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Biology

Osmotic पानी पारगम्यता गुणांक (पी मापने Published: October 8, 2014 doi: 10.3791/51652
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1
1The RH Smith Institute of Plant Sciences and Genetics in Agriculture, The Hebrew University of Jerusalem, 2Earth and Life Institute, Université catholique de Louvain, 3Institut des Sciences de la Vie, Université catholique de Louvain

Summary

कोशिकाओं की आसमाटिक पानी पारगम्यता गुणांक (पी एफ) को मापने aquaporins के नियामक तंत्र (AQPs) को समझने में मदद कर सकते हैं. यहाँ प्रस्तुत गोलाकार संयंत्र सेल मूलतत्त्वों में पी एफ दृढ़ संकल्प मूलतत्त्वों अलगाव और निरंतर स्नान छिड़काव के दौरान एक आसमाटिक चुनौती का एक परिणाम के रूप में मात्रा परिवर्तन के अपने प्रारंभिक दर के संख्यात्मक विश्लेषण शामिल है.

Abstract

AQP विनियमन तंत्र के अध्ययन के सेलुलर और पूरे संयंत्र स्तर दोनों पर पानी संबंधों की समझ के लिए महत्वपूर्ण है. आसमाटिक पानी पारगम्यता गुणांक संयंत्र मूलतत्त्वों में (पी एफ), ऐसे मेंढक oocytes के रूप में अन्य गोलाकार कोशिकाओं को भी सिद्धांत रूप में लागू के निर्धारण के लिए एक सरल और बहुत ही कुशल विधि यहाँ है प्रस्तुत किया. परख का पहला कदम एक उपयुक्त isotonic समाधान के साथ एक कक्ष में enzymatic पाचन द्वारा ब्याज के संयंत्र के ऊतकों से protoplasts के अलगाव है. दूसरे चरण के लिए एक आसमाटिक चुनौती परख के होते हैं: कक्ष के तल पर स्थिर मूलतत्त्वों एक hypotonic समाधान द्वारा एक isotonic समाधान के साथ एक निरंतर छिड़काव शुरू करने के लिए प्रस्तुत की और पीछा कर रहे हैं. सेल सूजन वीडियो दर्ज की गई है. तीसरे चरण में, छवियों मात्रा परिवर्तन उपज के लिए ऑफ़लाइन कार्रवाई कर रहे हैं, और मात्रा में परिवर्तन के समय पाठ्यक्रम osmola में परिवर्तन के समय के पाठ्यक्रम के साथ जोड़ा जाता हैचैम्बर छिड़काव माध्यम की rity, पी एफ उपज, Matlab ('PfFit') में लिखा एक वक्र ढाले प्रक्रिया का उपयोग कर.

Introduction

सेलुलर झिल्ली भर पानी तेज और प्रवाह सेलुलर और पूरे संयंत्र दोनों स्तरों पर संयंत्र अस्तित्व के लिए एक बुनियादी आवश्यकता है. सेलुलर स्तर पर, aquaporins (AQPs) कोशिका झिल्ली 1-3 की आसमाटिक पानी पारगम्यता गुणांक (पी एफ) के नियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं.

तिथि करने के लिए, कई तरीकों विभिन्न संयंत्र अंगों से मूलतत्त्व की अंतर्जात पी एफ मापने में नियोजित किया गया है (यानी जड़ों, मेज़ोफिल, इंडोडर्मिस, आदि., Chaumont एट अल. 4 द्वारा समीक्षा). पी एफ मापने के तरीकों में से एक एक आसमाटिक चुनौती को मूलतत्त्वों को बेनकाब करने और इसकी मात्रा परिवर्तन की प्रारंभिक दर पर नजर रखने के लिए है (यानी., मात्रा बदलने की जल्दी रैखिक चरण की ढलान). दो अलग अलग तरीकों पहले से समाधान का एक तात्कालिक एक्सचेंज पर इस दृष्टिकोण के आधार पर वर्णित, दोनों आधारित थे. पहले एक immobiliz के होते हैंएक चूषण micropipette साथ मूलतत्त्व आईएनजी और समाधान प्रवाह 5 और एक micropipette 6 का उपयोग कर एक दूसरे के समाधान से मूलतत्त्व के हस्तांतरण की एक दूसरे स्विचन. तेजी से समाधान विनिमय के बहुत शुरू में छवि अधिग्रहण की अनुमति जो इन micropipette सक्शन और micropipette स्थानांतरित तरीकों, संभावना मूलतत्त्वों को एक शारीरिक तनाव को शामिल, (मात्रा बदलने की जल्दी रैखिक चरण पर कब्जा करने के लिए) और विशेष उपकरण और विशेषज्ञ micromanipulation की आवश्यकता है.

यहाँ वर्णित विधि कोई micromanipulation शामिल है और स्नान छिड़काव तात्कालिक नहीं है जब पी एफ की व्युत्पत्ति परमिट, कोशिकाओं को अशांति को कम करता है.

Enzymatic पाचन के बाद, एक isotonic समाधान में डूबे हुए मूलतत्त्वों,, प्रभारी बातचीत से coverslip गिलास एक Plexiglass के नीचे (उर्फ Lucite या कड़ा) चैम्बर पर स्थिर रहे. फिर, एक निरंतर स्नान छिड़काव के दौरान,isotonic समाधान मूलतत्त्वों को एक hypoosmotic चुनौती पैदा एक hypotonic समाधान से दूर प्लावित है. मूलतत्त्व की सूजन वीडियो दर्ज की गई और फिर, स्नान छिड़काव के समय पाठ्यक्रम और सेल सूजन के समय के पाठ्यक्रम के बारे में जानकारी के संयोजन से, पी एफ इमेज प्रोसेसिंग और वक्र ढाले प्रक्रियाओं द्वारा निर्धारित किया जाता है.

इस विधि का लाभ, प्रयोग बहुत ही कुशल है कि यह एक एकल परख में एक साथ कुछ कोशिकाओं पर नजर रखने के लिए संभव है, और यह विशेष उपकरण या विशेष micromanipulation कौशल की आवश्यकता नहीं है कि अर्थात्. इस विधि के लिए कई आवेदन संभव हो रहे हैं. उदाहरण के लिए, ऐसे मेज़ोफिल के रूप में विभिन्न ऊतकों और पौधों से कोशिकाओं की एक किस्म के देशी पी एफ के दृढ़ संकल्प और Arabidopsis पत्ता 7, मक्का पत्ती मेज़ोफिल या जड़ प्रांतस्था कोशिकाओं 8-10 या निलंबन संवर्धित कोशिकाओं 11,12 से म्यान कोशिकाओं बंडल. Additi मेंपर, यह इस तरह के oocyte कोशिकाओं के रूप में 11 गोलाकार पशु कोशिकाओं के पी एफ निर्धारित करने के लिए संभव है. पी एफ के लिए उनके योगदान की और दृढ़ संकल्प, एक और उदाहरण protoplasts (जैसे, kinases का जीन या किसी भी अन्य जीनों उन्हें प्रभावित कर सकता है) में उनके जीन की क्षणिक अभिव्यक्ति द्वारा AQP गतिविधि की परीक्षा शामिल है; 2 खूंटी परिवर्तन और दृढ़ संकल्प SlTIP2 द्वारा Arabidopsis मेज़ोफिल मूलतत्त्वों में; उदाहरण, टमाटर AQP SlTIP2 की अभिव्यक्ति के लिए 13 एफ पी 2 से संबंधित. अंत में, (आदि दवाओं, हार्मोन,) विभिन्न अणुओं / पदार्थों के पी एफ पर प्रभाव की परीक्षा भी AQP अवरोधक HgCl 2 7 के उदाहरण के लिए, जांच की जा सकती समाधान के लिए कहा.

