Summary
Het meten van de osmotische waterdoorlatendheid coëfficiënt (P f) van de cellen kan helpen begrijpen van de regelgeving van aquaporines (AQPs). F bepaling P sferische plantencel protoplasten gepresenteerde omvat protoplasten isolatie en numerieke analyse van de initiële snelheid van volumeverandering als gevolg van een osmotische uitdaging bij constant bad perfusie.
Abstract
Studeren AQP regulatiemechanismen is cruciaal voor het begrip van water relaties bij zowel de cellulaire en de hele plant niveaus. Hier voorgesteld is een eenvoudige en zeer efficiënte methode voor de bepaling van de osmotische water permeabiliteit coëfficiënt (P f) in plantenprotoplasten, in principe ook toepasbaar op andere sferische cellen zoals kikker oocyten. De eerste stap van de assay is de isolatie van protoplasten uit het plantenweefsel plaats door enzymatische digestie in een kamer met een geschikte isotone oplossing. De tweede stap bestaat uit een osmotisch challenge test: protoplasten geïmmobiliseerd op de bodem van de kamer wordt onderworpen aan een constante perfusie start met een isotone oplossing en vervolgens een hypotone oplossing. De cel zwelling is video opgenomen. In de derde stap worden de beelden offline bewerkt om volumeveranderingen opleveren, en het tijdsverloop van de volumeveranderingen samenhangt met het tijdsverloop van de verandering in osmolaligheid van de kamer perfusie medium, met behulp van een curve fitting procedure geschreven in Matlab (de 'PfFit'), naar P f opleveren.
Introduction
Opname van water en stroom over cellulaire membranen is een fundamentele vereiste voor planten bestaan op zowel de cellulaire en de hele plant niveaus. Op cellulair niveau, aquaporines (AQPs) spelen een belangrijke rol in de regulatie van de osmotische waterdoorlatendheid coëfficiënt (P f) van de celmembraan 1-3.
Tot op heden zijn verscheidene werkwijzen toegepast bij het meten van de endogene P f protoplast van verschillende plantenorganen (bijvoorbeeld wortels, mesofyl, endodermis, etc., Beoordeeld door Chaumont et al. 4). Een van de benaderingen P f meten is de protoplasten blootgesteld aan een osmotische uitdaging en de initiële snelheid van de volumeverandering monitor (dwz. De helling van het eerste lineaire fase van de volumeverandering). Twee verschillende methoden eerder beschreven op basis van deze aanpak, beide betrokken op het direct uitwisselen van oplossingen. De eerste bestaat uit immobilizing de protoplast met een zuig micropipet en schakelen de vloeistoftoevoer 5 en de tweede overdracht van de protoplast van de ene naar de andere oplossing met een micropipet 6. Deze micropipet zuig en micropipet overdracht methoden die beeldacquisitie aan het begin van de snelle oplossing uitwisseling mogelijk maakt (naar de eerste lineaire fase van volumeverandering vangen), zal leiden tot een fysieke stress protoplasten en vereisen gespecialiseerde apparatuur en expert micromanipulatie.
De hier beschreven methode minimaliseert de verstoring van de cellen, omvat geen micromanipulatie en maakt afleiding van P f bij het bad perfusie niet onmiddellijk.
Na de enzymatische vertering, de protoplasten, ondergedompeld in een isotone oplossing, worden geïmmobiliseerd op het dekglaasje-glazen bodem van een plexiglas (aka Lucite of perspex) kamer door lading interactie. Vervolgens, tijdens een constante bad perfusiede isotone oplossing wordt weggespoeld door een hypotonische oplossing genereren van een hypoosmotic uitdaging voor de protoplasten. De zwelling van de protoplast is video opgenomen en vervolgens, door het combineren van de informatie over het tijdsverloop van het bad perfusie en het tijdsverloop van de cel zwelling wordt de P f bepaald door beeldverwerking en curve fitting procedures.
De voordelen van deze methode zijn dat de experiment is zeer efficiënt, Het is mogelijk om enkele cellen kan waarnemen in een enkele assay, en dat het geen speciale apparatuur of bijzondere micromanipulatie vaardigheden. Verschillende toepassingen voor deze methode mogelijk. Bijvoorbeeld, bepaling van de natieve P f van een verscheidenheid van cellen van verschillende weefsels en planten, zoals mesofyl en bundelschede cellen van Arabidopsis leaf 7, maïs bladmesofylcellen of wortelcortex cellen 8-10 of suspensie gekweekte cellen 11,12. In additiop, is het mogelijk om P f bolvormige dierlijke cellen te bepalen zoals eicel cellen 11. Een ander voorbeeld betreft onderzoek AQP-activiteit door tijdelijke expressie van het gen in de protoplasten (of andere genen die deze kunnen beïnvloeden, bijvoorbeeld genen kinasen) en bepaling van hun bijdrage aan P f; bijvoorbeeld expressie van tomaat AQP SlTIP2; 2 in Arabidopsis mesophyll protoplasten door PEG transformatie en de vastberadenheid van de SlTIP2; 2-gerelateerde P f 13. Tenslotte onderzoek van het effect op P f van verschillende moleculen / stoffen (drugs, hormonen, etc.) aan de oplossingen toegevoegd kan worden onderzocht, bijvoorbeeld van de AQP blocker HgCl2 7.
