaten, sondern in ostasiatischen Ländern häufiger mit einer Frequenz von 1 berichtet in 5000 in Taiwan. Obwohl viel über die Verwaltung der Gallengangsatresie bekannt ist, ist der Pathogenese noch ungeklärt. Das Meerneunauge (Petromyzon marinus) bietet eine einzigartige Gelegenheit, um den Mechanismus und den Verlauf von Gallendegeneration zu untersuchen. Meerneunauge entwickeln sich durch drei verschiedene Lebensphasen: Larven, Parasiten und Erwachsenen. Während des Übergangs von Larven von parasitären Jugend, Meerneunauge Metamorphose zu unterziehen mit dramatischen Sanierung und Umbau in äußere Morphologie und inneren Organen. In der Leber wird die gesamte Gallensystems verloren, einschließlich der Gallenblase und der Gallenwege. Eine neu entwickelte Methode namens "Klarheit" wurde modifiziert, um die gesamte Leber und die Kreuzung mit dem Darm in metamorphen Meerneunauge zu klären. DieProzess der Gallen Degeneration wurde durch Verwendung konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie visualisiert und Meerneunauge während der Metamorphose zu erkennen. Diese Methode bietet ein leistungsstarkes Werkzeug, um Gallengangsatresie in einer einzigartigen Tiermodell zu untersuchen.
Introduction
Meerneunauge durch drei verschiedene Leben zu entwickeln Stufen 1,2. Larven Meerneunauge (L) verbringen die meiste Zeit in Höhlen benthische Filtrierer. Nachdem man durch sieben metamorphen Phasen der dramatischen Veränderungen in der Morphologie und äußere Umgestaltung in die inneren Organe 3, die daraus resultierenden Jugendliche (JV) geben eine parasitäre Phase, während der sie auf Blut-und Gewebeflüssigkeiten von Host-Fische zu füttern, die Erhöhung der Körpermasse mehr als 100 Mal . Nach 1,0 bis 1,5 years Fütterung auf die Wirtsfische im Meer oder großen Seen, Erwachsene aufhören Fütterung während des Frühjahrs und wandern zum Laichen in die Flüsse und dann sterben 1,2.
Während der Metamorphose, verliert das Meerneunauge Leber die Gallenblase und der Gallenwege, eine evolutionäre mutierten Phänotyp, die den menschlichen Säugling Krankheit Gallengangsatresie nachahmt. Infant Gallengangsatresie ist eine seltene pädiatrische Lebererkrankung mit schweren medizinischen Komplikationen 4,5,6,7, 8.9.10, aber die Pathogenese und Ätiologie der Gallengangsatresie sind weitgehend unbekannt 4. Patienten mit Gallengangsatresie sterben innerhalb von zwei Jahren nach der Geburt, wenn ein chirurgischer Eingriff (Kasai-Verfahren) durchgeführt wird 5. Anschließend werden diese Patienten erfordern umfangreiche klinische Behandlung und oft eine Lebertransplantation sechs. Viele Theorien Gallenatresie Etiopathogenese vorgeschlagen worden, wie virale Infektionen, kongenitale Fehlbildungen, Autoimmunerkrankungen und toxischen Insult. Allerdings bleibt der Beitrag der jeweils für die Entwicklung der Gallengangsatresie nicht schlüssig 7,8,9,10.
Im Gegensatz zu Kindern, die pathologische Gallengangsatresie leiden, unterziehen Meerneunauge entwicklungs programmiert Gallengangsatresie ohne umfangreiche necroinflammation, Fibrose oder Zirrhose 10. Die Tiere können vorübergehende Cholestase während dieses Prozesses 10 leiden, aber passen sich diesem Entwicklungszustanddurch de novo-Synthese und Sekretion von Gallensäuren im Darm nach der Entwicklungs biliäre Atresie, zusätzlich zu bekannten Mechanismen, wie die Verringerung der Gallensalz-Synthese in der Leber 11. Dieser Entwicklungsprozess in Meerneunauge bietet die einzige bekannte Möglichkeit, das Fortschreiten der Gallengangsatresie zu untersuchen.