निम्नलिखित प्रोटोकॉल Arabidopsis मेज़ोफिल कोशिकाओं और उनके पी एफ के दृढ़ संकल्प की protoplasts के अलगाव का वर्णन है.

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Protocol

समाधान की 1. तैयारी

  1. तैयार isotonic (600 mOsm) और hypotonic 10 मिमी KCl, 1 मिमी 2 CaCl, और युक्त (500 mOsm) समाधान 8 एम 2 (एन morpholine) -ethanesulphonic एसिड (एमईएस), पीएच 5.7 और की उचित मात्रा के साथ परासारिता समायोजित डी sorbitol: isotonic और hypotonic समाधान के लिए 440 मिमी के लिए 540 मिमी. एक osmometer का उपयोग (लक्ष्य मूल्य का 3% के भीतर) समाधान के परासारिता सत्यापित करें.
  2. निम्नलिखित एंजाइमों युक्त 'एंजाइमी मिश्रण' की एक सूखी स्टॉक तैयार:, 0.55 ग्राम cellulase, 0.1 ग्राम pectolyase, 0.33 ग्राम Polyvinylpyrrolidone कश्मीर में 30, 0.33 ग्राम बीएसए (देखें टेबल के नीचे 1) भंवर से शुष्क पाउडर मिश्रण, 5.7 मिलीग्राम aliquots बनाने और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.

Arabidopsis मेसोफिल protoplasts के 2 अलगाव

  1. लगभग 6 बूंदों के साथ एक पेट्री डिश (10 सेमी) तैयार (लगभग. 30 μl प्रत्येक) isotonic समाधान की.
  2. पील abaxial (कम) Arabidopsis पत्ता एपिडर्मिस, गतो समाधान छू नीचे उजागर abaxial पक्ष के साथ चला जाता है isotonic समाधान पर चौकों जगह है, के बारे में 4 x 4 मिमी 2 के वर्गों में खुली पत्ती ut.
  3. , 165 μl में एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में isotonic समाधान (w / डब्ल्यू 3.3%) एंजाइम मिश्रण की 5.7 मिलीग्राम भंग भंग जब तक एक मिनट के लिए या तो pipetting द्वारा धीरे मिश्रण, और एक ही पेट्री में एंजाइमी समाधान के कई समान बूँदें जगह पकवान.
  4. , 28 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक नहाने के पानी में पकवान चल, Parafilm के एक दौर के साथ ढक्कन सील पकवान बंद करें और 20 मिनट के लिए सेते बूँदें एंजाइमी समाधान पर पत्ता टुकड़े स्थानांतरण.
  5. डिश isotonic समाधान के अधिक कई बूँदें (प्रत्येक एंजाइम समाधान बूंद प्रति 2 बूँदें) जोड़ें. एक नए isotonic समाधान ड्रॉप करने के लिए प्रत्येक पत्ती टुकड़ा स्थानांतरण, तो, क्रमिक रूप से, एक दूसरे ड्रॉप करने के लिए (दूर एंजाइमी समाधान धोने के लिए). , संदंश का उपयोग कर अपनी बढ़त से टुकड़ा उठा यह मूलतत्त्वों जारी करने के लिए (एक चाय बैग) की तरह दूसरे ड्रॉप में हिला.एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में (एक से काटा 100 μl विंदुक टिप का उपयोग) protoplasts साथ बूंदों लीजिए.

3 Hypotonic चैलेंज परख: Arabidopsis मेसोफिल सेल सूजन

  1. Hypotonic समाधान के साथ isotonic समाधान और एक और स्तंभ के साथ एक कॉलम भरने के द्वारा छिड़काव प्रणाली (चित्रा 1 ए) तैयार करें. नीचे इनलेट कई गुना (चित्रा 1 बी) के लिए ट्यूबिंग सभी तरह भरने के लिए कुछ समाधान प्रवाह (पहली hypotonic, तो isotonic), वाल्व खोलते हैं. कोई फँस हवा बुलबुले हैं सुनिश्चित करें, और फिर वाल्व बंद करें.
  2. (; भी चित्रा 1C में चैम्बर के schematics देख चित्रा 1 बी) Plexiglass स्लाइड के भीतर कक्ष के लिए एक नीचे करने के लिए, सिलिकॉन तेल (1 टेबल) का उपयोग करते हुए, एक coverslip सील. मूलतत्त्वों, कोट के लिए "चिपचिपा" (तेल रिंग के भीतर coverslip के ऊपर की ओर का सामना करना पड़ उजागर सतह) चैम्बर नीचे बनाने के लिएया पाली एल Lysine (पानी में 0.1%, 1 टेबल), सकारात्मक प्रभारी असर protamine सल्फेट (1 टेबल पानी में 1%) के साथ. , 2 मिनट कुल्ला 3 - 1 - के लिए प्रतीक्षा, एक विंदुक टिप का उपयोग coverslip पर इस 'गोंद' बिखरा 4 बार isotonic समाधान के साथ और शेष समाधान दूर हिला.
  3. Isotonic समाधान के साथ चैम्बर भरें. फिर, एक से काटा पिपेट टिप का उपयोग, कक्ष का हल युक्त protoplasts की एक बूंद को जोड़ने और 3 प्रतीक्षा - मूलतत्त्वों व्यवस्थित करने के लिए 4 मिनट. एक पारदर्शी कवर (आंकड़े -1 डी, 1E) के साथ चैम्बर (नीचे हवा के बुलबुले फँसाने बचने) समाधान सतह को छू कवर.
  4. (तेज दरें, एक औंधा माइक्रोस्कोप मेज पर! (धीरे) स्लाइड प्लेस छिड़काव प्रणाली और (ट्यूबिंग! में हवा के बुलबुले के खिलाफ रखवाली) पंप से कनेक्ट करने और / मिनट 1 मिलीलीटर में लगातार छिड़काव के लिए isotonic समाधान प्रवाह पर बारी 4 मिलीग्राम / मिनट) तक इस्तेमाल किया जा सकता है.
  5. रिकॉर्डिंग के लिएमात्रा में परिवर्तन, एक औंधा माइक्रोस्कोप एक 20x उद्देश्य के साथ और एक पीसी कंप्यूटर से जुड़ा एक सीसीडी वीडियो कैमरे के साथ प्रयोग किया जाता है. चयनित स्थिर protoplasts के एक 60 सेकंड के वीडियो फिल्म को रिकॉर्ड करने के लिए ImageJ सॉफ्टवेयर का 'सीएमयू 1394 कैमरा चालक' प्लगइन (इन दो सॉफ्टवेयर के टुकड़े के डाउनलोड पतों के लिए विशिष्ट सामग्री की तालिका देखें) का प्रयोग करें (संभवतः, नीचे करने के लिए अटक उन) 1 छवि / सेक (1 हर्ट्ज) की दर से. Isotonic समाधान की एक 15 सेकंड धोने के साथ रिकॉर्डिंग (इस आधारभूत गठन) को प्रारंभ करें, 45 सेकंड के लिए hypotonic समाधान करने के लिए स्विच (छिड़काव की शुरुआत से कुल 60 सेकंड पूरा करने के लिए). TIF स्वरूप में फिल्म को बचाने. नोट: उनकी सबसे बड़ी परिधि (2A चित्रा) में आकार में और एक अच्छी तरह से ध्यान केंद्रित सेल समोच्च साथ गोलाकार: निम्नलिखित मानदंडों को पूरा करने के रूप में संभव के रूप में कई कोशिकाओं, के साथ एक दृश्य के क्षेत्र चुनें.

