Summary
Lampreda di mare perde la cistifellea e vie biliari durante la metamorfosi, un processo simile a atresia biliare umano. Un nuovo metodo di fissazione e chiarificazione (CLARITY) è stato modificato per visualizzare l'intero albero biliare mediante scansione laser microscopia confocale. Questo metodo fornisce un potente strumento per studiare la degenerazione biliare.
Abstract
Atresia biliare è una rara malattia dell'infanzia, con una stima di 1 a 15.000 frequenza nel sud-est degli Stati Uniti, ma più comune nei paesi dell'Asia orientale, con una frequenza riportata di 1 su 5.000 in Taiwan. Anche se si sa molto circa la gestione di atresia biliare, la sua patogenesi è ancora sfuggente. La lampreda di mare (Petromyzon marinus) offre un'opportunità unica per esaminare il meccanismo e la progressione della degenerazione biliare. Lampreda di mare sviluppare attraverso tre fasi della vita distinte: larve, parassiti, e adulti. Durante la transizione da larve di parassiti giovanile, lampreda di mare subiscono metamorfosi con la riorganizzazione drammatica e rimodellamento in morfologia esterna e gli organi interni. Nel fegato, l'intero sistema biliare è perso, compresa la cistifellea e l'albero biliare. Un metodo di nuova concezione denominato "CHIAREZZA" è stata modificata per chiarire l'intero fegato e il bivio con l'intestino in metamorfico lampreda di mare. Ilprocesso di degenerazione biliare è stato visualizzato e discernimento durante la lampreda di mare metamorfosi mediante scansione laser microscopia confocale. Questo metodo fornisce un potente strumento per studiare atresia biliare in un modello animale unico.
Introduction
Lampreda di mare si sviluppano attraverso tre distinte fasi di vita di 1,2. Larvale lampreda di mare (L) trascorrono più tempo in tane come filtratori bentonici. Dopo aver attraversato sette stadi metamorfici di drammatici cambiamenti nella morfologia e riorganizzazione in organi interni 3 esterni, il novellame risultanti (JV) entrano in una fase parassitaria nel corso della quale si nutrono di sangue e fluidi tissutali di pesce ospitante, l'aumento della massa corporea più di 100 volte . Dopo la 1.0 to 1,5 anni di alimentazione sul pesce ospite in mare o grandi laghi, adulti cessano alimentazione durante la primavera e migrano nei fiumi per deporre le uova e poi muoiono 1,2.
Durante la metamorfosi, il fegato lampreda di mare perde la cistifellea e l'intero albero biliare, un fenotipo mutante evolutivo che imita la malattia neonato umano atresia delle vie biliari. Infant atresia biliare è una rara malattia del fegato pediatrico a gravi complicazioni mediche 4,5,6,7, 8,9,10, ma la patogenesi ed eziologia di atresia biliare sono in gran parte sconosciuti 4. I pazienti con atresia biliare muoiono entro due anni dopo la nascita se non viene eseguito l'intervento chirurgico (procedura Kasai) 5. Successivamente, questi pazienti richiedono una gestione clinica e spesso trapianto di fegato 6. Molte teorie di atresia biliare eziopatogenesi sono stati proposti, come l'infezione virale, malformazione congenita, malattia autoimmune, e insulto tossico. Tuttavia, il contributo di ciascuno allo sviluppo di atresia biliare rimane inconcludente 7,8,9,10.
A differenza dei bambini che soffrono patologico atresia delle vie biliari, lampreda di mare che formano oggetto evolutivamente programmato atresia delle vie biliari senza una necroinfiammazione, fibrosi o cirrosi 10. Gli animali possono soffrire colestasi transitorio durante questo processo 10, ma adattarsi a questa condizione dello sviluppovia de novo sintesi e secrezione di sali biliari nell'intestino dopo sviluppo atresia biliare, oltre ai meccanismi noti come la riduzione della sintesi di sali biliari nel fegato 11. Questo processo di sviluppo in lampreda di mare offre l'opportunità unica nota di esaminare la progressione di atresia biliare.