Het volgende protocol beschrijft de isolatie van protoplasten van Arabidopsis mesofylcellen en bepaling van de P f.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Voorbereiding van Solutions
- Bereid isotoon (600 mOsm) en hypotone (500 mOsm) oplossingen bevattende 10 mM KCl, 1 mM CaCl2 en 8 M 2-(N-morfoline) -ethanesulphonic zuur (MES), pH 5,7 en een osmolariteit passen aan de geschikte hoeveelheden D-sorbitol: 540 mm voor de isotone en 440 mm voor de hypotone oplossing. Controleer de osmolariteit van de oplossing (binnen 3% van de doelwaarde) met een osmometer.
- Bereid een droge voorraad "enzymatische mengsel" met de volgende enzymen: cellulase 0,55 g, 0,1 g pectolyase, 0,33 g polyvinylpyrrolidon K 30, 0,33 g BSA (zie tabel 1 hieronder), meng de droge poeder door vortex, maak 5,7 mg aliquots en bewaren bij -20 ° C.
2 Isolatie van Arabidopsis mesofyl Protoplasten
- Bereid een Petrischaal (10 cm) met ongeveer 6 druppels (ca.. 30 pi elk) isotone oplossing.
- Schil de abaxiale (lagere) Arabidopsis bladepidermis, cut de geschilde blad in vierkanten van ongeveer 4 x 4 mm 2, leg dan de vierkantjes op de isotone oplossing druppels met de blootgestelde abaxiale kant naar beneden, de oplossing te raken.
- Los 5.7 mg van het enzymmengsel in 165 ul isotone oplossing (3,3% w / w) in een 1,5 ml buis, meng voorzichtig door pipetteren van een minuut tot opgelost en door diverse soortgelijke dalingen van de enzymatische oplossing dezelfde Petri dish.
- Breng de bladdelen op de enzymatische oplossing daalt, sluit de schaal afdichten van de klep met een ronde parafilm en incubeer gedurende 20 min, drijven de schotel in een waterbad op 28 ° C.
- Voeg enige druppels van de isotone oplossing van de schaal (2 druppels per elke enzymoplossing druppel). Breng elk blad stuk in nieuw isotone oplossing druppel dan achtereenvolgens een tweede druppel (de enzymatische oplossing wegspoelen). Til het stuk bij de rand met behulp van een tang, schud het in de tweede drop (zoals een theezakje) om de protoplasten los.Verzamel de druppels met de protoplasten (met behulp van een afgeknipt 100 ul pipet tip) in een 1,5 ml tube.
3 De Hypotone Challenge Assay: Arabidopsis mesofyl celzwelling
- Bereid de perfusie-systeem (figuur 1A) door het invullen van een kolom met de isotone oplossing en een andere kolom met de hypotone oplossing. Open de klep, laat enkele oplossing flow (eerst de hypotone, dan is de isotone) om de slang naar het inlaatspruitstuk (Figuur 1B) vult de hele weg. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen en sluit de klep.
- Seal een dekglaasje, met siliconenvet (tabel 1), een bodem voor de kamer in de plexiglas slide maken (Figuur 1B, zie ook het schema van de kamer in figuur 1C). Naar de kamer beneden "sticky" voor protoplasten, jas maken (de opwaartse gerichte blootgestelde oppervlak van het dekglaasje binnen het vet ring) hetmet positieve-ladingdragende protaminesulfaat (1% in water; tabel 1) of poly-L-Lysine (0,1% in water; tabel 1). Spreid deze 'lijm' over het dekglaasje met een pipet tip, wacht 1 - 2 min, spoelen 3 - 4 maal met de isotone oplossing en schud weg de resterende oplossing.
- Vul de kamer met de isotone oplossing. Vervolgens voegt u een druppel protoplasten bevattende oplossing voor de kamer, met een afgeknipt pipettip en wacht 3-4 minuten voor de protoplasten te vestigen. Bedek de kamer met een doorzichtig deksel (figuren 1D, 1E) aanraken van de oplossing oppervlak (vermijd luchtbellen onder).
- Plaats de schuif (zachtjes!) Op een omgekeerde microscoop tafel, sluit deze aan op de perfusie-systeem en de pomp (bewaken tegen luchtbellen in de leidingen!) En zet de isotone oplossing stroom voor constante perfusie bij 1 ml / min (hogere snelheden kunnen worden gebruikt, tot 4 ml / min).
- Voor het opnemenvolume verandert, wordt een omgekeerde microscoop gebruikt, met een 20X objectief en met een CCD-videocamera die is aangesloten op een PC. Gebruik de 'CMU 1394 Camera Driver' plugin van de ImageJ software (zie de tabel van specifieke materialen voor het downloaden adressen van deze twee software stuks) om een 60 seconden video filmpje van geselecteerde immobiele protoplasten opnemen (vermoedelijk, die vast aan de onderkant) met een snelheid van 1 image / sec (1 Hz). Start de opname met 15 sec wassen van de isotone oplossing (dit betekent dat de basislijn), naar het hypotone oplossing 45 seconden (in totaal 60 seconden vanaf het begin van perfusie in). Sla de film in TIF-formaat. OPMERKING: Kies een veld oog met zoveel cellen mogelijk, voldoen aan de volgende criteria: bolvormig en met een goed gerichte cel contour op hun grootste omtrek (Figuur 2A).
4 Analyse van de Cel Volume wijzigen met ImageJ
OPMERKING: Om het analyserenreeks beelden van een zwelling cel, gebruik dan de 'Beeld Explorer' en 'Protoplast Analyzer' plugins in de ImageJ software (geschreven door Xavier Draye) 14. Beginnend met de gekozen protoplasten bij hun eerste tijdstip, zal het "Protoplast Analyzer" plugin automatisch de protoplasten randen (contouren) detecteren en bereken het tijdsverloop van de gebieden in het experiment (plugins zijn beschikbaar met de PfFit analyseprogramma hieronder) .
