Summary
يمكن قياس الاسموزي معامل نفاذية المياه (P و) من خلايا تساعد على فهم الآليات التنظيمية من aquaporins (AQPs). P و في تقرير كروية protoplasts الخلية النباتية المعروضة هنا ينطوي protoplasts العزلة والتحليل العددي من معدل الأولي للحجم التغيير نتيجة تحديا الاسموزي أثناء مستمر نضح حمام.
Abstract
دراسة آليات التنظيم AQP أمر حاسم لفهم العلاقات المائية في كل من الخلوية والمستويات مصنع كامل. المقدمة هنا هو طريقة بسيطة وفعالة جدا لتحديد ناضح معامل نفاذية المياه (P و) في protoplasts النبات، المعمول بها في المبدأ أيضا على خلايا كروية أخرى مثل الضفدع البويضات. الخطوة الأولى للمقايسة هي عزل protoplasts من الأنسجة النباتية من الاهتمام من قبل الهضم الأنزيمي في غرفة مع محلول متساوي التوتر المناسب. تتكون الخطوة الثانية من التحدي فحص الاسموزي: وتقدم protoplasts ثبتوا على الجزء السفلي من الغرفة إلى نضح انطلاق مستمر مع حل متساوي التوتر ويليه حل منخفض التوتر. تورم الخلية الفيديو المسجلة. في الخطوة الثالثة، تتم معالجة الصور حاليا أن تسفر التغييرات في الحجم، ويرتبط على مدار الساعة من التغييرات في الحجم مع مسار الوقت للتغيير في osmolaاألمن للغرفة نضح المتوسطة، وذلك باستخدام منحنى الإجراء المناسب مكتوبة في Matlab (في 'PfFit ")، لانتاج P و.
Introduction
امتصاص المياه وتدفقها عبر الأغشية الخلوية هو الشرط الأساسي لوجود محطة في كل من الخلوية والمستويات مصنع كامل. على المستوى الخلوي، aquaporins (AQPs) تلعب دورا رئيسيا في تنظيم الاسموزي معامل نفاذية المياه (P و) من غشاء الخلية 1-3.
حتى الآن، وقد استخدمت عدة طرق في قياس P و الذاتية البروتوبلازم من الأعضاء النباتية المختلفة (أي الجذور، وورقة، البشرة الداخلية وغيرها، التي استعرضتها تشاومونت وآخرون. 4). إحدى الطرق لقياس P و هو لفضح protoplasts إلى التحدي ناضح ورصد معدل الأولي للتغيير حجمه (أي.، المنحدر من المرحلة الخطية الأولى للتغيير الحجم). وصفت طريقتين مختلفتين في السابق على أساس هذا النهج، سواء على أساس تبادل لحظية من الحلول. يتكون أول واحد من immobilizجي في البروتوبلازم مع micropipette شفط والتبديل تدفق الحل 5 والثاني واحد من نقل البروتوبلازم من حل واحد إلى آخر باستخدام micropipette 6. هذه شفط micropipette وmicropipette طرق نقل، والتي تتيح الحصول على الصور في بداية جدا من تبادل حل سريع (لالتقاط المرحلة الخطية الأولى من تغيير الحجم)، من المرجح أن تنطوي على الاجهاد البدني لprotoplasts وتتطلب معدات متخصصة وخبراء المجهرية.
الطريقة الموصوفة هنا يقلل من اضطراب في الخلايا، لا ينطوي على أي المجهرية ويسمح اشتقاق P و عندما نضح حمام ليست لحظية.
بعد الهضم الأنزيمي، وprotoplasts، مغمورة في محلول متساوي التوتر، وثبتوا على الجزء السفلي من الزجاج ساترة من زجاج شبكي (الملقب سيت أو المقوى) غرفة من تهمة التفاعل. ثم، خلال نضح حمام مستمر،يتم مسح حل متساوي التوتر بعيدا عن حل منخفض التوتر توليد تحديا hypoosmotic إلى protoplasts. تورم في البروتوبلازم هو الفيديو المسجل وبعد ذلك، من خلال الجمع بين المعلومات حول مدار الساعة من نضح حمام وبالطبع الوقت من تورم الخلية، ويتم تحديد بواسطة P و معالجة الصور والإجراءات المناسب منحنى.
مزايا هذه الطريقة هي أن التجربة هي فعالة جدا، أي أنه من الممكن لمراقبة بضع خلايا في وقت واحد في فحص واحد، وأنه لا يحتاج إلى معدات خاصة أو مهارات معينة المجهرية. العديد من التطبيقات لهذه الطريقة ممكنة. على سبيل المثال، تحديد P و الأم من مجموعة متنوعة من الخلايا من الأنسجة والنباتات المختلفة، مثل ورقة وخلايا غمد حزمة من أوراق نبات الأرابيدوبسيس 7 والذرة ورقة ورقة أو خلايا قشرة الجذر 8-10 أو تعليق الخلايا المستزرعة 11،12. كما تعهدعلى ذلك، فمن الممكن لتحديد P و من الخلايا الحيوانية كروية مثل خلايا البويضة 11. مثال آخر ينطوي فحص النشاط AQP بواسطة التعبير عابرة من الجينات الخاصة بهم في protoplasts (أو أي جينات أخرى والتي قد تؤثر عليهم، مثل تحركات جينات) وتحديد مساهمتها في P و. على سبيل المثال، التعبير عن الطماطم AQP SlTIP2، 2 في protoplasts ورقة نبات الأرابيدوبسيس بواسطة PEG التحول وعزم SlTIP2؛ P 2 ذات الصلة و 13. أخيرا، فحص تأثير على P و من جزيئات مختلفة / المواد (الأدوية والهرمونات وغيرها) إضافة إلى حلول يمكن أيضا أن تدرس، على سبيل المثال من مانع AQP HgCl 2 7.