Un metodo di nuova concezione denominato "CHIAREZZA" permette di imaging ad alta risoluzione in complessi sistemi nervosi dei mammiferi trasformando tessuto intatto in un idrogel nanoporosa otticamente trasparente 12. Utilizzando mare fegato lampreda e un protocollo CLARITY modificato, imaging intatto tessuto della degenerazione biliare può essere documentata in tutta metamorfosi fegato.
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Protocol
1. Preparazione Solution
- Rendere 1 L 10x 0.1 M salina tampone fosfato (PBS, pH 7,4): Pesare 26,2 g di fosfato di sodio (monobasico), 115 g di fosfato di sodio (bibasico), e 87,66 g NaCl. Sciogliere in circa 800 ml di acqua distillata H 2 O, regolare il pH, e portare al volume di 1 litro con acqua distillata H 2 O.
- Rendere 1 L 0.1 M tampone fosfato salino (pH 7.4): Prendete 100 ml 10x PBS e aggiungere 900 ml di acqua distillata H 2 O.
- Rendere 1 L 0.1 M tampone fosfato salino (pH 7.4) con 0.1% Triton X-100: Prendete 100 ml 10x PBS, aggiungere 1 ml di Triton X-100, e portare al volume di 1 litro con acqua distillata H 2 O.
- Rendere 1 L 10x 0.1M tampone fosfato (PB, pH 7,4): Pesare 26,2 g di fosfato di sodio (monobasico) e 115 g di fosfato di sodio (bibasico). Sciogliere in circa 800 ml di acqua distillata H 2 O, regolare il pH, e portare al volume di 1 litro con acqua distillata H 2 O.
- Rendere 1 L 0.1 M tampone fosfato (pH 7.4): Prendete 100 ml 10x PB,e aggiungere 900 ml di acqua distillata H 2 O.
- Rendere 1 L 0.1 M tampone fosfato (pH 7.4) con 0.1% Triton X-100: Prendete 100 ml 10x PB, aggiungere 1 ml di Triton X-100, e portare al volume di 1 litro con acqua distillata H 2 O.
- Preparare la soluzione di 400 ml di idrogel monomero (4% acrilammide, 0,25% bis-acrilammide, 4% paraformaldeide, 0,0075% persolfato di ammonio, 0,0005% saponina in 0.1 M PBS): Pesare 0,3 g di persolfato di ammonio e 0,2 g saponina. Aggiungere 210 ml di H 2 O distillata, 40 ml 40% di acrilammide, 10 ml 2% bis-acrilammide, 40 ml 10x PBS (pH 7.4), 100 ml 16% paraformaldeide, e mescolare bene.
- Preparare la soluzione di compensazione 4 L (4% SDS in acido borico 0.2 M): Pesare 49,464 g di acido borico e 160 g SDS. Sciogliere in circa 3,5 L H 2 O distillata, aggiustare il pH a 8.5 con NaOH, e portare il volume fino a 4 L.
- Rendere 1 L soluzione di glicerolo 80%: Misurare 800 ml di glicerolo, aggiungere 200 ml di acqua distillata H 2 O, e mescolare bene.
2. Preparazione Tissue
- Preparare la soluzione di monomero idrogel e un'aliquota di 10 ml per ogni provetta da centrifuga 15 ml.
- Sezionare tutto il tessuto e fissare l'idrogel per 2 giorni a 4 ° C. Assicurarsi che la soluzione idrogel è almeno 10 volte il volume del tessuto.
- Portare il tessuto fissato idrogel (nella provetta da centrifuga 15 ml) ad una cappa aspirante.
- Polimerizzare il tessuto fissato idrogel con l'aggiunta di 5 ml TEMED, mescolare bene e lasciar riposare nella cappa a temperatura ambiente per 2-3 ore.
- Rimuovere accuratamente il gel in eccesso. Nota: gel Extra ostacolerà il processo di compensazione e la penetrazione degli anticorpi durante la colorazione.