Eine neu entwickelte Methode namens "Klarheit" ermöglicht hochauflösende Bildgebung in komplexen Nervensystem von Säugetieren durch die Umwandlung intakten Gewebe in einem optisch transparenten nanoporöse Hydrogel-12. Mit Meerneunauge Leber und eine modifizierte CLARITY-Protokoll können intakte Gewebe-Bildgebung der Leber und Gallen Degeneration ganzen Metamorphose dokumentiert werden.
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Protocol
1. Herstellung der Lösung
- Auffüllen auf 1 l 10x 0,1 M Phosphatpufferlösung (PBS, pH 7,4): Gewicht 26,2 g Natriumphosphat (einbasischen), 115 g Natriumphosphat (dibasisches) und 87,66 g NaCl. Löst in etwa 800 ml destilliertem H 2 O, pH-Einstellung und bringt das Volumen auf 1 l mit destilliertem H 2 O.
- Stellen Sie 1 L 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4): Nehmen Sie 100 ml 10x PBS, und fügen Sie 900 ml destilliertem H 2 O.
- Stellen Sie 1 L 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) mit 0,1% Triton X-100: Nehmen Sie 100 ml 10x PBS, 1 ml Triton X-100, und bringen das Volumen auf 1 L mit destilliertem H 2 O.
- Auffüllen auf 1 l 10x 0,1 M Phosphatpuffer (PB, pH 7,4): Gewicht 26,2 g Natriumphosphat (einbasischen) und 115 g Natriumphosphat (dibasisches). Löst in etwa 800 ml destilliertem H 2 O, pH-Einstellung und bringt das Volumen auf 1 l mit destilliertem H 2 O.
- Stellen Sie 1 L 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4): Nehmen Sie 100 ml 10x PB,und fügen Sie 900 ml destilliertem H 2 O.
- Stellen Sie 1 L 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) mit 0,1% Triton X-100: Nehmen Sie 100 ml 10x PB, 1 ml Triton X-100, und bringen das Volumen auf 1 L mit destilliertem H 2 O.
- Machen 400 ml Hydrogel-Monomer-Lösung (4% Acrylamid, 0,25% Bis-Acrylamid, 4% Paraformaldehyd, 0,0075% Ammoniumpersulfat, 0,0005% Saponin in 0,1 M PBS): Man wiegt 0,3 g Ammoniumpersulfat und 0,2 g Saponin. Add 210 ml destilliertem H 2 O, 40 ml 40% Acrylamid, 10 ml 2% Bis-Acrylamid, 40 ml 10x PBS (pH 7,4), 100 ml 16% igem Paraformaldehyd, und gut mischen.
- Stellen 4 L Clearing-Lösung (4% SDS in 0,2 M Borsäure): Wiegen 49,464 g Borsäure und 160 g SDS. Löst in etwa 3,5 L destilliertem H 2 O, pH auf 8,5 mit NaOH, und bringen das Volumen bis zu 4 L.
- Stellen Sie 1 L 80% Glycerin-Lösung: Messen 800 ml Glycerin, 200 ml destilliertem H 2 O, und gut mischen.
2. Gewebepräparation
- Hydrogel-Monomer-Lösung herzustellen, und 10 ml Aliquots zu je 15 ml Zentrifugenröhrchen.
- Präparieren Sie die ganze Gewebe und zu beheben in dem Hydrogel für 2 Tage bei 4 ° C Stellen Sie sicher, dass das Hydrogel-Lösung mindestens 10-fache Volumen des Gewebes.
- Bringen Sie die Hydrogel-fixierten Gewebe (in der 15-ml-Zentrifugenrohr) zu einem Abzug.
- Polymerisieren das Hydrogel fixiertem Gewebe durch Zugabe von 5 ul TEMED, gut mischen, und lassen Sie sich im Abzug bei Raumtemperatur für 2-3 Stunden.
- Entfernen Sie das überschüssige Gel gründlich. Hinweis: Extra-Gel wird den Clearing-Prozess und den Antikörper Penetration während der Färbung zu verhindern.
- Inkubieren Sie die fixierten Gewebe in 10 ml Clearing-Lösung in einem Inkubator Schüttler bei 70 rpm und 50 ° C eingestellt, für einige Tage, bis das Gewebe wird transparent. Ändern Clearing-Lösung mindestens einmal pro Tag und entfernen Sie das überschüssige Gel aus dem Gewebe, wenn die Änderung der Clearing-Lösung.