يصف البروتوكول بعد عزل protoplasts خلايا نبات الأرابيدوبسيس ورقة وعزم على P و.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد حلول
- إعداد متساوي التوتر (600 الميلي أسمول) وناقص التوتر (500 الميلي أسمول) الحلول التي تحتوي على 10 ملي بوكل، 1 مم CaCl 2، و 8 M 2- (N-المورفالين) حمض -ethanesulphonic (MES)، ودرجة الحموضة 5.7 وضبط الأسمولية مع كميات مناسبة من D-السوربيتول: 540 مم للمتساوي التوتر و 440 ملي من أجل حل منخفض التوتر. التحقق من الأسمولية من الحل (خلال 3٪ من القيمة المستهدفة) باستخدام مقياس التناضح.
- إعداد الأسهم الجاف "مزيج الأنزيمية" التي تحتوي على الانزيمات التالية: 0.55 ز سلولاز، 0.1 غرام pectolyase، 0.33 غرام بوفيدون K 30، 0.33 ز BSA (انظر الجدول 1 أدناه)، خلط مسحوق جاف من دوامة، وجعل مأخوذة 5.7 ملغ و تخزين في -20 درجة مئوية.
2. عزل ورقة نبات الأرابيدوبسيس Protoplasts
- إعداد طبق بتري (10 سم) مع حوالي 6 قطرات (حوالي 30 ميكرولتر لكل منهما) من محلول متساوي التوتر.
- قشر مجافي المحور البشرة (أقل) ورقة نبات الأرابيدوبسيس، جحزب التحرير ورقة مقشر إلى مربعات حوالي 4 × 4 مم 2، ثم وضع المربعات على محلول متساوي التوتر يسقط مع الجانب مجافي المحور تتعرض باستمرار، لمس الحل.
- حل 5.7 ملغ من مزيج الانزيم في 165 ميكرولتر حل متساوي التوتر (3.3٪ ث / ث) في أنبوب 1.5 مل، مزيج بلطف pipetting لمدة دقيقة أو نحو ذلك حتى يذوب، ووضع عدة قطرات مماثلة من الحل الأنزيمية في نفس بيتري الطبق.
- نقل القطع على ورقة الحل الأنزيمية قطرات، أغلق طبق ختم الغطاء مع جولة واحدة من parafilm واحتضان لمدة 20 دقيقة، وتطفو الطبق في حمام مائي تعيين إلى 28 درجة مئوية.
- إضافة عدة قطرات أكثر من الحل متساوي التوتر إلى الطبق (2 قطرات في كل قطرة محلول أنزيم). نقل كل قطعة ورقة إلى انخفاض حل متساوي التوتر الجديد، ثم، بالتتابع، إلى انخفاض الثاني (لغسل الحل بعيدا الأنزيمي). رفع قطعة من حافته باستخدام ملقط، والتخلص منه في الهبوط الثاني (مثل كيس الشاي) للافراج عن protoplasts.جمع قطرات مع protoplasts (باستخدام قص من 100 ميكرولتر ماصة تلميح) في أنبوب 1.5 مل.
3. ناقص التوتر التحدي الفحص: ورقة نبات الأرابيدوبسيس تورم الخلية
- إعداد نظام نضح (الشكل 1A) عن طريق ملء عمود واحد مع حل متساوي التوتر وعمود آخر مع محلول ناقص التوتر. فتح صمام، السماح لبعض تدفق الحل (أولا منخفض التوتر، ثم متساوي التوتر) لملء الأنابيب على طول الطريق وصولا الى مدخل متعددة (الشكل 1B). ضمان عدم وجود فقاعات الهواء المحتبسة، ثم يغلق الصمام.
- ختم ساترة، وذلك باستخدام سيليكون الشحوم (الجدول 1)، لجعل القاع للغرفة داخل الشريحة شبكي (الشكل 1B، وانظر أيضا الخطط للغرفة في الشكل 1C). لجعل أسفل الغرفة (والتصاعدي التي تواجه السطح المعرض من ساترة داخل حلقة الشحوم) "لزجة" لprotoplasts، ومعطف عليهمع الإيجابي المسؤول الحاملة بروتامين سلفات (1٪ في الماء؛ الجدول 1) أو بولي-L-يسين (0.1٪ في الماء؛ الجدول 1). نشر هذا 'الغراء' على ساترة باستخدام طرف ماصة، انتظر 1 - 2 دقيقة، شطف 3-4 مرات مع محلول متساوي التوتر ويهز بعيدا الحل المتبقية.
- ملء تصل الغرفة مع محلول متساوي التوتر. ثم، تضاف قطرة من protoplasts تحتوي على حل للغرفة، وذلك باستخدام قص قبالة الطرف ماصة والانتظار 3-4 دقائق لprotoplasts ليستقر. تغطية غرفة مع غطاء شفاف (أرقام 1D، 1E) لمس السطح الحل (تجنب احتباس فقاعات الهواء تحت).
- ضع الشريحة (بلطف!) على طاولة مجهر مقلوب، لأنه ربط نظام نضح ومضخة (حراسة ضد فقاعات الهواء في أنابيب!) وبدوره على تدفق محلول متساوي التوتر لنضح المستمر في 1 مل / دقيقة (معدلات أسرع يمكن استخدامها، تصل إلى 4 مل / دقيقة).
- للتسجيلالتغييرات في الحجم، يتم استخدام مجهر مقلوب، مع الهدف 20X ومع كاميرا CCD الفيديو وصله بجهاز الكمبيوتر PC. استخدام 'جامعة كارنيجي ميلون 1394 كاميرا سائق' البرنامج المساعد لبرنامج ImageJ (انظر الجدول مواد محددة لعناوين حمل هذه القطع البرمجيات اثنين) لتسجيل فيلم فيديو 60 ثانية من protoplasts متحركة مختارة (يفترض، تلك عالقا إلى أسفل) بمعدل 1 صورة / ثانية (1 هرتز). بدء تسجيل مع غسل 15 ثانية من الحل متساوي التوتر (هذا يشكل خط الأساس)، والتحول إلى الحل ناقص التوتر لمدة 45 ثانية (لإكمال مجموع 60 ثانية من بداية نضح). حفظ الفيلم في صيغة TIF. ملاحظة: اختيار حقل الرأي مع العديد من الخلايا ممكن، الوفاء بالمعايير التالية: كروية في الشكل ومع كفاف خلية ركز جيدا في هم أكبر محيط (الشكل 2A).