ImageJ का उपयोग सेल मात्रा बदलने के 4 विश्लेषण

नोट: विश्लेषण करने के लिएएक सूजन सेल की छवियों की श्रृंखला, 'छवि एक्सप्लोरर' और (जेवियर Draye द्वारा लिखित) ImageJ सॉफ्टवेयर 14 में 'हेतु प्रोटोप्लास्ट विश्लेषक' प्लगइन्स का उपयोग करें. उनकी पहली बार बिंदु पर चुना protoplasts के साथ शुरू, 'हेतु प्रोटोप्लास्ट विश्लेषक' प्लगइन स्वचालित रूप से मूलतत्त्वों किनारों (आकृति) की पहचान करेगा और (प्लगइन्स नीचे, PfFit विश्लेषण कार्यक्रम के साथ उपलब्ध हैं) प्रयोग के दौरान अपने क्षेत्रों की समय पाठ्यक्रम की गणना .

  1. ImageJ शुरू करो. वे प्रकट रूप में फिल्म खोलने के लिए, लटकती मेनू पर लगातार, तो, ImageJ पैनल पर 'फाइल' पर क्लिक करें: 'आयात' फिर 'छवि एक्सप्लोरर'. चुने हुए फिल्म को हाइलाइट करें, तो उस पर राइट क्लिक करें, तो 'हेतु प्रोटोप्लास्ट विश्लेषक' पर क्लिक करें छोड़ दिया. प्रयोग के दौरान बड़े पैमाने पर स्थिर बने हुए हैं कि protoplasts की पहचान करने के लिए (मूलतत्त्व छवि तल पर एक स्लाइडर का उपयोग) फिल्म के माध्यम से ब्राउज़ - इन विश्लेषण किया जाएगा. वापस पहले भारतीय सैन्य अकादमी परजीई, माउस का उपयोग कर, फिर दिखाई दिया कि 'जांच मापदंडों' की तालिका में 'ठीक' पर क्लिक करें, चयनित protoplasts (चित्रा 2 बी) के आसपास (ImageJ आरेखण उपकरणों से उठाया) हलकों आकर्षित.
  2. मूलतत्त्व पता लगाने एल्गोरिथ्म का शुभारंभ करने के लिए, लटकती मेनू में तो, मूलतत्त्व छवि शीर्ष पैनल पर 'प्रक्रिया' 'स्थानीय' पर क्लिक करें. फिल्म में चयनित protoplasts (चित्रा -2) के चारों ओर हरी हलकों जांच करते हैं. एक एक्सेल फाइल में 'परिणाम' बचाओ. ImageJ से बाहर निकलें. नोट: एक लाल डॉट प्रकट होता है मामले में (एक बुरा समोच्च फिट से संकेत मिलता है - आम तौर पर होने के कारण एक गरीब छवि के विपरीत करने के लिए) विभिन्न मापदंडों के साथ फिर से दौड़ना,.
  3. प्रत्येक सेल से संबंधित लाइनों को अलग करने के लिए (- दो या अधिक कोशिकाओं को एक साथ विश्लेषण किया गया तो - जो विश्लेषण फ्रेम से फ्रेम किया जाता है, क्योंकि intertwined किया जाएगा), एक्सेल में, सेल नंबर स्तंभ ('वस्तु' से बचाया डेटा सॉर्ट ).
  4. Dete करने के लिए, पी एफ के वास्तविक मूल्य प्राप्त करने के लिए पिक्सेल करने वाली माइक्रोन रूपांतरण कारक rmine वही 20X खुर्दबीन उद्देश्य के माध्यम से एक माइक्रोमीटर शासक की एक छवि तस्वीर. शासक छवि साथ (ImageJ आरेखण उपकरणों से उठाया) एक लाइन खींचें और ImageJ मुख्य पैनल के नीचे शासक लंबाई के लिए पिक्सेल संख्या बराबर पढ़ें. माइक्रोन 2 में एक्सेल फाइल में मनमाना पिक्सेल क्षेत्र मूल्यों में कनवर्ट करें. एक पाठ फ़ाइल के रूप में (प्रत्येक कोशिका अलग के लिए) (नंबर के दो स्तंभों केवल) क्षेत्रों समय पाठ्यक्रम को बचाओ. नोट: यह मात्रा ढाले 'PfFit' कार्यक्रम के लिए एक निवेश होगा.