- Spülen des Gewebes in 10 ml 0,1 M PB mit 0,1% Triton X-100 bei 70 rUhr und 37 ° C über Nacht. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal und entfernen Sie das überschüssige Gel aus dem Gewebe, wenn die Änderung der Pufferlösung.
- Inkubieren der geklärten Gewebe in der primären Antikörperlösung in PB mit 0,1% Triton X-100 bei 70 rpm und 37 ° C für 2 Tage. Hinweis: Stellen Sie genug primären Antikörperlösung, die ganze Gewebe einzutauchen.
- Mit 0,1% Triton X-100 spült das Gewebe in 10 ml PB bei 70 rpm und 37 ° C über Nacht. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal und entfernen Sie das überschüssige Gel aus dem Gewebe, wenn die Änderung der Pufferlösung.
- Führen Sie die folgenden Schritte in einem dunklen Raum oder unter schwachem Licht. Decken Sie die Proben mit Folie auf ein Foto, Bleich verhindern.
- Inkubieren der geklärten Gewebe mit dem fluoreszierenden Zweitantikörper-Lösung in PB mit 0,1% Triton X-100 und der Blockierungsserum bei 70 rpm und 37 ° C für 1 Tag.
- Mit 0,1% Triton X-100 spült das Gewebe in 10 ml PB bei 70 rpm und 37 ° C über Nacht. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal und entfernen Sie das überschüssige Gel from das Gewebe beim Wechsel der Pufferlösung.
- Spülen Sie das Gewebe in 10 ml PBS bei 70 min und 37 ° C über Nacht. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal und entfernen Sie das überschüssige Gel aus dem Gewebe, wenn die Änderung der Pufferlösung.
- Inkubieren geklärt Gewebe in 80% Glycerin bei 70 min und 37 ° C über Nacht.
- Bewahren Sie die fluoreszierenden Buntgewebe bei 4 ° C vor der konfokalen Mikroskopie.
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Representative Results
Mehrere wichtige Entwicklungsschritte in der Leber-Gallen-System auftreten, während das Meerneunauge Metamorphose. Der Gallengang und die Gallenblase Apoptose und entarteten (Abbildung 1). Kombinieren des modifizierten Klärungsverfahren und Färbung mit Leberzellmarker Cytokeratin 19 (CK19, sowohl Cholangiozyten-und Hepatozyten vor und nach der Metamorphose 13 vorhanden) und anti-apoptotischen Bcl-2-Marker mittels konfokaler Mikroskopie wurde die gesamte Gallensystems entlang der Z-Achse (fangen Figur 2) und die 3-dimensionale Struktur rekonstruiert (Fig. 3). Konfokalen Laserrastermikroskopie wurde verwendet, um optische Schnitt durch den intakten Leber, da der größte Teil der Gallensystem wird in der Leber eingebettet Ausnahme der Kreuzung, an der der Gallengang in den Darm führen. Die degenerative Prozess tritt in metamorphen Stufen 2-4, ausgehend von peripheren kleinen Gallen Ductuli in Richtung der zentralen großen intrahepatic Choledochus (Fig. 2), was mit früheren Studien 10.