4. تحليل تغيير حجم الخلية باستخدام يماغيج
ملاحظة: لتحليلسلسلة من الصور من خلية الورم، استخدم 'صورة إكسبلورر' والإضافات 'البروتوبلازم محلل "في برنامج ImageJ (كتبه خافيير Draye) 14. بدءا من protoplasts المختار في أول نقطة وقتهم، أن 'البروتوبلازم محلل' البرنامج المساعد تلقائيا كشف حواف protoplasts (ملامح) وحساب مدار الساعة من مناطقهم خلال التجربة (هي الإضافات المتاحة مع برنامج تحليل PfFit أدناه) .
- بدء يماغيج. لفتح الفيلم، انقر فوق "ملف" على لوحة يماغيج، ثم على التوالى على القوائم المنسدلة لأنها تتكشف: 'استيراد' ثم 'مستكشف صورة ". تسليط الضوء على فيلم المختار، ثم انقر بزر الماوس الأيمن على ذلك، ثم اليسار انقر على 'محلل البروتوبلازم. تصفح من خلال فيلم (باستخدام شريط التمرير في البروتوبلازم الصورة أسفل) لتحديد protoplasts التي لا تزال إلى حد كبير غير متحرك أثناء التجربة - سيتم تحليل هذه. مرة أخرى على أول معهد العالم العربيجنرال الكتريك، وذلك باستخدام الماوس، رسم الدوائر (اختار من أدوات الرسم يماغيج) حول protoplasts مختارة (الشكل 2B)، ثم انقر فوق "موافق" في جدول "المعلمات الكشف" التي ظهرت.
- لإطلاق خوارزمية الكشف البروتوبلازم، انقر فوق "المحلية" على الصورة البروتوبلازم أعلى لوحة، ثم "عملية" في القائمة المنسدلة. دراسة دوائر خضراء حول protoplasts مختارة (الشكل 2C) طوال الفيلم. حفظ "النتيجة" في ملف Excel. استقال يماغيج. ملاحظة: في حالة ظهور نقطة حمراء (للإشارة إلى كفاف نوبة سيئة - عادة بسبب ضعف تباين الصورة)، إعادة تشغيل مع معلمات مختلفة.
- لفصل خطوط تنتمي إلى كل خلية (التي - إذا تم تحليل اثنين أو أكثر من الخلايا في وقت واحد - سيتم متشابكة، ليتم تحليل الإطار من جانب الإطار)، في Excel، فرز البيانات المحفوظة حسب العمود عدد الخلايا ('الكائن' ).
- لDETErmine عامل التحويل بكسل إلى ميكرومتر للحصول على القيمة الحقيقية للP و، والمفاجئة صورة لحاكم ميكرومتر عبر نفس الهدف 20X المجهر. اسحب خط (اختار من أدوات الرسم يماغيج) على طول صورة الحاكم وقراءة ما يعادل عدد بكسل لطول المسطرة في الجزء السفلي من لوحة رئيسية يماغيج. تحويل القيم منطقة بكسل التعسفية في ملف Excel إلى 2 ميكرون. حفظ دوام مناطق (لكل خلية على حدة) كملف نصي (عمودين من الأرقام فقط). ملاحظة: وسوف يكون هذا مدخلا إلى برنامج تركيب الصوت "PfFit.
5. نمذجة أسعار الأسمولية تغيير في غرفة التجريبية عن طريق يماغيج وو صالح برنامج ماتلاب P
- إضافة 2 ملغ الزيلين cyanol (الجدول 1 أدناه) إلى 100 مل من محلول متساوي التوتر (لإنتاج "المؤشر صبغ ').
- إعداد نظام الارواء (كما في 3.1) مع صبغ المؤشر وح غير مصبوغحل ypotonic.
- ختم زلة تغطية باستخدام الشحوم السيليكون إلى الجزء السفلي من الغرفة زجاج شبكي، ثم بلطف ملء الغرفة مع صبغ المؤشر، وتغطية ذلك مع انزلاق الغطاء (كما هو الحال مع protoplasts قبل) ووضعه على المسرح المجهر.
- ربط الغرفة لنظام نضح ومضخة، وبدوره على تدفق المؤشر صبغ لنضح المستمر في لتر مل / دقيقة.
- تسجيل فيلم 60 ثانية بمعدل 1 هرتز. بدء تسجيل مع 15 ثانية من صبغ المؤشر، قم بالتبديل إلى حل منخفض التوتر لمدة 45 ثانية. وقف التصوير. مطاردة مع صبغ المؤشر (على الأقل لمدة 30 ثانية)، ثم البدء في فيلم جديد. كرر حوالي 5 - 6 مرات وحفظ جميع الأفلام
- استخدام البرنامج يماغيج لتحليل صور الفيديو من النفاذية المؤشر صبغ للحصول على دوام المتوسط للتغيير النفاذية.
- بدء يماغيج، انقر فوق "ملف"، ثم على 'فتح'، وتصفح للفيلم. عن كل فيلم، رسم 10 بكسل واسعة العموديالمستطيل في أي مكان على شارع 1 صورة من الفيلم. انقر فوق "صورة" على لوحة رئيسية يماغيج، ثم انقر فوق "المحاصيل" في القائمة المنسدلة.
- لمحاذاة 60 لقطة (الفيلم 60 ثانية) في صف واحد، ثم اضغط ثانية "صورة"، ثم انقر على التوالي في القوائم المنسدلة لأنها تتكشف: "الأكوام" و "جعل المونتاج" (60 الأعمدة، الصفوف 1). رسم مستطيل أفقي 1 بكسل عالية في أي مكان على طول صف كامل من الصور وانقر على 'تحليل' في اللوحة الرئيسية يماغيج، ثم انقر فوق نبذة عن مؤامرة "في القائمة المنسدلة. ملاحظة: A 'مؤامرة من المونتاج "سوف تظهر (لا يظهر) النافذة، وقائمة بيانات النفاذية يمكن فتح من القائمة الخاصة. يتم تمثيل كل صورة من الفيلم في هذه القائمة 10 قيم النفاذية الناشئة في المستطيل واسعة في 10 بكسل، وبالتالي "قاعدة الوقت" (الصورة الرقم المتسلسل) هو 10 مرات أطول.