- Start ImageJ. Om de film te openen, klikt u op 'Bestand' op het paneel ImageJ, daarna achtereenvolgens op de dropdown menu's als ze zich ontvouwen: 'Import' dan 'Afbeelding Explorer'. Markeer de gekozen film, klik met de rechtermuisknop op te klikken en vervolgens met de linkermuisknop op 'Protoplast Analyzer'. Blader door de film (met behulp van een schuifknop aan de protoplasten afbeelding onderaan) om protoplasten die grotendeels immobiel blijven tijdens het experiment te identificeren - deze zullen worden geanalyseerd. Terug op de eerste image, met behulp van de muis, trek cirkels (geplukt uit de ImageJ tekengereedschappen) rond de geselecteerde protoplasten (figuur 2B), en klik vervolgens op 'OK' in de tabel 'Detection parameters' dat verscheen.
- Om de protoplast- detectiealgoritme lanceren, klik op 'Local' op de protoplast- afbeelding bovenpaneel, vervolgens 'Proces' in het dropdown menu. Onderzoek de groene cirkels rond de geselecteerde protoplasten (figuur 2C) in de hele film. Sla het 'resultaat' in een Excel-bestand. Quit ImageJ. OPMERKING: In het geval verschijnt een rode stip (een slechte contour pasvorm geven - meestal te wijten aan een slecht imago contrast), opnieuw uit te voeren met verschillende parameters.
- De leidingen van elke cel scheiden (- indien twee of meer cellen tegelijkertijd geanalyseerd - die worden verweven, omdat de analyse uitgevoerd frame voor frame), in Excel, de opgeslagen gegevens door het kolomnummer cellen ('object' ).
- Aan Determine de pixel-voor-um omzettingsfactor voor het verkrijgen van de werkelijke waarde van P f, snap een afbeelding van een micrometer liniaal via dezelfde 20X microscoopobjectief. Sleep een lijn (geplukt uit de ImageJ tekentools) langs imago van de heerser en lees het aantal pixels gelijk aan de heerser lengte aan de onderkant van het hoofdpaneel ImageJ. Zetten de willekeurige pixelgebied waarden in het Excel-bestand in micrometer 2. Sla de gebieden tijdsverloop (voor elke cel afzonderlijk) als een tekstbestand (twee kolommen met getallen alleen). OPMERKING: Dit zal een ingang aan de volume-fitting programma 'PfFit' zijn.
5 Modelleren van de Rate of Change Osmolariteit in de experimentele kamer met behulp van ImageJ en de Matlab-programma P f Fit
- Voeg 2 mg xyleencyanol (tabel 1, hieronder) tot 100 ml van de isotone oplossing (de 'indicatorkleurstof' produceren).
- Bereid de perfusie-systeem (zoals in 3.1) met de indicator Dye en de niet geverfde hypotonic oplossing.
- Zegel een dekglas met siliconen vet op de bodem van de kamer van plexiglas, dan voorzichtig vullen de kamer met de Indicator Dye, bedek het met een dekglaasje (net als bij de protoplasten vóór) en plaats het op de microscoop podium.
- Sluit de kamer naar de perfusie-systeem en de pomp, en zet de indicator Dye flow voor een constante perfusie bij l ml / min.
- Het opnemen van een 60 sec film met een snelheid van 1 Hz. Start de opname met 15 sec van Indicator Dye, schakelen naar de hypotone oplossing voor 45 sec. Stop met filmen. Gelijk met de Indicator Dye (minimaal 30 seconden), daarna start een nieuwe film. Herhaal ongeveer 5-6 keer en bewaar alle films
- Gebruik de ImageJ software om de videobeelden van de indicatorkleurstof transmissie analyseren een gemiddelde tijdsverloop van de veranderende transmissie verkrijgen.
- Start ImageJ, klik op 'Bestand' en vervolgens 'Open', en blader naar de film. Voor elke film, trek je een 10 pixel brede verticalerechthoek overal op de 1 ste beeld van de film. Klik op 'Beeld' op het hoofdpaneel ImageJ, klik dan op 'Crop' in het dropdown menu.
- Om de 60 frames (van de 60 sec film) sluiten in een rij, klik nogmaals 'Beeld' en klik achtereenvolgens in de dropdown menu's als ze zich ontvouwen: 'Stacks' en 'Make Montage' (kolommen 60, rij 1). Teken een 1 pixel hoge horizontale rechthoek overal langs de hele rij van beelden en klik op 'Analyseren' in het hoofdpaneel ImageJ, klik dan op 'plot profiel' in het dropdown menu. NB: Een 'Perceel van Montage' venster verschijnt (niet getoond), en een lijst van de transmissie van gegevens kan worden geopend vanuit het menu. Elk beeld van de film is vertegenwoordigd in deze lijst met 10 transmissiewaarden uit haar 10 pixels breed rechthoek en dus ook de "time basis" (het beeld volgnummer) is 10 keer langer mee.