- Incubare il tessuto fissato in 10 ml di soluzione di compensazione in un agitatore incubatore a 70 rpm e 50 ° C per diversi giorni finché il tessuto diventa trasparente. Cambiare soluzione compensazione almeno una volta al giorno e rimuovere il gel in eccesso dal tessuto quando si cambia la soluzione di compensazione.
- Risciacquare il tessuto in 10 ml di 0,1 M PB con 0.1% Triton X-100 a 70 rpm e 37 ° C durante la notte. Ripetere questo passaggio 3 volte e rimuovere il gel in eccesso dal tessuto quando si cambia la soluzione tampone.
- Incubare il tessuto chiarito nella soluzione di anticorpo primario in PB con 0.1% Triton X-100 a 70 rpm e 37 ° C per 2 giorni. Nota: soluzione di anticorpo primario sufficiente a sommergere tutto il tessuto.
- Risciacquare il tessuto in 10 ml PB con 0.1% Triton X-100 a 70 rpm e 37 ° C durante la notte. Ripetere questo passaggio 3 volte e rimuovere il gel in eccesso dal tessuto quando si cambia la soluzione tampone.
- Effettuare le seguenti operazioni in una stanza buia o sotto la luce fioca. Coprire i campioni con un foglio per evitare foto sbiancamento.
- Incubare il tessuto chiarito con la soluzione di anticorpo secondario fluorescente in PB con 0.1% Triton X-100 e il siero di blocco a 70 rpm e 37 ° C per 1 giorni.
- Risciacquare il tessuto in 10 ml PB con 0.1% Triton X-100 a 70 rpm e 37 ° C durante la notte. Ripetere questa operazione 3 volte e rimuovere il gel in eccesso fROM il tessuto quando si cambia la soluzione tampone.
- Risciacquare il tessuto in 10 ml di PBS a 70 rpm e 37 ° C durante la notte. Ripetere questo passaggio 3 volte e rimuovere il gel in eccesso dal tessuto quando si cambia la soluzione tampone.
- Incubare il tessuto chiarito in 80% glicerolo a 70 rpm e 37 ° C durante la notte.
- Conservare il tessuto tinto fluorescente a 4 ° C prima di microscopia confocale.
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Representative Results
Diversi importanti eventi evolutivi si verificano nel sistema epatobiliare durante la lampreda di mare metamorfosi. Il dotto biliare e la cistifellea apoptosi e degenerata (Figura 1). Combinando il metodo chiarimento modificato e colorazione con fegato marker delle cellule citocheratina 19 (CK19, presente in entrambi i colangiociti ed epatociti prima e dopo la metamorfosi 13) e anti-apoptotica Bcl2 marcatore utilizzando la microscopia confocale, l'intero sistema biliare è stato catturato lungo l'asse Z ( Figura 2) e la struttura 3-dimensionale è stato ricostruito (Figura 3). Scansione laser confocale è stato usato per eseguire sezione ottica attraverso il fegato intatto poiché la maggior parte del sistema biliare è incorporata nel fegato tranne giunzione in cui il dotto biliare entra nell'intestino. Il processo degenerativo avviene in fasi metamorfiche 2-4, partendo da piccoli ductules biliari periferici verso il grande intrahep centraleATIC dotto biliare comune (Figura 2), in linea con studi precedenti 10.