- نسخ من قوائم دات النفاذيةو(قائمة واحدة في الفيلم) في ملف إكسل. متوسط الدورات الوقت النفاذية الحصول عليها من عدة أفلام من الهبات المؤشر صبغ. توليد قاعدة في الوقت الحقيقي بضرب صورة الرقم المتسلسل بنسبة 0.1. حفظ دوام المتوسط (عمودين) إلى ملف نصي. ملاحظة: قبل المتوسط، إذا رغبت، رسم الدورات الفردية الوقت، رفض أي مخالفات. تأكد من أن الفيلم يتضمن على الأقل 5 ثانية النهائي من النفاذية الحالة المستقرة للصبغ المؤشر.
- بدء تشغيل برنامج ماتلاب المناسب P و صالح (لوحة "المؤشر صالح"، الشكل 3) لحساب البارامترات المختلفة للدوام الأسمولية. ملاحظة: استنادا إلى تركيزات الأولية والنهائية معروفة من الحل في الحمام، ويتم احتساب مدار الساعة من التركيز الاسموزي تغيير من الحل من دوام تركيز (محسوبة، بدوره، من النفاذية المؤشر صبغ)، على افتراض أنه يتبع نفس ديناميات مثلتركيز الصبغة. P و صالح هو برنامج متاح للاستخدام مجانا. و"PfFit_Installer_web.exe" يمكن تحميلها من: P و دليل صالح العضو "مع شرح مفصل والتعاريف يمكن الوصول إليها عبر جوف] كملف إضافي، مما يساعد على تعريف المستخدم مع البرنامج صالح P و.
- في لوحة "المؤشر صالح"، استيراد البيانات من الدورة الوقت نفسه من النفاذية المؤشر صبغ ('ملف البيانات المؤشر، الشكل 3A) وتضاف يدويا المعلمات التجربة الحالية والتخمينات الأولية من "العرض" المعلمات و" t_half "واصفا مدار الساعة من تركيز المؤشر صبغ (الشكل 3B. انقر 'تشغيل' لعرض قطع من الدورات الوقت للتركيز المؤشر صبغ (بيانات حقيقية وتناسب، الشكل 4A)، وعلى غرار (محسوبة) حمام الأسمولية (الشكل 4B) ملاحظة: AGالعود يصلح للبيانات ضروري (توصية: بدء مع القيم هو مبين في الشكل 3).
6. تحديد و P باستخدام برنامج ماتلاب تركيب P و صالح
ملاحظة: بالإضافة إلى الافتراضات الأساسية فيما يتعلق سلوك البروتوبلازم بمثابة مقياس التناضح الحقيقي والمثالي 11، وتحديد P و يعتمد على افتراض أن P و قد تتغير مع مرور الوقت، أن هذا ديناميات P و ترتكز الوقت مسار تغيير حجم الخلية وأن المعلمات الثلاث يكفي لوصف ذلك: P فاي (القيمة الأولية P و)، المنحدر الجبهة الوطنية (معدل التغير الخطي للP و) وتأخير (في الفترة من بداية حمام تغيير الأسمولية حتى بداية تغيير حجم الخلية). يمكن اختبار نماذج مختلفة، بما في ذلك مجموعات مختلفة من هذه الثوابت والقيم، بما في ذلك القيم الخالية (11). P
- التبديل إلى "حجم صالح" لوحة (الشكل 5). اختيار لاستيراد ملف بيانات المناطق (ملف نصي مع مدار الساعة من "المناطق" من protoplasts تحليلها، الشكل 5A). اختر 'مؤشر نشاط تركيب "كمصدر المعلمة (الشكل 5B، انظر" P و دليل صالح العضو' عن بدائل). ملاحظة: هذه المعلمات (الشكل 5D) تستخدم بعد ذلك لتجديد التغيير osmoticum في الحمام لأحجام المناسب الإجراء.
- في لوحة "حجم صالح" (الشكل 5C)، تهيئة (ملء التخمينات الأولية ل) ف و المعلمات: P و، المنحدر الجبهة الوطنية وتأخير (توصية: يبدأ 1، 1، و 30، على التوالي)، اختارت نموذج 'الفئة' (توصية: يبدأ الثاني وعلامة 'الشيكات' لجميع المعلمات الثلاث لتركيبها). انقر 'تشغيل'، ثم مقلة العين الرقم المؤقت (الشكل 5E) وضبط المعلمة تأخير وطول السجل، إذا لزم الأمر.
- دراسة الرسم البياني النتائج (الشكل 6) لتقييم جودة مناسبة وتسجيل الخطأ مناسبا. تغيير المعلمات تهيئة بضعة أضعاف لكل منهما، وإعادة'Run. ملاحظة: لا تثبط عند البرنامج يحصل عالقا - مجرد إعادة تشغيل البرنامج!
- تكرار هذا الإجراء عدة مرات، بدءا من مجموعات مختلفة من معلمات التهيئة، وتهدف لأدنى قيمة الخطأ مناسبا.
- نسخ قائمة بنتائج تناسب مباشرة من الشاشة، أو العثور عليها في رانه PfFit المولدة الملف '_FIT_Vol_Results.txt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
من أجل تحديد P و ومقارنة نشاط AQPs مختلفة، وتستخدم protoplasts ورقة من أوراق نبات الأرابيدوبسيس. تم العثور على هذه protoplasts لديك منخفضة القاعدية (الخلفية) مستويات P و 7 ويمكن أن تكون بمثابة نظام وظيفي في التعبير لتمكين قياسات P و استنساخه.
تم عزل Protoplasts من ورقة ناضجة من نبات نبات الأرابيدوبسيس العمر 6 أسابيع ويبني ثلاثة الجينات مع جينات AQP من نبات الأرابيدوبسيس (AtPIP2؛ 1) والذرة (ZmPIP1، 2 وZmPIP2؛ 4) كان عابر (وحدة) أعرب باستخدام التحول PEG طريقة 15. على افتراض أن حالة التحول المتزامن لعدد كبير من البلازميدات تطبيقها على الخلية بغض النظر عن طبيعتها وبناء على النتائج التي أظهرت نسبة نجاح 100٪ لتزامن التعبير عابرة اثنين من البلازميدات في خلية واحدة عنها سابقا لأنظمة النباتية الأخرى15،16، كانوا شارك تحولت مع ناقلات ترميز تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) من أجل تسمية protoplasts تحولت (الشكل 7).