5 ImageJ और Matlab कार्यक्रम पी एफ फ़िट का उपयोग प्रायोगिक कक्ष में osmolarity परिवर्तन की दर मॉडलिंग

  1. Isotonic समाधान ('सूचक डाई' का उत्पादन करने के लिए) के 100 मिलीलीटर के लिए 2 मिलीग्राम XYLENE cyanol (1 टेबल के नीचे,) जोड़ें.
  2. सूचक डाई और गैर रंगे ज के साथ (3.1 में) छिड़काव प्रणाली तैयार करेंypotonic समाधान.
  3. एक कवर पर्ची (पहले protoplasts के साथ के रूप में) के साथ कवर और खुर्दबीन मंच पर जगह, फिर धीरे सूचक डाई के साथ चैम्बर भरें, plexiglass कक्ष के नीचे करने के लिए सिलिकॉन तेल का उपयोग कर एक कवर पर्ची सील.
  4. छिड़काव प्रणाली और पंप करने के लिए कक्ष कनेक्ट, और एल मिलीग्राम / मिनट पर एक निरंतर छिड़काव के लिए सूचक डाई प्रवाह पर बारी.
  5. 1 हर्ट्ज की दर पर एक 60 सेकंड फिल्म रिकॉर्ड. सूचक डाई के 15 सेकंड के साथ रिकॉर्डिंग शुरू, 45 सेकंड के लिए hypotonic समाधान करने के लिए स्विच. फिल्माने बंद करो. सूचक डाई (कम से कम 30 सेकंड) के साथ फ्लश, तो एक नई फिल्म शुरू करते हैं. 6 बार और सभी फिल्मों को बचाने - के बारे में 5 दोहराएँ
  6. बदलते संप्रेषण के एक औसत समय पाठ्यक्रम प्राप्त करने के लिए सूचक डाई संप्रेषण के वीडियो चित्र का विश्लेषण करने के लिए ImageJ सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें.
    1. ImageJ प्रारंभ, 'फ़ाइल', फिर 'ओपन' पर क्लिक करें, और फिल्म के लिए ब्राउज़ करें. प्रत्येक फिल्म के लिए, एक 10 पिक्सेल व्यापक खड़ी आकर्षितफिल्म के 1 सेंट छवि पर कहीं भी आयत. फिर लटकती मेनू में 'फसल' पर क्लिक करें, ImageJ मुख्य पैनल पर 'छवि' पर क्लिक करें.
    2. 'असेंबल करने' 'ढेर' और (कॉलम 60, पंक्तियों 1): वे प्रकट रूप में फिर से 'छवि' पर क्लिक करें, एक पंक्ति में (60 सेकंड फिल्म के) 60 फ्रेम संरेखित करने के लिए, तो लटकती मेनू में लगातार क्लिक करें. कहीं भी छवियों की पूरी पंक्ति के साथ एक 1 पिक्सेल उच्च क्षैतिज आयत ड्रा और ImageJ मुख्य पैनल में 'विश्लेषण' पर क्लिक करें, फिर लटकती मेनू में 'साजिश प्रोफाइल' पर क्लिक करें. नोट: () नहीं दिखाया दिखाई देगा खिड़की ए 'असेंबल की साजिश', और संप्रेषण डेटा की एक सूची अपने मेनू से खोला जा सकता है. फिल्म के प्रत्येक छवि अपने 10 पिक्सेल व्यापक आयत और फलस्वरूप "समय आधार" में होने वाले 10 संप्रेषण मूल्यों से इस सूची में प्रतिनिधित्व किया है (छवि अनुक्रमिक संख्या) 10 गुना रह गया है.
    3. संप्रेषण DAT की सूची कॉपीएक एक्सेल फाइल करने के लिए एक (फिल्म के प्रति एक सूची). सूचक डाई फ़्लश की कई फिल्मों से प्राप्त संप्रेषण समय पाठ्यक्रम औसत. 0.1 से छवि अनुक्रमिक संख्या गुणा करके एक वास्तविक समय आधार बनाता है. एक पाठ फ़ाइल के लिए औसतन समय पाठ्यक्रम (दो कॉलम) को बचाओ. नोट: औसत से पहले, अगर वांछित, किसी भी अनियमितता को अस्वीकार करने, व्यक्तिगत समय पाठ्यक्रम साजिश है. फिल्म सूचक डाई स्थिर राज्य संप्रेषण का कम से कम 5 अंतिम सेकंड में शामिल हैं सुनिश्चित करें.
  7. परासारिता समय पाठ्यक्रम के विभिन्न मापदंडों की गणना करने के लिए Matlab फिटिंग कार्यक्रम पी एफ फ़िट ('संकेतक फिट' पैनल, चित्रा 3) को प्रारंभ करें. नोट: स्नान में समाधान के ज्ञात प्रारंभिक और अंतिम सांद्रता पर आधारित, समाधान की बदलती आसमाटिक एकाग्रता का समय निश्चित रूप से यह मानते हुए, (सूचक डाई संप्रेषण से, बारी में, गणना) एकाग्रता समय पाठ्यक्रम से गणना की है के रूप में एक ही गतिशीलता इस प्रकार हैडाई एकाग्रता. पी एफ फ़िट नि: शुल्क उपयोग के लिए उपलब्ध एक कार्यक्रम है. पी एफ फ़िट कार्यक्रम के साथ उपयोगकर्ता को परिचित करने में मदद करता है जो एक पूरक फ़ाइल के रूप में जौव के माध्यम से पहुँचा जा सकता है विस्तृत व्याख्या और परिभाषा के साथ पी एफ फ़िट उपयोगकर्ता गाइड ':' PfFit_Installer_web.exe 'से डाउनलोड किया जा सकता है.
  8. 'संकेतक फिट' पैनल में, सूचक डाई संप्रेषण ('संकेतक डेटा फ़ाइल', चित्रा 3 ए) का मतलब समय निश्चित रूप से डेटा आयात और मैन्युअल वर्तमान प्रयोग मापदंडों और मानकों 'चौड़ाई' और 'के प्रारंभिक अनुमान डालें t_half सूचक डाई एकाग्रता के समय पाठ्यक्रम के भूखंडों (वास्तविक डेटा और फिट, चित्रा -4 ए) देखने के लिए भागो '' सूचक डाई एकाग्रता (चित्रा 3 बी के समय के पाठ्यक्रम का वर्णन. क्लिक करें ', और मॉडलिंग की (गणना) स्नान के परासारिता (चित्रा 4 बी) नोट:. एजीडेटा को ई फिट आवश्यक है (एक सिफारिश: 3 चित्र में दिखाया मूल्यों के साथ शुरू).

6 Matlab फिटिंग कार्यक्रम पी एफ फ़िट का उपयोग पी एफ निर्धारण

नोट: एक सच्चे और सही osmometer 11 के रूप में एक मूलतत्त्व के व्यवहार के संबंध में बुनियादी मान्यताओं के अतिरिक्त, पी एफ के निर्धारण पी एफ पी एफ के इस गतिशीलता समय underlies कि, समय के साथ बदल सकते हैं कि धारणा पर टिकी हुई है सेल मात्रा परिवर्तन के पाठ्यक्रम और कहा कि तीन मानकों यह वर्णन करने के लिए पर्याप्त है: पी फाई (पी एफ की प्रारंभिक मूल्य), ढलान पीएफ (पी एफ के रैखिक परिवर्तन की दर) और विलंब (स्नान का शुरू से ही अवधि सेल मात्रा परिवर्तन की शुरुआत तक परासारिता परिवर्तन). विभिन्न मॉडलों शून्य मान 11 सहित विभिन्न इन मानकों का संयोजन और उनके मूल्यों, सहित परीक्षण किया जा सकता है. पी 11, गणना की प्रयोगात्मक समय पाठ्यक्रम का सबसे वफादार प्रजनन, बारी में, सेल समोच्च क्षेत्रों की आयातित श्रृंखला से (देखें यह भी पूरक 'पी एफ फ़िट उपयोगकर्ता गाइड').

  1. 'वॉल्यूम फिट' पैनल (चित्रा 5) के लिए स्विच करें. आयात के लिए क्षेत्रों डेटा फ़ाइल (विश्लेषण किया protoplasts, चित्रा 5A की 'क्षेत्रों' के समय के पाठ्यक्रम के साथ पाठ फ़ाइल) चुनें. पैरामीटर स्रोत के रूप में 'अंतिम संकेतक फिटिंग' चुनें (चित्रा 5 ब, विकल्प के लिए 'पी एफ फ़िट उपयोगकर्ता गाइड' देखें). नोट: इन मानकों (चित्रा 5D) तो प्रक्रिया ढाले संस्करणों के लिए स्नान में osmoticum परिवर्तन पुनर्जीवित करने के लिए उपयोग किया जाता है.
  2. 'वॉल्यूम फिट' पैनल (चित्रा 5C) में, इनिशियलाइज़ (के लिए प्रारंभिक अनुमान) पी एफ मापदंडों में भरें: पी एफ, ढाल पीएफ और विलंब (एक सिफारिश:, मॉडल 'क्लास' चुना क्रमशः 1, 1, और 30) के साथ शुरू (एक सिफारिश: द्वितीय और मार्क के साथ शुरू सभी तीन मानकों के लिए 'चेक') लगाया जा सके. फिर अंतरिम आंकड़ा (चित्रा 5E) नेत्रगोलक और अगर जरूरत देरी पैरामीटर और रिकॉर्ड की लंबाई, समायोजित, 'भागो' पर क्लिक करें.
  3. फिट गुणवत्ता का मूल्यांकन और फिट त्रुटि रिकॉर्ड करने के लिए परिणामों ग्राफ (चित्रा 6) की जाँच करें. कुछ प्रत्येक गुना आरंभ मापदंडों को बदलने, और ''Run रहे हैं. नोट: कार्यक्रम अटक जाता है जब निराश न हो - बस कार्यक्रम को पुनः आरंभ!
  4. फिट त्रुटि की सबसे कम मूल्य के लिए लक्ष्य, आरंभीकरण पैरामीटर के विभिन्न संयोजनों के साथ शुरू, इस प्रक्रिया को कई बार दोहराएं.
  5. स्क्रीन से सीधे फिट परिणामों की सूची की प्रतिलिपि बनाएँ, या टी में उन्हें लगता हैवह '_FIT_Vol_Results.txt' फ़ाइल जनित PfFit.