- Kopieer de lijsten van de transmissie DATeen (een lijst per film) naar een Excel-bestand. Het gemiddelde van de transmissie tijdsverloop verkregen uit de verschillende films van de Indicator Dye flushes. Genereer een real-time basis door het beeld volgnummer vermenigvuldigen met 0,1. Sla het gemiddelde tijdsverloop (twee kolommen) naar een tekstbestand. OPMERKING: Voordat middeling, indien gewenst, plot de individuele tijd cursussen, om eventuele onregelmatigheden te weigeren. Zorg ervoor dat de film bevat minstens 5 laatste seconden van de steady-state-transmissie van de Indicator Dye.
- Start het Matlab fitting programma P f Fit (het "Indicator Fit" paneel, figuur 3) van de verschillende parameters van de osmolariteit tijdsverloop berekenen. OPMERKING: gebaseerd op de bekende aanvankelijke en eindwaarden van de oplossing in het bad, wordt het tijdsverloop van de verandering osmotische concentratie van de oplossing berekend uit de concentratie tijdsverloop (berekend beurt de indicatorkleurstof transmissie), zo deze volgt dezelfde dynamiek als dekleurstofconcentratie. P f Fit is een programma beschikbaar voor gratis gebruik. De 'PfFit_Installer_web.exe' kan worden gedownload van: P f Fit User Guide 'met gedetailleerde uitleg en definities is bereikbaar via Jupiter als een aanvullend bestand, dat helpt om de gebruiker met de P f Fit programma vertrouwd.
- In het "Indicator Fit" paneel importeren de gegevens van de gemiddelde tijdsverloop van de indicatorkleurstof transmissie (Indicator gegevensbestand, figuur 3A) en plaats handmatig huidige experiment parameters en de initiële gissingen van de parameters "breedte" en " t_half 'het tijdsverloop van de Indicator Dye concentratie (Figuur 3B beschrijven. Klik op' Uitvoeren 'om de percelen van het tijdsverloop van de Indicator Dye concentratie (echte gegevens en fit, figuur 4A) te bekijken, en van de gemodelleerde (berekend) bad osmolariteit (Figuur 4B). OPMERKING: agood fit aan de gegevens onontbeerlijk (aanbeveling: begin met de in figuur 3 waarden).
6 Het bepalen van de P f met behulp van de Matlab Fitting Program P f Fit
OPMERKING: Naast de uitgangspunten met betrekking tot het gedrag van een protoplast als ware en volmaakte osmometer 11, de bepaling van P f berust op de veronderstelling dat Pf kan veranderen met de tijd, dat deze dynamiek van P f grondslag tijd Tijdens het celvolume veranderingen en dat drie parameters voldoende te beschrijven: P fi (de beginwaarde van P f) Helling Pf (het percentage van de lineaire verandering van P f) en Delay (de periode vanaf het begin van het bad osmolariteit verandering tot het begin van de cel volumeverandering). Verschillende modellen kunnen worden getest, waaronder verschillende combinaties van deze parameters en hun waarden, met inbegrip van null-waarden 11. P
- Schakel over naar de 'Volume Fit' (zie figuur 5). Kies voor invoer in het gebied gegevensbestand (het tekstbestand met het tijdsverloop van de "gebieden" van de geanalyseerde protoplasten figuur 5A). Kies 'Laatste Indicatorfitting' als de parameter source (figuur 5B, zie de 'P f Fit User Guide' voor alternatieven). Opmerking: Deze parameters (figuur 5D) worden dan gebruikt om de osmoticum verandering in het bad voor de volumes montage procedure regenereren.
- In de 'Volume Fit' (zie figuur 5C), initialiseren (in de initiële schattingen van) de P f-parameters in te vullen: P f, Helling Pf en Delay (een aanbeveling: beginnen met 1, 1, en 30, respectievelijk), koos het model 'Class' (aanbeveling: begin met II en mark 'checks' voor alle drie de parameters te worden gemonteerd). Klik op 'Uitvoeren', dan oogbol de interim-figuur (Figuur 5E) en indien nodig de parameter Delay en de lengte van de plaat, aan te passen.
- Onderzoek de resultaten grafiek (figuur 6) om de pasvorm kwaliteit evalueert en noteer de fit fout. Verander het initialiseren van parameters een paar klappen elk, en re-'Run '. LET OP: Laat je niet ontmoedigen als het programma loopt vast - gewoon het programma opnieuw te starten!
- Herhaal deze procedure meerdere malen, te beginnen met verschillende combinaties van initialisatie parameters, streven naar de laagste waarde van de fit fout.
- Kopieer de lijst van de fit resultaten direct van het scherm, of ze vinden in thij PfFit-generated '_FIT_Vol_Results.txt' bestand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de P f bepalen en vergelijken van de activiteit van verschillende AQPs worden mesofyl protoplasten van Arabidopsis leaf gebruikt. Deze protoplasten bleken lage basale (achtergrond) P f niveaus 7 en kan dienen als een functionele expressiesysteem reproduceerbare P f maatvoering.
Protoplasten van een volwassen blad van een 6 weken oude Arabidopsis planten werden geïsoleerd en drie gen-constructen met AQP genen van Arabidopsis (AtPIP2; 1) en maïs (ZmPIP1, 2 en ZmPIP2; 4) waren kortstondig (en afzonderlijk) uitgedrukt met behulp van de PEG-transformatie Werkwijze 15. Ervan uitgaande dat bij transformatie simultaan voor een groot aantal plasmiden toegepast op de cel ongeacht de aard en van de resultaten die voor 100% succes gebleken voor gesynchroniseerde transiënte expressie van twee plasmiden in een cel eerder gerapporteerd voor andere plantensystemen15,16, ze co-getransformeerd met een vector die codeert voor het versterkte groen fluorescent proteïne (eGFP) om de getransformeerde protoplasten (figuur 7) label.