لفحوصات P و تم تعيين protoplasts في غرفة التجريبية (الشكل 1B) وكانت رصدت المسمى GFP protoplasts عن طريق الفيديو بينما كانوا مسح في البداية مع الحل متساوي التوتر (600 الميلي أسمول)، ثم مع محلول ناقص التوتر (500 الميلي أسمول)، باستخدام نظام نضح (الشكل 1A).
تم الحصول على الدورات وقت التغييرات حجم الخلية (الشكل 8A) لكل خلية في مرحلتين: أولا، 'صورة إكسبلورر' واستخدمت الإضافات 'البروتوبلازم محلل "لتوليد مدار الساعة من التغييرات في المنطقة كفاف الخلية (الشكل 2) ثم، تم استخدام برنامج ماتلاب المناسب P و صالح (الشكل 5) لاستيراد تساه المناطق وتحويلها إلى وحدات تخزين الخلايا. وقد استمدت القيم P و (الشكل 8C) لكل خلية باستخدام برنامج صالح P و (الشكل 5)، على أساس دوام على حجم الخلية و، بالإضافة إلى ذلك، على استيراد متوسط مدار الساعة من التغييرات النفاذية للمؤشر تحويل صبغ (الشكل 3)، على مدار الساعة من تغيير تركيز المؤشر صبغ (الشكل 4A) وبعد ذلك - إلى مسار الوقت للتغيير حمام الأسمولية (أرقام 4B، 8B 6A و). ومن الجدير بالذكر، أن delC، والفرق في تركيزات الأسموزي في الخلية (سين) و في حمام (COUT)، أي، القوة الدافعة لتدفق المياه، ويرجع تقريبا فقط لتغيير COUT (الشكل 6A ). في هذه التجربة، زادت P و خلال فحص (الشكل 6B).
ف و و P الخلية تحولت السيطرة مع GFP وحدها (الشكل 8C).
الشكل 1: نظام الحجم الفحص. (A) والإعداد التجريبية: يحتوي نظام نضح الخزانات الحل (الأعمدة التسريب، "العواميد")، أنابيب (T) والصمامات (V) ومضخة تحوي (P) متصلة الشريحة شبكي تعيين على الجدول المجهر. HS = محلول ناقص التوتر، هو حل متساوي التوتر، سم الكاميرا. (B) موسع للرأي الشريحة شبكي مع الغرفة التجريبية (مركز حقوق الانسان) وأنابيب المرفقة عن طريق مدخل (في) الموصل المتعددة. يرشح المحلول من الغرفة عبر منفذ (خارج) إلى المضخة. (ج) الرسم التخطيطي ل الشريحة شبكي (عكس اتجاه عقارب الساعة: أعلى عرض، عرض الجانب طويلة وعرض الجانب القصير): أ = غطاء زجاجي زلة، والجزء السفلي غرفة المركزي؛ ب = اضح شريط لاصق (الجدول 1)، بمثابة أسفل لمدخل ومخرج الأخاديد الحلول الرائدة من وإلى الغرفة المركزية؛ عندما يتم استبدال الشريط سكوتش (أحيانا فقط)، يتم قطع ثقب فيه تحت الغرفة. ج = كتلة شبكي لصقها على الشريحة. د = حفرة موصل منفذ. الأرقام ملم (ولكن الرسم ليس لتوسيع نطاق). (D) موسع للرأي لمركز جزء من الشريحة مع غطاء شفاف (شبكي أيضا) تغطي جزئيا الغرفة المركزية (السهام). (E) الرسم التخطيطي (أعلى والآراء الجانب) من غطاء شفاف. حجم مقبض غطاء شفاف (البلاستيك الأخضر في D) هو إجراء تعسفي. تفاصيل اخرى هي كما في C.
2 / 51652fig2highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الشكل 2: تحليل تورم protoplasts الصور باستخدام "البروتوبلازم محلل 'البرنامج المساعد. (A) لذلك، فإن الصورة الأولى من الفيلم مع protoplasts، ب، كما هو الحال في، ولكن الدوائر الصفراء تشير إلى اختيار تتم بعد مراجعة الفيلم، قبل أن يتم autodetected معالم، ج، من الأول حتى الصورة الأخيرة الدوائر الخضراء اتبع بإحكام معالم protoplasts "حسن تصرف" تمر التحليل. (B) 'المؤامرات Time' بالطبع (مع وحدات من عدد الصورة على الإحداثي السيني) من المناطق المحسوبة ضمن معالم البروتوبلازم (' المنطقة '، في مربع بكسل )، لكل تتبع (ومرقمة) البروتوبلازم. (C) لوحة إدخال المعلمات من "البروتوبلازم محلل 'البرنامج المساعد. يمكن تعديل الأربعة المعلمات كشف "لضبط خوارزمية الكشف البروتوبلازم. و"عدد البكسلات الحدود "المعلمة تحدد الحد الأدنى لسماكة كفاف البروتوبلازم (القيمة الافتراضية: 5). و"الوزن النسبي" المعلمة يؤثر على مستوى الفرق عتبة الرمادي بين منطقة البروتوبلازم الداخلية والحدود الخارجي (الافتراضي: 2). "نسبة محيط الأقصى 'تحدد عتبة لاستبعاد protoplasts كلما شكلها ينحرف عن دائرة. هذه المعلمة هي نسبة محيط البروتوبلازم إلى محيط دائرة مثالية لها نفس المنطقة باسم البروتوبلازم (الافتراضي: 1.05). و"زيادة المساحة القصوى" (٪ زيادة في الوقت خطوة) تستثني المعلمة protoplasts مع زيادات منطقة كفاف فوق قيمة المعلمة (القيمة الافتراضية: 5٪). أخيرا، ويعالج البرنامج المساعد أيضا الحركات البروتوبلازم صغيرة ولكنها سوف تتوقف تتبع protoplasts التي تتحرك بسرعة أو أن تختفي من منطقة الصورة. الفيلم يمكن أعد تشغيل عدة مرات حسب الضرورة، ويمكن أعادوا تحليل والبروتوبلازم واحد على حدة.