Abbildung 1. Gallenblase Degeneration während Meerneunauge Metamorphose. Meerneunauge verlieren die Gallenblase (schwarze Pfeile) während der Metamorphose. Die Proben wurden von Tieren mit externen Morphologie zwischen metamorphen Stufen 2 und 3; dh rund Auge ohne (Stufe 2) oder mit (Stufe 3) scharfe Differenzierung der Iris und Pupille, prominente Papille artige Vorsprünge an der inneren dorsalen Oberfläche der Mund Haube (beide Stufen), verdickte Lippen der mündlichen Haube (Stufe 2) bilden einen rechteckigen Eingang in die Mundhöhle (Stufe 3), oder "Mops-wie" Schnauze (Stufe 3) 3. Beachten Sie, dass die Gallenblase auch verändert Farbe zeigt Unterschiede in der Gallenproduktion.I: Darm. L:. Leber Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Konfokale Bilder, die die Gallenwege in Meerneunauge Leber während der Metamorphose. Die Proben wurden von Tieren mit externen Morphologie zwischen metamorphen Stufen 2 und 3 übernommen. Top Platten werden von der vorderen genommen und die unteren Platten aus dem hinteren Ende. Bilder von Leberzellmarker Cytokeratin 19 (1:100 Maus-anti-CK19, gefärbt mit 2 pg / ml Alexa Fluor 350 Ziege-Anti-Maus-IgG, blau) und anti-apoptotischen Bcl-2-Marker (1:100 Kaninchen-anti- Bcl-2, gefärbt mit 2 pg / ml Alexa Fluor 488-Esel-Anti-Kaninchen-IgG, grün) überlagert, um die zusammengeführten Bilder zu erzeugen. Weiße Pfeile zeigen die biliary Baum. Schwarze Pfeile zeigen die dunklen dendritischen suchen apoptotischen Zellen und umgebenden Kanälchen Duktuli und in der Leber. I: Darm. L: Leber. Maßstab:. 500 um Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
3. 3D-Bilder aus fusionierte konfokalen z-Reihe rekonstruiert. 3D-Bilder wurden von dem konfokalen z-Reihe von drei Lebern zwischen metamorphen Stufen 2 und 3 aufgebaut. Optische Abschnitte zusammengeführten Bilder von Leberzellmarker Cytokeratin 19 (1:100 Maus Anti-CK19, gefärbt mit 2 pg / ml Alexa Fluor 350 Ziege-Anti-Maus-IgG, blau) und anti-apoptotischen Bcl-2-Marker (1:100 Kaninchen-anti-Bcl-2, mit 2 pg / ml Alexa Fluor 488-Esel gebeizt -AntiKaninchen-IgG; grün) mit der Software des Herstellers, um die 3D-Bilder erzeugen rekonstruiert. Top Platten werden von der vorderen genommen und die unteren Platten aus dem hinteren Ende. Weiße Pfeile zeigen die Gallenwege. Schwarze Pfeile zeigen die dunklen dendritischen suchen apoptotischen Zellen und umgebenden Kanälchen Duktuli und in der Leber. I: Darm. L: Leber. Maßstab:. 500 um Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
.. Abbildung 4 A konfokalen optischen Schnitt, der Gallenwege mit Gallentropfen in das Lumen Zusammengeführt Bild 3 Fluoreszenzkanäle; blau: Maus-anti-c-Myc (1:100) / 2 pg / ml Alexa Fluor 350 Ziege-Anti-Maus-IgG; grün: 2 pg / ml Nissl grün; Rot: Kaninchen-anti-TGFβRII (1:100) / 2 pg / ml Alexa Fluor 594-Esel-anti-Kaninchen. Maßstabsbalken: 500 um. Gallentröpfchen durch schwarze Pfeile angedeutet. Die Leberprobe wurde zwischen metamorphen Stufe 2 und 3 vor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dieses Protokoll wird von einer neuen Methode namens "Klarheit" 12, die intakten Gewebes mit Polyacrylamid vernetzt, um ein nanoporöses Hydrogel zu bilden, und streift die Plasmamembran des Gewebes, um optische Transparenz und Durchlässigkeit zu erreichen makromolekularen dann modifiziert. "CLARITY" können intakte Gewebe Bildgebung von Langstrecken-Projektion und lokale Verdrahtung im Nervensystem. Diese neue Methode kann verwendet werden, um die gesamte Gallensystems in Meerneunauge Leber während der Metamorphose zu visualisieren. Es ist eine Herausforderung in der Biologie, um hochauflösende Informationen zu erhalten und pflegen die globale Perspektive aus einem komplexen System wie dem gesamten Gallenwege oder des zentralen Nervensystems mit herkömmlichen Methoden Einbetten und Schneiden. Dieses modifizierte Verfahren erlaubt CLARITY ein Laserstrahl durch die intakte Meerneunlarven Leber bis zu einer Dicke von 1 bis 2 mm unter Verwendung von Low-Power-Fluoreszenz Ziel (4x) in einem regelmäßigen Laserscan confoca eindringenl Mikroskop. Tieferes Eindringen kann über eine erweiterte Multi-Photonen konfokalen Mikroskop erreicht werden. Dreidimensionale Bilder können unter Verwendung von 3D-Rekonstruktion Software rekonstruiert werden. Vergleichbare Ergebnisse erzielt mit herkömmlichen Methoden wäre mühsam, Stück für Stück, die die Rekonstruktion der viele Bereiche, und würde zu kleinen Gewebemengen begrenzt werden. Dieses neue Verfahren liefert wertvolle Informationen aus ganzen Strukturanalysen von intakten Systeme 12, weniger arbeitsintensiv, effizienter und reproduzierbarer.