Voor de P f assays, werden protoplasten in de experimentele kamer (Figuur 1B) en GFP gemerkte protoplasten videobewaking maar wacht aanvankelijk gespoeld met de isotone oplossing (600 mOsm), daarna met hypotone oplossing (500 mOsm), met de perfusie (figuur 1A).
Het tijdsverloop van de cel volume veranderingen (Figuur 8A) werden verkregen voor elke cel in twee fasen: de eerste, de 'Afbeelding Explorer' en 'Protoplast Analyzer' plugins werden gebruikt om het tijdsverloop van de veranderingen in de cel contouren genereren (Figuur 2) dan het Matlab fitting programma P f Fit (figuur 5) werd gebruikt importeren these gebieden en ze converteren naar mobiele volumes. De P f-waarden (Figuur 8C) werden afgeleid voor elke cel met de P f Fit programma (Figuur 5), gebaseerd op het tijdsverloop van de cel volumes en bovendien op de ingevoerde gemiddelde tijdsverloop van de verandering van de transmittantie Indicator Dye (figuur 3), omgezet in het tijdsverloop van de indicatorkleurstof concentratieveranderingsratio (Figuur 4A) en vervolgens - het tijdsverloop van het bad osmolariteit verandering (figuren 4B, 6A en 8B). Opgemerkt zij, dat Delc het verschil in osmotische concentratie in de cel (Cin) en in het bad (Cuit), dwz. De drijvende kracht voor de watertoevoer, wijten was bijna alleen de verandering van Cout (figuur 6A ). In dit experiment, P f steeg in de assay (figuur 6B).
De P f f van de controle cel getransformeerd met GFP alleen (Figuur 8C).
Figuur 1: De volume-testsysteem. (A) De experimentele opstelling: Het perfusiesysteem bevat oplossing reservoirs (infusie kolommen 'Cols'), buis (T), kleppen (V) en een peristaltische pomp (P) verbonden met de plexiglas dia die op de microscoop tafel. HS = hypotone oplossing isotoon oplossing Cm camera. (B) is een vergroot aanzicht van het plexiglas dia met de experimentele kamer (Chr) en de slang verbonden via een inlaat (In) spruitstuk connector. De oplossing wordt aangezogen uit de kamer via een uitlaat (Out) aan de pomp. (C) Een schematische tekening van het plexiglas dia (tegen de klok in: bovenaanzicht, lange-zijaanzicht en korte-zijaanzicht): a = glazen afdekplaat slip, de centrale kamer beneden; b = doorzichtig plakband (tabel 1), die als een bodem voor de inlaat en uitlaat oplossing groeven leiden naar en van de centrale kamer; wanneer de Scotch tape vervangen (slechts af en toe), wordt een gat geknipt in het kader van de kamer; c = een plexiglas blok vastgelijmd aan de dia; d = een stopcontact connector gat. Nummers zijn mm (maar de tekening is niet op schaal). (D) Een vergrote weergave van het middengedeelte van de dia met de transparante afdekking (ook plexiglas) een gedeeltelijke dekking van de centrale kamer (pijlen). (E) Schematische tekening (top en zijaanzichten) van de transparante kap. De afmetingen van de transparante kap hendel (groen plastic D) is arbitrair. Andere bijzonderheden zijn zoals in C.
2 / 51652fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 2: Analyse van de zwelling protoplasten beelden met behulp van de 'Protoplast Analyzer' plugin. (A) een, het eerste beeld van de film met protoplasten, b, zoals in een, maar gele cirkels geven de selectie na het bekijken van de film vóór de contouren gedetecteerd, c, van de eerste tot de laatste het groene cirkels strak volgen de contouren van de "brave" protoplasten die worden geanalyseerd. (B) 'Time'-gangen percelen (met eenheden van het getal op de x-as) van de berekende gebieden binnen de protoplasten contouren (' Area ', in vierkante pixels ), voor elk gevolgd (en genummerd) protoplasttransformatie. (C) De parameters ingang paneel van de 'Protoplast analyzer' plugin. Vier 'detectieparameters' kan worden aangepast aan fine-tunen van de protoplasten detectie algoritme. Het 'aantal grensregio pixels 'Parameter wordt de minimale dikte van de protoplasten contour (standaardwaarde: 5). De parameter 'relatieve gewicht "beïnvloedt de grijswaardedrempel verschil tussen het binnenste protoplast stippellijn de buitenste rand (standaard 2). De 'maximale omtrek verhouding' definieert een drempel voor het uitsluiten van protoplasten wanneer hun vorm afwijkt van een cirkel. Deze parameter is de verhouding van de omtrek protoplast de omtrek van een perfecte cirkel met hetzelfde oppervlak als de protoplast (standaard: 1,05). De 'maximale oppervlakte stijging' (% stijging per tijdstap) parameter sluit protoplasten met contouren stijgt boven de