كوم / ملفات / ftp_upload / 51652 / 51652fig2highres.jpg "الهدف =" _ على بياض "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: لوحة و 'المؤشر صالح "لصالح برنامج P و. هذا الجزء يترجم دوام النفاذية المؤشر في مسار وقت الحمام الأسمولية. (A) تصفح لملف البيانات المحفوظة التي تحتوي على مدار الساعة من التغييرات النفاذية للصبغ المؤشر. (B) إما استخدام قائمة المحفوظة مسبقا من المتغيرات والمعلمات، أو إدراج يدويا 5 قيم المتغيرات من التجربة الحالية: "true_C_init 'و' true_C_end" (في osmolarities من الحل حمام الأولي والحل P و -assay perfused لعن طريق حمام)، t_start_wash"(مدة أخذ العينات خط الأساس على مستوى المؤشر صبغ الأولي)،" threshold_٪ '(٪ من القيمة الأساسية، حيث البرنامج بالكشف تلقائيا رحيل من النفاذية خطوط الأساس؛ 1-5٪ وعادة ما تكون الأكثر فعالية)، "N_steady_st_pts "(عدد العينات - مع 10 عينات تمثل كل صورة المؤشر صبغ اتخذت - أن يكون متوسط في نهاية مستوى الدولة المطرد للصبغ المؤشر، حاسمة لتحويل تركيز صبغ المؤشر إلى تركيز osmoticum) والتخمينات الأولية لاثنين من المعلمات أربعة من المؤشر صبغ النفاذية دوام السيني، 'عرض' و ر نصف (المتعلقة تقريبا لمدة الجزء الانتقال من السيني، وإلى منتصفه، على التوالي؛ قد تكون ر نصف سلبي!). ويتم الحصول على اثنين من أفضل تناسب المعلمات، بالإضافة إلى 'عرض' ر ونصف دون الحاجة إلى تخمين الأوليوفاق: تأخر ('flush_lag')، والوقت بين فتح صمام وصول الحل في الحمام، و "C_init"، دون معنى مادي، ولكنها ضرورية لوصف مسار الوقت الأسمولية (انظر إضافي P و صالح دليل المستخدم.
الشكل 4: تركيز صبغ المؤشر في الحمام والأسمولية من المتوسط (A) وبالطبع الوقت لتركيز صبغ المؤشر، وتحسب مباشرة من البيانات (نقطة) والمعلمات من أفضل تناسب (الخط) كما هو غسله بعيدا عن حل غير مصبوغ. (B) وبالطبع الوقت المحسوب للتغيير الأسمولية من الحل الحمام، على افتراض أنه يتبع نفس ديناميات كما تغير تركيز المؤشر صبغ.
الرقم 5: إن "حجم صالح" لوحة البرنامج صالح و P (A) تصفح لملف بيانات دوام منطقة البروتوبلازم تحليلها (B) اختيار "مؤشر نشاط تركيب 'الخيار لاستيراد المعلمات من التجربة. . الماضي البعيد من خلال "المؤشر صالح" (انظر إضافي P و صالح دليل المستخدم عن بدائل) (C) "نموذج نوع '/' الفئة ': الدرجة الأولى يحتوي على أبسط نموذج 1، من الدرجة الثانية - نماذج 2-5، والطبقة ثالثا - نماذج 6 - 8. النماذج تختلف فيما يتعلق التي يجري ثابتة المعلمات والتي يتم تعديلها (أي متغير بحرية.) أثناء الإجراء المناسب (وضع علامة في المربع للسماح لها تختلف)، وأم لا " SlopePf "و / أو" تأخير "لاغية. وضعليرة سورية 1 - 6 ومناقشة مستفيضة من قبل Moshelion وآخرون 11. يسرد "دمج" الخيارات المعلمة التي تمليها اختيار "نوع نموذج '/' الفئة '. بين النماذج مع نتيجة مماثلة تناسب - اختيار أبسط! تهيئة "و P '،' المنحدر الجبهة الوطنية" ('Slope_Pf') والمعلمات "تأخير" كما هو مبين (مزيد من التفاصيل حول "تأخير" في E أدناه). (D) والمتغيرات والمعلمات واصفا مدار الساعة من تغيير osmoticum حمام يتم إدخال إما يدويا، أو كما هو موضح في B. (E) مؤامرة المؤقتة، التي يحتج بها ضرب 'تشغيل'، على مدار الساعة من تغيير حجم (محسوبة من المناطق كفاف خلية) للمساعدة في اختيار القيمة الأولية للمعلمة في "تأخير". تقدير، من خلال ييبالينج، ويبلغ طول خط الأساس من وجهة شارع 1 حتى بداية تغيير حجم الخلية ("تأخير شامل: مجموع "تي بدء غسل '+' تأخر '/' دافق الفاصلة '+ من" الفسيولوجية "' تأخير '). تضاف هذه القيمة كمعلمة إدخال ل"تأخير" في لوحة "VolumeFit 'و' تشغيل 'مرة أخرى (انظر أيضا التكميلي P و صالح دليل المستخدم).