Figura 1. Vescica degenerazione Gallo durante la lampreda di mare metamorfosi. Lampreda di mare perde la cistifellea (frecce nere) durante la metamorfosi. I campioni sono stati prelevati da animali con morfologia esterna tra gli stadi metamorfici 2 e 3, cioè occhio tondo senza (stadio 2) o (fase 3) sharp differenziazione di iride e la pupilla, proiezioni papilla simile prominenti sulla superficie dorsale interna del orale Cappa (entrambe le fasi), labbra di cappa orale (fase 2) che formano un ingresso rettangolare nella cavità orale (fase 3), o il muso "pug-like" (fase 3) 3 addensato. Si noti che la cistifellea anche cambiato colore che indica le differenze di produzione di bile.I: intestino. L:. Fegato cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Immagini confocale che mostrano l'albero biliare in lampreda di mare epatica durante la metamorfosi. I campioni sono stati prelevati da animali con morfologia esterna tra gli stadi metamorfici 2 e 3. Torna pannelli sono prese dalla anteriori, ed i pannelli inferiori dalla fine posteriore. Immagini di fegato marker delle cellule citocheratina 19 (1:100 mouse anti-CK19, marcate con 2 mg / ml Alexa Fluor 350-capra-topo anti-IgG, blu) e indicatore anti-apoptotica Bcl2 (1:100 coniglio anti- Bcl2, macchiato con 2 mg IgG / ml Alexa Fluor 488-asino-anti-coniglio; verde) si sovrappongono per generare le immagini unite. Frecce bianche indicano la balbero Auxiliary. Frecce nere indicano il dendritiche scura, guardando cellule apoptotiche e canalicoli e ductules nel fegato circostante. I: intestino. L: fegato. Barra della scala:. 500 micron cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Immagini 3D ricostruiti da unito confocale z-series. Immagini 3D sono stati ricostruiti dalla confocale z-serie di tre fegati tra fasi metamorfiche 2 e 3. Sezioni ottiche di immagini unite il fegato marker delle cellule citocheratina 19 (1:100 mouse- anti-CK19, macchiata di 2 mg / ml Alexa Fluor 350-capra-topo anti-IgG, blu) e indicatore anti-apoptotica Bcl2 (1:100 coniglio anti-Bcl2, macchiata di 2 mg / ml Alexa Fluor 488-asino -anti-IgG di coniglio; verde) sono ricostruiti con il software del produttore per generare le immagini 3D. Pannelli superiori sono prese dalla anteriori, ed i pannelli inferiori dalla fine posteriore. Frecce bianche indicano l'albero biliare. Frecce nere indicano il dendritiche scura, guardando cellule apoptotiche e canalicoli e ductules nel fegato circostante. I: intestino. L: fegato. Barra della scala:. 500 micron cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
.. Figura 4 Una sezione ottica confocale mostra dotti biliari con le goccioline biliari nel lume immagine unita da 3 canali fluorescenti; blu: mouse anti-c-Myc (1:100) / 2 mg / ml Alexa Fluor 350-capra-topo anti-IgG; verde: 2 mg / ml verde Nissl; Rosso: Rabbit-anti-TGFβRII (1:100) / 2 mg / ml Alexa Fluor 594-asino-anti-coniglio. Scala bar: 500 micron. Goccioline biliari sono indicati da frecce nere. Il campione di fegato è stata scattata tra lo stadio metamorfico 2 e 3. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo è modificato da un nuovo metodo chiamato "chiarezza" 12, che reticola tessuto intatto con poliacrilammide per formare un idrogel nanoporoso, e poi strappa via la membrana plasmatica del tessuto per ottenere la trasparenza ottica e permeabilità macromolecolare. "CHIAREZZA" permette l'imaging intatto tessuto di lungo raggio di proiezione e il cablaggio del circuito locale nel sistema nervoso. Questo nuovo metodo può essere usato per visualizzare l'intero sistema biliare in lamprey mare fegato durante la metamorfosi. È una sfida in biologia avere informazioni ad alta risoluzione e mantenere la prospettiva globale di un sistema complesso come l'intero sistema biliare o del sistema nervoso centrale con incorporamento convenzionale e sezionamento metodi. Questo metodo CLARITY modificata permette un raggio laser di penetrare attraverso la intatta lampreda mare fegato larvale fino ad uno spessore di 1 a 2 mm mediante obiettivo fluorescente a bassa potenza (4x) in un normale confoca scansione laserl microscopio. Penetrazione più profonda può essere raggiunto utilizzando un più avanzato multi-fotone microscopio confocale. Immagini tridimensionali possono essere ricostruiti utilizzando il software di ricostruzione 3D. Giungere a risultati comparabili con metodi convenzionali sarebbe laborioso, coinvolgendo la ricostruzione frammentaria di molte sezioni, e sarebbe limitata a piccoli volumi di tessuto. Questo nuovo metodo fornisce preziose informazioni da intere analisi strutturali dei sistemi intatti 12, è meno, più efficiente e riproducibile ad alta intensità di manodopera.