parameter waarde (standaardwaarde: 5%). Tot slot, de plugin behandelt ook kleine protoplasttransformatie bewegingen, maar stopt het bijhouden van protoplasten die snel bewegen of die verdwijnen uit het beeld. De film kan worden herhaald zo vaak als nodig, en een protoplast kan afzonderlijk opnieuw geanalyseerd.com / files / ftp_upload / 51652 / 51652fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: De 'Indicator Fit' panel van de P f Fit programma. Dit deel vertaalt de indicator transmissie tijdsverloop in bad osmolariteit tijdsverloop. (A) Blader naar het opgeslagen bestand met het tijdsverloop van de transmissie veranderingen van de indicator Dye. (B) Of gebruik de eerder opgeslagen lijst van variabelen en parameters, of Plaats handmatig 5 variabelen van het huidige experiment 'true_C_init "en" true_C_end (de osmolarities van de oorspronkelijke badoplossing en P f -assay oplossing geperfuseerd via het bad), "t_start_wash'(De duur van de basislijn bemonstering op de eerste indicator Dye-niveau),' threshold_% '(% van de baseline-waarde, waarbij het programma het vertrek van baseline transmissie automatisch gedetecteerd; 1-5% zijn meestal de meest effectieve),' N_steady_st_pts '(het aantal monsters - met 10 monsters per Indicator Dye afbeelding genomen vertegenwoordigen - worden gemiddeld aan het eind steady state niveau van de indicator Dye, van cruciaal belang voor de omzetting van de Indicator Dye concentratie naar de osmoticum concentratie) en de initiële gissingen voor twee van de vier parameters van de indicator Dye transmissie sigmoidaal tijdsverloop, 'width' en t half (Ruwweg van de duur van het overgangsdeel van de sigmoid, en het middelpunt respectievelijk; t half kan negatief zijn!). Twee best fit parameters naast "breedte" en t helft worden verkregen zonder dat beginschattinges: vertraging ('flush_lag'), de tijd tussen de opening van de afsluiter naar de komst van de oplossing in het bad, en 'C_init', zonder een fysieke betekenis, maar die noodzakelijk zijn voor de beschrijving van de osmolariteit tijdsverloop (zie de Aanvullende P f Fit User Guide.
Figuur 4:. De indicatorkleurstof concentratie in het bad en de osmolariteit van het medium (A) Het tijdsverloop van de indicatorkleurstof concentratie direct berekend uit gegevens (dots) en van de best passende parameters (line) terwijl deze gewassen weg door een niet geverfd oplossing. (B) De berekende tijdsverloop van de verandering osmolariteit van het bad oplossing veronderstelling dat volgt dezelfde dynamiek als de verandering van de indicator kleurstof concentratie.
Figuur 5:. De 'Volume Fit' panel van de P f Fit programma (A) Blader naar het gebied tijdsverloop databestand van de geanalyseerde protoplasten (B) Kies de 'Last Indicatorfitting' optie om het experiment parameters van de te importeren. . laatste run door de 'Indicator Fit' (zie de Aanvullende P f Fit Gebruikershandleiding voor alternatieven) (C) 'Model Type' / 'Klasse': Klasse I omvat de eenvoudigste model 1, Klasse II - modellen 2-5, klasse III - modellen 6 - 8 De modellen verschillen ten aanzien van welke parameters worden vastgesteld en die worden aangepast (dwz, vrij variabel.) tijdens de montage procedure (vink het vakje aan om deze te variëren), en al dan niet ' SlopePf 'en / of' Delay 'is null. De models 1-6 uitvoerig worden besproken door Moshelion et al 11.. 'Combinaties' somt de parameter keuzes bepaald door de keuze van het 'Model Type' / 'Class'. Onder de modellen met een soortgelijke fit resultaat - de eenvoudigste! Initialiseren van de 'P f', 'Slope Pf' ('Slope_Pf') en parameters "Delay" zoals afgebeeld (meer details over 'Vertraging' in E hieronder). (D) De variabelen en parameters het tijdsverloop van de veranderende bad osmoticum beschrijven van zijn inbreng, hetzij handmatig, of zoals beschreven in B. (E) is een interim-plot, ingeroepen door het raken van 'Run', van een tijdsverloop van volume veranderen (berekend van de cel contour gebieden) te helpen bij de keuze van de initiële waarde voor de parameter "Delay". Schatting, door het oog houdende, de totale lengte van de basislijn van de 1 ste punt tot aan de start van de cel volume verandering (de 'inclusief vertraging: de som van "t-start-wash '+' lag '/' flush-lag '+ de" fysiologische "" vertraging "). Steek deze waarde als input parameter voor de 'vertraging' in de 'VolumeFit' paneel en 'Run' weer (zie ook de Aanvullende P f Fit User Guide).