Ein weiterer Vorteil des neuen Verfahrens ist, daß die Probe mehrmals für Anfärben mit 12 verschiedenen Antikörpern verwendet werden. Dies macht den Vergleich zwischen verschiedenen molekularen Markern im selben Proben zuverlässiger und reproduzierbarer. Der stabile Rahmen von Hydrogel erzeugt ermöglicht eine effektive Entfernung von Antikörpern ohne Feinstruktur Schaden und hält die Antigenität für eine long Zeit 12. Die Clearing-Lösung denaturiert Antikörper und stört die Bindung, daher wirkt wie ein Antikörper-Stripping-Lösung 12. Mehrere Runden der Färbung sind in den Meerneunauge Leberproben durchgeführt wurden und die Struktur und Färbung blieb optimal.
Es gibt zwei wichtige Änderungen in diesem Protokoll aus dem ursprünglichen "CLARITY" Protokoll 12. (1) freie Radikale erzeugenden Reagenzien (Ammoniumpersulfat und TEMED) wurden verwendet, um zu initiieren und beschleunigen die Polymerisation des Hydrogels statt VA044. VA044 lichtempfindlich ist und nicht in den USA (2) Keine custom-built Elektrophoresekammer verwendet. In der Klarheit Verfahren 12, aufgrund der Größe der Gewebe (Gehirn der Maus gegen Leberneunauge) wird elektrophoretischen Gewebe Clearing benötigt, um die Extraktion der Plasmamembran zu beschleunigen. Um die Anschaffungskosten für eine maßgeschneiderte Elektrophorese Kammer zu vermeiden, zuerst haben wir existechen Agarose-Gelelektrophorese Geräte in unserem Labor. Dies erwies sich als sehr ineffizient. Jedoch ist die Inkubation in der Lichtung Lösung mit erhöhter Temperatur (50 ° C) sehr wirksam bei der Klärung der Plasmamembran.
Obwohl die Autoren für "CLARITY", warnte vor der Verwendung von Saponin in dem Hydrogel, die Transparenz in der Meerneunauge Gewebe in unserem Verfahren verbessert es. Ein Nachteil für die konfokale Bildgebung ist, dass Meerneunauge Gewebe hat eine starke Autofluoreszenz. Die Auswahl der Fluorophore durch einen Vergleich der Bilder vor und nach Immunfluoreszenzfärbung getestet werden.
Während Meerneunauge Metamorphose, die Regression der Gallenblase Epithel beginnt zwischen metamorphen Stufen 2 und 3. Durch metamorphen Stufe 4, verschwindet die Gallenblase vollständig aus Meerneunauge Leber 14. Gallengang-Degeneration ist am dramatic zwischen metamorphen Stufen 3 und 4 15. Dieses modifizierte Verfahren ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die zellulären und molekularen Mechanismen der Degeneration des gesamten Gallensystems, die Erkenntnisse für die menschliche Gallengangsatresie bieten kann studieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren danken den Beitrag der Hammond Bay Biologische Station, Great Lakes Science Center, US Geological Survey. Wir danken auch Dr. Melinda Rahmen des Center for Advanced Microscopy an der Michigan State University für ihre technische Unterstützung bei der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie. Diese Studie wird durch Zuschüsse aus dem Great Lakes Kommission für die Fischerei zu YWCD und WML unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
| boric acid | Sigma | B7901-1KG | |
| saponin | Sigma | 47036 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma | L337-500G | |
| sodium phosphate (monobasic) | Sigma | 04269-1KG | |
| sodium phosphate (dibasic) | Sigma | S5136-1KG | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| glycerol | Sigma | G9012-500ML | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| NaOH pellets | EMD | SX0590-3 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Any brand | ||
| dissecting tools | Any brand |
References
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