الرقم 6: نتائج المناسب (A) "وراء الكواليس": الدورات وقت النهائية المحسوبة لتركيزات osmoticum في القسمين: حمام (COUT، الخط الأخضر) وخلية (سين، الخط الأزرق، سين هو تحسب على أساس تغيير حجم البروتوبلازم وافتراض أن نفاذية غشاء البلازما هي فقط لالمياه - "مقياس التناضح المثالي والحقيقي" 11)، وبالطبع وقت والفرق بينهما (delC، خط أحمر)، والتي هي القوة الدافعة لتدفق المياه، "EO-tLag" يصادف نهاية "دافق الفاصلة" وبدء التحدي منخفض التوتر (هنا فقط في حوالي 21 ثانية). مربع أحمر: الخطأ من قيمة مناسبة (صالح-ERR، انظر التعريف في الأسفل B) (B) والنتيجة النهائية لتركيب دوام حجم؛ الصندوق الأخضر: "المتغيرات الإدخال 'هي القيم المدخلة عن طريق لوحة P و صالح /' VolumeFit" (المعرفة في الشكل 5A أسطورة). الصندوق الأسود: "exptl-المجلد" و "المجلد-تركيبها" هي البيانات التجريبية وحجم المحسوبة باستخدام المعلمات أفضل تناسب، على التوالي، "EO-tLag 'هو نفسه كما في A، علامات" EO-تأخير "و بداية تغيير حجم. 'المنطقة بنسبة 3٪' يمثل حجم الذي زادت مساحة السطح بنسبة 3٪، والحد من المفترض أن القدرة غشاء الخلية لتمتد دون تمزق. "الجبهة الوطنية (تحجيم) 'هو بالطبع وقت للبا المناسبااا تحسب P و، والتي تمتد القيم المشار إليها أدناه المربع الأحمر باسم 'سبان من P و. مربع أحمر: "تركيبها البارامترات هي قيم من أفضل المعلمات صالح:" الجبهة الوطنية ط "(وو P الأولية)،" تأخير "(الفترة ما بين بداية التحدي منخفض التوتر وبداية تغيير حجم (الذي، وفقا للنموذج 5 المستخدمة في هذا المثال، هو أيضا بداية في التغير في القيمة و P)، و "المنحدر P-F '(معدل ثابت من التغير في القيمة P و" fit_ERR "هو مبين في A. - الهدف التقليل من ماتلاب الإجراء المناسب - هو انحراف "جذر متوسط مربع" (أي الجذر التربيعي لمتوسط مربع الانحراف) من نقطة خضراء من الخط الأسود)، كما عرضت٪ من حجم خط الأساس و. هو من خلال هذه القيمة أن النجاح النسبي لتركيب المتكررة مع القيم المعلمة التهيئة مختلفة يتم الحكم. وملاحظة تحذير: بما أن القيم المعلمة أفضل تناسب يمكن أن يكون نتيجة لأدنى المحلي وجدت خطأ في الإجراء تقليل - للتحقق من الحد الأدنى العالمي قد تم العثور، يطلب من عدة أشواط مع القيم التهيئة مختلفة لهذه المعايير الثلاثة (و وينبغي السعي أدنى fit_ERR خلال هذه المحاولات المربع الأزرق: دلتا هي التغييرات التي حدثت قبل نهاية فترة تغيير حجم المجهزة: "متوسط VOLm٪ 'هو مدى النسبي لتغيير حجم البروتوبلازم حساب و' المنطقة متوسط٪ ' هو التغيير النسبي للمساحة البروتوبلازم. وتعطى الحجم الأولي للخلية ل 'شعاع'، والمستمدة من القيمة المتوسطة للالبروتوبلازم منطقة كفاف القاعدية.
الرقم 7: برنامج التحصين الموسع ومضان المجهري نظرا لورقة protoplasts (A) التي تنتقل تحت الضوء الأبيض و (B) في 488 نانومتر الإثارة و 520 نانومتر الانبعاثات. شريط مقياس: 100 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 8: تغيير حجم ونفاذية المياه المستخرجة التناضحي، و P (A) بالطبع الوقت (60 ثانية) البروتوبلازم تورم عند التعرض لتحدي منخفض التوتر (يعني ± SE) (B) تركيز osmoticum حساب في الحمام أثناء. التحدي منخفض التوتر. نلاحظ أنه في حين تم تحويل تدفق منخفض التوتر على حل في 15 ثانية، وصلت إلى الحمام إلا بعدتأخر، وهنا من 5.9 ثانية. (C) P و (يعني ± SE). تشير العلامات النجمية اختلافات كبيرة من سيطرة (ع ≤0.05). البيانات من ثلاث تجارب مستقلة على الأقل لكل معاملة مع ما مجموعه protoplasts ن (التحكم: ن = 52، AtPIP2، 1: N = 13، ZmPIP1؛ 2: ن = 28، ZmPIP2؛ 4: ن = 34).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الموصوفة هنا هو إجراء بسيط وفعال جدا لقياس و P من protoplasts النباتية المعزولة، المعمول بها في المبدأ أيضا على خلايا كروية أخرى، على سبيل المثال، البويضات الضفدع 11. وتستند هذه الطريقة على قياس P و ردا على التحدي الاسموزي إلى الخلية. على النقيض من الطرق الأخرى القائمة على هذا النهج، ومع ذلك، فإن التغيير من الحلول، أي من الأسمولية، ليست لحظية، ولكن تدريجيا، خلال نضح حمام مستمر، بدءا من محلول متساوي التوتر، الذي هو حجم الخلية الأساس أنشئت. وبالإضافة إلى ذلك، وهذه الطريقة لا تنطوي على ماصة شفط وبالتالي يقلل من الاضطراب للprotoplasts.
النهج المقدمة هنا يمكن قياسات من مجموعة متنوعة من protoplasts، من النباتات أو الأنسجة المختلفة. ومع ذلك، وبسبب الحسابات المعنية، ويمكن تحليل الخلايا كروية فقط. أيضا، فإن العزلة الأنزيمية من عشرprotoplasts الإلكترونية والأسمولية من الحلول تحتاج إلى تعديل لخلايا يعاير (على سبيل المثال، عزل الأنزيمية من الطماطم protoplasts ورقة يستغرق حوالي ساعة، وقتا أطول بكثير مما كانت عليه في حالة protoplasts نبات الأرابيدوبسيس).
عزل protoplasts ورقة نبات الأرابيدوبسيس وفقا لبروتوكول المعروضة بسيطة وسريعة وفعالة، مما أسفر عن عدد كبير من protoplasts. والجدير بالذكر أن هذا، جنبا إلى جنب مع انخفاض مستويات القاعدية و P وكفاءة عالية تحولها (الشكل 8)، يجعلها نظاما جذابا للتعبير الوظيفي للAQPs، لتمكين المقارنات الكمية للP و الناجمة عن الأشكال الإسوية AQP مختلفة. عند التعبير عن AQPs في هذه protoplasts مع الجينات علامة (مثل GFP)، يمكن للمرء أن الشاشة بسهولة protoplasts في غرفة تجريبية لالاستشعاع الخلايا لتحليلها.