Figuur 6: De resultaten van de fitting (A) "Achter de schermen": de berekende uiteindelijke tijdsverloop van de osmoticum concentraties in de twee compartimenten:. Het bad (Cout, groene lijn) en de cel (Cin, blauwe lijn; Cin is berekend op de protoplast volumeverandering en de veronderstelling dat de plasmamembraan permeabel alleen water - de "perfecte en ware osmometer" 11) en het tijdsverloop van het verschil tussen hen (Delc, Rode lijn), die de drijvende kracht voor waterstroming 'Eo-tlag markeert het einde van het "flush-lag en de start van de hypotone challenge (hier slechts ongeveer 21 sec). Rode doos: de fout van de fit-waarde (fit-ERR, zie definitie in onder B) (B) Het uiteindelijke resultaat van de montage van de volume tijdsverloop;. Groene doos: 'variabelen' zijn de opgenomen via de P f Fit / 'VolumeFit' panel (gedefinieerd in figuur 5A legende) waarden. Black box: 'Exptl-Vol' en 'voorzien-Vol' zijn de experimentele data en het volume dat wordt berekend met behulp van de best-fit parameters, respectievelijk 'Eo-tlag' is hetzelfde als in A, 'Eo-Delay' markeert de Begin volumeverandering. 'Oppervlakte tot 3%' markeert het volume waarop de oppervlakte met 3% gestegen, de vermoedelijke grens aan de celmembraan mogelijkheid om te rekken zonder open te barsten. 'Pf (geschaald)' is het tijdsverloop van de montage-based berekende P f, verspreid over de onder de rode doos als 'Span van P f' aangegeven waarden. Red box: Gepaste PARAMETERS 'zijn de waarden van de best passende parameters:' Pf i '(de oorspronkelijke P f) "vertraging" (de periode tussen het begin van de hypotone uitdaging en de start van de volumeverandering (die volgens het model 5 in dit voorbeeld, is de start van een verandering in de waarde P f), en "slope-P f '(de constante snelheid van verandering in de waarde P f' fit_ERR 'getoond in A. - de minimalisering doelwit van de Matlab fitting procedure - is de "root-mean-square" afwijking (dwz, een wortel van een gemiddeld kwadraat deviatie) van een groene stip van de zwarte lijn), voorgesteld als% van de uitgangswaarde volume It. is deze waarde die het relatieve succes van herhaalde vallend met verschillende parameters initialisatiewaarden wordt beoordeeld. AWaarschuwend: Als de best-fit parameterwaarden het resultaat van een lokaal minimum in de foutminimalisatie procedure kan - te verifiëren dat een globale minimum gevonden verschillende runs nodig met verschillende initialisatie waarden voor deze drie parameters (en de laagste fit_ERR moet tijdens deze pogingen worden gezocht Blauwe doos:. delta's zijn de veranderingen die zich hebben voorgedaan bij het einde van de ingebouwde volume verandering periode: 'gem Volm%' is de relatieve omvang van de berekende protoplast- volume verandering en 'gem Area%' is de relatieve verandering van het protoplast oppervlak. de oorspronkelijke grootte van de cel wordt gegeven door "straal", afgeleid van de gemiddelde waarde van de protoplast basale contourgedeelte.
Figuur 7: Epi-fluorescentie microscopie aanzicht mesofyl protoplasten (A) onder doorgelaten wit licht en (B) bij 488 nm excitatie en 520 nm emissie. Schaalbalk:. 100 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 8:. Volumewijziging en geëxtraheerd osmotische waterdoorlaatbaarheid, P f (A) Tijdsverloop (60 sec) van protoplast zwelling na blootstelling aan hypotone challenge (gemiddelde ± SE) (B) De berekende osmoticum concentratie in het bad tijdens de. hypotone uitdaging. Merk op dat terwijl de hypotonische oplossing stroom werd ingeschakeld op 15 sec, zij het bad pas na eenlag, hier van 5,9 sec. (C) P f (gemiddelde ± SE). Sterretjes geven significante verschillen van controle (p ≤0.05). Gegevens uit ten minste drie onafhankelijke experimenten voor elke behandeling met een totaal van n protoplasten (control: n = 52, AtPIP2, 1: n = 13, ZmPIP1, 2: n = 28, ZmPIP2, 4: n = 34).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschreven is een eenvoudige en zeer efficiënte procedure voor het meten van de P f van geïsoleerde plantenprotoplasten in principe ook toepasbaar op andere bolvormige cellen, bijvoorbeeld., Kikker eicellen 11. Deze methode is gebaseerd op het meten van de P f in reactie op een osmotische uitdaging voor de cel. In tegenstelling tot de andere methoden op basis van deze benadering is echter de verandering van oplossingen, dat wil zeggen van de osmolariteit, niet onmiddellijk, maar geleidelijk gedurende een constante bad perfusie, te beginnen met de isotone oplossing, waarbij het volume basislijn cel vastgesteld. Bovendien is deze methode niet om een zuig pipet en minimaliseert derhalve de verstoring van de protoplasten.
De hier gepresenteerde aanpak maakt metingen van verschillende protoplasten van verschillende planten of weefsels. Maar vanwege de betrokken berekeningen alleen sferische cellen kunnen worden geanalyseerd. Ook de enzymatische isolatie van the protoplasten en de osmolariteit van de oplossingen worden aangepast aan de cellen getest (bijvoorbeeld de enzymatische isolatie van tomaat mesofyl protoplasten duurt ongeveer een uur, veel langer dan bij Arabidopsis protoplasten).
De isolatie van Arabidopsis mesofyl protoplasten volgens de gepresenteerde protocol is eenvoudig, snel en efficiënt, waardoor een groot aantal protoplasten. Met name dit, in combinatie met lage basale niveaus Pf en de hoge transformatie-efficiëntie (figuur 8), vormen ze een aantrekkelijk systeem voor de functionele expressie van AQPs, kwantitatieve vergelijkingen van P f geïnduceerd door verschillende AQP isovormen mogelijk. Bij expressie AQPs in deze protoplasten met een merkergen (bijvoorbeeld GFP), kan men gemakkelijk screenen de protoplasten in de experimentele kamer voor fluorescerende cellen te analyseren.
Het is de moeite waard om na te gaan of dit systeem is een levensvatbare alternative om eicellen te testen AQPs ook uit dierlijke bronnen (die functioneel dierlijke eiwitten kunnen tot expressie worden gebracht in plantencellen is reeds aangetoond 17).
De P f Fit programma twee parameters, naast de P f, verkregen voor de beschrijving van de protoplast antwoorden hypotone uitdagingen: vertragingstijd, de tijd tussen het begin van de volumeverandering en de start van bad perfusie en Slope Pf, de mate van verandering in P f tijdens de osmotische challenge (in detail beschreven in 11).