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Representative Results

अलग AQPs की गतिविधि पी एफ का निर्धारण और तुलना करने के लिए, Arabidopsis पत्ती से मेज़ोफिल मूलतत्त्वों किया जाता है. इन मूलतत्त्वों कम बेसल (पृष्ठभूमि) पी एफ स्तर 7 पाया गया और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पी एफ माप सक्षम करने के लिए एक कार्यात्मक अभिव्यक्ति प्रणाली के रूप में सेवा कर सकते हैं.

एक 6 सप्ताह पुराने Arabidopsis संयंत्र से एक परिपक्व पत्ती से protoplasts अलग थे और तीन जीन Arabidopsis से AQP जीन के साथ constructs (AtPIP2; 1) और मक्का (ZmPIP1, 2 और ZmPIP2, 4) (अलग से) और क्षणिक थे खूंटी परिवर्तन का उपयोग व्यक्त विधि 15. सिंक्रनाइज़ के लिए परिवर्तन की घटना की सूचना एक कक्ष में दो plasmids के क्षणिक अभिव्यक्ति अन्य संयंत्र प्रणालियों के लिए पहले से एक 100% सफलता की दर से पता चला है, जो परिणामों पर उनके स्वभाव की परवाह किए बगैर सेल करने के लिए आवेदन किया है और आधारित प्लास्मिड की एक बड़ी संख्या के लिए एक साथ है यह मानते हुए कि15,16, वे तब्दील protoplasts (चित्रा 7) लेबल के क्रम में बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) एन्कोडिंग एक वेक्टर के साथ सह तब्दील हो गया.

पी एफ assays के लिए, protoplasts प्रायोगिक कक्ष (चित्रा 1 बी) में स्थापित किए गए थे और वे isotonic समाधान (600 mOsm), तो hypotonic समाधान के साथ (500 mOsm) के साथ शुरू में प्लावित कर रहे थे, जबकि मूलतत्त्वों लेबल GFP वीडियो द्वारा निगरानी की गई, छिड़काव प्रणाली (चित्रा 1 ए) का उपयोग.

पहला, 'छवि एक्सप्लोरर' और 'हेतु प्रोटोप्लास्ट विश्लेषक' प्लगइन्स सेल समोच्च क्षेत्र में परिवर्तन के समय पाठ्यक्रम उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया (चित्रा: सेल मात्रा परिवर्तन (चित्रा 8A) के समय पाठ्यक्रम दो चरणों में प्रत्येक कक्ष के लिए प्राप्त किया गया 2), तो, Matlab फिटिंग कार्यक्रम पी एफ फ़िट (चित्रा 5) thes आयात करने के लिए इस्तेमाल किया गया थाई क्षेत्रों और सेल संस्करणों के लिए उन्हें बदलने. पी एफ मूल्यों (चित्रा 8C) सूचक का संप्रेषण परिवर्तन की आयातित औसतन समय पाठ्यक्रम पर, इसके साथ ही, सेल संस्करणों के समय के पाठ्यक्रम पर आधारित पी एफ फ़िट प्रोग्राम का उपयोग कर प्रत्येक कक्ष (चित्रा 5), के लिए ली गई है और कर रहे थे डाई (चित्रा 3), सूचक डाई एकाग्रता परिवर्तन के समय के पाठ्यक्रम में कनवर्ट तो (चित्रा -4 ए) और - स्नान परासारिता परिवर्तन (आंकड़े 4 बी, 6A और 8B) के समय के पाठ्यक्रम के लिए. यह delC, सेल (सिनेमा) में आसमाटिक सांद्रता में अंतर और स्नान (अदालत), यानी. में, पानी बाढ़ के लिए प्रेरणा शक्ति, लगभग केवल कोर्ट की परिवर्तन (चित्रा 6A की वजह से था कि ध्यान देने योग्य है ). इस प्रयोग में, पी एफ परख (चित्रा 6B) के दौरान वृद्धि हुई है.

पी एफ (चित्रा 8C) के साथ बदल नियंत्रण सेल के पी एफ की तुलना में काफी अधिक थे.

चित्रा 1
चित्रा 1: मात्रा परख प्रणाली. (ए) प्रयोगात्मक स्थापना: छिड़काव प्रणाली समाधान जलाशयों में शामिल है (अर्क कॉलम, 'कर्नल') माइक्रोस्कोप मेज पर सेट Plexiglass स्लाइड से जुड़े, ट्यूबिंग (टी), वाल्व (वी) और एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप (पी). एच एस = hypotonic समाधान, isotonic समाधान, मुख्यमंत्री कैमरा. (बी) प्रायोगिक कक्ष (CHR) और एक इनलेट (में) कई गुना कनेक्टर के माध्यम से संलग्न ट्यूबिंग साथ Plexiglass स्लाइड के एक बढ़े हुए दृश्य है. समाधान पंप करने के लिए एक दुकान (से) के माध्यम से कक्ष से चूसा है. (सी) एक योजनाबद्ध ड्राइंग की Plexiglass स्लाइड (वामावर्त: शीर्ष देखने के लिए, लंबे समय की ओर देखने और कम साइड देखें): एक = गिलास को कवर पर्ची, केंद्रीय कक्ष नीचे; बी = स्पष्ट चिपकने वाला टेप (1 टेबल), के लिए और केंद्रीय कक्ष से प्रमुख इनलेट और आउटलेट समाधान खांचे के लिए एक नीचे के रूप में सेवारत; स्कॉच टेप (कभी कभी ही) बदला गया है, जब एक छेद चैम्बर के तहत उस में कट जाता है; सी स्लाइड से चिपके एक Plexiglass ब्लॉक =; डी एक दुकान कनेक्टर छेद =. नंबर मिमी (लेकिन ड्राइंग पैमाने पर नहीं है). (डी) को आंशिक रूप से केंद्रीय कक्ष (तीर) को कवर (भी plexiglass) पारदर्शी कवर के साथ स्लाइड के मध्य भाग के एक बढ़े हुए देखें. (ई) योजनाबद्ध ड्राइंग (शीर्ष और पक्ष विचारों) पारदर्शी कवर की. पारदर्शी कवर संभाल (डी में हरी प्लास्टिक) का आकार मनमाना है. अन्य विवरण सी के रूप में कर रहे हैं