Un altro vantaggio di questo nuovo metodo è che i campioni possono essere riutilizzati più volte per la colorazione con differenti anticorpi 12. Questo rende il confronto tra i diversi marcatori molecolari nello stesso campione più affidabile e riproducibile. Il quadro stabile generato da idrogel permette la rimozione efficace di anticorpi senza fini danni alla struttura e mantiene l'antigenicità per un lotempo ng 12. La soluzione di compensazione denatura anticorpi e sconvolge vincolanti, quindi agisce come una soluzione di anticorpo-strippaggio 12. Diversi giri di colorazione sono stati eseguiti nei campioni di fegato lampreda di mare e la struttura e la colorazione è rimasta ottimale.
Ci sono due importanti modifiche in questo protocollo dal protocollo originale "CHIAREZZA" 12. (1) reagenti di radicali liberi (persolfato di ammonio e TEMED) sono stati usati per avviare e accelerare la polimerizzazione del idrogel anziché VA044. VA044 è fotosensibile e non è disponibile negli Stati Uniti (2) Nessuna camera di elettroforesi su misura viene utilizzato. Nel metodo CLARITY 12, a causa delle dimensioni dei tessuti (cervello di topo contro lampreda fegato), compensazione tessuto elettroforetica è necessario per accelerare l'estrazione della membrana plasmatica. Per evitare il costo iniziale di una camera di elettroforesi su misura, in primo luogo abbiamo usato existing dispositivi gel elettroforesi nel nostro laboratorio. Questo si è rivelato essere molto inefficiente. Tuttavia, incubazione nella soluzione di compensazione con temperatura aumentata (50 ° C) è molto efficace nell'eliminare la membrana plasmatica.
Anche se per "CHIAREZZA" gli autori in guardia contro l'uso della saponina in idrogel, migliora la trasparenza nel tessuto lampreda di mare nella nostra procedura. Uno svantaggio per l'imaging confocale è che il tessuto lampreda di mare ha una forte auto-fluorescenza. La scelta di fluorofori deve essere verificata confrontando le immagini prima e dopo immunofluorescenza.
Durante la lampreda di mare metamorfosi, la regressione dell'epitelio cistifellea inizia tra gli stadi metamorfici 2 e 3. By stadio metamorfico 4, la cistifellea scompare del tutto dal lampreda di mare, fegato 14. La degenerazione del dotto biliare è più dramatic tra gli stadi metamorfici 3 e 4 15. Questo metodo modificato è un potente strumento per studiare i meccanismi cellulari e molecolari della degenerazione dell'intero sistema biliare, che può fornire spunti per atresia biliare umana.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono il contributo della stazione Hammond Bay biologica, Great Lakes Science Center, US Geological Survey. Ringraziamo anche il Dott. Melinda frame presso il Centro di Microscopia Avanzata presso la Michigan State University per il suo supporto tecnico nella scansione laser microscopia confocale. Questo studio è sostenuto da finanziamenti della Commissione Grandi Laghi per la pesca a YWCD e WML.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
| boric acid | Sigma | B7901-1KG | |
| saponin | Sigma | 47036 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma | L337-500G | |
| sodium phosphate (monobasic) | Sigma | 04269-1KG | |
| sodium phosphate (dibasic) | Sigma | S5136-1KG | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| glycerol | Sigma | G9012-500ML | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| NaOH pellets | EMD | SX0590-3 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Any brand | ||
| dissecting tools | Any brand |
References
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