Voor elke set het volume fitting procedure experimentele gegevens moeten meerdere keren worden uitgevoerd, leveren verschillende beginnend (initialisatie) waarden voor deze parameters, uiteindelijk de keuze van de fit met de laagste fout. Dit foutminimalisatie proces kan worden afgeschilderd als het zoeken naar de diepste dal (een "global minimum") in een landschap van valleien met verschillende dieptes, onder de menseny heuvels, of pogingen niet worden gevangen in een vrij ondiepe vallei (een "lokaal minimum").
Twee typen P f verkregen, P f aan het begin van de hypoosmotic zwelling respons (P f aanvankelijke ') en P f berekend aan het einde van 15 sec zwelling, geteld vanaf de eind de vertraging ('P f uiteindelijke'). Het verschil tussen de twee volledig besproken door Moshelion e.a.. 11, wat de 6 modellen geanalyseerd.
Er zijn twee belangrijke stappen in het protocol: eerste, een goede pasvorm voor het tijdsverloop van de indicatorkleurstof concentratie anderzijds een goede fit voor het tijdsverloop van het volume van de zwelling cel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Nationaal Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FNRS), de Interuniversitaire Attractie Polen Programma-Federaal Wetenschapsbeleid en de "Communaute française de Belgique-acties de Recherches Concertées" om FC, uit de Israel Science Foundation Jeruzalem ( ISF) naar MM (Grant # 1311-1312), en NM (Grant # 1312-1312).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade |
| CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com Any source, anal. grade |
| 2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS002603 | http://www.worthingtonbiochem.com |
| Pectolyase | Karlan, Phonix, AZ, USA | 8006 | http://www.karlan.com |
| Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418-5G | http://www.sigmaaldrich.com |
| Protamine sulphate | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Silicone vacuum grease heavy | Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
| Peristaltic pump | BIO-RAD | EP-1 Econo Pump | http://www.bio-rad.com |
| Grayscale digital camera | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
| CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software |
|
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software |
|
| Econo Gradient Pump Fittings Kit | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
| Connectors, manifold | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S | |
| Burette infusion sets (columns) | Welford | IF-BR-001 | http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 |
| Tubing | TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com |
| 3M packaging Scotch tape 1'', clear | Viking Industrial, UK | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK |
References
- Tyerman, S. D., Niemietz, C. M., Bramley, H. Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles. Plant Cell Environ. 25, 173-194 (2002).
- Maurel, C. Plant aquaporins: Novel functions and regulation properties. Febs Letters. 581, 2227 (2007).
- Maurel, C., Verdoucq, L., Luu, D. T., Santoni, V. Plant aquaporins: Membrane channels with multiple integrated functions. Annual Review of Plant Biology. 59, 595 (2008).
- Chaumont, F., Moshelion, M., Daniels, M. J. Regulation of plant aquaporin activity. Biology Of The Cell. 97, 749-764 (2005).
- Ramahaleo, T., Morillon, R., Alexandre, J., Lassalles, J. P. Osmotic water permeability of isolated protoplasts. Modifications during development. Plant Physiology. 119, 885-896 (1999).
- Suga, S., Murai, M., Kuwagata, T., Maeshima, M. Differences in aquaporin levels among cell types of radish and measurement of osmotic water permeability of individual protoplasts. Plant Cell Physiol. 44, 277-286 (2003).
- Shatil-Cohen, A., Attia, Z., Moshelion, M. Bundle-sheath cell regulation of xylem-mesophyll water transport via aquaporins under drought stress: a target of xylem-borne ABA? The Plant Journal. 67, 72-80 (2011).
- Hachez, C., Moshelion, M., Zelazny, E., Cavez, D., Chaumont, F. Localization and quantification of plasma membrane aquaporin expression in maize primary root: A clue to understanding their role as cellular plumbers. Plant Molecular Biology. 62, 305-323 (2006).
- Hachez, C., Heinen, R. B., Draye, X., Chaumont, F. The expression pattern of plasma membrane aquaporins in maize leaf highlights their role in hydraulic regulation. Plant Molecular Biology. 68, 337-353 (2008).
- Besserer, A., et al. Selective regulation of maize plasma membrane aquaporin trafficking and activity by the SNARE SYP121. The Plant Cell. 24, 3463-3481 (2012).
- Moshelion, M., Moran, N., Chaumont, F. Dynamic changes in the osmotic water permeability of protoplast plasma membrane. Plant Physiology. 135, 2301-2317 (2004).
- Moshelion, M., et al. Membrane water permeability and aquaporin expression increase during growth of maize suspension cultured cells. Plant, Cell & Environment. 32, 1334-1345 (2009).
- Sade, N., et al. Improving plant stress tolerance and yield production: is the tonoplast aquaporin SlTIP2;2 a key to isohydric to anisohydric conversion? New Phytologist. 181, 651-661 (2009).
- Volkov, V., et al. Water permeability differs between growing and non-growing barley leaf tissues. J. Exp. Bot. 58, 377 (2007).
- Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Reports. 21, 865-871 (2003).
- Hosy, E., Duby, G., Véry, A. A., Costa, A., Sentenac, H., Thibaud, J. B. A procedure for localisation and electrophysiological characterisation of ion channels heterologously expressed in a plant context. Plant Methods. 19, (2005).
- Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. Human Recombinant Type I Collagen Produced in Plants. Tissue Eng Part A. 19, 1527-1533 (2013).