2 / 51652fig2highres.jpg "चौड़ाई =" 500 "/>
चित्रा 2: 'हेतु प्रोटोप्लास्ट विश्लेषक' प्लगइन का उपयोग कर protoplasts छवियों सूजन का विश्लेषण. आकृति पिछले छवि तक पहले से,, सी स्वतः डिटेक्ट कर रहे हैं इससे पहले कि (ए) एक, एक के रूप में मूलतत्त्वों, बी, के साथ फिल्म की पहली छवि है, लेकिन पीला हलकों, फिल्म की समीक्षा करने के बाद किए गए चयन का संकेत हरी हलकों कसकर विश्लेषण के दौर से गुजर "अच्छी तरह से व्यवहार" protoplasts की आकृति का पालन करें. (बी) वर्ग पिक्सल में एरिया ',' मूलतत्त्व आकृति के भीतर गणना क्षेत्रों की ((भुज पर छवि संख्या की इकाइयों के साथ) Time' पाठ्यक्रम भूखंडों ' ), प्रत्येक ट्रैक (और गिने) मूलतत्त्व के लिए. (सी) 'हेतु प्रोटोप्लास्ट विश्लेषक' प्लगइन के मापदंडों के इनपुट पैनल. चार 'का पता लगाने के मापदंडों' ठीक धुन मूलतत्त्व पता लगाने एल्गोरिथ्म के लिए समायोजित किया जा सकता है. सीमा पिक्सल का 'नंबर 'पैरामीटर मूलतत्त्व समोच्च की न्यूनतम मोटाई सेट (डिफ़ॉल्ट मूल्य: 5). 'रिश्तेदार' वजन पैरामीटर भीतरी मूलतत्त्व क्षेत्र और बाहरी सीमा के बीच ग्रे स्तर दहलीज अंतर (डिफ़ॉल्ट: 2) को प्रभावित करती है. 'अधिकतम परिधि अनुपात' उनके आकार एक वृत्त से भटक जब भी मूलतत्त्वों को छोड़कर के लिए एक सीमा निर्धारित करता है. यह पैरामीटर मूलतत्त्व के रूप में एक ही क्षेत्र (1.05 डिफ़ॉल्ट) होने के एक पूर्ण चक्र की परिधि को मूलतत्त्व परिधि का अनुपात है. 'अधिकतम क्षेत्र में वृद्धि' पैरामीटर (समय कदम प्रति% वृद्धि) पैरामीटर मूल्य से ऊपर समोच्च क्षेत्र बढ़ जाती है (5% डिफ़ॉल्ट मान) के साथ मूलतत्त्वों शामिल नहीं है. अंत में, प्लगइन भी छोटे मूलतत्त्व आंदोलनों संभालती है, लेकिन तेजी से स्थानांतरित या कि छवि क्षेत्र से गायब हो जाते हैं कि मूलतत्त्वों ट्रैकिंग बंद हो जाएगा. फिल्म के रूप में आवश्यक कई बार के रूप में फिर से दौड़ना किया जा सकता है, और एक ही मूलतत्त्व अलग reanalyzed किया जा सकता है.कॉम / फ़ाइलें / ftp_upload / 51652 / 51652fig2highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3: पी एफ फ़िट कार्यक्रम का 'संकेतक फिट' पैनल. यह हिस्सा स्नान परासारिता समय पाठ्यक्रम में सूचक संप्रेषण समय बेशक अनुवाद. (ए) सूचक डाई का संप्रेषण परिवर्तन के समय पाठ्यक्रम युक्त बचाया डेटा फ़ाइल के लिए ब्राउज़ करें. (बी) किसी भी चर और मापदंडों के पहले से बचाया सूची का उपयोग करें, या वर्तमान प्रयोग के मैन्युअल 5 चर मान डालें: 'true_C_init' और 'true_C_end' (प्रारंभिक स्नान समाधान और स्नान के माध्यम से perfused पी एफ -assay समाधान की osmolarities), 't_start_wash'(प्रारंभिक सूचक डाई स्तर पर आधारभूत नमूने की अवधि),' threshold_% '(प्रोग्राम स्वचालित रूप से आधारभूत संप्रेषण से प्रस्थान का पता लगाता है, जिस पर आधारभूत मूल्य का%,, 1 - 5% आमतौर पर सबसे अधिक प्रभावी रहे हैं),' N_steady_st_pts '(नमूनों की संख्या - ले जाया हर सूचक डाई छवि का प्रतिनिधित्व 10 नमूनों के साथ - सूचक डाई के अंत स्थिर राज्य स्तर पर औसतन होने के लिए, osmoticum एकाग्रता के लिए सूचक डाई एकाग्रता के रूपांतरण के लिए महत्वपूर्ण) दो के लिए और प्रारंभिक अनुमान सूचक डाई संप्रेषण sigmoidal समय पाठ्यक्रम के चार मापदंडों की, 'चौड़ाई' और टी आधा (मोटे तौर पर अवग्रह के संक्रमण भाग की अवधि से संबंधित है, और क्रमशः अपने मध्य, के लिए; टी आधा नकारात्मक हो सकता है!). 'चौड़ाई' और टी आधे के अलावा दो सबसे अच्छा फिट मापदंडों, प्रारंभिक अनुमान के लिए आवश्यकता के बिना प्राप्त कर रहे हैंतों: परासारिता समय पाठ्यक्रम का विवरण (पूरक पी देखने के लिए एक भौतिक अर्थ के बिना अंतराल ('flush_lag'), स्नान के समाधान के आगमन के लिए वाल्व खोलने के बीच का समय, और 'C_init', लेकिन आवश्यक च फ़िट प्रयोक्ता गाइड.

चित्रा 4
चित्रा 4:. स्नान में सूचक डाई एकाग्रता और मध्यम के परासारिता (ए) सूचक डाई एकाग्रता का समय बेशक, डेटा (डॉट्स) से सीधे गणना की और इसे धोया जाता है के रूप में सबसे फिट मानकों (लाइन) से इसे दूर सूचक डाई एकाग्रता के परिवर्तन के रूप में ही गतिशीलता निम्नानुसार मानते हुए एक गैर रंगे समाधान. (बी) स्नान समाधान की परासारिता परिवर्तन की गणना समय बेशक, से.

चित्रा 5 चित्रा 5:. पी एफ फ़िट कार्यक्रम का 'वॉल्यूम फिट' पैनल (ए) का विश्लेषण किया मूलतत्त्व के क्षेत्र समय बेशक डेटा फ़ाइल के लिए ब्राउज़ (ख) 'फिटिंग अंतिम संकेतक' चुनें विकल्प से प्रयोग पैरामीटर आयात करने के लिए. . 'संकेतक फिट' (विकल्प के लिए पूरक पी एफ फ़िट उपयोगकर्ता गाइड देखें) (सी) के 'मॉडल प्रकार' / 'क्लास' के माध्यम से पिछले चलाने: कक्षा मैं सरल मॉडल 1 शामिल हैं, कक्षा द्वितीय - मॉडल 2 - 5, कक्षा तृतीय - मॉडल 6 - 8 मॉडल पैरामीटर तय की और जो समायोजित किया जा रहा है (. यानी, आज़ादी परिवर्तनीय) फिटिंग प्रक्रिया के दौरान (यह भिन्न करने के लिए अनुमति देने के लिए बॉक्स टिकटिक), और 'क्या है या नहीं किया जा रहा है जो करने के लिए सम्मान के साथ अलग SlopePf 'और / या' देरी 'अशक्त हैं. मोडरास 1 -. 6 Moshelion एट अल 11 से विस्तार से चर्चा कर रहे हैं. 'संयोजन' 'मॉडल प्रकार' / 'क्लास' की पसंद से तय पैरामीटर विकल्प सूचीबद्ध करता है. एक ऐसी ही फिट परिणाम के साथ मॉडल के बीच - सरल चुनते हैं! 'पी एफ', 'ढाल पीएफ' ('Slope_Pf') और (नीचे ई में 'देरी' के बारे में अधिक जानकारी के) के रूप में दिखाया 'देरी' मापदंडों को प्रारम्भ करें. (डी) चर और बदलते स्नान osmoticum के समय के पाठ्यक्रम का वर्णन मापदंडों निवेश कर रहे हैं या तो बी (ई) एक अंतरिम साजिश में वर्णित के रूप में मैन्युअल, या, मात्रा परिवर्तन का एक समय निश्चित रूप से, 'भागो' मार से लागू (गणना सेल समोच्च क्षेत्रों से) 'देरी' पैरामीटर के लिए प्रारंभिक मूल्य के चुनाव में मदद के लिए. अनुमान '(सेल मात्रा परिवर्तन की शुरुआत तक 1 सेंट बिंदु से, आधारभूत की कुल लंबाई eyeballing द्वारासमावेशी देरी: 'टी शुरू धोने' + 'अंतराल' / 'फ्लश अंतराल' + "शारीरिक" 'देरी') का योग. (यह भी पूरक पी एफ फ़िट उपयोगकर्ता गाइड देखें) फिर 'VolumeFit' पैनल में 'देरी' और 'रन' के लिए एक इनपुट पैरामीटर के रूप में यह मान डालें.