فإنه من المفيد للتحقق ما إذا كان هذا النظام هو البديلة قابلة للحياةه إلى البويضات لمعايرة AQPs حتى من مصادر حيوانية (يمكن التعبير عن ذلك البروتينات الحيوانية وظيفية في الخلايا النباتية قد أظهرت بالفعل 17).
و باستخدام برنامج P صالح، معلمتين أكثر، بجانب P و، ويتم الحصول على لوصف ردود البروتوبلازم للتحديات ناقص التوتر: تأخير الوقت بين بداية تغيير حجم وبداية حمام نضح، والمنحدر PF، معدل التغير في P و خلال التحدي التناضحي (وصفها بالتفصيل في 11).
لكل البيانات التجريبية تعيين حجم الإجراء المناسب يحتاج إلى أن تتم عدة مرات، توريد مختلفة بدءا (التهيئة) القيم لهذه المعلمات، واختيار في النهاية تتناسب مع أدنى خطأ. يمكن تصوير هذه العملية تقليل الخطأ كما تسعى أعمق واد (أ "الحد الأدنى العالمي") في المناظر الطبيعية من الوديان مع أعماق مختلفة، بين رجلذ التلال، ومحاولة لا تكون اشتعلت في واد ضحل إلى حد ما (و"الحد الأدنى المحلي").
ويتم الحصول على نوعين من P F، P و في البداية من hypoosmotic تورم استجابة ('P و الأولي') و P و يحسب في نهاية 15 ثانية من تورم، والعد من نهاية التأخير ('P فاي و نال'). وناقش الفرق بين الاثنين بشكل كامل من قبل Moshelion آخرون 11، فيما يتعلق نماذج 6 تحليلها.
هناك نوعان من الخطوات الحاسمة في البروتوكول: أولا، مناسبا لمسار الوقت للتركيز صبغ المؤشر، الثانية، مناسبا للدوام من حجم الخلية التورم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من الصندوق الوطني البلجيكي للفاي Scienti ج أبحاث (FNRS)، والفلمنكي الجذب البولنديين برنامج البلجيكي سياسة العلوم و"COMMUNAUTÉ الفرنسية دو بلجيك-تطبيقات للأبحاث Concertées" لFC، من القدس مؤسسة العلوم اسرائيل ( ISF) لMM (المنحة # 1311-1312)، وNM (المنحة # 1312-1312).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade |
| CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com Any source, anal. grade |
| 2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS002603 | http://www.worthingtonbiochem.com |
| Pectolyase | Karlan, Phonix, AZ, USA | 8006 | http://www.karlan.com |
| Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418-5G | http://www.sigmaaldrich.com |
| Protamine sulphate | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Silicone vacuum grease heavy | Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
| Peristaltic pump | BIO-RAD | EP-1 Econo Pump | http://www.bio-rad.com |
| Grayscale digital camera | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
| CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software |
|
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software |
|
| Econo Gradient Pump Fittings Kit | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
| Connectors, manifold | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S | |
| Burette infusion sets (columns) | Welford | IF-BR-001 | http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 |
| Tubing | TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com |
| 3M packaging Scotch tape 1'', clear | Viking Industrial, UK | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK |
References
- Tyerman, S. D., Niemietz, C. M., Bramley, H. Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles. Plant Cell Environ. 25, 173-194 (2002).
- Maurel, C. Plant aquaporins: Novel functions and regulation properties. Febs Letters. 581, 2227 (2007).
- Maurel, C., Verdoucq, L., Luu, D. T., Santoni, V. Plant aquaporins: Membrane channels with multiple integrated functions. Annual Review of Plant Biology. 59, 595 (2008).
- Chaumont, F., Moshelion, M., Daniels, M. J. Regulation of plant aquaporin activity. Biology Of The Cell. 97, 749-764 (2005).
- Ramahaleo, T., Morillon, R., Alexandre, J., Lassalles, J. P. Osmotic water permeability of isolated protoplasts. Modifications during development. Plant Physiology. 119, 885-896 (1999).
- Suga, S., Murai, M., Kuwagata, T., Maeshima, M. Differences in aquaporin levels among cell types of radish and measurement of osmotic water permeability of individual protoplasts. Plant Cell Physiol. 44, 277-286 (2003).
- Shatil-Cohen, A., Attia, Z., Moshelion, M. Bundle-sheath cell regulation of xylem-mesophyll water transport via aquaporins under drought stress: a target of xylem-borne ABA? The Plant Journal. 67, 72-80 (2011).
- Hachez, C., Moshelion, M., Zelazny, E., Cavez, D., Chaumont, F. Localization and quantification of plasma membrane aquaporin expression in maize primary root: A clue to understanding their role as cellular plumbers. Plant Molecular Biology. 62, 305-323 (2006).
- Hachez, C., Heinen, R. B., Draye, X., Chaumont, F. The expression pattern of plasma membrane aquaporins in maize leaf highlights their role in hydraulic regulation. Plant Molecular Biology. 68, 337-353 (2008).
- Besserer, A., et al. Selective regulation of maize plasma membrane aquaporin trafficking and activity by the SNARE SYP121. The Plant Cell. 24, 3463-3481 (2012).
- Moshelion, M., Moran, N., Chaumont, F. Dynamic changes in the osmotic water permeability of protoplast plasma membrane. Plant Physiology. 135, 2301-2317 (2004).
- Moshelion, M., et al. Membrane water permeability and aquaporin expression increase during growth of maize suspension cultured cells. Plant, Cell & Environment. 32, 1334-1345 (2009).
- Sade, N., et al. Improving plant stress tolerance and yield production: is the tonoplast aquaporin SlTIP2;2 a key to isohydric to anisohydric conversion? New Phytologist. 181, 651-661 (2009).
- Volkov, V., et al. Water permeability differs between growing and non-growing barley leaf tissues. J. Exp. Bot. 58, 377 (2007).
- Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Reports. 21, 865-871 (2003).
- Hosy, E., Duby, G., Véry, A. A., Costa, A., Sentenac, H., Thibaud, J. B. A procedure for localisation and electrophysiological characterisation of ion channels heterologously expressed in a plant context. Plant Methods. 19, (2005).
- Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. Human Recombinant Type I Collagen Produced in Plants. Tissue Eng Part A. 19, 1527-1533 (2013).