चित्रा 6
चित्रा 6: फिटिंग का परिणाम (क) "परदे के पीछे": दो डिब्बों में osmoticum सांद्रता की गणना अंतिम समय पाठ्यक्रम:. स्नान (अदालत, ग्रीन लाइन) और सेल (सिनेमा, नीली रेखा, सिनेमा है "सही और सच्चे osmometer" 11), और उन दोनों के बीच अंतर का समय कोर्स (delC - मूलतत्त्व मात्रा परिवर्तन और प्लाज्मा झिल्ली ही पानी के लिए पारगम्य है कि एक धारणा के आधार पर गणनापानी के प्रवाह के लिए प्रेरणा शक्ति है, जो लाल रेखा), 'EO-tLag' 'फ्लश अंतराल' और यहाँ hypotonic चुनौती की शुरुआत (केवल बारे में 21 सेकंड में) के अंत का प्रतीक है. लाल बॉक्स: फिट मूल्य की त्रुटि (फिट अरे, नीचे बी में परिभाषा देखें) (बी) की मात्रा समय के पाठ्यक्रम फिटिंग का अंतिम परिणाम;. हरे बॉक्स: 'इनपुट चर' (चित्रा 5A कथा में परिभाषित) पी एफ फ़िट / 'VolumeFit' पैनल के माध्यम से प्रवेश मान रहे हैं. ब्लैक बॉक्स: 'exptl वॉल' और 'फिट वॉल' प्रयोगात्मक डेटा कर रहे हैं और सबसे फिट मापदंडों का उपयोग कर की गणना की मात्रा क्रमश: 'EO-tLag', 'Eo देरी' निशान ए के रूप में ही है मात्रा परिवर्तन की शुरुआत. 'अप एरिया 3%' सतह क्षेत्र rupturing बिना फैलाने के लिए कोशिका झिल्ली क्षमता को, 3% से प्रकल्पित सीमा में वृद्धि हुई है, जिस पर मात्रा के निशान. 'पीएफ (स्केल)' फिटिंग बीए का समय निश्चित हैSED 'पी एफ की अवधि' के रूप में लाल बॉक्स के नीचे संकेत मूल्यों फैले, पी एफ गणना. लाल बॉक्स: सबसे अच्छा फिट मापदंडों के मूल्यों 'सज्जित मापदंडों' हैं: 'पीएफ मैं' (प्रारंभिक पी एफ), 'देरी' hypotonic चुनौती की शुरुआत और मात्रा परिवर्तन की शुरुआत के बीच (अवधि (जो, इस उदाहरण में प्रयुक्त मॉडल 5 के अनुसार, भी पी एफ मूल्य में एक परिवर्तन में शुरू), और 'ढलान पी एफ' पी एफ मूल्य में परिवर्तन का (स्थिर दर है 'fit_ERR' ए में दिखाया गया है. - Matlab फिटिंग प्रक्रिया के न्यूनतम लक्ष्य - "रूट मतलब वर्ग" विचलन है (यानी, एक औसत चुकता विचलन का वर्गमूल) आधारभूत मात्रा के% के रूप में प्रस्तुत काला लाइन से एक हरे रंग की बिंदी), की यह. विभिन्न पैरामीटर आरंभीकरण मूल्यों के साथ दोहराया फिटिंग के सापेक्ष सफलता माना जाता है कि इस मूल्य से है. एकसतर्कता का नोट: सबसे फिट पैरामीटर मान त्रुटि न्यूनतम प्रक्रिया में पाया एक स्थानीय न्यूनतम का नतीजा हो सकता है - एक वैश्विक न्यूनतम पाया गया है कि सत्यापित करने के लिए, कई रनों इन तीन मानकों के लिए अलग आरंभीकरण मूल्यों के साथ आवश्यक (और कर रहे हैं 'औसत VOLm%' रिश्तेदार गणना मूलतत्त्व मात्रा परिवर्तन की हद और 'औसत क्षेत्रफल%' है: डेल्टा सज्जित मात्रा परिवर्तन की अवधि के अंत तक होने वाले परिवर्तन हैं. सबसे कम fit_ERR इन प्रयासों के दौरान नीले बॉक्स की मांग की जानी चाहिए मूलतत्त्व सतह क्षेत्र के सापेक्ष परिवर्तन है. सेल के प्रारंभिक आकार मूलतत्त्व बेसल समोच्च क्षेत्र का मतलब मूल्य से व्युत्पन्न 'त्रिज्या', द्वारा दिया जाता है.

चित्रा 7
चित्रा 7: मेज़ोफिल protoplasts की महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी देखें (बी) के तहत GFP के साथ खूंटी परिवर्तन, (ए) के बाद. स्केल बार:. 100 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 8
8 चित्रा:. मात्रा बदलने और निकाले आसमाटिक पानी पारगम्यता, hypotonic चुनौती के लिए जोखिम पर सूजन मूलतत्त्व के पी एफ (ए) समय पाठ्यक्रम (60 सेकंड) (± एसई मतलब) (बी) के दौरान स्नान में गणना की osmoticum एकाग्रता. hypotonic चुनौती. Hypotonic समाधान प्रवाह 15 सेकंड में पर बंद किया गया था, जबकि यह केवल एक के बाद स्नान पर पहुंच गया है कि नोटयहां 5.9 सेकंड. (सी) पी एफ के अंतराल, (एसई ± मतलब है). तारों नियंत्रण (पी ≤0.05) से महत्वपूर्ण मतभेद का संकेत मिलता है. (:;: N = 13, ZmPIP1, 2: N = 28, ZmPIP2, 4: N = 34 एन 1 = 52, AtPIP2 नियंत्रण) कम से कम तीन स्वतंत्र n protoplasts की कुल के साथ प्रत्येक उपचार के लिए प्रयोगों से डेटा.

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Discussion

यहाँ वर्णित अन्य गोलाकार कोशिकाओं को भी सिद्धांत रूप में लागू पृथक संयंत्र protoplasts के पी एफ,, उदा., मेंढक oocytes 11 को मापने के लिए एक सरल और बहुत ही कुशल प्रक्रिया है. इस विधि सेल करने के लिए एक आसमाटिक चुनौती के जवाब में पी एफ मापने पर आधारित है. इस दृष्टिकोण पर आधारित अन्य तरीकों के विपरीत, तथापि, परासारिता के समाधान के परिवर्तन, यानी, आधारभूत सेल मात्रा है जिसमें isotonic समाधान, के साथ शुरू, एक निरंतर स्नान छिड़काव के दौरान, तात्कालिक, लेकिन क्रमिक नहीं है की स्थापना की. इसके अलावा, इस पद्धति एक सक्शन पिपेट शामिल है और इसलिए मूलतत्त्वों को अशांति कम से कम नहीं है.

यहाँ प्रस्तुत दृष्टिकोण अलग पौधों या ऊतकों से protoplasts की एक किस्म से माप में सक्षम बनाता है. फिर भी, क्योंकि इसमें शामिल गणना की, केवल गोलाकार कोशिकाओं का विश्लेषण किया जा सकता है. वें के अलावा, एंजाइमी अलगावई protoplasts और समाधान की osmolarity (उदाहरण के लिए, टमाटर मेज़ोफिल मूलतत्त्वों के enzymatic अलगाव Arabidopsis protoplasts के मामले में की तुलना में काफी लंबे समय तक, एक घंटे के बारे में लेता है) assayed कोशिकाओं को समायोजित करने की जरूरत है.

प्रस्तुत प्रोटोकॉल के अनुसार Arabidopsis मेज़ोफिल protoplasts के अलगाव protoplasts के एक उच्च संख्या उपज, सरल, तेजी से और कुशल है. विशेष रूप से, यह उनकी कम बेसल पी एफ के स्तर और उनके उच्च परिवर्तन दक्षता (चित्रा 8) के साथ संयुक्त, अलग AQP isoforms द्वारा प्रेरित पी एफ के मात्रात्मक तुलना सक्षम करने के लिए, उन्हें AQPs के कार्यात्मक अभिव्यक्ति के लिए एक आकर्षक व्यवस्था करता है. (जैसे GFP के रूप में) एक मार्कर जीन के साथ इन मूलतत्त्वों में AQPs व्यक्त करते हैं, एक विश्लेषण के लिए कोशिकाओं fluorescing के लिए प्रायोगिक कक्ष में मूलतत्त्वों आसानी से स्क्रीन कर सकते हैं.

यह इस प्रणाली एक व्यवहार्य alternativ है कि क्या जांच करने के लिए सार्थक हैयहां तक कि पशु स्रोतों से AQPs परख करने की क्रिया के लिए oocytes को ई (कि कार्यात्मक पशु प्रोटीन संयंत्र कोशिकाओं में व्यक्त किया जा सकता है पहले से ही 17 प्रदर्शन किया गया है).

पी एफ फ़िट कार्यक्रम का उपयोग करना, दो और मापदंडों, पी एफ के बगल में, hypotonic चुनौतियों के लिए मूलतत्त्व प्रतिक्रियाओं का वर्णन के लिए प्राप्त कर रहे हैं: देरी, मात्रा परिवर्तन की शुरुआत और स्नान छिड़काव की शुरुआत, और ढलान पीएफ के बीच का समय, (11 में विस्तार से वर्णित) आसमाटिक चुनौती दौरान पी एफ में परिवर्तन की दर.

मात्रा फिटिंग प्रक्रिया सेट प्रत्येक प्रयोगात्मक डेटा के लिए अंत में सबसे कम त्रुटि के साथ फिट का चयन, इन मानकों के लिए अलग से शुरू होने (आरंभीकरण) मूल्यों की आपूर्ति, कई बार प्रदर्शन करने की जरूरत है. यह त्रुटि न्यूनतम प्रक्रिया आदमी के बीच, विभिन्न गहराई के साथ घाटियों के परिदृश्य में गहरी घाटी (एक "वैश्विक न्यूनतम") की मांग के रूप में चित्रित किया जा सकता हैवाई पहाड़ियों, और एक नहीं बल्कि उथले घाटी (एक "स्थानीय न्यूनतम") में पकड़ा नहीं प्रयास.

पी एफ के दो प्रकार hypoosmotic के बहुत शुरुआत में पी एफ के अंत से गिनती, ('प्रारंभिक एफ पी') और सूजन के 15 सेकंड के अंत में गणना की एफ पी प्रतिक्रिया सूजन, प्राप्त कर रहे हैं   देरी ('पी एफ Fi एनएएल'). दोनों के बीच अंतर Moshelion एट अल द्वारा पूरी तरह से चर्चा की है. 11, विश्लेषण किया 6 मॉडल के संबंध में.

प्रोटोकॉल में दो महत्वपूर्ण कदम हैं: पहला, सूचक डाई एकाग्रता, सूजन सेल की मात्रा के समय पाठ्यक्रम को दूसरा, एक अच्छा फिट के समय के पाठ्यक्रम के लिए एक अच्छी फिट.

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Acknowledgments

इस काम रिसर्च (FNRS) सी Scienti फाई के लिए बेल्जियम के राष्ट्रीय कोष से अनुदान, इसराइल विज्ञान फाउंडेशन यरूशलेम से एफसी को Interuniversity आकर्षण डंडों कार्यक्रम-बेल्जियम विज्ञान नीति और "Recherches Concertées डे Communauté Française de Belgique-actions", (द्वारा समर्थित किया गया एम एम (अनुदान # 1311-1312) के लिए ISF), और समुद्री मील (अनुदान # 1312-1312) के लिए.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KCl Chem-Impex International 01247-1 http://www.chemimpex.com
Any source, anal. grade
CaCl2 Merck 11718006 http://www.merck.com
Any source, anal. grade
2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) Sigma 15152002 http://www.sigmaaldrich.com
Any source, anal. grade
D-Sorbitol Sigma 18032003 http://www.sigmaaldrich.com
Any source, anal. grade
Cellulase Worthington, Lakewood, NJ, USA LS002603 http://www.worthingtonbiochem.com
Pectolyase Karlan,               Phonix, AZ, USA 8006 http://www.karlan.com
Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) Sigma 81420 http://www.sigmaaldrich.com
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A9418-5G http://www.sigmaaldrich.com
Protamine sulphate Sigma P4380 http://www.sigmaaldrich.com
Poly-L-Lysine Sigma P8920 http://www.sigmaaldrich.com
Xylene cyanol Sigma X4126 http://www.sigmaaldrich.com
Silicone vacuum grease heavy Merck 107921 https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA
Inverted microscope  Nikon Eclipse TS100/TS100F http://www.nikoninstruments.com
Peristaltic pump BIO-RAD EP-1 Econo Pump http://www.bio-rad.com
Grayscale digital camera Scion Corporation CFW-1308M http://www.scioncorp.com
CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ Carnegie Mellon http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html
Free software
ImageJ NIH http://rsb.info.nih.gov/ij/
Free software
Econo Gradient Pump Fittings Kit BIO-RAD 731-9006 http://www.bio-rad.com
Connectors, manifold DirectMed http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S
Burette infusion sets (columns) Welford IF-BR-001 http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61
Tubing TYGON R-3603 http://www.usplastic.com
3M packaging Scotch tape 1'', clear Viking Industrial, UK VKMONO25 http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8
any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK

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References

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प्लांट बायोलॉजी अंक 92 Osmotic पानी पारगम्यता गुणांक aquaporins protoplasts वक्र ढाले गैर तात्कालिक परासारिता परिवर्तन मात्रा परिवर्तन समय पाठ्यक्रम
Osmotic पानी पारगम्यता गुणांक (पी मापने<sub&gt; च</sub&gt;) गोलाकार कोशिकाओं का एक उदाहरण के रूप में अलग संयंत्र protoplasts
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Shatil-Cohen, A., Sibony, H., Draye, … More

Shatil-Cohen, A., Sibony, H., Draye, X., Chaumont, F., Moran, N., Moshelion, M. Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example. J. Vis. Exp. (92), e51652, doi:10.3791/51652 (2014).

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